CN112010865A - 一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用，涉及生物检测技术领域。本发明荧光探针的制备方法是将式(II)所示的8‑羟基‑九洛尼定‑9‑甲醛与乙酸乙酯和哌啶在醇中反应得到式(III)所示的香豆素衍生物；然后再在在惰性气氛下，式(III)所示香豆素衍生物与甲烷磺酸和2‑巯基乙醇在有机溶液中反应，得到式(I)所示的化合物，即本发明的荧光探针。本发明荧光探针具有很高的选择性和灵敏度，可以用于检测次氯酸的小分子荧光探针在活细胞外源性次氯酸检测以及炎症细胞内HOCl动态变化的荧光成像。

Description

一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

次氯酸(HOCl)是生物体内一种必不可少的活性氧物质(ROS),并且与机体内各种病理与生理过程密切相关，对生物体有重要的影响。次氯酸在机体内主要由巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞，通过过氧化氢(H₂O₂)和氯离子(Cl^_)在髓过氧化物酶(MPO)催化下反应产生。次氯酸在细胞内能够用来杀灭细菌，是抵抗入侵免疫系统病原体的有效工具。然而，高浓度的次氯酸会引起氧化应激导致许多疾病，包括炎症、癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。鉴于次氯酸在生命体的重要作用，目前迫切需要开发一种工具来研究次氯酸在机体内的动态变化。

目前有多种方法可以选择性地检测HOCl，但大多数方法繁琐，并且某些方法必须在有机或水性介质中进行，因此限制了这些方法的应用。荧光成像技术近年来发展迅速。它可以高选择性和高灵敏度地实时，无创地研究细胞水平上分子的变化。因此荧光探针是研究分子生命活动的理想工具。目前已成功开发出许多探针来检测细胞中的HOCl。Young-TaeChang等人报道了一种双光子荧光探针，可以检测亚细胞水平的HOCl并成功地对小鼠炎症组织进行成像；Wu Yangjie Wu等人成功开发了一种新型荧光探针，可以检测HOCl和Cys/Hcy的氧化还原过程。然而，上述两种荧光探针在进行检测时，选择性和灵敏度都较差。因此，因此亟须一种具有很高的选择性和灵敏度，用于活细胞内外源性次氯酸根检测以及炎症细胞中次氯酸动态水平的快速检测的荧光探针。

发明内容

本发明提供的一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针，该探针具有式(I)所示的结构式：

其中，上述用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：式(II)所示的8-羟基-九洛尼定-9-甲醛与乙酸乙酯和哌啶在醇中反应得到式(III)所示的香豆素衍生物；

步骤二：在惰性气氛下，式(III)所示香豆素衍生物与甲烷磺酸和2-巯基乙醇在有机溶液中反应，得到式(I)所示的化合物。

上述制备方法中，步骤一中所述8-羟基-九洛尼定-9-甲醛与乙酸乙酯和哌啶的摩尔比为1:1:1；所述醇为无水乙醇，所述反应温度为100℃，反应时间为6小时。

上述制备方法中，步骤二中所述香豆素衍生物与甲烷磺酸和2-巯基乙醇的摩尔比为1:1:1.1；所述惰性气氛为氩气，所述有机溶液为二氯甲烷，所述反应温度为60℃，反应时间为3小时。

优选的，步骤一中所述香豆素衍生物为反应后通过过滤收集悬浮液，并用冷的无水乙醇洗涤，最后将产物在真空下干燥所获得的橙色结晶。

优选的，步骤二中所述式(I)化合物为反应后所得到的沉淀物过滤并通过硅胶柱色谱法纯化，得到的淡黄色固体状化合物。

进一步的，所述硅胶柱色谱法采用的洗脱液为二氯甲烷/甲醇的混合液。

作为优选，所述二氯甲烷/甲醇的混合液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。

本发明还提供了上述用于检测次氯酸的小分子荧光探针在活细胞外源性次氯酸检测以及炎症细胞内HOCl动态变化的荧光成像中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)通过利用香豆素衍生物与巯基乙醇进行简单缩合反应得到荧光探针，荧光探针由于本身具有强烈的绿色荧光信号，其可以在HOCl存在下被氧化还原并且荧光信号迅速减弱，通过本发明的探针紫外吸收与荧光发射的光学性能变化既能进行“裸眼”鉴别，也实现了对细胞内外源性HOCl和炎症细胞内HOCl的动态变化进行荧光成像。

(2)本发明中所合成的新型荧光探针分子中含有C＝N键，在加入次氯酸根对其氧化之后，C＝N键会氧化断裂并且生成新的C＝O键，进而有效猝灭探针的荧光。

(3)本发明中设计并合成了一种具有高灵敏性和选择性的小分子荧光探针，对HOCl有很强的选择性，即使是在一些其他离子的干扰下，也能对次氯酸根进行十分有效的识别。

(4)本发明中荧光探针的光学性质研究发现其可利用紫外与荧光对HOCl进行“裸眼”识别，该探针由于选择性好，反应迅速等优点可被应用于多种实际体系的测试。

(5)本发明中荧光探针对细胞外源性与内源性HOCl的检测以及对炎症细胞内HOCl的动态变化的成像进一步表明探针良好的应用前景，这对深入研究次氯酸在疾病状态下的作用具有重要的生物医学意义。

附图说明

图1是本发明中有机分子荧光探针的氢谱；

图2是本发明有机分子荧光探针的荧光光谱图；

图3是本发明有机分子荧光探针与HOCl作用的紫外-可见光谱测定；

图4是本发明有机分子荧光探针与HOCl作用的响应时间测定；

图5是溶液pH对本发明有机分子荧光探针测定HOCl的影响；

图6是本发明有机分子荧光探针对细胞活力的影响；

图7是本发明有机分子荧光探针对细胞中外源性HOCl的荧光成像检测；

图8是本发明有机分子荧光探针对炎症细胞中内外源性HOCl的荧光成像检测；

图9是本发明有机分子荧光探针对小鼠喉部炎症HOCl的荧光成像检测。

具体实施方式

下面通过实例结合附图对本发明做进一步的说明，实施例仅用于说明本发明的方法，包括但不限于实施例的方法。

实施例1：本发明荧光探针分子的合成：

式(III)所示的香豆素衍生物的合成：

将式(II)所示的8-羟基-九洛尼定-9-甲醛(0.6518g，3mmol)、乙酸乙酯(0.7748g，3mmol)和哌啶(0.5ml，3mmol)溶解在24mL无水乙醇中。将混合物加热并回流6小时，然后冷却至室温。然后通过过滤收集悬浮液，并用冷的无水乙醇洗涤。最后将产物在真空下干燥以获得橙色结晶，得到式(III)所示的香豆素衍生物(0.6715g，79％)。

核磁共振氢谱测定：1H NMR(400MHz,CDCl3-d1)δ(ppm):8.31(s,1H),6.94(s,1H),3.33–3.30(t,4H),2.86–2.84(t,2H),2.76–2.74(t,2H),2.64(s,3H),1.97–1.93(m,4H).13C NMR(CDCl3-d1,125MHZ)δ(ppm):196.08,161.33,153.85,148.82,147.87,127.84,119.60,114.96,108.13,105.70,50.01,30.70,27.49,21.20,20.12.HRMS(ESI+):m/zC17H17NO3 calcd.283.1028,found[M+H]+284.1280。

式(I)所示的荧光探针的合成：

将将式(III)所示的香豆素衍生物(0.2833g，1mmol)、甲烷磺酸(250μm，1mmol)和2-巯基乙醇(250μm，1mmol)溶解在100mL二氯甲烷中。在氩气保护下加热回流3小时，然后冷却至室温，将得到的沉淀物过滤并通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱液二氯甲烷：甲醇＝10:1)，得到淡黄色固体状的荧光探针(0.1336g，37％)。

核磁共振氢谱测定：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.56(s,1H),6.90(s,1H),4.37-4.41(m,1H),4.11-4.13(m,1H),3.24-3.29(m,4H),3.12(d,1H),2.91-2.97(m,3H),2.77-2.91(m,2H),2.00-2.03(t,4H),1.95(s,3H),1.25(s,2H)。

实施例2：本发明中测定有机分子荧光探针的荧光光谱图：

将次氯酸浓度梯度采用PBS缓冲溶液控制，于10ml比色管中依次加入0-50μM浓度梯度的次氯酸，再加入10μM探针，摇匀溶液，37℃下平衡10分钟后，将上述混合后的工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。在470nm激发下荧光强度曲线随次氯酸变化如图2所示。

由图2可知，随着次氯酸浓度的增加，反应体系荧光强度快速减弱；当次氯酸浓度达到50μM时，反应体系荧光几乎全部淬灭。因此探针对次氯酸具有良好的响应性。

实施例3：本发明有机分子荧光探针与HOCl作用的紫外-可见光谱测定：

紫外-可见吸收光谱测定所用的仪器为岛津UV-2600紫外-可见分光光度计。

配置不同浓度梯度的次氯酸(0～50μmol/L)，再向其中加入10μM探针，摇匀溶液，通过紫外-可见分光光度计测定其吸收峰，其测定结果如图3所示。

从图3可以看出，随着次氯酸浓度(0～50μmol/L)的增加，探针在470nm处的吸收峰逐渐减小，410nm处的吸收峰逐渐增强，并且在430nm处形成了等吸收点。这表明次氯酸的加入生成了新的化合物。

实施例4：本发明有机分子荧光探针与HOCl作用的响应时间测定：

配置浓度为50μmol/L次氯酸，再向其中加入10μM探针，其荧光强度测定结果如图4所示。

由图4可知，在50μmol/L次氯酸存在下，荧光探针(10μmol/L)与次氯酸的反应在5s内基本完成，并且荧光强度在30s内基本保持稳定，同时荧光强度达到最大值后荧光强度不再随时间延长而变化，表明荧光探针光稳定性好。

实施例5：溶液pH对本发明有机分子荧光探针测定HOCl的影响：

对探针在不同pH值(3.0～10.0)条件下对次氯酸识别性能做了进一步研究(见图5)。结果表明探针1(10μmol/L)本身的荧光强度比值在pH值7.0～10.0之间基本保持不变。在加入次氯酸(50μmol/L)后，探针1在pH(3～10)范围内荧光强度明显降低。并且在生理环境pH＝7.4下具有良好的稳定性和识别效果。表明探针可能在生物领域具有良好的应用前景。

实施例6：本发明有机分子荧光探针对细胞活力的影响：

A549、HELA、HepG2和RAW264.7细胞在添加了10％FBS的DMEM中，在5％二氧化碳(CO₂)和95％空气中，在37℃下培养。将细胞(8000个细胞/孔)接种到96孔板中并使其贴壁24小时。随后将细胞与0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μM(最终浓度)的探针(溶于DMSO)在37℃的5％CO₂和95％空气中孵育24小时，在与对照相同的条件下，还进行了未经处理的DMEM检测。将CCK-8溶液(5.0mg/mL，10μL)添加到每个孔中。然后将板在5％CO₂和95％空气中孵育1小时后，使用酶标仪(TECAN infinite M200pro)在510nm处测量吸光度，结果如图6所示。

从图6中发现不管在哪一种细胞系，随着探针的浓度增加细胞的存活率下降，但是到探针浓度达到100μM时细胞存活率仍然接近80％，探针浓度在50μM时细胞存活率在90％左右。毒性测试结果表明该探针具有低细胞毒性和高生物相容性的特点。

实施例7：本发明有机分子荧光探针对细胞中外源性HOCl的荧光成像检测：

为了研究探针检测细胞外源性次氯酸能力，首先将活的A549、HELA、HepG2细胞用外源HOCl(50μM)预处理，并与10μM探针孵育后用PBS洗涤三次后通过共聚焦显微镜拍摄图像以观察探针对外源性HOCl的荧光反应，其结果如图7所示。

从如图7可知，在没有添加外源HOCl的情况下三种细胞的荧光信号均较强。而加入外源HOCl后，与对照组相比，三种细胞内的荧光亮度明显减弱。这表明该探针可以有效渗透细胞膜并检测外源性HOCl水平变化。

实施例8：本发明有机分子荧光探针对炎症细胞中内外源性HOCl的荧光成像检测：

为了探索荧光探针在炎症细胞中对HOCl动态变化检测的能力，将活的RAW264.7细胞用不同浓度的外源HOCl(0至50μM)预处理，并与10μM荧光探针孵育后通过共聚焦显微镜拍摄图像以观察探针对HOCl的荧光反应，结果如如图8所示。

从图8中可知，在没有外源HOCl的情况下，装有荧光探针的细胞显示出强烈的荧光信号。在暴露于增加的外源HOCl浓度后，细胞内荧光以浓度依赖性方式逐渐减弱。与对照组相比，加入50μMHOCl可使荧光强度减弱至少五倍，这表明探针可以有效渗透细胞膜并检测RAW264.7外源性HOCl水平变化。

为了研究探针是否具有对炎症细胞内源性HOCl进行成像的潜在能力，使用脂多糖LPS(一种炎症激活剂)来刺激RAW264.7细胞生成内源性HOCl。用LPS(1μg/mL)预处理细胞12h，然后再与荧光探针(10μM)孵育5分钟。如图8所示LPS处理组与对照组相比其绿色荧光增强减弱，而髓过氧化物酶(MPO)是一种过氧化物酶，能够催化过氧化氢和氯离子的转化以次氯酸盐(HOCl)(pKa 7.6)和其他氯化物。

为了探索MPO生成HOCl的机制，将RAW264.7细胞与MPO\H₂O₂\Cl^-预孵育，然后与荧光探针孵育。在MPO与H₂O₂\Cl^-共同处理组中观察到荧光强度明显减弱，而单独的MPO、H₂O₂\Cl^-处理组中荧光强度只有轻微减弱。相比之下，与未经处理的组相比，4-氨基苯甲酸酰肼(4-ABAH)或水杨基羟肟酸(SHA)(众所周知的MPO抑制剂)理的细胞在绿色通道中的荧光信号明显增强，以上一系列实验清楚地表明抑制MPO活性可导致细胞内HOCl生成减少，并暗示其有望作为一种简单的工具来探索在MPO的介导下炎症细胞内外源HClO水平的动态变化。

实施例9：本发明有机分子荧光探针对小鼠喉部炎症HOCl的荧光成像检测：

为了研究探针是否具有对炎症组织内HOCl进行成像的能力，使用脂多糖LPS(1μg/mL)(一种炎症激活剂)来刺激小鼠喉部组织产生HOCl。然后在炎症区域注射荧光探针(10μM，50μL DMSO：盐水＝1:99，v:v)后对炎症组织成像，如图9所示。

从图9中可知，随着时间的增加荧光强度逐渐减弱，表明荧光探针能够对活体的炎症区域内的次氯酸进行成像，预示探针具有临床应用的能力。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种用于检测次氯酸的小分子荧光探针，其特征在于，该探针具有式(I)所示的结构式：

2.一种如权利要求1所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：式(II)所示的8-羟基-九洛尼定-9-甲醛与乙酸乙酯和哌啶在醇中反应得到式(III)所示的香豆素衍生物；

步骤二：在惰性气氛下，式(III)所示香豆素衍生物与甲烷磺酸和2-巯基乙醇在有机溶液中反应，得到式(I)所示的化合物。

3.根据权利要求2所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤一中所述8-羟基-九洛尼定-9-甲醛与乙酸乙酯和哌啶的摩尔比为1:1:1；所述醇为无水乙醇，所述反应温度为100℃，反应时间为6小时。

4.根据权利要求2所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤二中所述香豆素衍生物与甲烷磺酸和2-巯基乙醇的摩尔比为1:1:1.1；所述惰性气氛为氩气，所述有机溶液为二氯甲烷，所述反应温度为60℃，反应时间为3小时。

5.根据权利要求2所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤一中所述香豆素衍生物为反应后通过过滤收集悬浮液，并用冷的无水乙醇洗涤，最后将产物在真空下干燥所获得的橙色结晶。

6.根据权利要求2所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤二中所述式(I)化合物为反应后所得到的沉淀物过滤并通过硅胶柱色谱法纯化，得到的淡黄色固体状化合物。

7.根据权利要求6所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述硅胶柱色谱法采用的洗脱液为二氯甲烷/甲醇的混合液。

8.根据权利要求7所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述二氯甲烷/甲醇的混合液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。

9.根据权利要求1-8任一项所述的用于检测次氯酸的小分子荧光探针在活细胞外源性次氯酸检测以及炎症细胞内HOCl动态变化的荧光成像中的应用。

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