CN112552901B - 一种比率型锌离子荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

一种比率型锌离子荧光探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种比率型锌离子荧光探针及其制备方法和应用。该方法包括：(1)将5‑邻位氨基对位磺酸基苯基‑10,15,20‑三磺酸基苯基卟啉(o‑PNH2)的水溶液与三光气的二氯甲烷溶液等体积混合后常温反应，得到5‑邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基‑10,15,20‑三磺酸基苯基卟啉(o‑PNCS)。(2)o‑PNCS与氨甲基吡啶衍生物于常温下反应，得到最终产物卟啉–吡啶(o‑SP)探针。该探针水溶性好，对水溶液中的锌离子进行荧光检测时，荧光信号双发射峰成比率型变化，且不受钠、钾、镁、铁、锰等金属离子的干扰；结合激光共聚焦扫描显微技术，还可实现该探针在活细胞内对锌离子的荧光检测成像。

Description

一种比率型锌离子荧光探针及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种比率型锌离子荧光探针，具体涉及一种以吡啶为信号识别基团，卟啉分子为荧光发色团的卟啉–吡啶(o-SP)类水溶性锌离子荧光探针的制备方法，该探针分子应用于水溶液及细胞中锌离子的检测。
背景技术
锌是人体中含量第二的微量金属元素，以二价阳离子的形式广泛分布于各种组织器官中。锌离子作为一种重要的辅助因子，是人体内两百多种酶的核心组成部分，参与了包括大脑的功能与调节、基因转录、免疫反应和哺乳动物繁殖等一系列生理过程。此外，锌含量的变化还与阿尔茨海默病、癫痫、缺血性心脏病以及婴幼儿腹泻等疾病的发生有关。因此，快速灵敏的对锌离子进行检测具有重要的临床意义与应用前景。
由于锌离子具有稳定的3d10电子结构，其自身无可测定的光谱和核磁信号，常用的紫外光谱、圆二色谱、核磁共振和电子顺磁共振均不适于对锌离子的测定。目前国内外测定锌离子的方法主要包括原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电子顺磁共振、离子色谱法等。除了检测仪器价格昂贵、体积庞大、操作复杂且维护较为困难外，还存在着无法对生物体内锌离子进行实时、原位动态检测等缺点。荧光检测法因其检测信号直观、操作便捷，灵敏度高等优点，近年来得到迅速发展。其中，比率型荧光探针以相同背景下测定的不同波长处的荧光强度的比值作为信号参数，能极大程度的降低各种环境因素干扰，进一步提高检测的灵敏度和准确性，对细胞内金属离子检测有着良好的应用前景。
比率型锌离子荧光探针主要由两部分组成：一部分是可与锌离子特异结合的识别基团，另一部分是起到荧光发射作用的信号基团。识别基团与锌离子结合从而引起信号基团光物理性质的变化，达到对锌离子特异性检测的目的。在比率型锌离子光化学探针的设计中，识别单元的选择十分重要，它决定了整个探针分子与锌离子的结合灵敏性和选择性，并进一步影响荧光团的信号输出。公开号为CN106588967A的专利“一种氟硼二吡咯类荧光探针及其制备方法和应用”，公开号为CN104597015B的专利“锌离子检测用量子点比率荧光探针及其检测方法”均报道了比率型锌离子探针在水环境中的应用，其他类型的锌离子探针如公开号为CN1715919A的专利“细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针”报道了锌离子探针在生物环境的应用。虽然这些探针有着较高的锌离子选择性及灵敏度，但在实际应用，尤其是在生物应用方面，如锌离子的细胞成像检测中仍然面临很多问题：例如有些探针分子水溶性差，难以入胞进行生物检测，强行添加一定比例的有机溶剂虽有助于探针进入细胞组织，但却对生物体具有一定的毒性而难以广泛应用；有些探针虽然水溶性良好，但本身具有较高的生物毒性，同样难以应用于生物成像；有些探针本身的荧光基团发光波长过低，与生物样品的背景荧光波长相当，从而导致探针的灵敏度受到影响而难以应用于生物检测；此外，一些探针虽然具有良好的水溶性与较小的细胞毒性，但合成步骤繁琐，限制了其进一步的应用。因此，选择具有良好生物适应性，适用于生物体内成像的荧光基团；构建出特异的识别基团，从而提高其灵敏度和选择性；并在此基础上改善探针分子的水溶性与细胞毒性，最终实现生物体内锌离子的高灵敏高选择性检测是解决上述问题的关键。
发明内容
针对现有荧光探针所存在的制备复杂、水溶性差、生物毒性大及生物稳定性差等问题，本发明第一个目的是提供一种比率型锌离子荧光探针。
卟啉是一类由四个吡咯环通过次甲基相连形成的环状共轭大分子，是性能优异的荧光发色基团，它的吸收和发射峰均在可见光区，能够尽可能地减少背景荧光的干扰。此外，卟啉的结构容易修饰，能较容易的添加特异的识别基团或者其他基团从而调节其选择性、灵敏性与水溶性。此外，卟啉是生物体内血红蛋白、细胞色素和酶的辅基，具有特殊的生物活性，毒性较低，完全可以应用于生物成像。因此，可通过分子设计和化学反应将其与锌离子识别单元结合，合成一系列光物理和光化学性质可调的功能化荧光探针，应用于水体及生物体内锌离子的检测。本发明采用的技术方案是；
一种卟啉–吡啶水溶性锌离子荧光探针(o-SP)，具有如下结构通式：
Figure BDA0002196642430000031
其中，
Figure BDA0002196642430000032
本发明的第二个目的是提供一种比率型锌离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
将5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)溶于蒸馏水中，将三光气溶于三氯甲烷中，两者以5:1的体积比混合后常温下反应2～4h后，于1000kDa的透析袋中透析40～50h，冷冻干燥20～28h后得到5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)；将5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)与2-氨甲基吡啶混合后溶于蒸馏水中，形成浓度为10mg/mL的溶液，在常温下反应6～10h后，于1000kDa的透析袋中透析40～56h，冷冻干燥20～28h后得到最终的产物卟啉–吡啶(o-SP)。
进一步地，所述制备方法，具体包括如下步骤：
(1)以市售吡咯、苯甲醛、邻硝基苯甲醛为起始原料，将吡咯、苯甲醛、邻硝基苯甲醛以2:1:1的摩尔质量比混合后溶于二甲苯中，形成吡咯0.4mmol/mL，苯甲醛和邻硝基苯甲醛均为0.2mmol/mL的溶液，加热至回流；反应进行1～3h后，利用薄层层析法判断反应进行程度，待产物点不再增加时停止加热；反应液冷却至室温后，向其中加入与二甲苯等体积的石油醚使副产物及杂志析出，抽滤并取滤液旋干得5-邻位硝基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-NTPP)粗产物。将o-NTPP粗产物与氯化亚锡以1:10的质量比混合后，加入浓盐酸中，形成0.3g/mL的混合液，搅拌并加热至70度；反应8～10h后，利用薄层层析法判断反应进行程度，待原料点全部反应时停止加热，冷却后抽滤得固体，为5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)粗产物。硅胶色谱柱分离，二氯甲烷为展开剂，收集第二条色带产物，得到5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)。
o-NTPP的结构式为：
Figure BDA0002196642430000041
o-ATPP的结构式为：
Figure BDA0002196642430000042
(2)将5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)溶于浓硫酸中，形成15mg/mL的溶液，加热至回流，反应6～9h，利用薄层层析法判断反应进行程度，待原料点全部反应后停止加热；反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液中和至溶液的pH为7，于1000kDa的透析袋中透析45～50h，冷冻干燥20～28h，待水溶液后得到5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)。
o-PNH2的结构式为：
Figure BDA0002196642430000043
(3)将5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)溶于溶剂一中，将三光气溶于溶剂二中，两者以5:1的体积比混合后常温下反应2～4h，利用薄层层析法判断反应进行程度，待原料点全部反应后，停止反应；于1000kDa的透析袋中透析46～50h，冷冻干燥20～28h后得到5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)。
o-PNCS的结构式为：
Figure BDA0002196642430000051
(4)5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)与氨甲基吡啶衍生物混合后溶于溶剂一中，形成浓度为20mg/mL的溶液，在常温下反应6～10h，利用薄层层析法判断反应进行程度，待原料点全部反应后，于1000kDa的透析袋中透析46～56h，冷冻干燥20～28h后得到最终的产物卟啉–吡啶(o-SP)。
o-SP的结构式为：
Figure BDA0002196642430000052
其中，
Figure BDA0002196642430000053
所述溶剂一是蒸馏水。所述溶剂二是三氯甲烷。
所述的步骤(1)中5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)的合成参照文献：单取代铁卟啉的合成、性质与催化活性分析(Filho J C S,Ferreira A G,Gotardo M CA F,et al.Mono-crowned substituded iron porphyrin:synthesis,analyticalproperties and catalytic activity[J].Journal of Porphyrins andPhthalocyanines,2005,09(09):637-645.)中报道的方法，通过优化吡咯、苯甲醛、邻硝基苯甲醛的比例，调整溶剂与加热回流时间，获得产率较高的5-邻位硝基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-NTPP)粗产物，在不进行分离的情况下直接进行还原反应，其后通过柱层析分离得到产率与纯度较高的5-邻位氨基苯-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)。与文献相比，步骤1中o-ATPP的合成产率提高了250％。
所述的步骤(2)中5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)的合成参照文献：一种简便的合成与纯化四(4-磺酸基)苯基卟啉的方法(SrivastavaT S,Tsutsui M.Unusual metalloporphyrins.XVI.Preparation and purification oftetrasodium meso-tetra(p-sulfophenyl)porphine.Easy procedure[J].The Journalof Organic Chemistry,1973,38(11):2103-2103.)中报道的方法，通过优化o-ATPP与浓硫酸的比例，调整加热回流时间，获得产率与纯度较高的5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)。
所述的步骤(3)中5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)与溶剂一的加入量之比优选为15mg/mL，三光气与溶剂二的加入量之比优选为5μL/mL，这两个比例可使得5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)与三光气分别在溶剂用量最少的情况下溶解最充分，更利于反应充分进行并符合绿色化学的主张。
所述的步骤(4)中5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)的水溶液与三光气的二氯甲烷溶液体积比优选1:1，这个体积比可以使得溶液中5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉与三光气的摩尔比为1:7.5，由于底物o-PNH2与产物o-PNCS的分子量相近，透析难以分离，而过量的三光气底物可以通过透析步骤除去，因此，该比例可最高效率促进5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)转化为5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)，不但提高了原料o-PNH2的利用度，还降低了透析除杂所需的时间。
所述的步骤(4)中5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)与2-氨甲基吡啶混合物的摩尔比为1:1。实验表明，当二者摩尔比为1:1时，反应底物利用度最高、所需反应时间最少，副产物也最少。
采用所述的制备方法制得的探针分子，所述的卟啉–吡啶(o-SP)分子为水溶性分子。
所述的卟啉–吡啶(o-SP)分子可通过卟啉空腔中的N原子与吡啶基团上N原子的共同作用，与锌离子发生特异性配位，锌离子接受N原子的孤对电子形成σ键,电子由卟啉-吡啶(o-SP)流向锌原子,使得卟啉-吡啶(o-SP)上的电子云密度降低；从而增加了电子跃迁所需要的能量，造成卟啉信号基团的荧光特性发生改变，实现锌离子的专一性检测。如下(以邻位吡啶为例)所示：
Figure BDA0002196642430000071
所述的卟啉–吡啶(o-SP)分子具有良好的膜穿透性，可用于细胞内锌离子的检测。
因此，本发明提供了上述比率型锌离子荧光探针的制备方法制备的卟啉–吡啶(o-SP)荧光探针在水溶液中微量锌离子检测的应用以及在活细胞中微量锌离子检测的应用。
本发明具有如下优点：
(1)本发明的卟啉–吡啶(o-SP)探针分子的合成方法，条件温和、步骤简单，后处理简便；
(2)本发明利用锌离子可与该卟啉-吡啶探针中卟啉空腔的四个氮原子结合，并与吡啶氮原子轴向配位，形成五配位的特异结合，其它离子无明显干扰，实现了锌离子检测的专一性与准确性；
(3)本发明使用卟啉分子作为荧光报告基团，该分子为近红外荧光发色团分子，光学性能优异、结构稳定、对微环境敏感、可获得较大的Stocks位移，增强了反应信号的灵敏度；
(4)本发明的卟啉-吡啶(o-SP)探针分子具有良好的水溶性，能够对锌离子显示出荧光敏感性质，可实现水溶液中低达10-8mol/L浓度的锌离子快速检测，且能够对锌离子的检测显示出高选择性；
(5)借助于激光共聚焦扫描显微技术，本发明的卟啉–吡啶(o-SP)探针可用于细胞内锌离子检测成像。
附图说明
图1为实施例1制备的卟啉–吡啶(o-SP)探针溶液对不同金属离子的荧光变化图；
图2为实施例1制备的卟啉–吡啶(o-SP)探针的锌离子滴定荧光光谱图；
图3为实施例1制备的卟啉–吡啶(o-SP)探针与锌离子的配位比荧光光谱图；
图4为实施例3制备的卟啉–吡啶(o-SP)探针的细胞内锌离子检测的激光共聚焦显微成像图。
具体实施方式
实施例1
将吡咯(2.7g,0.04mol)、苯甲醛(2.1g,0.02mol)、邻硝基苯甲醛(3.0g,0.02mol)溶于100mL二甲苯中，形成吡咯0.4mmol/mL，苯甲醛和邻硝基苯甲醛均为0.2mmol/mL的溶液，加热至回流，反应2h后停止加热；反应液加入等体积的石油醚至黑色糊状沉淀析出，取溶液旋干，得到5-邻位硝基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-NTPP)粗产物；
将o-NTPP粗产物(2.0g)溶于80mL浓盐酸，加入氯化亚锡20g，形成0.275g/mL的混合液，加热至70度，反应8h后停止加热，反应液冷却后抽滤，得固体，为5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)粗产物。硅胶色谱柱分离，二氯甲烷为展开剂，收集第二条色带产物。得到5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)。
将5-邻位氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(o-ATPP)(120mg，0.19mmol)溶于8mL浓硫酸中，形成15mg/mL的溶液，加热至回流，反应9h后停止加热；反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液中和至溶液的pH为7，于1000kDa的透析袋中透析48h，冷冻干燥24h后得到5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)。
将5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)(150mg,0.157mmol)溶于10mL蒸馏水中，将三光气(20μL,0.26mmol)溶于2mL三氯甲烷中；将混合后的三光气三氯甲烷溶液缓慢滴加至o-PNH2的水溶液中，常温下反应4h后，于1000kDa的透析袋中透析48h，冷冻干燥24h后得到5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)。
将5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)(100mg,0.101mmol)与2-氨甲基吡啶(10mg，0.1mmol)混合后溶于5mL蒸馏水中，在常温下反应8h后，于1000kDa的透析袋中透析56h，冷冻干燥24h后得到最终的产物卟啉–吡啶(o-SP)，采用核磁共振氢谱、高分辨质谱验证其化学结构。其结构式如下：
Figure BDA0002196642430000091
应用例1
卟啉–吡啶(o-SP)探针分子对水溶液中锌离子的选择性检测：由于只有锌离子可与卟啉–吡啶(o-SP)上卟啉空腔中的氮原子以及吡啶上的氮原子发生特异性的五配位结合，引起卟啉信号基团发生颜色及光谱信号响应，因此可将一定浓度的o-SP分子水溶液中分别加入等浓度的不同金属离子水溶液中，采用荧光光谱测定其荧光变化。具体过程如下：在5mL菌种瓶中加入实施例1中制备的o-SP水溶液0.5mL(10μM)，再分别加入等当量的Na+,Sn2+,Fe3+,Cu2+,Hg2+,Mg2+,Ca2+,Ba2+，Zn2+,Ni2+,Al3+,K+,Cd2+,Na+的水溶液0.5mL，静置30分钟后，采用荧光光谱测定加入不同金属离子的荧光变化谱图。结果如图1所示。只有Zn2+可引起o-SP探针608nm处的荧光强度的增强，650nm处的荧光强度减弱，说明o-SP探针对锌离子有较高的选择性(图1)。
应用例2
卟啉–吡啶(o-SP)探针分子对水溶液中不同浓度锌离子的荧光滴定：在10mL容量瓶中加入实施例1中制备的o-SP水溶液1.0mL(10μM)后，再分别加入不同浓度的锌离子水溶液1.0mL，静置30分钟后，采用荧光光谱测定加入不同浓度锌离子的荧光变化谱图。结果如图2所示。随着锌离子浓度的增强，651nm处的荧光强度逐渐减弱，608nm处的荧光强度逐渐增强，说明o-SP溶液对于锌离子表现出比率型荧光响应(图2)。
应用例3
实验之前采用纯化水配制1mM的由实施例1制备的卟啉–吡啶(o-SP)探针分子储备液。取上述100μL o-SP分子储备液分别加入含有贴壁细胞的培养皿中，置于37℃的5％培养箱中孵育15min后，弃掉储备液，并用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗3次，以除去培养皿中过量的未进入细胞的探针分子。取其中一个经o-SP分子孵育的细胞培养皿，进一步加入2当量的锌离子水溶液100μL，置于37℃的5％培养箱中孵育15min后，弃掉水溶液，并用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗3次，以除去培养基中过量的未进入细胞的锌离子。将以上两组细胞分别固定在96孔板上后，采用奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜观察成像情况。结果如图4所示。可以看出，未加入锌离子之前，细胞内无明显荧光；锌离子加入后，细胞内呈现出明显的荧光增强。说明所合成的o-SP分子具有良好的细胞膜穿透性，且对细胞内锌离子表现出优异的检测性能。
激光共聚焦显微镜的参数如下：a.激光功率是氩离子激光器总输出功率50mW的20％，激发光波长594nm，分光镜为TD 488/543nm，检测发射波段为600nm～620nm；b.激光扫描强度是激光输出功率的10％；c.探测针孔为1Airy单位；d.光电倍增管电压为1000V。
对比实施例
本发明对比现有已报道的荧光探针，具备有制备方便、水溶性好、生物毒性小及生物稳定性高等优点，具体对比实施例如下所示。
对比实施例1
文献(Burdette S C,Walkup G K,Spingler B,et al.Fluorescent sensors forZn2+based on a fluorescein platform:Synthesis,properties and intracellulardistribution[J].Journal of the American Chemical Society,2001,123(32):7831-7841.)中，探针Zinpyr-2的合成需要4步，首先，通过在4’，5’-二甲基荧光素的酚氧基团上添加苯甲酸保护基，再依次通过自由基溴化反应，水解反应，添加DPA基团和水解反应得到终产物；其中第三步的水解反应为整个合成过程的关键步骤，若使用为干燥的DMSO作为溶剂，则反应产率只有50％，且DMSO分离困难，这大大增加了合成的复杂程度，限制了探针的进一步应用。
对比实施例2
在文献(Hirano T,Kikuchi K,Urano Y,et al.Improvement and BiologicalApplications of Fluorescent Probes for Zinc,ZnAFs[J].Journal of the AmericanChemical Society,2002,124(23):6555-6562.)中，探针ZnAF的合成更是需要五步反应，作者以4-硝基邻苯二甲酸酐和4-氟间苯二酚为起始原料，通过金属化，溴乙烷化，添加DPA及水解五步反应得到终产物，虽然每一步的反应条件都并不苛刻，但较长的反应步骤，仍然限制了探针进一步应用。
在本专利中，利用商业可得的o-PNH2，只需要两步反应便可得到o-SP，反应条件温和，后处理方便，增加了探针进一步应用的可能性。
对比实施例3
文献(Ingale S A,Seela F.Aratiometric fluorescent on-off Zn2+chemosensor based on a tripropargylamine pyrene azide click adduct[J].Journalof Organic Chemistry,2012,77(20):9352-9356.)中，探针1以三聚炔丙胺芘结构为主题，虽然合成简便，只需要一步反应，但该结构的探针因为没有水溶性基团的存在，故无法溶于水。作者用该探针在乙腈/二氯甲烷(1000:1,体积比)的溶液中对锌离子进行检测，得到较好的结果。但因为只能在有机溶剂体系中进行溶解，导致该探针不但难以应用于自然水体种的锌离子检测，更是无法应用于生物环境的锌离子检测，大大增加了探针应用的局限性。
对比实施例4
在文献(Dong W K,Akogun S F,Zhang Y,et al.A reversible“turn-on”fluorescent sensor for selective detection of Zn2+[J].Sensors&Actuators BChemical,2017,238:723-734.)中，探针H2L的合成较为简便，以3-氨基-2-羟基苯乙酮肟为起始原料，通过两步反应得到，反应条件温和，且探针的水溶性也得以改善，但同样难以溶于纯水溶液，需要在甲醇/水(9:1,体积比)的混合溶剂中进行溶解。强行添加一定比例的有机溶剂虽有助于探针进入细胞组织，但却对生物体具有一定的毒性而难以广泛应用。
对比实施例5
在文献(Dudina N,Antina E,Guseva G,et al.New fluorescent chemosensorfor Zn ions on the basis of 3,3’-bis(dipyrrolylmethene)[J].Russian Journal ofOrganic Chemistry,2013,49(12):1734-1739.)中，作者以3,5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸甲酯为起始原料，通过甲基缩合、氧化脱羧、偶联三步反应得到探针H2L。反应条件较为温和，由于探针H2L极性较小，无法溶于水，虽然在三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺体系中获得了较好的锌离子检测性能，但由于水溶性的限制，使得该探针无法进一步应用于生物体系的锌离子检测。

Claims (7)

1.一种比率型锌离子荧光探针，其特征在于，所述的探针分子的结构式如下：
Figure FDA0003615663350000011
其中，
Figure FDA0003615663350000012
2.一种比率型锌离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNH2)溶于溶剂一中，将三光气溶于溶剂二中，两者以5:1的体积比混合，在常温下反应2～4h后，于1000kDa的透析袋中透析40～50h，冷冻干燥20～28h后得到5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)；
(2)5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)与氨甲基吡啶混合后溶于溶剂一中，形成浓度为20mg/mL的溶液，在常温下反应6～10h后，于1000kDa的透析袋中透析46～56h，冷冻干燥20～28h后得到最终的产物卟啉–吡啶(o-SP)；
所述的氨甲基吡啶为2-氨甲基吡啶(2-EP)，或3-氨甲基吡啶(3-EP)，或4-氨甲基吡啶(4-EP)，结构式如下：
Figure FDA0003615663350000013
所述终产物卟啉–吡啶(o-SP)的结构式为：
Figure FDA0003615663350000014
其中，
Figure FDA0003615663350000015
3.根据权利要求2所述的一种比率型锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)(2)中所述溶剂一是蒸馏水，所述溶剂二是三氯甲烷。
4.根据权利要求2所述的一种比率型锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中5-邻位氨基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉与溶剂一的加入量之比为15mg/mL，三光气与溶剂二的加入量之比为5μL/mL，二者混合过程为三光气与溶剂二混合形成的溶液二，缓慢滴加至o-PNH2与溶剂一形成的溶液一中。
5.根据权利要求2所述的一种比率型锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中5-邻位异硫氰酸基对位磺酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(o-PNCS)与氨甲基吡啶衍生物混合后的摩尔比为1:1。
6.如权利要求2所述的一种比率型锌离子荧光探针的制备方法制备的卟啉–吡啶(o-SP)荧光探针在水溶液中微量锌离子检测的应用。
7.如权利要求2所述的一种比率型锌离子荧光探针的制备方法制备的卟啉–吡啶(o-SP)荧光探针在活细胞中微量锌离子检测的应用。
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A porphyrin derivative containing 2-(oxymethyl)pyridine units showing unexpected ratiometric fluorescent recognition of Zn2+ with high selectivity;Chun-Yan Li et al.，;《analytica chimica acta》;20080416;第616卷(第2期);第214-221页 *

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