CN111518083A - 一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种检测一氧化碳(CO)的打开型荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：
Figure DDA0002508018050000011
本发明提供了以2‑氨基‑5‑氯苯甲酰胺、4‑羟基间苯二甲醛、3‑乙基‑1,1,2‑三甲基‑1H‑苯并[e]吲哚‑3‑鎓、烯丙基氯甲酸酯等为原料合成该荧光探针的制备方法；我们认为该荧光探针有着良好的光谱响应性能。该探针的检测范围较宽，检测限也较低，从而说明该探针可以高灵敏的检测CO；该探针对于CO的选择性好，且其与CO反应时并不受其他活性物质的影响如活性氧、活性氮、活性硫以及生物硫醇等；且该探针响应时间在120s以内，其与CO反应较为迅速；该荧光探针能监控细胞内CO含量的变化。

Description

一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的制备和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的制备和应用。
背景技术
众所周知，一氧化碳(CO)对于人类和动物具有高毒性和致命性。然而，最新的研究表明，CO可以通过血红素和血红素加氧酶的相互作用不断产生，因此它在我们体内可作为一个重要的气体信号分子(L. Wu,R.Wang,Pharmacol.Rev.,2005,57,585-630)。由于要维持其正常的生物学功能，例如抗炎，降低血压等等，因此人们认为在生理环境中一氧化碳的生理浓度需要被严格调控(E.Bathoorn,D.-J.Slebos,D. Postma,G.Koeter,A.Oosterhout,M.Toorn,H.Boezen,H.Kerstjens,Eur.Respir.J.,2007,30,1131-1137；R.Motterlini,L.E.Otterbein,Nat.Rev.DrugDiscov.,2010,9,728-743)。一氧化碳的异常水平浓度与某些严重疾病息息相关，如高血压，阿尔茨海默氏病，氧化应激和心力衰竭等。(F.Wattel,R.Favory,S.Lancel,R. Neviere,D.Mathieu,Bull.Acad.Natl.Med.,2006,190,1961-1975；D.Premkumar,M.Smith,P.Richey,R. Petersen,R.Castellani,R.Kutty,J.Neurochem.,1995,65,1399-1402；R.Schroeder,C.Ewing,J.Sitzmann,P. Kuo,Dig.Dis.Sci.,2000,45,2405-2410；I.Lee,S.Luo,C.Lee,S.Wang,C.Lin,C.Chang,Am.J.Pathol.,2009, 175,519-532；V.Raju,N.Imai,C.Liang,J.Mol.Cell.Cardiol.,1999,31,1581-1589)。因此，我们认为，CO 的检测对于CO的生物学功能在生物系统中的研究是相当重要的。
近年来，由于荧光探针具有方便，灵敏和无创等优点，因此荧光检测成为了一种可监测和检测各种生物学重要分子的强大工具(Y.Tang,D.Lee,J.Wang,G.Li,J.Yu,W.Lin,J.Yoon,Chem.Soc.Rev.,2015,46, 5003-5015)，然而，到目前为止，用荧光来检测生命系统中的CO仍处于起步阶段(L.Yuan,W.Lin,L.Tan, K.Zheng,W.Huang,Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,1628-1630；X.Zhou,S.Lee,Z.Xu,J.Yoon,Chem.Rev., 2015,115,7944-8000；C.Marín-Hernández,A.Toscani,F.Sancenón,J.D.E.T.Wilton-Ely,R.Martínez-Mánez,Chem.Commun.,2016,52,5902-5911)。在过去的十年中，尽管已经开发出了几种用于检测生命系统中CO 的荧光检测系统(C.W.Rogers,M.O.Wolf,Angew.Chem.Int.Ed.,2002,41,1898-1900；K.M.Matkovich,L.M. Thorne,M.O.Wolf,T.C.S.Pace,C.Bohne,B.O.Patrick,Inorg.Chem.,2006,45,4610-4618)但是直到最近几年，人们才解决了在生命系统中如何用荧光来检测CO这一问题。然而，以上所提到的大部分探针仍会显示出某些缺陷以及不足之处，例如合成难度较大，分辨探针检测前后颜色或发射的变化较为困难，探针对于 CO的选择性较差，响应时间较长或需要使用紫外光(400nm)来进行激发等(C.Marín-Hernández,A.Toscani, F.Sancenón,J.D.E.T.Wilton-Ely,R.Martínez-Mánez,Chem.Commun.,2016,52,5902-5911)。因此，很显然，我们迫切需要开发新的荧光检测系统来改善CO的传感性能。
据我们了解，目前而言荧光探针领域中应用较为广泛且较为新颖的一类染料是一种基于HPQ的荧光染料，它能显示出类似于四苯乙烯的强烈固态荧光(J.Mei,N.L.Leung,R.T.Kwok,J.W.Lam,B.Z.Tang, Chem.Rev.,2015,115,11718-11940；D.Ding,K.Li,B.Liu,B.Z.Tang,Acc.Chem.Res.,2013,46,2441-2453； R.T.Kwok,C.W.Leung,J.W.Lam,B.Z.Tang,Chem.Soc.Rev.,2015,44,4228-4238；J.Liang,G.Feng,R.T. K.Kwok,D.Ding,B.Tang,B.Liu,Sci.China:Chem.,2016,59,53-61；Y.Zhang,X.Huang,W.Liu,G.Zhang,D.Zhang,X.Jiang,Sci.China:Chem.,2016,59,106-113)。然而，它的最大激发波长仅为350nm。由于激发波长太短，所以此染料并不特别适合使用共聚焦显微镜来进行荧光成像。因此，本文设计了一种新型荧光团通过将发光染料3-(6-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-4-羟基苯甲醛(HPQ-CHO)上用双键连接一个3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓而设计合成，并以此来延长染料的波长。据报道，利用HPQ染料所合成的荧光探针已经成功检测了许多被测物，如碱性磷酸酶(ALP),β-半乳糖苷酶，γ-谷氨酰转肽酶(GGT) 等(HW Liu,K Li,X X Hu,Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,11788-11792；W Yang,X Zhao,JZhang,Dyes Pigments.,2018,156,100-107；J Ou-Yang,YF Li,PWu,ACSsens.,2018,3,1354-1361)。但是，还没有基于 HPQ的新型荧光团所合成的荧光探针被用于检测CO，因此设计和合成一种检测CO的新型荧光探针是有必要的。
发明内容
根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种检测一氧化碳的打开型荧光探针。
本发明的技术方案是，一种检测一氧化碳的打开型荧光探针，其结构式如下：
Figure BDA0002508018030000021
一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的制备方法。步骤如下：
1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的3-(6-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-4羟基苯甲醛(HPQ-CHO) 和1～1.5当量的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓溶解到10～15mL甲苯中，加入0.5mL哌啶，0.5mL 乙酸，反应混合物在常温以及氮气保护下搅拌过夜，停止反应，然后将反应溶液用饱和食盐水和CH2Cl2萃取，取下层有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗产品用体积比为100:1～100:4的CH2Cl2/CH3OH洗脱剂进行柱层析，得到绿色固体化合物Ct-OH(产率50％)。
2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的化合物Ct-OH，10当量的烯丙基氯甲酸酯以及2当量的三乙胺在 0℃冰浴，氮气保护的条件下溶解到15～25mL的无水二氯甲烷中，过夜，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到淡黄色固体产物(产率60％)，即为所述的荧光探针Ct-CO。
本发明的有益效果是，一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。荧光探针本身或加入Pd2+之后，在605nm处没有明显的发射峰；当探针同时加入Pd2+和CO之后，在605nm处出现了明显的发射峰。并且随着CO浓度的增大，探针的荧光强度不断增强。该探针的检测范围从1.0μM到100μM，检测限为0.35μM，这说明该探针可以高灵敏的检测CO。紧接着，可以来研究探针的紫外吸收光谱。探针本身是没有吸收带的；当加入Pd2+之后，其吸收峰并没有明显的改变；然而同时加入Pd2+和CO之后，能发现在570nm附近有出现新的强紫外吸收峰。然后，研究探针的选择性。本文考察了探针与活性氧(H2O2,ONOO-,·OH,ClO-,ROO·,O2 -)，活性氮(NO,NO2 -,NO3 -)，活性硫(H2S,SO3 2-,HSO3 -,SO4 2-)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)之间的荧光响应情况。结果发现，只有在加入CO时，能引起探针的荧光光谱的改变，在605nm附近出现的新的强荧光发射峰，而其他检测物对探针的荧光光谱并没有明显的影响。最后，本文还研究了pH值对于荧光探针测定CO的影响，当pH值在7.0到8.0之间时，并不影响荧光探针对CO的测定。此外，该荧光探针的响应时间在120s以内。
一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的应用。当我们仅在细胞中加入荧光探针时，可以发现红色通道中是几乎没有荧光的。当我们在细胞中同时加入荧光探针和Pd2+时，可以发现红色通道中同样没有明显的荧光变化，这个结果可以说明细胞中的CO含量是较低的。然而，当细胞先与CO释放剂50μM(CORM-3) 共同培养30min，随后在细胞中加入荧光探针和Pd2+共同孵育后，细胞开始呈现出强烈的红色荧光(图9c)，这些结果表明，探针可以应用于活体细胞成像CO。最后，细胞先用血红素(Heme)处理，刺激细胞内 CO的产生，然后加入Pd2+同时用探针染色，检测到细胞内出现了较为强烈的红色荧光信号(图9d)。我们从红色通道中细胞荧光发射强度的定量柱状图(图9E)中也可以看出相同结论。这些结果说明荧光探针能监控细胞内CO含量的变化，这为监控人体内和一氧化碳相关病变提供一种可靠的手段。
附图说明
图1为荧光探针的合成路线。
图2为荧光探针与不同浓度的CO作用后的荧光光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针和Pd2+的浓度均为10μM，CO浓度分别为：0,1.0,5.0,10, 15,20,25,30,40,50,60,75,90,100μM。荧光激发波长为570nm。
图3为荧光探针对不同CO浓度的荧光线性响应图。
图4为荧光探针与Pd2+，CO作用后的紫外可见吸收光谱图。
图5为荧光探针的选择性图。
荧光探针和Pd2+的浓度均为10μM，CO浓度为50μM，其它分析物浓度均为200μM。
图6为pH对荧光探针的影响图。
图7为荧光探针与CO作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。
图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
图9荧光探针与CO作用的细胞成像图。(a)细胞用探针染色0.5h。(b)细胞同时用探针和Pd2+染色0.5h。(c)细胞先用CO释放剂(50μM)培养30min，随后同时用探针和Pd2+染色0.5h。(d)细胞用Heme处理4h，然后同时用探针和Pd2+染色0.5h。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：
荧光探针的合成
合成路线如图1。化合物Ct-OH的合成：在100mL的圆底烧瓶中，将3-(6-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-4羟基苯甲醛(HPQ-CHO)(0.30g,1.0mmol)和3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓(0.35g, 1.0mmol)溶解到10mL甲苯中，在常温以及氮气保护的条件下，用1mL针管先加入0.5mL哌啶，之后再用1mL针管加入0.5mL乙酸，反应混合物搅拌过夜后停止反应，然后将反应溶液用饱和食盐水和CH2Cl2萃取，取下层有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干后，粗产品可以采用体积比为100:1～100:4的 CH2Cl2/CH3OH洗脱剂来进行柱层析，从而得到绿色固体化合物(0.32g，产率50％)，即为化合物Ct-OH。
CO荧光探针(Ct-CO)的合成：在100mL的双口圆底烧瓶中，将化合物Ct-OH(0.32g,0.5mmol)，烯丙基氯甲酸酯(0.60g,5.0mmol)和三乙胺(0.10g,1.0mmol)在0℃冰浴，氮气保护的条件下溶解到20mL无水二氯甲烷中，反应混合物溶液在室温下搅拌过夜后，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，从而得到淡黄色固体产物(0.21g，产率60％)，即为荧光探针。1H NMR(400MHz, DMSO,ppm):δ8.47(d,J＝15.5Hz,1H),8.32(d,J＝8.6Hz,1H),8.14(dd,J＝19.3,8.5Hz,3H),8.01(d,J＝2.2Hz, 1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.86–7.65(m,3H),7.60(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(d,J＝15.6Hz,1H),6.72(d,J＝9.0 Hz,1H),5.33–5.06(m,1H),4.86(d,J＝6.7Hz,2H),4.62(d,J＝7.2Hz,2H),4.29(d,J＝7.7Hz,2H),2.00(s,6H), 1.42(t,J＝7.0Hz,3H),1.11–0.87(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO,ppm):δ182.19,174.77,167.43,165.19, 160.79,154.36,153.65,152.95,145.09,138.66,135.38,133.48,133.18,131.98,131.61,130.49,130.08,129.15, 128.82,127.47,127.26,125.95,125.59,123.52,122.53,119.76,115.42,113.49,109.81,107.91,70.24,54.09, 45.50,29.51,14.33.MS(TOF):604.30.
实施例2：
荧光探针和CO溶液配制
探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成1×10-4M的探针溶液。PdCl2溶液的制备：同时称取一定量PdCl2溶解在二次蒸馏水中，配成1×10-4M的储备液。CO溶液的配制：将一定量的 CORM-3溶解在二次蒸馏水中，转移到500mL的容量瓶中，加水至刻度线，得到浓度为1.0×10-3mol·L-1的CORM-3。将1.0×10-3mol·L-1的CORM-3溶液逐渐稀释，得到1.0×10-4-1.0×10-5mol·L-1的CORM-3水溶液。将1.0mL探针的备用溶液，1.0mL的PdCl2备用溶液和1.0mL的CORM-3水溶液分别加入到不同的10mL的容量瓶中，用缓冲溶液定容后，得到浓度为1.0×10-5mol·L-1的荧光探针溶液和PdCl2溶液，以及 1.0×10-5-1.0×10-6mol·L-1的CO待测溶液。
实施例3：
荧光探针与CO作用的荧光光谱的测定
图2为荧光探针与CO作用的荧光光谱，荧光探针和Pd2+的浓度均为10μM，CO浓度分别为：0,1.0, 5.0,10,15,20,25,30,40,50,60,80,90,100μM。激发波长固定为570nm，荧光发射波长范围为540～750nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，由于烯丙基氯甲酸酯对于新型荧光团Ct-OH中羟基的淬灭作用，因此可以发现，当荧光探针加入Pd2+之后，在 605nm处没有明显的发射峰；同时加入Pd2+和CO之后，在605nm处出现了明显的发射峰。这是因为Pd2+首先被CO还原为Pd0，随后由Pd0介导的Tsuji-Trost反应，导致Ct-CO中的烯丙基甲酸酯基断裂，释放出Ct-OH荧光团，从而产生荧光。荧光探针Ct-CO本身是无荧光的，因为荧光团Ct-OH的羟基受到甲酸烯丙基的保护，降低了羟基的供电子能力，阻碍了分子内电荷转移(ICT)过程。加入CO和Pd2+后，探针上的甲酸烯丙基被裂解，导致ICT过程的恢复和强信号的产生。并且随着CO浓度的增大，探针分子的荧光强度不断增强。图3为探针对不同CO浓度的线性响应图。荧光强度跟CO的浓度呈现线性关系，线性范围是1.0×10-6～1.0×10-4M，检测限是0.35μM。这说明该探针可以高灵敏的检测CO。
实施例4：
荧光探针与CO作用的紫外可见吸收光谱的测定
图4为荧光探针与CO作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，CO的加入量为50 μM。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，探针本身是没有吸收带的；加入Pd2+之后，也没有明显的改变；然而当同时加入Pd2+和CO时，可以清楚的发现在570nm附近出现新的强吸收峰。
实施例5：
荧光探针对CO测定的选择性
图5为荧光探针对CO测定的选择性图。考察在浓度为10μM的荧光探针和Pd2+溶液中加入CO(50μM) 及其活性氧(H2O2,ONOO-,·OH,ClO-,ROO·,O2 -)，活性氮(NO,NO2 -,NO3 -)，活性硫(H2S,SO3 2-,HSO3 -, SO4 2-)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)(200μM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有CO能引起荧光光谱的改变，当在探针溶液中加入50μM CO后，在605nm处会出现一个显著增强的荧光发射带，并且有一个12倍的荧光增强。而其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对CO有较好的选择性。这一系例的对比向我们展示了探针Ct-CO对于CO有着优异的选择性，可以特异性的识别CO，从而能够在复杂的生物系统中检测到CO。
实施例6：
溶液pH值对荧光探针测定CO的荧光性质的影响
考察pH值对荧光探针测定CO的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为2.0～12.0，荧光探针和Pd2+的浓度均为10μM，CO的浓度为50μM。我们能从图中观察到，荧光探针Ct-CO本身随着pH的变化，其荧光强度是几乎不变的，从而说明pH的变化对探针本身来说并没有很大的影响。然而，当加入CO之后，发现在pH在7.0～8.0范围内，荧光强度比值是显著增强的。综上所述，当荧光探针在 pH值在7.0到8.0之间的环境下来测定CO是较为准确的，因此7.0到8.0之间是一个比较合适的pH值范围，这对于探针Ct-CO在实际样品中来测定CO是非常有帮助的。
实施例7：
荧光探针与CO作用的响应时间的测定
我们研究了荧光探针对CO的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对CO的响应时间为120s，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，在荧光强度达到最大值后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。
实施例8：
荧光探针在活细胞中的应用
首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～30μM CO探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的CO。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择肝癌细胞HepG2进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光(图9a)；在细胞中同时加入荧光探针和Pd2+,红色通道依然没有明显的荧光变化(图9b)，这说明细胞中的CO含量较低。当细胞先与CO释放剂50μM(CORM-3)共同培养30min，随后在细胞中加入荧光探针和Pd2+共同孵育后，可以发现细胞开始呈现强烈的红色荧光(图9c)，这些结果表明，探针可以应用于活体细胞成像CO。同时文献报道血红素(Heme)可以刺激细胞内CO的产生。细胞用血红素(Heme)预先处理4h，刺激细胞内CO的产生，然后加入Pd2+同时用探针染色0.5h，可以检测到细胞内出现了较为强烈的红色荧光信号(图9d)。图9E是红色通道中细胞荧光发射强度的定量柱状图，我们从图9E中也可以看出相同结论。这些结果说明荧光探针能监控细胞内CO含量的变化，这为监控人体内和一氧化碳相关病变提供一种可靠的手段。

Claims (3)

1.一种检测一氧化碳的打开型荧光探针Ct-CO，其结构如下：
Figure FDA0002508018020000011
2.根据权利要求1所述的一种检测一氧化碳的打开型荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：
1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的3-(6-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-4羟基苯甲醛和1～1.5当量的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓溶解到10～15mL甲苯中，加入0.5mL哌啶，0.5mL乙酸，反应混合物在常温以及氮气保护下搅拌过夜，停止反应，然后可以将反应溶液用饱和食盐水和CH2Cl2来进行萃取，取下层有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗产品用体积比为100:1～100:4的CH2Cl2/CH3OH洗脱剂进行柱层析，得到绿色固体化合物Ct-OH，其产率为50％，其结构如下：
Figure FDA0002508018020000012
2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的化合物Ct-OH，10当量的烯丙基氯甲酸酯和2当量的三乙胺在0℃冰浴，氮气保护的条件下溶解到15～25mL的无水二氯甲烷中，过夜，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到淡黄色固体产物，其产率为60％，即为所述的荧光探针Ct-CO。
3.根据权利要求1所述的一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞内一氧化碳含量的检测。
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