CN101948488B - 钌-硒配合物及其在制备荧光探针和抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钌-硒配合物及其合成方法和应用。本发明配合物的分子式为[Ru(phen)2p-MOPIP]2+,化学名称为二-邻菲罗啉-1,10-菲罗啉硒二唑合钌配合物,其结构如通式(I)所示。本发明钌-硒配合物可以作为识别肿瘤细胞的荧光探针,识别细胞膜上的受体,并可进入细胞质,最终富集在细胞核区域内。本发明钌-硒配合物作为荧光探针,与肿瘤细胞作用30min后,荧光强度即显著增强,随着时间的延长,其荧光强度会进一步增强,但在正常细胞中荧光微弱或没有荧光。因此本发明钌-硒配合物可以用于肿瘤细胞的检测和活体荧光成像,还可用于制备预防或治疗癌症的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物检测、临床医学检测及化学合成药领域,具体涉及肿瘤细胞或生物体中巯基的检测技术,特别涉及一种具有肿瘤识别功能和抗肿瘤活性的钌-硒配合物及其制备方法和在制备高选择性检测肿瘤细胞的荧光探针和抗肿瘤药物的用途。
背景技术
应用小分子荧光探针进行肿瘤细胞和活体肿瘤成像,对于癌症的检测、诊断、治疗具有极其重要意义。通过分子荧光探针能够实时观测肿瘤细胞和活体肿瘤活动的发生、发展过程,能在真实、完整的生理环境中通过荧光成像直接观测药物对肿瘤组织、肿瘤细胞以及肿瘤细胞信号通路的影响,能够观测到药物分子在活体内的表达及其生物活性、对肿瘤细胞迁移和对药物治疗反应影响的生物过程。譬如在肿瘤病例中,肿瘤的部位和侵袭度等检测指标可由特异性更强的癌前病变分子成像来检测,细胞生长动力学、血管生长因子、肿瘤细胞标记物、基因的改变等检测方法都可由荧光成像检测技术来代替。利用分子荧光成像技术可以评价药物作用的疗效,为药物筛选和药物的开发可提供一个平台。这也是分子成像自提出至今20年内迅速兴起,并在化学、生命科学、医学等各个领域广泛进行研究的原因。
应用荧光探针分子成像进行肿瘤研究引起了许多学科的关注。其中存在二个重要问题:(1)一些小分子荧光探针本身具有很高的荧光量子产率,但最大吸收波长和荧光发射波长多小于600nm。其生物样品和一些杂质在此区域也会有吸收或荧光,再加上光散射的影响往往会产生较为严重的背景干扰,限制了荧光分析法灵敏度的提高。(2)对肿瘤细胞凋亡检测主要是通过组织学手段,由于不能实时反应细胞凋亡的情况,组织学方法对细胞凋亡的情况常常不能准确反应。细胞凋亡的过程实际就是一系列特定分子在特定时间的连续相互作用,是一个动态连续的过程,在对生物大分子功能的活体研究中光学技术能发挥其特有的优势。
关于钌配合物作为抗肿瘤药物的研究已经有不少的报道,并且有几种钌配合物作为抗肿瘤药物已经进入了I期或者II期临床。在金属抗肿瘤药物中,研究最多的就是顺铂类,其次就是钌配合物抗肿瘤药物的研究,国际上普遍认为:钌和钌的配合物属于低毒性,容易吸收并在体内很快排泄,将成为最有前途的抗癌药物之一。硒及其化合物在防癌抗癌方面也有很多的研究报道。但是目前关于钌配合物诱导细胞凋亡的信号通路研究报道较少,但已经引起人们的重视。有关金属配合物作为荧光探针识别肿瘤国际范围内尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足,提供一种可以作为荧光探针的钌-硒配合物。
本发明的另一目的在于提供上述钌-硒配合物的制备方法。
本发明还有一个目的在于提供上述钌-硒配合物在制备快速响应、高选择性、高灵敏度识别肿瘤细胞的荧光探针中的用途。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:一种钌-硒配合物,该钌-硒配合物的结构如通式(I)所示,
其中,所述N-N为以下配体:
bpy为2,2′-联吡啶,phen为1,10菲罗啉,ip为1H-咪唑[4,5-f][1,10]-邻菲罗啉,p-mopip为2-(4-甲氧基苯)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]-邻菲罗啉。
所述钌-硒配合物含有1,10-菲罗啉硒二唑配体(式II):
所述钌-硒配合物优选为具有如式(a)~(h)所示结构的化合物:
上述化合物化学简式及其中文名称如下:
a为[Ru(phen)2p-ipSe](ClO4)2(高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二菲罗啉合钌(II));
b为[Ru(bpy)2p-ipSe](ClO4)2(高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二2,2′-联吡啶合钌(II);
c为[Ru(p-ipSe)2(phen)](ClO4)2(高氯酸1,10-菲罗啉二1,10-菲罗啉硒二唑合钌(II));
d为[Ru(p-ipSe)2(bpy)](ClO4)2(高氯酸2,2′-联吡啶二1,10-菲罗啉硒二唑合钌(II));
e为[Ru(p-ipSe)3](ClO4)2(高氯酸三1,10-菲罗啉硒二唑合钌(II));
f为[Ru(p-ipSe)2]Cl2(二氯二1,10-菲罗啉硒二唑合钌(II));
g为[Ru(ip)2p-ipSe](ClO4)2(高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二1H-咪唑[4,5-f][1,10]-菲罗啉合钌(II));
h为[Ru(p-MOPIP)2p-ipSe](ClO4)2(高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二2-(4-甲氧基苯)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]-邻菲罗啉合钌(II))。
本发明钌-硒配合物的合成路线为:
上述的一种钌-硒配合物的制备方法,包括以下操作步骤:
(1)1,10-菲罗啉-5,6-二酮的合成:将1,10-菲罗啉和溴化钾拌匀并置于圆底烧瓶中,然后滴加冷的混合酸;滴加完混合酸后维持温度在80~85℃反应3小时,冷却至室温,倒入冰水中,然后用10mol/L NaOH溶液中和至中性;用300mL氯仿进行萃取,合并有机相后,蒸馏水洗涤,最后用硫酸钠干燥过夜;过滤后,减压蒸去氯仿,固体产物用乙醇重结晶,得到1,10-菲罗啉-5,6-二酮;
(2)1,10-菲罗啉-5,6-二肟的合成:将1,10-菲罗啉-5,6-二酮、NH2OH·HCI和BaCO3混合后加入到无水乙醇中,搅拌回流12小时;蒸发去除溶剂,将剩余产物用摩尔浓度为0.2mol/L的盐酸搅拌处理30分钟后过滤,得到淡黄色产物;将淡黄色产物依次用蒸馏水、乙醇和乙醚洗涤,并在80℃下真空干燥,得到1,10-菲罗啉-5,6-二肟;
(3)1,10-菲罗啉-5,6-二胺的合成:将1,10-菲罗啉-5,6-二肟和Pd-C催化剂混合加入到100mL无水乙醇中,通入氮气回流一小时,加入水合肼,继续回流12小时后,趁热通过砂芯漏斗过滤;滤液减压干燥后,溶于蒸馏水中,在4℃环境下放置24小时;过滤得到黄褐色固体,用冰水洗涤并干燥,得到1,10-菲罗啉-5,6-二胺;
(4)1,10-菲罗啉硒二唑配体的合成:在室温下,分别将研磨成细粉的5,6-二氨基邻菲罗啉与SeO2混合均匀,充分研磨反应,得到红色粉末,将红色粉末用乙醇重结晶,得到1,10-菲罗啉硒二唑配体;
(5)活性中间体RuL2Cl2·2H2O的合成:将RuCl3·6H2O、L和氯化锂混合后溶于二甲基甲酰胺中,在氩气保护条件下,加热回流,冷至室温,加入丙酮,放入冰箱过夜,抽滤得墨绿色固体,水洗得粗产物,用体积比为1∶1的乙醇-水混合液重结晶回流30分钟,过滤得到RuL2Cl2·2H2O;所述L为2,2′-联吡啶、1,10-菲罗啉、1H-咪唑[4,5-f][1,10]-邻菲罗啉或2-(4-甲氧基苯)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]-邻菲罗啉;
(6)钌-硒配合物的合成:将RuL2Cl2·2H2O和1,10-菲罗啉硒二唑配体在体积比为9∶1的乙二醇-水混合液中,加热回流,反应结束后滤去不溶的固体杂质,加入高氯酸钠固体,搅拌并静置后抽滤得棕红色固体,用中性三氧化二铝柱提纯,得到钌-硒配合物。
步骤(1)所述1,10-菲罗啉与溴化钾的质量比为1∶1;所述混合酸是由体积比为2∶1的浓硫酸和浓硝酸混合而成;所述混合酸的用量根据1,10-菲罗啉的质量确定,每加入1克的1,10-菲罗啉,需要相应加入15ml的混合酸。
步骤(2)所述1,10-菲罗啉-5,6-二酮、NH2OH·HCI和BaCO3的摩尔比为2∶7∶3;所述无水乙醇的用量根据1,10-菲罗啉-5,6-二酮的质量确定,每加入1克的1,10-菲罗啉,需要相应加入60ml的无水乙醇;所述盐酸的用量根据1,10-菲罗啉-5,6-二酮的质量确定,每加入1克的1,10-菲罗啉,需要相应加入80ml的盐酸。
步骤(3)所述1,10-菲罗啉-5,6-二肟和Pd-C催化剂的质量比为1∶1;所述无水乙醇的用量根据1,10-菲罗啉-5,6-二肟的质量确定,每加入1克的1,10-菲罗啉-5,6-二肟,需要相应加入250ml的无水乙醇;所述水合肼的用量根据1,10-菲罗啉-5,6-二肟的质量确定,每加入1克的1,10-菲罗啉-5,6-二肟,需要相应加入8ml的水合肼;所述Pd-C催化剂中含有质量分数为10%的Pd。
步骤(4)所述1,10-菲罗啉-5,6-二胺与SeO2的摩尔比为1∶1~1∶1.5;所述反应为固相反应。
步骤(5)所述RuCl3·6H2O、1,10-菲罗啉和氯化锂的摩尔比为1∶2∶4;
步骤(6)所述RuL2Cl2·2H2O和1,10-菲罗啉硒二唑配体的摩尔比为1∶1~1∶1.4;所述甲苯和乙腈的体积比为1∶2.5~3.5,以1∶3为最佳。
本发明钌-硒配合物可用于制备鉴别肿瘤细胞,或者作为荧光探针,用于鉴别肿瘤细胞,还可用于肿瘤荧光成像,或者用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
本发明中的钌-硒配合物荧光探针,激发波在460nm,发射波长在600nm到720nm之间,属于近红外波长范围,生物样品基体光吸收或荧光强度很小,因而背景干扰大大降低,从而能够提高分析的灵敏度。该荧光探针的另一个突出优势在于:该小分子荧光探针具有抗肿瘤活性和特异性识别肿瘤细胞的双重功能,一方面可以用于肿瘤的检测,另一方面可以用于抗肿瘤药物的研究与开发。尤其是在研究其抗肿瘤活性过程中,可以利用其荧光成像特性,能够实现实时、连续动态的观测药物对细胞或组织的影响,尤其是可以观察到对肿瘤细胞凋亡过程的影响。很好的解决了上述二个问题。
本发明设计的具有抗肿瘤活性和荧光探针双重功能的小分子,可以实时动态地监测到活性小分子对线粒体、死亡受体途径的影响,在此基础上获得肿瘤细胞凋亡中发生的分子事件。类似的研究至今未见相关报道。
本发明的配合物对肿瘤细胞和正常细胞具有识别作用,本发明的钌-硒配合物可以用于多种肿瘤细胞的检测和荧光成像,以及临床医学上肿瘤组织的检测、诊断、治疗。
本发明配合物作为荧光探针分子的设计基于以下原理:
(1)该荧光探针的激发波长为460nm,在600-720nm波长范围发射较强的荧光,属于近红外区。在这一波长范围内,生物样品基体光吸收或荧光强度很小,背景干扰大大降低,从而能够提高分析的灵敏度。
(2)探针在正常细胞中荧光显著减弱甚至被淬灭,因为正常细胞中谷胱甘肽和蛋白硫醇的浓度很高,巯基对Se-N键具有强亲核作用,将Se-N键打断后形成新的配合物荧光消失(反应机理如下图所示),形成的配合物苯环上邻位的二个氨基与H2O形成强烈的氢键从而使Ru-Se的荧光淬灭,因此Ru-Se在人正常肝细胞(HL-7702)中荧光微弱或没有荧光。但是在人肝癌细胞(HepG-2)内谷胱甘肽和蛋白硫醇浓度急剧下降,Se-N键不会断裂,Ru-Se进入肿瘤细胞中可以与DNA相互作用,荧光显著增强,据此可以实现此探针对肿瘤细胞的特异性识别。Ru-Se与硫醇反应的机理如下式所示:
本发明配合物荧光探针作为抗肿瘤药物的应用
该探针具有强烈的抑制肿瘤细胞生长的作用,其效果比顺铂要好,且毒性较低,本发明的钌配合物有用于治疗或预防癌症药物的应用前景。
所述肿瘤一般包括人黑色素瘤、肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等。
本发明的钌配合物在使用时还可以是药学上可接受的盐、溶剂化物或相应的结晶形态(含不同结晶水)的物质。药学上可接受的盐包括它们的碱金属、碱土金属或铵类物质的盐,如果必要,也可以是酸式盐,如盐酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、苯磺酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、乳糖酸、高氯酸、六氟合磷酸等药效学上常用的酸形成的盐。溶剂化物可以是水合物,包括一水合物至十水合物等。
为实现上述的应用,本发明还提供一种药物组合物,只要该组合物中含有上述任一种或其混合物的钌配合物。上述组合物还可包括药学上可接受的载体,以及一些药用的助剂,稀释剂等辅助性组分。
上述的组合物可以制成一种药物制剂使用,剂型可以是任何一种药用的剂型,如片剂、糖衣片剂、薄膜片剂、肠溶衣片剂、胶囊片剂、口服液、颗粒剂、冲剂、丸剂、注射剂、喷雾剂或缓释制剂等。
上述钌配合物的应用,可以是单独应用,也可以是联合用药。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明配合物作为荧光探针的稳定性好,能够在室温条件下长期保存;
(2)本发明配合物作为荧光探针,对人和动物无毒副作用;
(3)本发明配合物作为荧光探针,具有很好的选择性,能够识别正常细胞与肿瘤细胞;
(4)本发明配合物作为荧光探针,可识别细胞膜上的受体,并可进入细胞质,并最终富集在细胞核区域内。该探针与肿瘤细胞作用30分钟,荧光强度即显著增强,随着时间的延长,其荧光进一步增强,在正常细胞中荧光微弱或没有荧光;
(5)本发明配合物作为荧光探针的发射荧光在600-720nm,属于近红外区,因此其具有损伤程度小,避免生物体背景荧光的干扰,对肿瘤细胞和正常细胞识别灵敏度高的优点,该探针还具有很强的抗肿瘤活性,因此该探针既可以作为肿瘤识别与诊断试剂,又可以发展成抗肿瘤药物,尤其是可以利用其荧光识别的功能研究其诱导细胞凋亡的信号通路;
(6)本发明通过结构设计、合成、结构修饰与改造,合成了具有特色结构的钌-硒配合物,该配合物是钌-硒配合物,主要配体及结构上与现有的钌配合物具有很大的差异,尤其是我们将钌配合物的活性与硒的活性结合在一起,发现了其既具有识别肿瘤的荧光探针功能又具有抗肿瘤药物的用途;
(7)本发明的配合物在体外具有明显的抑癌作用,活性与顺铂相当或明显好于顺铂,而且与顺铂有较小的交叉耐药性。
附图说明
图1是配合物a的ESI-MS结果图。
图2是配合物a的1H NMR结果图。
图3是配合物b的ESI-MS结果图。
图4是配合物b的1H NMR结果图。
图5是向本发明的探针分子与谷胱甘肽结合后产物相对荧光强度的变化图,其中横坐标为发射波长,纵坐标为相对荧光强度。
图6是激光共聚焦荧光显微镜观察探针a配合物在HepG-2细胞中的定位图。
图7是探针配合物a对HpeG2肝癌细胞的荧光成像图。
图8是探针配合物a对正常细胞NIH-3T3胚胎成纤维细胞的活体成像图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本发明所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可,来源均可从市场购得。
实施例1配合物a:高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二菲罗啉合钌(II)([Ru(phen)2p-ipSe](ClO4)2)的制备
(1)1,10-菲罗啉-5,6-二酮:将4.0g菲罗啉和4.0g溴化钾拌匀并置于圆底烧瓶中,然后滴加冷的浓H2SO4(40mL)和浓HNO3(20mL)的混合酸。滴加完混酸后维持温度在80-85℃反应3h,冷却,将其倒入500mL冰水中,然后用10mol/LNaOH溶液小心中和至中性。用3×100mL氯仿对该溶液进行萃取。合并有机相后,用50mL水对其洗涤,最后用硫酸钠干燥过夜。过滤后,减压蒸去氯仿,固体产物用乙醇重结晶,得到黄色或橙黄色针状晶体,即为1,10-菲罗啉-5,6-二酮。
(2)1,10-菲罗啉-5,6-二肟的合成:将0.420g(2mmol)的菲罗琳二酮、0.486g(7mmol)的NH2OH.HCI和0.592g(3.00mmol)的BaCO3混合加入到30mL的乙醇中,搅拌回流12小时。蒸发掉所有溶剂,将剩余产物用40mL盐酸(0.2M)处理,搅拌30分钟后过滤,得到淡黄色产物;将淡黄色产物依次用蒸馏水、乙醇和乙醚洗涤,并在80℃下真空干燥,得到1,10-菲罗啉-5,6-二肟。
(3)1,10-菲罗琳-5,6-二胺的合成:将0.40g(1.63mmol)的1,10-邻菲罗琳-5,6-二肟和0.4g的Pd-C(10%)催化剂混合加入到100mL的无水乙醇中,通入氮气回流一小时后,向该混合液中加入3.5mL的水合肼和15mL的乙醇,继续回流12小时;混合物趁热通过砂芯漏斗过滤,然后用热的乙醇洗涤四次,每次20mL;滤液减压干燥,然后将滤渣溶于30mL水,在4℃环境下放置过夜;过滤得到黄褐色的固体,用冰水洗涤并干燥,得到1,10-菲罗琳-5,6-二胺。
(4)1,10-菲罗啉硒二唑配体的合成:在室温下,分别将研磨成细粉的5,6-二氨基邻菲罗啉与SeO2按物质的量1∶1均匀混合,充分研磨,在反应过程中,可以观察到明显剧烈的变化,研磨30min,反应完成后得到红色粉末,将红色粉末用乙醇重结晶,得到1,10-菲罗啉硒二唑配体。
(5)活性中间体Ru(L2)Cl2 2+其中(L=bpy,phen,ip,p-mopip)的合成:称1.57g(6mmol)RuCl3·6H2O,1.61g(12mmol)1,10-邻菲罗啉,2.42g氯化锂,溶于15mL DMF中,在氩气保护下,140℃加热回流8h,冷至室温,加入50mL丙酮,摇匀,放入冰箱过夜,抽滤得墨绿色固体,水洗得粗产物,用150mL乙醇和水(体积比为1∶1)的混合溶液重结晶回流30分钟,过滤得到Ru(phen)2Cl2·2H2O。
(6)高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二菲罗啉合钌(II)(简写为:[Ru(phen)2p-ipSe](ClO4)2)的合成:将0.48g(1mmol)Ru(phen)2Cl2·2H2O和0.29g(1mmol)1,10-菲罗啉硒二唑配体在乙二醇和水(体积比为9∶1)的混合液中,110℃加热回流5h,向反应液中加入30mL水,滤去不溶的固体杂质,加入0.5g高氯酸钠固体,搅拌并静置30min,抽滤得棕红色固体,用中性三氧化二铝柱提纯。ESI-MS:m/z 846.93(M-ClO4-H),374.27(M-2ClO4/2).1H NMR[CD3CN]:δ9.08(d,2H),8.63(q,4H),8.27(m,4H),8.22(d,2H),8.03(d,2H),7.99(d,2H),7.72-7.62(multiplet,6H).配合物a的ESI-MS和1HNMR分别如图1、图2所示。
实施例2配合物b:高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二2,2′-联吡啶合钌(II)([Ru(bpy)2p-ipSe](ClO4)2)的制备
(1)1,10-菲罗啉-5,6-二酮的合成:参见配合物a的制备中的步骤(1)。
(2)1,10-菲罗啉-5,6-二肟的合成:参见配合物a的制备中的步骤(2)。
(3)1,10-菲罗琳-5,6-二胺的合成:参见配合物a的制备中的步骤(3)。
(4)1,10-菲罗啉硒二唑配体的合成:参见配合物a的制备中的步骤(4)。
(5)活性中间体Ru(bpy)2Cl2 2+的合成:参见配合物a的制备中的步骤(5),区别在于所用联吡啶1.48g(12mmol),其他步骤相同。
(6)高氯酸1,10-菲罗啉硒二唑二2,2′-联吡啶合钌(II)(简写为:[Ru(bpy)2p-ipSe](ClO4)2)的制备:将0.48g(1mmol)Ru(phen)2Cl2·2H2O和0.29g(1mmol)1,10-菲罗啉硒二唑配体在乙二醇和水(体积比为9∶1)的混合液中,110℃加热回流5h,向反应液中加入30mL水,滤去不溶的固体杂质,加入0.5g高氯酸钠固体,搅拌并静置30min,抽滤得棕红色固体,用中性三氧化二铝柱提纯。ESI-MS:m/z 801.0(M-ClO4-H),350.3(M-2ClO4/2).1H NMR[CD3CN]:δ9.11(d,2H),8.57(t,4H),8.15-8.11(multiplet,4H),8.05(t,2H),7.84(d,2H),7.80(q,2H),7.74(d,2H),7.48(t,2H),7.31(t,2H).配合物b的ESI-MS和1H NMR分别如图3、图4所示。
以下通过实验数据说明本发明的探针可以识别肿瘤细胞和作为抗肿瘤药物。
实施例3
1、识别肿瘤细胞荧光探针实验
(1)谷胱甘肽对探针荧光强度的影响
在模拟生物体系的条件下(PBS,pH 7.4,终浓度20mM),以谷胱甘肽与探针的反应研究光谱性质,比色管中依次加入探针溶液(5.0μM,1.0mL),2.0mL PBS缓冲溶液(0.10M,pH=7.4),谷胱甘肽溶液(1.2μM,1.0mL),超纯水定容至10mL刻度,摇匀,25℃反应30min。用1cm荧光池上机测λex/λem=460/650nm处的荧光强度。空白实验不加谷胱甘肽,仪器激发和发射狭缝为0.6nm。记录荧光强度随谷胱甘肽浓度的的变化。结果如图5所示。
(2)亚细胞定位
荧光染色观察钌配合物的亚细胞定位,肿瘤细胞爬片24h后,用不同浓度的目标配合物处理24h。在培养基中加入100nmol/L线粒体荧光染料Mitotracker red CM-H2Ros(Molecular Probes)培养30min。移除培养基后用3.7%甲醛固定15min,再用0.2%的Triton X-100进行膜穿孔3min,0.1%BSA封闭5min。然后加入p53抗体室温孵育1h,再加入Alexa-488标记的二抗(Cell Signaling Technology提供)孵育1h,最后用DAPI(1μg/ml)染色15min。PBS洗涤后在Bio-Rad激光共聚焦显微镜下,确定视野后,设置空间坐标,以激光器激发波长为405nm(DAPI)460nm和DIC三通道同时断层扫描,拍摄上述细胞的荧光成像,对Ru进行亚细胞定位。以HepG-2细胞为例,前期结果发现Ru-Se配合物在作用12h后可以透过细胞膜进入到细胞质,24h完全聚集到细胞核。结果如图6所示。
(3)活体单细胞实时观测荧光探针对肿瘤细胞的识别
利用活体细胞成像工作站,通过Ru-Se在肿瘤细胞中实现单细胞荧光成像,“实时、动态、连续”观察肿瘤的生长。分别用MitoTracker Red CMXRos和DAPI染色细胞线粒体和细胞核。将染色后的细胞用PBS溶液洗涤两次,之后加入新的培养基及药物,放进Carl Zeiss细胞观察仪(Jena,Germany)的FCS2恒温细胞培养室中。用Cool SNAP FX单反相机(Roper Scientific,USA)连续拍摄细胞图片,通过AxioVision 4.2软件(Carl Zeiss)进行分析数据。利用Ru-Se在肿瘤细胞中荧光显著增强的特点,实时观测配合物对肿瘤细胞的识别,进一步发展能识别肿瘤细胞和在肿瘤细胞中示踪的荧光探针;同时可观察细胞线粒体和细胞核及形貌的变化。
以HepG-2细胞为例,用Ru-Se处理细胞后,利用活体细胞工作站,连续进行了24h实时观测并进行录像,在加入Ru-Se 30min后就能观察到肿瘤细胞的线粒体断裂及染色质固缩,且该效应随着时间的延长而增强;作用4.5h后,线粒体基本完全断裂,内容物释放到细胞质中,同时可观察到细胞核的破碎;从5.5h开始,所有线粒体均破碎,而染色质的信号则完全消失,提示细胞核的破碎。并且30min之后,就可以观察到Ru-Se(绿色荧光)在细胞膜上聚集,之后细胞上Ru-Se的累积显著增强。实验结果如图7所示。
Ru-Se处理正常细胞(NIH-3T3胚胎成纤维细胞)的结果,发现Ru-Se在NIH-3T3细胞中对线粒体无影响,并且无荧光产生。此结果显示Ru-Se作为肿瘤细胞识别探针具有较高的可行性。实验结果如图8所示。
2、作为抗肿瘤药物的体外实验
细胞株
本实验选择多种购自ATCC公司的肿瘤细胞株,人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人肝癌细胞(HepG2)、人结肠癌细胞(SW480)、人前列腺癌(PC-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺腺癌细胞(A549)。所试样品编号为:a、b、c、d和顺铂。
(1)MTT测试方法
取处于对数生长期的肿瘤细胞,调整活细胞浓度为2×104/ml加于96孔培养板,每孔100μl,在培养箱中培养24h待贴壁后,再分别加入不同浓度受试样品100μl,阴性对照为等体积生理盐水,阳性对照为顺铂,加样组和对照组均设4个复孔,置37℃,5%CO2培养72h,然后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,5h后离心弃上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔,振荡10min左右,用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率,通过软件计算其半数抑制浓度IC50。
细胞存活率(%)=加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值;
细胞抑制率(%)=100%-细胞存活率;
实验结果见表1。
表1钌配合物的体外抗肿瘤活性
(2)流式细胞分析
DNA流式细胞分析参照文献。离心收集处理后的细胞,用PBS清洗两次,加入70%乙醇,-20℃放置固定过夜,离心,清洗后进行细胞PI染色。DNA含量测定利用Beckman流式细胞分析仪。细胞周期分布利用软件MultiCycle(Phoenix Flow Systems,San Diego,CA)。用DNA柱状图表示细胞在G0/G1、S和G2/M各相的分布比例。凋亡细胞亚二倍体DNA含量测定通过定量图中sub-G1峰测得。每个样品分析10000个细胞。
本发明的配合物具有一定的脂溶性和水溶性,易为人体吸收,在体外试验中对肿瘤细胞具有强烈的抑制作用,比顺铂的疗效要好,且毒性比顺铂低,显示良好的应用价值,特别适合制备成抗肿瘤药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
3.一种如权利要求1所述的钌-硒配合物的制备方法,其特征在于包括以下操作步骤:
(1)1,10-菲罗啉-5,6-二酮的合成:将1,10-菲罗啉和溴化钾拌匀并置于圆底烧瓶中,然后滴加冷的混合酸;滴加完混合酸后维持温度在80~85℃反应3小时,冷却至室温,倒入冰水中,然后用10mol/L NaOH溶液中和至中性;用300mL氯仿进行萃取,合并有机相后,蒸馏水洗涤,最后用硫酸钠干燥过夜;过滤后,减压蒸去氯仿,固体产物用乙醇重结晶,得到1,10-菲罗啉-5,6-二酮;所述混合酸是由体积比为2:1的浓硫酸和浓硝酸混合而成;
(2)1,10-菲罗啉-5,6-二肟的合成:将1,10-菲罗啉-5,6-二酮、NH2OH·HCI和BaCO3混合后加入到无水乙醇中,搅拌回流12小时;蒸发去除溶剂,将剩余产物用摩尔浓度为0.2mol/L的盐酸搅拌处理30分钟后过滤,得到淡黄色产物;将淡黄色产物依次用蒸馏水、乙醇和乙醚洗涤,并在80℃下真空干燥,得到1,10-菲罗啉-5,6-二肟;
(3)1,10-菲罗啉-5,6-二胺的合成:将1,10-菲罗啉-5,6-二肟和Pd-C催化剂混合加入到100mL无水乙醇中,通入氮气回流一小时,加入水合肼,继续回流12小时后,趁热通过砂芯漏斗过滤;滤液减压干燥后,溶于蒸馏水中,在4℃环境下放置24小时;过滤得到黄褐色固体,用冰水洗涤并干燥,得到1,10-菲罗啉-5,6-二胺;
(4)1,10-菲罗啉硒二唑配体的合成:在室温下,分别将研磨成细粉的5,6-二氨基邻菲罗啉与SeO2混合均匀,充分研磨反应,得到红色粉末,将红色粉末用乙醇重结晶,得到1,10-菲罗啉硒二唑配体;
(5)活性中间体RuL2Cl2·2H2O的合成:将RuCl3·6H2O、L和氯化锂混合后溶于二甲基甲酰胺中,在氩气保护条件下,加热回流,冷至室温,加入丙酮,放入冰箱过夜,抽滤得墨绿色固体,水洗得粗产物,用体积比为1:1的乙醇-水混合液重结晶回流30分钟,过滤得到RuL2Cl2·2H2O;所述L为2,2′-联吡啶或1,10-菲罗啉;
(6)钌-硒配合物的合成:将RuL2Cl2·2H2O和1,10-菲罗啉硒二唑配体在体积比为9:1的乙二醇-水混合液中,加热回流,反应结束后滤去不溶的固体杂质,加入高氯酸钠固体,搅拌并静置后抽滤得棕红色固体,用中性三氧化二铝柱提纯,得到钌-硒配合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述1,10-菲罗啉与溴化钾的质量比为1:1;所述混合酸的用量为15ml每克1,10-菲罗啉。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述1,10-菲罗啉-5,6-二酮、NH2OH·HCI和BaCO3的摩尔比为2:7:3;所述无水乙醇的用量为60ml每克1,10-菲罗啉;所述盐酸的用量为80ml每克1,10-菲罗啉-5,6-二酮。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)所述1,10-菲罗啉-5,6-二肟和Pd-C催化剂的质量比为1:1;所述无水乙醇的用量为250ml每克1,10-菲罗啉-5,6-二肟;所述水合肼的用量为8ml每1,10-菲罗啉-5,6-二肟;所述Pd-C催化剂中含有质量分数为10%的Pd。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤(4)所述1,10-菲罗啉-5,6-二胺与SeO2的摩尔比为1:1~1:1.5;所述反应为固相反应。
8.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤(5)所述RuCl3·6H2O、1,10-菲罗啉和氯化锂的摩尔比为1:2:4;步骤(6)所述RuL2Cl2·2H2O和1,10-菲罗啉硒二唑配体的摩尔比为1:1;所述甲苯和乙腈的体积比为1:2.5~3.5。
9.根据权利要求1所述的钌-硒配合物应用于制备识别肿瘤细胞的荧光探针。
10.根据权利要求1所述的钌-硒配合物应用于制备抗肿瘤药物。
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