CN113620998B - 一种环金属钌配合物脂滴粘度探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于芳香族环金属配合物荧光探针领域，具体涉及一种环金属钌配合物脂滴粘度探针及其制备方法和应用，先以邻菲罗啉‑5,6‑二酮和肉桂醛通过迈克尔加成反应制备出邻菲罗啉肉桂醛，然后加入三氯化钌，以乙二醇为溶剂制备出粘度响应具有脂滴细胞器靶向功能的钌配合物。由于钌配合物结构中含有三面对称的肉桂醛，而肉桂醛中的双键和苯环，会随着溶剂粘度的变化而发生旋转，在旋转的过程中，双键和苯环会逐渐和邻菲罗啉平面重合，进而导致钌配合物的荧光逐渐增强，因此利用这一性质可以有效监测不同体系下的粘度变化；此外由于钌配合物的大平面芳环结构，使得其脂溶性较高，在细胞中可以靶向脂滴细胞器。
Description
技术领域
本发明属于芳香族环金属配合物荧光探针领域，具体涉及一种环金属钌配合物脂滴粘度探针及其制备方法和应用。
背景技术
粘度在自然界中普遍存在，根据粘度的不同，液体分为牛顿流体和非牛顿流体，粘度数值的大小直接影响流体扩算的速率。生物体中细胞间和细胞内的液体，因其粘度不同液体的流动性不同，尤其细胞内各个细胞器之间液体中有机物含量不同，导致各个细胞器之间流体的流动性差异很大，而细胞内氨基酸，核苷酸等生物分子的运载、合成几乎都需要各个细胞器之间流体的流动性作为动力运载，流体的流动性又和粘度密切相关，因此细胞内微小粘度的变化将会影响细胞的新陈代谢。现在越来越多的研究表明细胞内粘度的异常与许多疾病有关，尤其如肥胖，心血管疾病和癌症。有研究报道肥胖和心血管疾病产生的主要原因之一是细胞内脂滴的大量堆积和脂滴内粘度升高导致脂质代谢紊乱所致。脂滴是细胞内脂质存储和转运的场所，脂滴内粘度的变化直接影响脂质代谢，因此动态监测脂滴内粘度的微小变化对于理解肥胖和心血管疾病的发生具有重要的意义。
荧光成像技术作为目前非侵入式诊断的新型技术被越来越多的应用到生物疾病的诊断中，由于荧光成像具有便捷方便，非侵入式，背景信号低和灵敏度高等优点引起了人们的广泛关注，但目前用于荧光成像的分子大都是有机小分子，小分子荧光探针在使用过程中光谱稳定性较差，不能对生物样品进行长时间追踪，而金属配合物荧光探针则可以弥补上述缺陷，同时金属配合物荧光探针的斯托克斯位移大，合成简单等优势很有希望应用到生物成像中，但目前用金属配合物动态监测细胞内粘度变化的报道较少，所以，发展一种新型金属配合物基荧光探针对于动态监测脂滴内粘度变化具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种环金属钌配合物脂滴粘度探针及其制备方法和应用。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种环金属钌配合物脂滴粘度探针，其化学名称为肉桂醛邻菲罗啉-2,2-联吡啶钌配合物，简称为Ru(Phen-CA)3(PF6)2，结构式如式(I)如下：
一种如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，包括如下步骤：
1)邻菲罗林肉桂醛主配体的制备：首先称取1,10-邻菲罗林-5,6-二酮溶解在冰醋酸溶液中，再用移液枪量取肉桂醛溶液并溶解在上述冰醋酸溶液中，其中1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和肉桂醛的摩尔比为1：0.8-1.5；同时加入一定量的醋酸铵，且1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和醋酸铵摩尔比为1：20；
然后在115-120℃下回流3-5h进行反应，反应式如下：
反应结束后冷却到室温，用氨水进行中和；
最后过滤，用乙醇水溶液反复洗涤过滤物2-4遍，烘干得到邻菲罗林肉桂醛产物；
2)邻菲罗林钌配合物脂滴粘度探针的制备：首先称取步骤1)得到的邻菲罗林肉桂醛产物溶解在乙二醇溶液中，然后称取三氯化钌水合物加入到上述乙二醇溶液中，其中邻菲罗林肉桂醛产物和三氯化钌水合物中的三氯化钌的摩尔比为2.8-3.2:1；
然后然后在反应体系中加入催化剂，升温到130-140℃，在保护气体的保护下反应36-48h，反应式如下：
反应结束后冷却到室温，再把反应液缓慢滴加到冰水混合液中，产生棕黑色沉淀，过滤烘干后得到钌配合物粗产物；
最后通过纯化得到肉桂醛邻菲罗林钌配合物脂滴粘度探针。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤1)中，1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和肉桂醛的摩尔比为1:1.2。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤1)中，在118℃下回流4h进行反应。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤2)中，邻菲罗林肉桂醛产物和三氯化钌水合物中的三氯化钌的摩尔比为3：1。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤2)中，在135℃反应48h。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤2)中，催化剂为氯化锂。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤2)中，保护气体为氮气。
进一步地，如上所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，步骤2)中，纯化的步骤为：以中性氧化铝柱为分离的色谱柱，采用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为洗脱剂，逐渐加大甲醇的比例进行柱色谱分离，旋干洗脱剂得到肉桂醛邻菲罗林钌配合物。
本发明提供上述环金属钌配合物脂滴粘度探针在监测脂滴粘度变化方面的应用。
本发明荧光探针的识别机理如下：
由于探针是钌配合物具有八面体结构，钌配合物三边对称，结构中含有肉桂醛分子，肉桂醛中的苯环和双键与邻菲罗林大平面通过单键相连，在低粘度的环境中，苯环和双键可以自由旋转，使整个探针分子不共平面，探针几乎没有荧光即荧光处于“关闭”状态，当在粘度比较大的体系中，由于苯环和双键旋转受到抑制，使得苯环和双键以及单键相连的邻菲罗林大平面处于一个平面，使钌配合物中钌原子中的光子得以向配体进行跃迁产生荧光，即荧光开关被打开。所以，通过这种“开关型”荧光探针可以检测不同环境下的粘度。
本发明的有益效果是：
本发明所提供的区分不同粘度的荧光探针，可以选择性的靶向细胞中的脂滴，探针的光学稳定性和光谱接收范围较窄，能够和背景荧光有很好的区分，最重要的是探针能够对粘度有特异性响应；能够实现在细胞以及脂滴粘度(如斑马鱼内脂滴粘度)的动态长时间观测。同时，本发明提供了该探针的合成办法，步骤简单，纯化方便，探针的保存周期较长。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是邻菲罗林肉桂醛的质谱图；
图2是肉桂醛邻菲罗林钌配合物的质谱图；
图3是肉桂醛邻菲罗林钌配合物的1H NMR图；
图4是探针在不同粘度体系中的荧光光谱图；
图5是探针在细胞脂滴中的定位成像图；
图6是探针检测地塞米松刺激下细胞中粘度变化图；
图7是探针在细胞中监测内质网应激过程中脂滴粘度的变化图；
图8是探针在斑马鱼中的成像应用示意图一；
图9是探针在斑马鱼中的成像应用示意图二。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明先以邻菲罗啉-5,6-二酮和肉桂醛通过迈克尔加成反应制备出邻菲罗啉肉桂醛，然后加入三氯化钌，以乙二醇为溶剂制备出粘度响应具有脂滴细胞器靶向功能的钌配合物。由于钌配合物结构中含有三面对称的肉桂醛，而肉桂醛中的双键和苯环，会随着溶剂粘度的变化而发生旋转，在旋转的过程中，双键和苯环会逐渐和邻菲罗啉平面重合，进而导致钌配合物的荧光逐渐增强，因此利用这一性质可以有效监测不同体系下的粘度变化；此外由于钌配合物的大平面芳环结构，使得其脂溶性较高，在细胞中可以靶向脂滴细胞器，初步实验表明该发明的探针，能够在细胞和活体中动态监测脂滴细胞器中的粘度变化，并且观测到内质网应激过程中，脂滴粘度会逐渐变大，这对于了解细胞内部细胞器之间的关联提供可视化的手段，因此本发明的探针能够为了解细胞器之间的协作提供可视化和检测的方法。本发明的相关具体实施例如下：
实施例1
钌配合物荧光探针的合成：
1)化合物邻菲罗林肉桂醛的合成：
首先，将200mg的1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和1.46g的醋酸铵溶解在冰醋酸溶液中，然后称取143μL的肉桂醛溶液，加入到上述溶液中，然后用油浴118℃加热回流，反应约4h，反应结束后，往反应体系中加入15ml的蒸馏水，随后在搅拌下，加入氨水进行中和反应，用pH试纸进行测量，在中和的过程中会有沉淀产生，中和结束后，用抽滤漏斗进行抽滤得到粉红色固体，随后分别用蒸馏水和乙醇/水的混合溶剂体系进行洗涤三次。烘干得到邻菲罗林肉桂醛产物，质谱图如图1所示。
2)邻菲罗林肉桂醛钌配合物的合成：
称取200mg的邻菲罗林肉桂醛，溶解在1ml的乙二醇或者10ml的二甲基甲酰胺溶剂中，然后再称取43mg的三氯化钌水合物，溶解到上述溶剂中，随后在反应体系中加入催化剂量的氯化锂作为催化剂，升温到135℃，在氮气的保护下，反应48h，反应结束后把上述反应体系缓慢滴加到冰水混合液中，在滴加的过程中逐渐有棕黑色固体产生，滴加结束后，采用抽滤方式进行过滤，得到棕黑色滤饼。紧接着以中性氧化铝柱为分离的色谱柱，采用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为洗脱剂，逐渐加大甲醇的比例，分离提纯后得到邻菲罗林钌配合物的产物。即本发明的最终探针，探针的质谱图如图2所示，1H NMR谱如图3所示，
实施例2
钌配合物荧光探针在不同粘度体系中的荧光光谱：
配制浓度为10mM实施例1所得的钌配合物荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。测试液中，分别取1ml不同比例甘油与甲醇的溶剂(甘油：甲醇＝0:10,1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,10:0)，然后加入探针母液(终浓度为10μM)，进行荧光光谱扫描(激发波长为488nm，检测波长为520-700nm)，测定各体系中相对荧光强度，如图4所示。由图4可知，随着溶剂粘度的增加，相对荧光强度变强。
实施例3
荧光探针在细胞中脂滴共定位成像：
配制浓度为10mM实施例1中所制备的荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的母液，放置在4℃保存待用。
将适当密度的MCF-7细胞接种灭菌的共聚焦培养皿中，在二氧化碳培养箱中(培养条件为37℃，5％的CO2)，培养，等到细胞贴壁后，像细胞培养瓶中加入本发明制备的荧光探针和商用的脂滴探针BODIPY，使荧光探针的最终浓度为10μM，脂滴探针的最终浓度为5μM。探针孵育8h后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，随后进行荧光共定位成像，(激发波长为488nm，绿色通道：500-540nm，红色通道：600-640nm)。同时按照上述方法，分别用线粒体探针和溶酶体探针进行测定本发明的荧光探针不在溶酶体和线粒体中。结果如图5所示，其中(a)图为脂滴共定位成像图，(b)图为溶酶体荧光共定位图，(c)图为线粒体共定位成像图。从图6中可以看出该探针如脂滴探针的绿色荧光有较好的重叠，但与线粒体或者溶酶体的荧光没有重叠，说明本发明的探针主要定位在脂滴中，可以用于监测脂滴细胞器的粘度变化。
实施例4
荧光探针在外界刺激下监测细胞内粘度变化：
配制浓度为10mM实施例1中所制备的荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的母液，放置在4℃保存待用。
首先将适当密度的MCF-7细胞接种到灭菌的共聚焦培养皿中，在二氧化碳培养箱中(培养条件为37℃，5％的CO2)，培养，等到细胞贴壁后，把细胞分成两组，第一组加入本发明制备的荧光探针，第二组加入本发明制备的荧光探针，等两组探针分别孵育8h后洗去培养基，然后用PBS洗涤三遍，再重新加入培养基，然后在第二组细胞中加入5μM的细胞粘度刺激剂地塞米松，继续孵育6h后，洗去培养基，再洗涤三遍，然后加入少量的培养基。直接用激光共聚焦进行拍照。激发波长为488nm接收范围为600-640nm。分别每隔半小时进行拍照一次，总共连续追踪2h。从图6可以看出，第一组在没有加细胞粘度刺激剂下，荧光强度几乎保持不变，而第二组加入刺激剂后，随着时间的增加，细胞内红色荧光的强度逐渐增强，在拍照两小时后达到最大。因此初步验证该荧光探针能够实时监测细胞中粘度的变化。
实施例5
荧光探针在内质网应激刺激下监测细胞内脂滴粘度变化：
配制浓度为10mM实施例1中所制备的荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的母液，放置在4℃保存待用。
首先将适当密度的MCF-7细胞接种到灭菌的共聚焦培养皿中，在二氧化碳培养箱中(培养条件为37℃，5％的CO2)，培养，等到细胞贴壁后，在细胞中都加入该探针，继续在培养箱中进行孵育8h，孵育结束后，先洗去培养基，并用PBS洗涤细胞三次，然后再重新加入培养基，在第二组细胞中加入内质网应激刺激剂衣霉素，衣霉素能够刺激内质网产生显著的应激，有研究报道，当细胞产生内质网应激过程中，细胞中胆固醇的含量会增加，而脂滴是胆固醇储存场所，因此在内质网应激下，脂滴中胆固醇的含量会升高，相应的脂滴中的粘度也会增加。再加入衣霉素后，直接进行共聚焦拍照，拍照时间按照加入衣霉素的时间为0min、30min、60min、90min和120min。结果如图7所示，从图中可以看出，在没有加入衣霉素的时候(0min)该探针在细胞中的红色荧光比较弱，但随着时间的增加，细胞中的红色荧光强度逐渐增加，并且呈现出点状分布，结合脂滴的共定位实验，可以得出该探针可以实时监测追踪内质网应激过程中脂滴粘度的变化，这对于理解内质网应激下，脂滴细胞器中的粘度变化，提供了一种检测方法。
实施例6
荧光探针在斑马鱼中的成像：
配制浓度为1mM实施例1中所制备的荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的母液，放置在4℃保存待用。
将购买的斑马鱼放入到10cm的培养皿中进行培养，培养条件为常氧，37℃。将斑马鱼分成两组，第一组只加入该探针，第二组在加入该探针的过程中，还要加入内质网应激刺激剂衣霉素，在加药结束后，继续培养孵育8h，孵育结束后，直接用激光共聚焦进行拍照，激发波长为488nm，接收范围为600-640nm。成像结果如图8和9所示，通过比较分析可以看出，在只有该探针的斑马鱼中，红色荧光比较弱，而在加有衣霉素刺激下的斑马鱼体内尤其尾部发出强烈的红色荧光，因此可以证明该探针可以在斑马鱼等活体上，进行实时监测活体内部的粘度变化。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (8)
1.一种环金属钌配合物脂滴粘度探针，其特征在于，其化学名称为肉桂醛邻菲罗啉-2,2-联吡啶钌配合物，结构式如式（I）如下：
2.一种如权利要求1所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）邻菲罗林肉桂醛主配体的制备：首先称取1,10-邻菲罗林-5,6-二酮溶解在冰醋酸溶液中，再用移液枪量取肉桂醛溶液并溶解在上述冰醋酸溶液中，其中1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和肉桂醛的摩尔比为1：0.8-1.5；同时加入一定量的醋酸铵，且1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和醋酸铵摩尔比为1：20；
然后在115-120℃下回流3-5h进行反应，反应结束后冷却到室温，用氨水进行中和；
最后过滤，用乙醇水溶液反复洗涤过滤物2-4遍，烘干得到邻菲罗林肉桂醛产物；
2）邻菲罗林钌配合物脂滴粘度探针的制备：首先称取步骤1）得到的邻菲罗林肉桂醛产物溶解在乙二醇或二甲基甲酰胺溶剂中，然后称取三氯化钌水合物加入到上述溶剂中，其中邻菲罗林肉桂醛产物和三氯化钌水合物中的三氯化钌的摩尔比为2.8-3.2：1；
然后在反应体系中加入催化剂，催化剂为氯化锂，升温到130-140℃，在保护气体的保护下反应36-48h，反应结束后冷却到室温，再把反应液缓慢滴加到冰水混合液中，产生棕黑色沉淀，过滤烘干后得到钌配合物粗产物；
最后通过纯化得到肉桂醛邻菲罗林钌配合物脂滴粘度探针。
3.根据权利要求2所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于：步骤1）中，1,10-邻菲罗林-5,6-二酮和肉桂醛的摩尔比为1：1.2。
4.根据权利要求2所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于：步骤1）中，在118℃下回流4h进行反应。
5.根据权利要求2所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于：步骤2）中，邻菲罗林肉桂醛产物和三氯化钌水合物中钌的摩尔比为3：1。
6.根据权利要求2所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于：步骤2）中，在135℃反应48h。
7.根据权利要求2所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于：步骤2）中，保护气体为氮气。
8.根据权利要求2所述环金属钌配合物脂滴粘度探针的制备方法，其特征在于：步骤2）中，纯化的步骤为：以中性氧化铝柱为分离的色谱柱，采用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为洗脱剂，逐渐加大甲醇的比例进行柱色谱分离，旋干洗脱剂得到肉桂醛邻菲罗林钌配合物。
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