CN110669501A - 一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的及其制备方法和应用，其结构为：
采用的原料易于得到，反应条件温和、易于控制，节约了反应成本，得到的过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针，具有高选择性，可应用于帕金森病模型中。
Description
技术领域
本发明涉及一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针及其制备方法和应用，属于生物化学技术领域。
背景技术
帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，严重影响人们的日常生活。脑中黑质区多巴胺能神经元丧失为帕金森病的主要病理特征。但是黑质神经元多巴胺减少的原因还尚未明确。越来越多的证据表明，多巴胺能神经元的损伤与神经元中过量产生的活性氧/活性氮物种的神经毒性有关。
过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)，由一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O2 -)产生，作为一种重要的活性氧物种，具有较高的氧化和硝化能力。低浓度的ONOO-在神经信号转导方面有重要作用。然而，过表达的ONOO-在帕金森病中造成的氧化应激作用是一种重要的神经毒素。因此，ONOO-可以作为帕金森病前期诊疗潜在的疾病标志物。然而，ONOO-在帕金森病中的作用还尚未明确。因此，开发一种有效的工具用于ONOO-实时监测不仅有助于理解ONOO-的致病机制，并且对帕金森病的前期诊疗也有重要意义。
由于ONOO-在生理环境中的半衰期短(10-20ms)，因此传统的检测方法，如比色法，电化学方法，气相色谱法等，不能满足检测要求。荧光探针成像法的由于具有高特异性，高灵敏度，可实时监测的优点受到了研究者们的青睐。目前为止，已经有许多探针应用到了生物体系中ONOO-的检测。但是可以用于帕金森病中检测ONOO-的荧光探针至今没有被报道。为了满足实时监测和PD前期诊疗的要求，我们面临着以下几个挑战：1)由于ONOO-的短的半衰期，对ONOO-超快响应是亟需的；2)应用于PD模型体内检测的探针应具有较大的斯托克斯位移和近红外发射波长，实现高分辨和较深的组织穿透深度；3)探针还应具有对ONOO-的较高的特异性，不受体内其他活性氧/活性氮物种的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针及其制备方法和应用，制备得到可对ONOO-快速响应的荧光探针，并将其应用于帕金森模型中。
为解决上述技术问题，本发明提供一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针，其结构如结构式(Ι)所示：
本发明还提供了一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2-R1-6-R2-4-硝基苯酚加入到第一溶剂中，加入氢化钠、氯甲基乙醚，在20～40℃下，反应后得到1-(乙氧基甲氧基)-2-R1-6-R2-4-硝基苯；
(2)将1-(乙氧基甲氧基)-2-R1-6-R2-4-硝基苯加入到第二溶剂中，加入九水硫化钠，室温下搅拌反应，得到4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-苯胺；
(3)将4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-苯胺加入到第三溶剂中，加入甲醇钠、多聚甲醛，搅拌2～5h后，加入硼氢化钠，升温反应，得到4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-N-甲基苯胺；
(4)将异佛尔酮、丙二腈加入到第四溶剂中，加入哌啶、乙酸、乙酸酐，室温搅拌4～8h后，升温反应4～6h，得到化合物1；
(5)将化合物1、对溴苯甲醛加入到第五溶剂中，加入哌啶，40～60℃加热反应8～12h后，得到化合物2；
(6)将化合物2、4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-N-甲基苯胺、催化剂、膦配体加入到第六溶剂中，在90～120℃下反应，得到化合物15-18；
(7)分别将化合物15-18溶解在第七溶剂中，酸性条件下，分别得到目标产物NIR-PN1～NIR-PN4；
反应过程为：
优选地，所述第一溶剂为无水四氢呋喃溶剂；所述第二溶剂为乙醇；所述第三溶剂为无水甲醇；所述第四溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述第五溶剂为乙腈；所述第六溶剂为甲苯；所述第七溶剂为四氢呋喃。
优选地，所述步骤(3)中的升温反应温度为50～60℃。
优选地，所述步骤(4)中的升温反应温度为110～130℃。
优选地，所述步骤(6)中的催化剂为醋酸钯，膦配体为2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦)中的一种。
同时，本发明还提供了一种所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针或所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法制备得到的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针在帕金森疾病模型中的应用。
本发明所达到的有益效果：
1、本发明的一种过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针，具有高选择性，检测限达到3.3nM，灵敏度高，可以超快响应ONOO-，并且在生理pH下稳定性好，有助于实时原位检测ONOO-；探针的发射波长可以达到近红外区域，可以显著降低生物体自发荧光的干扰，光损伤较小，可以用于生物组织成像。
2、本发明的一种过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，采用的原料易于得到，反应条件温和、易于控制，节约了反应成本，保证目标产物的产量。
3、本发明的过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针可应用于帕金森病模型中，这是首次实现在帕金森病模型中对ONOO-进行检测，通过对活细胞和和组织中过氧亚硝基阴离子实时原位检测，对帕金森病的前期诊疗和病理过程研究具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中NIR-PN1的核磁氢谱图；
图2为本发明中NIR-PN1的核磁碳谱图；
图3为本发明中NIR-PN2的核磁氢谱图；
图4为本发明中NIR-PN2的核磁碳谱图；
图5为本发明中NIR-PN3的核磁氢谱图；
图6为本发明中NIR-PN3的核磁碳谱图；
图7为本发明中NIR-PN4的核磁氢谱图；
图8为本发明中NIR-PN4的核磁碳谱图；
图9为本发明中NIR-PN1-～NIR-PN4的紫外吸收、发射谱图；
图10为本发明中NIR-PN1～NIR-PN4与ONOO-作用的荧光强度变化图；
图11为本发明中NIR-PN1在PC12细胞中的共聚焦荧光成像；
图12为本发明中NIR-PN1在果蝇脑中的共聚焦荧光成像；
图13为本发明中NIR-PN1在秀丽隐杆线虫中的共聚焦荧光成像。
具体实施方式
下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针，其结构如结构式(Ι)所示：
一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2-R1-6-R2-4-硝基苯酚加入到第一溶剂中，加入氢化钠、氯甲基乙醚，在20～40℃下，反应后得到1-(乙氧基甲氧基)-2-R1-6-R2-4-硝基苯；
(2)将1-(乙氧基甲氧基)-2-R1-6-R2-4-硝基苯加入到第二溶剂中，加入九水硫化钠，室温下搅拌反应，得到4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-苯胺；
(3)将4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-苯胺加入到第三溶剂中，加入甲醇钠、多聚甲醛，搅拌2～5h后，加入硼氢化钠，升温反应，得到4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-N-甲基苯胺；
(4)将异佛尔酮、丙二腈加入到第四溶剂中，加入哌啶、乙酸、乙酸酐，室温搅拌4～8h后，升温反应4～6h，得到化合物1；
(5)将化合物1、对溴苯甲醛加入到第五溶剂中，加入哌啶，40～60℃加热反应8～12h后，得到化合物2；
(6)将化合物2、4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-N-甲基苯胺、催化剂、膦配体加入到第六溶剂中，在90～120℃下反应，得到化合物15-18；
(7)分别将化合物15-18溶解在第七溶剂中，酸性条件下，分别得到目标产物NIR-PN1～NIR-PN4；
反应过程为：
上述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针可应用于帕金森疾病模型中。
实施例1
在反应器中加入2-甲氧基-4-硝基苯酚(5g，29.6mmol)，在0℃，无水四氢呋喃中溶解，加入氢化钠(88.8mmol)0℃下搅拌0.5h，然后滴加氯甲基乙醚(59.2mmol)，继续搅拌1h，转移至室温搅拌3h。待反应结束，冰水淬灭氢化钠，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:3的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率95％。
在反应器中加入化合物3(2g,8.8mmol)，在乙醇中溶解，分批加入九水硫化钠(44mmol)，室温搅拌8h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，得到化合物7，直接进行下一步。
在反应器中加入化合物7，在无水甲醇中溶解，分批加入甲醇钠(32.5mmol)，室温搅拌10分钟后加入多聚甲醛(9.1mmol)，室温下继续搅拌3h。加入硼氢化钠(6.5mmol)，升温至50℃，搅拌1h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比3:1的石油醚/乙酸乙酯的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标产物，产率31％。
以异佛尔酮(16.5mL,110mmol)和丙二腈(100mmol)为反应物，在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入哌啶(18.2mmol)，乙酸(7mmol)，乙酸酐(2mmol)，搅拌6h后，120℃搅拌4h，停止反应。加入等体积的水，抽滤得到固体，用异丙醇/水(8/3，v/v)重结晶，得到化合物1，产率为67％。
以化合物1(1.12g,6mmol)和对溴苯甲醛(9mmol)为反应物，在乙腈溶剂中，加入哌啶(0.9mmol)，加热至50℃搅拌11h后，冷却至室温，抽滤得到化合物2，产率为75％。
在反应器中加入化合物11(352mg,1.67mmol)，化合物2(590mg,1.67mmol)，醋酸钯(0.17mmol)，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(0.25mmol)，碳酸铯(4.1mmol)在无水无氧甲苯溶剂中，100℃下，搅拌回流16h，冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂。用体积比3:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率52％。
在反应器中加入化合物15(145mg,0.3mmol)，在0℃，四氢呋喃中溶解，滴加浓盐酸，0℃搅拌0.5h，转移至室温反应1.5h。待反应结束，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到NIR-PN1，产率89％。
如图1所示，1H NMR(300MHz,CDCl3)δ/ppm＝7.36(d,J＝8.7Hz,2H),7.03-6.93(m,2H),6.82-6.67(m,6H),5.60(s,1H),3.86(s,3H),3.32(s,3H),2.57(s,2H),2.45(s,2H),1.06(s,6H).
如图2所示，13C NMR(75MHz,CDCl3)δ/ppm＝169.3,155.2,151.3,147.4,144.1,140.2,138.0,129.2,125.0,121.8,119.9,115.3,114.1,109.9,56.2,43.2,40.6,39.5,32.1.28.2.
实施例2
在反应器中加入2-甲基-4-硝基苯酚(4.5g,29.6mmol)，在0℃，无水四氢呋喃中溶解，加入氢化钠(88.8mmol),0℃下搅拌0.5h，然后滴加氯甲基乙醚(59.2mmol)，继续搅拌1h，转移至室温搅拌3h。待反应结束，冰水淬灭氢化钠，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:3的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率93％。
在反应器中加入化合物4(1.85g,8.8mmol)，在乙醇中溶解，分批加入九水硫化钠(44mmol)，室温搅拌8h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，得到化合物8，直接进行下一步。
在反应器中加入化合物8，在无水甲醇中溶解，分批加入甲醇钠(32.5mmol)，室温搅拌10分钟后加入多聚甲醛(9.1mmol)，室温下继续搅拌3h。加入硼氢化钠(6.5mmol)，升温至55℃，搅拌1h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比3:1的石油醚/乙酸乙酯的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标产物，产率53％。
以异佛尔酮(16.5mL,110mmol)和丙二腈(100mmol)为反应物，在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入哌啶(18.2mmol)，乙酸(7mmol)，乙酸酐(2mmol)，搅拌6h后，120℃搅拌4h，停止反应。加入等体积的水，抽滤得到固体，用异丙醇/水(8/3，v/v)重结晶，得到化合物1，产率为67％。
以化合物1(1.12g,6mmol)和对溴苯甲醛(9mmol)为反应物，在乙腈溶剂中，加入哌啶(0.9mmol)，加热至50℃搅拌11h后，冷却至室温，抽滤得到化合物2，产率为75％。
在反应器中加入化合物12(326mg,1.67mmol)，化合物2(590mg,1.67mmol)，醋酸钯(0.17mmol)，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(0.25mmol)，碳酸铯(4.1mmol)在无水无氧甲苯溶剂中，100℃下，搅拌回流16h，冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂。用体积比3:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率58％。
在反应器中加入化合物16(140mg,0.3mmol)，在0℃，四氢呋喃中溶解，滴加浓盐酸，0℃搅拌0.5h，转移至室温反应1.5h。待反应结束，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到NIR-PN2，产率85％。
如图3所示，1H NMR(300MHz,CDCl3)δ/ppm＝7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.03-6.91(m,3H),6.84-6.73(m,3H),6.69(d,J＝8.7Hz,2H),4.85(s,1H),3.30(s,3H),2.57(s,2H),2.45(s,2H),2.25(s,3H),1.06(s,6H).
如图4所示，13C NMR(75MHz,CDCl3)δ/ppm＝169.4,155.4,152.2,151.4,140.4,138.2,129.4,129.3,125.6,125.5,124.8,121.7,116.1,114.3,114.0,113.5,43.2,40.6,39.4,32.1,28.2,16.0.
实施例3
在反应器中加入2，6-二甲基-4-硝基苯酚(5g,29.6mmol)，在0℃，无水四氢呋喃中溶解，加入氢化钠(88.8mmol)0℃下搅拌0.5h，然后滴加氯甲基乙醚(59.2mmol)，继续搅拌1h，转移至室温搅拌3h。待反应结束，冰水淬灭氢化钠，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:3的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率91％。
在反应器中加入化合物5(2g,8.8mmol)，在乙醇中溶解，分批加入九水硫化钠(44mmol)，室温搅拌8h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，得到化合物9，直接进行下一步。
在反应器中加入化合物9，在无水甲醇中溶解，分批加入甲醇钠(32.5mmol)，室温搅拌10分钟后加入多聚甲醛(9.1mmol)，室温下继续搅拌3h。加入硼氢化钠(6.5mmol)，升温至55℃，搅拌1h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比3:1的石油醚/乙酸乙酯的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标产物，产率32％。
以异佛尔酮(16.5mL,110mmol)和丙二腈(100mmol)为反应物，在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入哌啶(18.2mmol)，乙酸(7mmol)，乙酸酐(2mmol)，搅拌6h后，120℃搅拌4h，停止反应。加入等体积的水，抽滤得到固体，用异丙醇/水(8/3，v/v)重结晶，得到化合物1，产率为67％。
以化合物1(1.12g,6mmol)和对溴苯甲醛(9mmol)为反应物，在乙腈溶剂中，加入哌啶(0.9mmol)，加热至50℃搅拌11h后，冷却至室温，抽滤得到化合物2，产率为75％。
在反应器中加入化合物13(350mg,1.67mmol)，化合物2(590mg,1.67mmol)，醋酸钯(0.17mmol)，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(0.25mmol)，碳酸铯(4.1mmol)在无水无氧甲苯溶剂中，100℃下，搅拌回流16h，冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂。用体积比3:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率45％。
在反应器中加入化合物17(145mg,0.3mmol)，在0℃，四氢呋喃中溶解，滴加浓盐酸，0℃搅拌0.5h，转移至室温反应1.5h。待反应结束，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到NIR-PN3，产率85％。
如图5所示，1H NMR(300MHz,CDCl3)δ/ppm＝7.33(d,J＝8.4Hz,2H),7.03(d,J＝15.9Hz,1H),6.83-6.75(d,4H),6.67(d,J＝8.4Hz,2H),4.65(s,1H),3.29(s,3H),2.56(s,2H),2.45(s,2H),2.25(s,6H),1.06(s,6H).
如图6所示，13C NMR(75MHz,CDCl3)δ/ppm＝169.3,155.3,151.4,150.5,139.9,138.2,129.3,127.0,124.7,124.7,121.7,114.3,114.0,113.5,43.2,40.6,39.5,32.1,28.2,16.1.
实施例4
在反应器中加入4-硝基苯酚(4.2g,29.6mmol)，在0℃，无水四氢呋喃中溶解，加入氢化钠(88.8mmol)0℃下搅拌0.5h，然后滴加氯甲基乙醚(59.2mmol)，继续搅拌1h，转移至室温搅拌3h。待反应结束，冰水淬灭氢化钠，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:3的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率92％。
在反应器中加入化合物6(1.7g,8.8mmol)，在乙醇中溶解，分批加入九水硫化钠(44mmol)，室温搅拌8h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，得到化合物10，直接进行下一步。
在反应器中加入化合物10，在无水甲醇中溶解，分批加入甲醇钠(32.5mmol)，室温搅拌10分钟后加入多聚甲醛(9.1mmol)，室温下继续搅拌3h。加入硼氢化钠(6.5mmol)，升温至55℃，搅拌1h。待反应结束，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比3:1的石油醚/乙酸乙酯的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标产物，产率31％。
以异佛尔酮(16.5mL,110mmol)和丙二腈(100mmol)为反应物，在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入哌啶(18.2mmol)，乙酸(7mmol)，乙酸酐(2mmol)，搅拌6h后，120℃搅拌4h，停止反应。加入等体积的水，抽滤得到固体，用异丙醇/水(8/3，v/v)重结晶，得到化合物1，产率为67％。
以化合物1(1.12g,6mmol)和对溴苯甲醛(9mmol)为反应物，在乙腈溶剂中，加入哌啶(0.9mmol)，加热至50℃搅拌11h后，冷却至室温，抽滤得到化合物2，产率为75％。
在反应器中加入化合物14(300mg,1.67mmol)，化合物2(590mg,1.67mmol)，醋酸钯(0.17mmol)，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(0.25mmol)，碳酸铯(4.1mmol)在无水无氧甲苯溶剂中，100℃下，搅拌回流16h，冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂。用体积比3:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到目标产物，产率55％。
在反应器中加入化合物18(136mg,0.3mmol)，在0℃，四氢呋喃中溶解，滴加浓盐酸，0℃搅拌0.5h，转移至室温反应1.5h。待反应结束，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥后，减压旋干溶剂，用体积比2:1的二氯甲烷/石油醚的展开剂进行柱层析分离，得到NIR-PN4，产率90％。
如图7所示，1H NMR(300MHz,CDCl3)δ/ppm＝7.35(d,J＝8.7Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),7.03(d,J＝15.9Hz,1H),6.89(d,J＝8.7Hz,2H),6.82-6.75(m,2H),6.69(d,J＝8.7Hz,1H),5.04(s,1H),3.31(s,3H),2.57(s,2H),2.45(s,2H),1.06(s,6H).
如图8所示，13C NMR(75MHz,CDCl3)δ/ppm＝169.4,155.3,153.8,151.3,140.8,138.1,129.3,128.2,125.0,121.8,116.8,114.2,113.5,43.2,40.6,39.5,32.1,28.2.
取探针NIR-PN1～NIR-PN4分别溶于二甲亚砜(DMSO)中，制成10mM储备液。测试液为DMSO/PBS(3/97,10mM,pH 7.4,含0.4％吐温80)，探针测试浓度为2μM。如图9所示，探针NIR-PN1～NIR-PN4的吸收峰在520nm左右，较弱的荧光发射峰位于650nm左右，探针NIR-PN1～NIR-PN4与ONOO-反应后的发射峰(Dye1)在670nm处有明显增强。如图10-a所示，原有的探针荧光强度，如图10-b所示，探针对浓度不断增加的ONOO-的响应情况，随着ONOO-的浓度不断增加，探针NIR-PN1～NIR-PN4的荧光强度不断增强，浓度增加到15μM时，探针NIR-PN1对ONOO-的响应达到平衡。如图10-c所示，测试了探针在加入不同浓度ONOO-后荧光强度随时间的变化，实验结果显示在加入ONOO-的瞬间就可以完成反应，荧光强度显著增强，表明探针可以对ONOO-超快速响应，可以达到实时检测ONOO-动态变化的需要。如图10-d所示，探针NIR-PN1～NIR-PN4在与不同生物活性物质的作用情况下，荧光强度均未发生明显变化，只有在ONOO-的作用下荧光强度有明显的增强，表明探针NIR-PN1～NIR-PN4对ONOO-有高选择性。
应用实施例1
探针NIR-PN1在PC12细胞中的共聚焦荧光成像。
探针NIR-PN1示踪PC12细胞内ONOO-动态变化。使用NIR-PN1(10μM)和共聚焦荧光显微镜跟踪PC12细胞中的ONOO-。如图11所示，细胞在使用UA(ONOO-清除剂)处理后(如图11-b)，荧光强度比未处理的细胞(如图11-a)有明显降低，说明细胞中是有内源性的ONOO-产生的。在使用SIN-1(ONOO-供体)处理(如图11-c)或LPS/IFN-γ(内源诱导剂)处理(如图11-d)后，细胞中的荧光强度有显著增强，说明探针可以对细胞中内源性和外源性的ONOO-成像。在抑制剂组分别使用L-NAME(NO合成抑制剂)与LPS/IFN-γ共同孵育处理(如图11-e)，TEMPO(超氧阴离子清除剂)与LPS/IFN-γ共同孵育处理(如图11-f)，UA与LPS/IFN-γ共同孵育处理(如图11-g)后，荧光强度有明显降低，说明在在加入抑制剂或清除剂后抑制或清除了ONOO-的产生，从而使荧光强度降低。
应用实施例2
探针NIR-PN1在果蝇脑中的共聚焦荧光成像。
果蝇由于个体小，生命周期短，基因组测序已经完成，被广泛应用于神经和遗传学研究。使用共聚焦荧光显微镜对野生型和parkin null型果蝇脑的ONOO-的含量进行检测。选用20天雄性野生型果蝇和相同天数的雄性parkin null型果蝇进行实验。如图12所示，实验结果表明，野生型果蝇脑中也有少量的ONOO-存在，可以看到微弱的荧光(图12-b)。野生型果蝇在外源加入SIN-1后，也可以观察到荧光强度明显增强(图12-c)。parkin null型果蝇脑中的ONOO-的含量明显高于野生型，荧光强度显著增强(图12-d)。使用UA清除ONOO-后，parkin null果蝇脑的荧光强度明显降低(图12-e)。实验结果显示，探针NIR-PN1可以对帕金森疾病模型的果蝇脑组织中的ONOO-进行成像。
应用实施例3
探针NIR-PN1在秀丽隐杆线虫中的共聚焦荧光成像。
线虫由于结构简单透明，基因组序列已知，被应用于神经系统研究的模式生物。我们选择了正常的线虫WLZ1型和帕金森模型线虫WLZ3型进行实验。如图13所示，实验结果显示，WLZ1型线虫与探针NIR-PN1孵育后，显示出微弱的荧光(图13-a,b,c)。WLZ3型线虫与探针NIR-PN1孵育后，荧光强度比WLZ1型线虫明显增加(图13-d,e,f)。WLZ3型线虫在使用UA预处理，再与探针NIR-PN1孵育后，荧光强度明显下降(图13-g,h,i)。实验结果表明，探针NIR-PN1可以实现对帕金森疾病模型的线虫中的ONOO-进行成像。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针，其特征是，其结构如结构式(Ι)所示：
2.根据权利要求1所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将2-R1-6-R2-4-硝基苯酚加入到第一溶剂中，加入氢化钠、氯甲基乙醚，在20～40℃下，反应后得到1-(乙氧基甲氧基)-2-R1-6-R2-4-硝基苯；
(2)将1-(乙氧基甲氧基)-2-R1-6-R2-4-硝基苯加入到第二溶剂中，加入九水硫化钠，室温下搅拌反应，得到4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-苯胺；
(3)将4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-苯胺加入到第三溶剂中，加入甲醇钠、多聚甲醛，搅拌2～5h后，加入硼氢化钠，升温反应，得到4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-N-甲基苯胺；
(4)将异佛尔酮、丙二腈加入到第四溶剂中，加入哌啶、乙酸、乙酸酐，室温搅拌4～8h后，升温反应4～6h，得到化合物1；
(5)将化合物1、对溴苯甲醛加入到第五溶剂中，加入哌啶，40～60℃加热反应8～12h后，得到化合物2；
(6)将化合物2、4-(乙氧基甲氧基)-3-R1-5-R2-N-甲基苯胺、催化剂、膦配体加入到第六溶剂中，在90～120℃下反应，得到化合物15-18；
(7)分别将化合物15-18溶解在第七溶剂中，酸性条件下，分别得到目标产物NIR-PN1～NIR-PN4；
反应过程为：
3.根据权利要求2所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，其特征是，所述第一溶剂为无水四氢呋喃溶剂；所述第二溶剂为乙醇；所述第三溶剂为无水甲醇；所述第四溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述第五溶剂为乙腈；所述第六溶剂为甲苯；所述第七溶剂为四氢呋喃。
4.根据权利要求2或3所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤(3)中的升温反应温度为50～60℃。
5.根据权利要求2～4任一项所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤(4)中的升温反应温度为110～130℃。
6.根据权利要求5所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤(6)中的催化剂为醋酸钯，膦配体为2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦)中的一种。
7.一种权利要求1所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针或根据权利要求2～6任一项所述的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针的制备方法制备得到的对过氧亚硝基阴离子响应的近红外荧光探针在帕金森疾病模型中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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