CN113620997A

CN113620997A - 一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备及应用

Info

Publication number: CN113620997A
Application number: CN202110919035.5A
Authority: CN
Inventors: 杨刚刚; 胡晓军; 徐霞; 张楷
Original assignee: Anhui University of Technology AHUT
Current assignee: Anhui University of Technology AHUT
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2021-11-09

Abstract

本发明属于有机金属配合物分子荧光探针技术领域，具体涉及一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备及应用，先以三氯化铱和2‑氨基吡啶为原料，用乙二醇乙醚和水为溶剂合成环金属铱配合物；以4‑羟基‑3‑硝基苯甲醛、1,10‑菲啰啉‑5,6‑二酮、醋酸氨为原料，冰醋酸为溶剂，反应得到邻菲啰啉‑聊肉桂醛配体；然后以金属铱配合物、邻菲啰啉‑聊肉桂醛配体为反应物，以二氯甲烷和甲醇作为反应溶剂，反应得到邻羟基硝基苯‑邻菲罗啉‑铱配合物产物，分离提纯即得邻羟基硝基苯‑邻菲罗啉‑铱配合物。本发明邻羟基铱配合物的荧光光谱在一氧化碳体系中发生红移，荧光强度随浓度逐渐增加，荧光不随溶剂极性，氨基酸和体内常见离子而变化。

Description

一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备及应用

技术领域

本发明属于有机金属配合物分子荧光探针技术领域，具体涉及一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备及应用。

背景技术

粘度在自然界中普遍存在，根据粘度的不同，液体分为牛顿流体和非牛顿流体，粘度数值的大小直接影响流体扩算的速率。生物体中细胞间和细胞内的液体，因其粘度不同液体的流动性不同，尤其细胞内各个细胞器之间液体中有机物含量不同，导致各个细胞器之间流体的流动性差异很大，而细胞内氨基酸，核苷酸等生物分子的运载、合成几乎都需要各个细胞器之间流体的流动性作为动力运载，流体的流动性又和粘度密切相关，因此细胞内微小粘度的变化将会影响细胞的新陈代谢。现在越来越多的研究表明细胞内粘度的异常与许多疾病有关，尤其如肥胖，心血管疾病和癌症。有研究报道肥胖和心血管疾病产生的主要原因之一是细胞内脂滴的大量堆积和脂滴内粘度升高导致脂质代谢紊乱所致。脂滴是细胞内脂质存储和转运的场所，脂滴内粘度的变化直接影响脂质代谢，因此动态监测脂滴内粘度的微小变化对于理解肥胖和心血管疾病的发生具有重要的意义。

荧光成像技术作为目前非侵入式诊断的新型技术被越来越多的应用到生物疾病的诊断中，由于荧光成像具有便捷方便，非侵入式，背景信号低和灵敏度高等优点引起了人们的广泛关注，但目前用于荧光成像的分子大都是有机小分子，小分子荧光探针在使用过程中光谱稳定性较差，不能对生物样品进行长时间追踪，而金属配合物荧光探针则可以弥补上述缺陷，同时金属配合物荧光探针的斯托克斯位移大，合成简单等优势很有希望应用到生物成像中，但目前用金属配合物动态监测细胞内粘度变化的报道较少，所以，发展一种新型金属配合物基荧光探针对于动态监测脂滴内粘度变化具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备及应用。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针，其名称为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物，结构式如式(I)所示：

一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)三氯化铱、2-氨基吡啶以乙二醇乙醚和水为溶剂，在130-140℃下反应12-36h，加热反应后得到如式(II)所示的环金属铱配合物，反应式如下：

2)4-羟基-3-硝基苯甲醛、1,10-菲啰啉-5,6-二酮与醋酸氨以冰醋酸为溶剂，在110-120℃下反应3-7h，加热反应后冷却到室温，然后加入少量蒸馏水，缓慢滴加氨水并且搅拌，调节pH至7，过滤得到橘黄色沉淀，及如式(III)所示的邻菲啰啉-聊肉桂醛配体，反应式如下：

3)以二氯甲烷和甲醇为溶剂，将式(II)所示的环金属铱配合物、式(III)所示的邻菲啰啉-聊肉桂醛配体溶于溶剂中，加热反应，反应结束后旋蒸干溶剂；再通过分离提纯得到如式(I)所示的邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物，反应式如下：

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤1)中，三氯化铱与2-氨基吡啶的摩尔比为1:2；溶剂中乙二醇乙醚和水的体积比为3:1。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤1)中，加热反应的温度为135℃，反应时间为24h。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤2)中，4-羟基-3-硝基苯甲醛、1,10-菲啰啉-5,6-二酮与醋酸氨的摩尔比为1:1:1.2。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤2)中，加热反应的温度为118℃，反应时间为5h。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤3)中，式(II)所示的环金属铱配合物、式(III)所示的邻菲啰啉-聊肉桂醛配体的摩尔比为1:1；溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤3)中，加热反应的温度为118℃，反应时间为5h。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，步骤3)中，分离提纯的步骤为：对反应液减压蒸馏，然后干法上样并通过硅胶柱层析，以二氯甲烷、甲醇的混合液作为淋洗剂。

进一步地，如上所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针在检测溶液和细胞中CO含量方面的应用。

本发明中荧光探针的识别机理如下：

本发明运用芳香硝基会被一氧化碳还原为氨基的机制，设计了邻羟基硝基铱配合物，邻羟基铱配合物的荧光光谱在一氧化碳体系中发生红移，荧光强度随浓度逐渐增加，并且邻羟基铱配合物的荧光不随溶剂极性，氨基酸和体内常见离子而变化，初步实现对一氧化碳浓度的检测。识别反应如下：

本发明的有益效果是：

邻羟基铱配合物的荧光光谱在一氧化碳体系中发生红移，荧光强度随浓度逐渐增加，并且邻羟基铱配合物的荧光不随溶剂极性，氨基酸和体内常见离子而变化，荧光强度较好，持续时间长，稳定性好等。而且检测荧光所需的荧光化学传感器是一种灵敏度高、选择性和重现性好测量装置，正常情况下不会产生误差。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉配体质谱图；

图2为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物质谱图；

图3为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉¹H NMR谱图；

图4为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物的¹H NMR谱图；

图5为邻羟基铱配合物在不同溶剂中的荧光强度示意图；

图6为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物对CO浓度的响应图；

图7为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物供体与低浓度一氧化碳供体反应后的荧光强度示意图；

图8为细胞中主要氨基酸对邻羟基铱配合物荧光强度的干扰测定示意图；

图9为不同pH条件下加入CO供体后邻羟基铱配合物荧光性能的变化示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明先以三氯化铱和2-氨基吡啶为原料，用乙二醇乙醚和水为溶剂合成环金属铱配合物；以4-羟基-3-硝基苯甲醛、1,10-菲啰啉-5,6-二酮、醋酸氨为原料，冰醋酸为溶剂，反应得到邻菲啰啉-聊肉桂醛配体；然后以金属铱配合物、邻菲啰啉-聊肉桂醛配体为反应物，以二氯甲烷和甲醇作为反应溶剂，反应得到邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物产物，最后以二氯甲烷/甲醇(V:V＝50:1)为淋洗剂通过柱层析得到纯净的邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物。对于金属铱，它的磷光寿命较长，其斯托克斯位移大，荧光稳定。同时因为固有的化学性质，导致其形成的配合物较难分解，不能与机体内多种生物分子相互作用，而邻羟基硝基苯-邻菲罗啉铱配合物的荧光光谱在一氧化碳体系中会发生红移，荧光强度随浓度逐渐增加，并且邻羟基铱配合物的荧光不随溶剂极性，氨基酸和体内常见离子而变化，荧光强度较好，持续时间长，稳定性好等。所以通过一氧化碳可以将硝基还原成氨基的机理，将含有硝基的基团和金属铱形成配合物来用于检测一氧化碳，为一氧化碳的可视化检测提供了一种方法。

本发明实施例中所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。

本发明的相关具体实施例如下：

实施例1

邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物荧光探针的合成：

称取三氯化铱200mg，2-氨基吡啶52mg(48μL)于100ml圆底烧瓶中，加入15ml乙二醇乙醚和5ml水为溶剂，反应温度135℃，冷凝回流。反应时间为24h。反应结束后，冷却至室温，超声、抽滤，得到黄绿色固体，最后使用蒸馏水洗涤后烘干，得到环金属铱配合物；

称取4-羟基-3-硝基苯甲醛150mg，1,10-菲啰啉-5,6-二酮158mg，醋酸氨1160mg于烧瓶中，加入15ml冰醋酸作为溶剂，反应温度118℃，冷凝回流。反应时间为5h，反应结束后，冷却到室温，加入少量蒸馏水，向烧瓶中缓慢滴加氨水，调节pH至7，边加氨水边搅拌，烧瓶中有大量橘黄色沉淀析出。过滤，再用蒸馏水洗涤两次，烘干后得到邻菲啰啉-聊肉桂醛配体；

称取环金属铱配合物，72mg，邻菲啰啉-聊肉桂醛配体，108mg于烧瓶中，加入20ml二氯甲烷和20ml甲醇作为反应溶剂，反应温度控制在70℃，冷凝回流。反应时间为12h，反应结束后，超声，加入少量硅胶，旋蒸干溶剂干法上样，以二氯甲烷/甲醇(V:V＝50:1)为淋洗剂通过柱层析得到纯净的邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物-铱配合物溶液。再将溶液干燥后，得到纯净的橘黄色羟基铱配合物。

质谱谱图，¹H NMR谱图分别见图1-图4所示，邻羟基硝基苯-邻菲罗啉配体(图1)的理论分子质量为357，而实际为358，质谱图在358和714处有一倍和两倍峰。邻羟基铱配合物(图2)的理论分子质量为857，实际质谱图为858，也可大致确定是正确的合成产物。

实施例2

邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物荧光探针在不同溶剂中的荧光强度:

称取0.5mg邻羟基铱配合物溶于615μL二甲基亚砜中得到1mmol/L的邻羟基铱配合物母液。取4μL邻羟基铱配合物母液(1mmol/L)于离心管中，分别加入二氯甲烷，乙腈，二甲基亚砜，二氧六环，甲醇，定容到100μL，将离心管中的液体转移到96孔黑板中使用酶标仪进行应该分析(固定激发:405nm，发射开始:450nm，停止:700nm，步骤:2nm)。其中，溶剂为二氯甲烷的溶液具有极强的腐蚀性，96孔板被腐蚀较为严重，所以取消对二氯甲烷的检测。检测完荧光强度后，立刻将黑板中的液体转移到透明96孔透明板中测试紫外吸收。

结果如图5所示，邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物在二甲基亚砜溶剂中，荧光的强度会有显著增强，而在其它的溶剂中，荧光强度和水相中几乎相同。

实施例3

一氧化碳刺激下邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物的荧光和紫外吸收光谱测定:

称取0.5mg邻羟基铱配合物溶于615μL甲醇中得到1mmol/L的羟基铱配合物母液。取5mg三羰基二氯代钌二聚物溶于974μL二甲基亚砜中得到10mmol/L的三羰基二氯代钌二聚物溶液母液。

1、不同浓度，取三个1.5ml离心管，编号1，2，3。在编号1中加入20μL邻羟基铱配合物母液，30μL甲醇，50μL二甲基亚砜和400μL蒸馏水；编号2中加入20μL羟基铱配合物母液，30μL甲醇，2μL三羰基二氯代钌二聚物(10mmol/L)，48μL二甲基亚砜和400μL蒸馏水；编号3中加入20μL羟基铱配合物母液，30μL甲醇，20μL三羰基二氯代钌二聚物母液(10mmol/L)，30μL二甲基亚砜和450μL蒸馏水，得到三个甲醇：二甲基亚砜：水＝1:1:8的溶液。再取三个1.5ml离心管，编号4，5，6。将这六个离心管置于37℃水浴锅中恒温30分钟后，取每个离心管中100μL液体于96孔黑板中，用酶标仪检测其荧光强度(固定激发:405nm，发射开始:450nm，停止:700nm，步骤:2nm)。

2、三羰基二氯代钌浓度梯度，取16个离心管，在各离心管中加入20μL羟基铱配合物母液(1mmol/L)，30μL甲醇，400μL水，并依次加入0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30μL三羰基二氯代钌二聚物母液(10mmol/L)，依次加入50，48，46，44，42，40，38，36，34，32，30，28，26，24，22，20μL二甲基亚砜，构建甲醇：二甲基亚砜：水＝1：1：8的液相环境并得到羟基铱配合物40μmol/L,三羰基二氯代钌二聚物0，40，80，120，160，200，240，280，320，360，400，440，480，520，560，600μmol/L的溶液500μL。将所得离心管置于37℃水浴30分钟后，每份取100μL于96孔黑板中检测荧光(固定激发:405nm发射开始:450nm，停止:700nm，步骤:2nm)。

数据结果如图6-图7所示，在水相中，三羰基二氯代钌二聚物的浓度0，40，400μmol/L，羟基铱配合物为40μmol/L。羟基铱配合物在加入一氧化碳供体后，首先在470nm左右的峰随着浓度的增加峰值越来越小，而在615nm处从没有峰到峰的峰值越来越大。将一氧化碳供体的浓度调整为铱配合物浓度的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15倍后，羟基铱配合物在与一氧化碳结合后，在波长470nm左右处的峰随着一氧化碳的浓度增加而降低，而在波长615nm处会出现一个新的峰。将一氧化碳供体的浓度再下降，羟基铱配合物和一氧化碳供体的浓度比例依次为10:1，10:2，10:3，10:4，10:5，10:6，10:7，10:8，10:9。

实施例4

细胞中主要氨基酸对邻羟基铱配合物荧光强度的干扰测定：

测试的氨基酸种类分别为谷氨酸，甘氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，组氨酸和亮氨酸。将上述氨基酸使用二甲基亚砜配置成1mmol/L的母液。羟基铱配合物：取10个离心管加入4μL羟基铱配合物母液(1mmol/L)，分别标记1到10，其中第一组和第十组是空白组(不加其它物质)和对照组(加入一氧化碳供体)，2-8号分别加入谷氨酸，甘氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，组氨酸和亮氨酸。最后离心管中所得的溶液的各组分浓度都为40μmol/L。体系中甲醇：二甲基亚砜：水＝1：1：8。每个离心管取出100μL于96孔黑板中进行荧光检测(固定激发:405nm发射开始:450nm，停止:700nm，步骤:2nm)。

结果如图8所示，细胞中含有大量氨基酸，所以需要检测氨基酸会不会影响铱配合物的荧光强度，将40μmol/L的铱配合物置于100μmol/L的谷氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，组氨酸，亮氨酸的溶液中进行荧光检测，其他氨基酸对羟基铱配合物的影响比较小，而羟基铱配合物在组氨酸溶液中470nm处的荧光强度有了很大的加强，可能是由于组氨酸为碱性，羟基铱配合物在微碱性下的荧光强度有很明显的提高。

实施例5

不同pH条件下加入CO供体后邻羟基铱配合物荧光性能的变化：

使用pH＝4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的pH缓冲液作为水相，配置出40μmol/L氨基铱配合物溶液，再配置一组40μmol/L氨基铱配合物溶液中加入三羰基二氯代钌二聚物后，浓度为40μmol/L。其中，甲醇：二甲基亚砜：水＝1:1:8。将所得溶液37℃恒温30分钟后，每份取100μL于96孔黑板中测荧光强度(固定激发:405nm发射开始:450nm，停止:700nm，步骤:2nm)

结果如图9所示，加入一氧化碳供体后，羟基铱配合物会在pH＝5.5左右会在波长475nm处的荧光强度有很明显的提升，而在其它pH中，荧光强度会比不加供体的稍弱。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims

1.一种环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针，其特征在于，其名称为邻羟基硝基苯-邻菲罗啉-铱配合物，结构式如式(I)所示：

2.一种如权利要求1所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中，三氯化铱与2-氨基吡啶的摩尔比为1：2；溶剂中乙二醇乙醚和水的体积比为3：1。

4.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中，加热反应的温度为135℃，反应时间为24h。

5.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)中，4-羟基-3-硝基苯甲醛、1,10-菲啰啉-5,6-二酮与醋酸氨的摩尔比为1：1：1.2。

6.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)中，加热反应的温度为118℃，反应时间为5h。

7.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3)中，式(II)所示的环金属铱配合物、式(III)所示的邻菲啰啉-聊肉桂醛配体的摩尔比为1：1；溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1。

8.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3)中，加热反应的温度为118℃，反应时间为5h。

9.根据权利要求2所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3)中，分离提纯的步骤为：对反应液减压蒸馏，然后干法上样并通过硅胶柱层析，以二氯甲烷、甲醇的混合液作为淋洗剂。

10.如权利要求1所述环金属铱配合物比率型一氧化碳荧光探针在检测溶液和细胞中CO含量方面的应用。