CN110128435A - 一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种过氧化亚硝基(ONOO‑)比率型荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：本发明提供了以8‑羟基久洛尼定‑9‑甲醛、乙酰乙酸乙酯、4‑二乙氨基酮酸等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种近红外比率型过氧化亚硝基荧光探针；首先，该荧光探针对ONOO‑表现出很高的灵敏度，荧光强度比值(F500/F720)增强72倍；其次，该荧光探针对ONOO‑表现出很高的选择性，不受其他活性氧、活性氮、活性硫以及生物硫醇的干扰；并且，该荧光探针与ONOO‑作用迅速，响应时间在7min以内；此外，该荧光探针应用于活细胞内过氧化亚硝基含量的检测。

Description

一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的制备和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于苯并吡喃-香豆素染料的过氧化亚硝基比率型荧光探针的制备和应用。
背景技术
过氧化亚硝基(ONOO-)是由超氧阴离子自由基(O2.-)与一氧化氮(NO)反应生成的一种高活性氧(C.H.Ischiropoulos,R.Radi,Nat.Rev.Drug Discovery,2007,6,662-680)。近年来研究表明,ONOO-可作为信号分子参与调控细胞的生长、分裂、迁移及凋亡等许多生理活动(B.Dickinson,C.Chang,Nat.Chem.Biol.,2011,7,504-511)。并且，由于ONOO-对生物分子具有较高的氧化性，长期被认为是一类损伤DNA、蛋白等生物分子，引起脂质过氧化反应的有害分子(T.Nagano,J.Clin.Biochem.Nutr.,2009,45,111-124)，导致其与多种疾病的发生密切相关，如：心血管疾病、神经退行性疾病、炎症和糖尿病(G.Ferrer-Sueta,R.Radi,ACS Chem.Biol.,2009,4,161-177；P.Pacher,J.Beckman,L.Liaudet,Physiol.Rev.,2007,87,315-424；J.Li,J.Su,W.Li,W.Liu,B.Altura,B.Altura,Neurosci.Lett.,2003,350,173-177；L.Virág,E.P.Gergely,C.Toxicol.Lett.,2003,140,113-124)。鉴于过氧化亚硝基重要的生理及临床意义，迫切需要设计有效的方法去精确检测它的含量。
荧光检测方法以其灵敏度高，操作简单，并且可应用于生物成像等优点，受到了广泛的关注(H.Zhu,J.-L.Fan,J.-J.Du,X.Peng,J.Acc.Chem.Res.,2016,49,2115-2126)。近年来，有许多荧光探针被设计开发用来检测ONOO-，比如：苯基硼酸酯基探针(J.Zhou,Y.Li,J.-N.Shen,Q.Li,R.Wang,Y.-F.Xu,X.-H.Qian.RSC Adv.,2014,4,51589-51592；Z.-J.Chen,W.Ren,Q.Wright,H.Ai,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,14940-14943)，肼基探针(X.-F.Yang,X.-Q.Guo,Y.-B.Zhao,Talanta.,2002,5,883-890；G.Ambikapathi,S.Kempahanumakkagari,B.Lamani,D.Shivanna,H,Maregowda,A.Gupta,P.Malingappa,Fluoresc.,2013,23,705-712)，硒基或碲基探针(F.Yu,P.Li,G.Li,G.Zhao,T.Chu,K.Han,J.Am.Chem.,Soc.,2011,133,11030-11033；J.Tian,H.Chen,L.Zhuo,Y.Xie,N.Li,B.Tang,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,7674-7680；F.Yu,P.Li,B.Wang,K.Han.J.Am.Chem.Soc.,2013,135,7674-7680)和甲基(4-羟基苯基)氨基探针(T.Peng,N.Wong,X.Chen,Y.Chan,D.Ho,Z.Sun,J.Hu,J.Shen,H.EI-Nezami,D.Yang,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,11728-11734；J.Park,C.Heo,H.Kim,J.Hong,Tetrahedron Lett.,2016,57,715-718)。但是，它们存在一些问题：(1)这些荧光探针具有较短的分析波长，因此容易被活体内生物分子产生的自发荧光信号干扰，从而降低了探针的灵敏度；(2)这些荧光探针大多是以单个荧光发射峰强度变化作为响应信号的，容易受到光源稳定性、探针浓度和仪器因素的影响。因此，设计和合成具有长波长发射的比率型荧光探针是非常有意义的。
苯并吡喃-香豆素染料是目前荧光探针领域中的新型荧光染料，它具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点。特别是，基于苯并吡喃-香豆素类的探针具有近红外发射，因此组织穿透力强，不易受到生物自体荧光的干扰，对生物成像更有利。据文献报道，苯并吡喃-香豆素类荧光探针已被用来检测生物Cys、HClO、H2O2和Hg2+(H.Lv,X.-F.Yang,Y.Zhong,Y.Guo,Z.Li,H.Li,Anal.Chem.,2014,86,1800-1807；S.Ding,Q.Zhang,S.Xue,G.Feng,Analyst,2015,140,4687-4693；J.Liu,Y.-Q.Sun,P.Wang,J.Zhang,W.Guo,Analyst,2013,138,2654-2660；B.Dong,X.Song,X.Kong,C.Wang,Y.Tang,Y.Liu,W.Lin,Adv.Mater.,2016,28,8755-8759)。但是，还没有基于苯并吡喃-香豆素染料的探针被用于检测ONOO-。因此，设计和合成一个苯并吡喃-香豆素类探针来检测ONOO-是非常必要的。
发明内容
根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于苯并吡喃-香豆素的近红外比率型过氧化亚硝基荧光探针。
本发明的技术方案是，一种过氧化亚硝基比率型荧光探针，其结构式如下：
一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的制备方法。步骤如下：
1)在100mL圆底烧瓶中，将10当量的8-羟基久洛尼定-9-甲醛，10当量的乙酰乙酸乙酯和1当量的哌啶溶解于20.0mL二氯甲烷中，搅拌回流5～8h后，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到深黄色固体化合物(香豆素334)(产率60％)。2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的香豆素334和1当量的4-二乙氨基酮酸溶解到8mL浓硫酸中，反应混合物在90℃下搅拌10～14h，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，倒入盛有50g冰水的烧杯中，随即加入0.8mL 70％高氯酸，立即析出蓝绿色固体，静止1～3h，过滤，用10mL的冰水洗涤固体，干燥，粗产品用体积比为30:1～10:1的CH2Cl2/CH3CH2OH洗脱剂进行柱层析，得到绿色固体产物(产率40％)，即为荧光探针。
本发明的有益效果是，一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究了该探针的荧光光谱性质，加入ONOO-之前，荧光探针有近红外(720nm)的荧光发射峰；加入ONOO-之后，在可见区(500nm)出现了绿色发射峰。并且随着ONOO-浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断降低，绿色荧光强度不断增强。当加入15μM的ONOO-时，荧光强度比值(F500/F720)增强72倍，因此可以比率检测ONOO-。该探针的检测范围从1.0μM到15μM，检测限为0.33μM，这说明该探针可以高灵敏的检测ONOO-。其次，研究了探针的紫外吸收光谱，在没有加入ONOO-时，探针在650nm处有吸收带；加入ONOO-后，650nm处的吸收峰逐渐减小，在440nm附近出现新的吸收峰，溶液颜色从蓝色变为黄色。接着，研究了探针的选择性，考察了探针与活性氧(OCl-,H2O2,O2 -,ROO·,·OH)，活性氮(NO,NO2 -,NO3 -)，活性硫(H2S,SO3 2-,HSO3 -)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)的荧光响应情况。结果发现，只有ONOO-能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。最后，研究了pH值对荧光探针测定ONOO-的影响，当pH值在7.0到8.0之间时，不影响荧光探针对ONOO-的测定。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在7min以内。
一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的应用。在细胞中加入荧光探针，红色通道可以观察到的较强的荧光，而在绿色通道几乎没有荧光，这说明细胞中的ONOO-含量较低。细胞用脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)处理，然后用探针染色，发现绿色通道荧光明显增强，而红色通道荧光减弱；用氨基胍盐酸盐(AG)处理抑制细胞内ONOO-的产生，发现绿色通道的荧光减弱，红色通道的荧光增强。这些结果说明荧光探针能监控细胞内ONOO-含量的变化，这为监控人体内和过氧化亚硝基相关病变提供一种可靠的手段。
附图说明
图1为荧光探针的合成路线。
图2为荧光探针与不同浓度的ONOO-作用后的荧光光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为5μM，ONOO-浓度分别为：0,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,15μM。荧光激发波长为440nm。插图为荧光探针与ONOO-作用前后的荧光图片。
图3为荧光探针对不同ONOO-浓度的荧光线性响应图。
图4为荧光探针与ONOO-作用后的紫外可见吸收光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度均为5μM，ONOO-浓度为0,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,15μM。插图为ONOO-作用前后探针在日光灯下的图片。
图5为荧光探针的选择性图。
荧光探针的浓度均为5μM，ONOO-浓度为15μM，其它分析物浓度均为150μM。
图6为pH对荧光探针的影响图。
图7为荧光探针与ONOO-作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。
图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
图9荧光探针与ONOO-作用的细胞成像图。(a)细胞用探针染色0.5h。(b)细胞用LPS和IFN-γ处理10h，然后用探针染色0.5h。(c)细胞用LPS、IFN-γ和AG处理10h，然后用探针染色0.5h。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：
荧光探针的合成
合成路线如图1。香豆素334的合成：在100mL圆底烧瓶中，将8-羟基久洛尼定-9-甲醛(1.09g,5mmol)，乙酰乙酸乙酯(0.63mL,5mmol)和哌啶(0.035mL,0.5mmol)溶解于20.0mL二氯甲烷中，搅拌回流6h后，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到深黄色固体化合物(0.85g，产率为60％)，即为香豆素334。
ONOO-荧光探针的合成：在100mL的圆底烧瓶中，将香豆素334(0.42g,1.48mmol)和4-二乙氨基酮酸(0.46g,1.48mmol)溶解到8mL浓硫酸中，反应混合物在90℃下搅拌12h，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，倒入盛有50g冰水的烧杯中，随即加入0.8mL 70％高氯酸，立即析出蓝绿色固体，静止2h，过滤，用10mL的冰水洗涤固体，干燥，粗产品用体积比为20:1的CH2Cl2/CH3CH2OH洗脱剂进行柱层析，得到绿色固体产物(0.33g，产率40％)，即为荧光探针。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ8.85(s,1H),8.12(d,J＝7.6Hz,1H),7.82(t,J＝8.0Hz,1H),7.76-7.72(m,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.27(s,1H),7.14-7.05(m,4H),3.59(d,J＝8.0Hz,4H),3.43(s,4H),2.72(d,J＝4.0Hz,4H),1.88(s,4H),1.20(s,6H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6,ppm):δ167.1,159.9,158.3,157.2,154.0,152.5,150.7,144.3,144.2,133.0,130.4,130.2,130.1,129.1,128.3,125.1,121.4,109.7,105.4,96.1,50.4,49.8,45.1,26.7,20.3,19.3,12.5.MS(TOF):561.4.
实施例2：
荧光探针和ONOO-溶液配制
探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在甲醇中，配成1×10-3M的探针溶液。ONOO-溶液的配制：将0.70M的H2O2溶液、0.60M的HCl溶液、0.60M的NaNO2溶液混合，并迅速加入1.5M的NaOH溶液，过量的H2O2用二氧化锰除去，保存在-20℃的冷冻环境中。使用前化冻使用，ONOO-浓度的确定，需要测定该溶液在302nm处的吸光度A，计算公式为:CONOO-＝A/1.67(mM)。
实施例3：
荧光探针与ONOO-作用的荧光光谱的测定
图2为荧光探针与ONOO-作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为5μM，ONOO-的浓度依次为0,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,15μM。激发波长固定为440nm，发射波长范围为450～820nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入ONOO-之前，荧光探针有近红外(720nm)的荧光发射峰；加入ONOO-之后，在可见区(500nm)出现了绿色发射峰。这是因为探针分子被ONOO-氧化，导致断裂，共轭结构变小，从而产生短波长的绿色荧光。并且随着ONOO-浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断降低，绿色荧光强度不断增强。当加入15μM的ONOO-时，荧光强度比值(F500/F720)增强72倍，因此可以比率检测ONOO-。图3为探针对不同ONOO-浓度的线性响应图。荧光强度跟ONOO-的浓度呈现线性关系，线性范围是1.0×10-6～15×10-6M，检测限是0.33μM。这说明该探针可以高灵敏的检测ONOO-。
实施例4：
荧光探针与ONOO-作用的紫外可见吸收光谱的测定
图4为荧光探针与ONOO-作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为5μM，ONOO-的加入量为15μM。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，在没有加入ONOO-时，探针在650nm处有吸收带；加入ONOO-后，650nm处的吸收峰逐渐减小，在440nm附近出现新的吸收峰，溶液颜色从蓝色变为黄色。
实施例5：
荧光探针对ONOO-测定的选择性
图5为荧光探针对ONOO-测定的选择性图。考察在浓度为5μM的荧光探针溶液中加入ONOO-(15μM)及其活性氧(OCl-,H2O2,O2 -,ROO·,·OH)，活性氮(NO,NO2 -,NO3 -)，活性硫(H2S,SO3 2-,HSO3 -)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)(150μM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有ONOO-能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对ONOO-有较好的选择性。
实施例6：
溶液pH值对荧光探针测定ONOO-的荧光性质的影响
考察pH值对荧光探针测定ONOO-的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为2.0～10.0，荧光探针的浓度为5μM，ONOO-的浓度为15μM。从图中可以看出，荧光探针随着pH的变化，荧光强度比值(F500/F720)基本不变，说明pH对探针本身没有很大的影响。然而，加入ONOO-之后，当pH<5.0，荧光强度也基本不变，这是因为在酸性条件下，ONOO-不能稳定存在；在pH在7.0～8.0范围内，荧光强度比值显著增强。当pH>7，荧光强度比值有所下降。综上所述，当pH值在7.0到8.0之间时，不影响荧光探针对ONOO-的测定，是比较合适的pH值范围，这非常有利于该探针用于实际样品中ONOO-的测定。
实施例7：
荧光探针与ONOO-作用的响应时间的测定
我们研究了荧光探针对ONOO-的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对ONOO-的响应时间为7min，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。
实施例8：
荧光探针在活细胞中的应用
首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～30μM ONOO-探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的ONOO-。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择肝癌细胞HepG2进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在细胞中加入荧光探针，红色通道可以观察到的较强的荧光，而在绿色通道几乎没有荧光，这说明细胞中的ONOO-较低(图9a)。文献报道脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)可以共同刺激巨噬细胞释放OONO-，氨基胍盐酸盐(AG)可以抑制细胞内ONOO-的产生。细胞用LPS和IFN-γ预先处理10小时，然后用探针染色0.5h，绿色通道荧光明显增强，而红色通道荧光减弱(图9b)；细胞用LPS、IFN-γ和AG处理10h，然后用探针染色0.5h，绿色通道的荧光减弱，红色通道的荧光增强(图9c)。这些结果说明荧光探针能监控细胞内ONOO-含量的变化，这为监控人体内和过氧化亚硝基相关病变提供一种可靠的手段。

Claims (3)

1.一种过氧化亚硝基比率型荧光探针，其结构如下：
。
2.根据权利要求1所述的一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：
1）在100 mL圆底烧瓶中，将10当量的8-羟基久洛尼定-9-甲醛，10当量的乙酰乙酸乙酯和1当量的哌啶溶解于20.0 mL二氯甲烷中，搅拌回流5~8 h后，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到深黄色固体化合物，即香豆素334，其结构如下：
；
2）在100 mL的圆底烧瓶中，将1当量的香豆素334和1当量的4-二乙氨基酮酸溶解到8mL浓硫酸中，反应混合物在90 ◦C下搅拌10~14 h，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，倒入盛有50 g冰水的烧杯中，随即加入0.8 mL 70%高氯酸，立即析出蓝绿色固体，静止1~3 h，过滤，用10 mL的冰水洗涤固体，干燥，粗产品用体积比为30:1~10:1的CH2Cl2/CH3CH2OH洗脱剂进行柱层析，得到绿色固体产物，即为所述的荧光探针。
3.根据权利要求1所述的一种过氧化亚硝基比率型荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞内过氧化亚硝基含量的检测。
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