CN1844119A - 检测细胞内锌离子的近红外荧光探针及合成方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供检测细胞内锌离子的近红外荧光探针及合成方法和用途,该合成方法按如下步骤进行:a.以花菁染料Cy.7∶络合基团=1∶5~10的重量份配比为原料加入N,N-二甲基甲酰胺溶解,然后在惰性气体保护和60~70℃下反应2-5小时;b.将a工序所得反应混合物室温下冷却至10~20℃,减压蒸干,后用乙醚溶解,再加入水萃取至分层,取萃取液I加入乙酸乙酯萃取至分层,得萃取液II;c.取b工序所得萃取液II加无水硫酸镁干燥,后在30~40℃下减压蒸干,蒸除乙酸乙酯,得产品。该近红外荧光探针细胞渗透性好,对细胞本身没有毒副作用,特别适于细胞内锌离子检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术及临床医学检测领域,尤其涉及用于检测细胞内锌离子的近红外荧光探针;本发明还涉及该荧光探针的合成方法;另外,本发明还涉及该荧光探针的用途。
背景技术
锌离子是生物体中第二富集的过渡金属。大量的锌离子集中在神经组织中,如在脑组织中的浓度是0.1-0.5nM。锌离子通过金属调整蛋白直接参与调整基因表达,如锌作为锌指蛋白的组成,可通过改变染色质的结构或通过中断DNA的合成来影响基因表达。生物体内大部分的锌离子都与蛋白质紧紧结合,某些细胞中存在着“游离锌池”。锌离子在金属蛋白中作为一种构造因子。锌可以抑止超氧自由基的产生以及消除超氧自由基的毒害作用。锌离子能够从突触囊中释放出来并通过电位调控型钙离子信道进入细胞,这表明游离锌离子还具有神经调节功能。同时,生物体内外的大量证据都说明锌在细胞凋亡中是一种重要的调整元素。
现有许多方法,包括原子吸收光谱法,电子顺磁共振,Electron ProbeMicronalysis等,已经被用于细胞内的金属离子的检测,但是这些方法所用仪器昂贵,不能够对生物体内金属离子进行实时、原位动态检测,并且这些方法测定时样品的预处理比较复杂,所以应用受到一定的限制。
目前,已有的能够进行细胞锌离子检测用的荧光探针主要有以下几类:TSQ(Frederickson,C.J.;Kasarkis,E.J.;Ringo,D.;Frederickson,R.E.J.Neurosci.Methods,1987,20,91-103.)、Zinquin乙酯(Tsuda,M.Neurosci.,17,6678,1997)丹磺酰基氨基乙基环楞胺(Koike,T.;Watanabe,T.;Aoki,S.;Kimura,E.;Shiro,M.,J.Am.Chem.Sic.,118,12696-12703,1996)zinpyr(Burfrtte,S.C.;Frederickson,C.J.;Bu,W.;Lippard,S.J.,J.Am.Chem.Soc.,2003,125,1778-1787.)及ZnAF(Hirano,T.;Kikuchi,K.;Urano,Y.;Higuchi,T.;Nagano,T.J.Am.Chem.Soc.,2002,124,6555-6562.)等,但这些探针缺点在于其激发波长处于紫外区(~350nm),激发时会对细胞产生损伤,且由于其发射波长位于紫外或者可见区,生物本体自荧光干扰严重,对pH变化比较敏感,使其受到了一定的限制。另外存在的问题就是这类探针分子合成起来一般比较困难,结构比较复杂,实际应用会有一定困难。
发明内容
本发明的目的改进现有的用于细胞内锌离子检测的荧光探针的性能和结构上的不足,设计合成出性能优良、适用于锌离子检测的基于花菁荧光染料的探针分子作为研究目标。
本发明的目的之一旨在克服现有技术荧光探针的性能和结构上的不足之处,提供一种性能优良、适用于锌离子检测的基于花菁荧光染料的检测细胞内锌离子的近红外荧光探针;目的之二是提供工艺简单、成本低、操作方便的该近红外荧光探针的合成方法;目的之三是提供该荧光探针的用途。
本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现:
该花菁染料荧光探针具有下列结构通式:
通式中:R=-CH2CH3,-CH2CH2CH3,-CH2CH2CH2CH2SO3 -。
本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现:
该合成方法按如下步骤进行:
a.以花菁染料Cy.7∶络合基团=1∶5~10的重量份配比为原料加入N,N-二甲基甲酰胺溶解,然后在惰性气体保护和60~70℃下反应2-5小时;
b.将a工序所得反应混合物室温下冷却至10~20℃,减压蒸干,后用乙醚溶解,再加入水萃取至分层,取萃取液I加入乙酸乙酯萃取至分层,得萃取液II;
c.取b工序所得萃取液II加无水硫酸镁干燥,后在30~40℃下减压蒸干,蒸除乙酸乙酯,得产品。
本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现:
a工序所述的花菁染料Cy.7是具有近红外荧光光谱的花菁类染料;a工序所述的络合基团选自二(2-吡啶甲基)胺、喹啉磺酰胺或4,7,10-三甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基;b工序所述的水∶乙醚=1∶1~1.5的重量份;所述的乙酸乙酯∶萃取液I=1∶1~1.5的重量份;所述的萃取均在室温下进行;b、c工序中所述的减压蒸干是指油泵减压,35~45℃旋转蒸发。
本发明代表性的化合物显示在下面的合成方案中。
在惰性气体保护下,花菁荧光染料与二(2-吡啶甲基)胺在N,N-二甲基甲酰胺中反应得到探针分子,最后经过萃取分离得到探针纯品。
本发明的荧光探针在使用时没有特殊的限制,通常,可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙醇、乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂中,然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现:
将本发明的检测细胞内锌离子的近红外荧光探针用于化学模拟生物体系中锌离子的检测,生物活细胞和活组织内的锌离子的分析检测和荧光成像检测,以及临床医学上病变组织中锌离子的检测。
细胞内锌离子检测的一般方法是将培养好的细胞放于含有探针分子的缓冲溶液中孵化,将一部分细胞用激光共聚焦显微镜成像得到空白图像,然后将剩下的细胞一部分浸入含有锌离子及对锌离子选择性的离子载体中,分别用培养液冲洗后,进行激光共聚焦显微成像。然后将含有络合物的细胞浸入含有N,N,N’,N’-四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)的溶液中,进行激光共聚焦显微成像。
本发明具有如下积极效果:
该荧光探针分子属于近红外荧光探针,可以有效避免细胞自发荧光的干扰,提高检测方法的选择性和灵敏度,减少对生命体的损伤,有利于活体检测。探针分子激发在720-730范围内,发射在780-790范围内,对溶剂极性不敏感,有较大的Stokes位移,并且化学-光稳定性好;本发明荧光探针分子的设计基于分子内诱导电子转移(PET)原理,荧光探针分子络合锌离子前荧光量子产率低于0.1,络合锌离子后荧光量子产率高于0.4,锌离子络合前后量子产率至少有20几倍的增长;荧光探针分子对锌离子有很好的选择性,钠、钾、钙、镁、铁、钴、镍、铜、汞等金属离子对检测没有影响;荧光探针分子对pH变化不敏感,当pH值在6到8范围内,pH值变化对荧光发射没有影响;荧光探针分子与锌离子之间的络合常数在微摩尔到皮摩尔浓度范围内,可以检测纳摩尔浓度的细胞锌离子;荧光探针分子细胞渗透性好,对细胞本身没有毒副作用,适于细胞内锌离子浓度变化的检测。
本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子其激发波长位于近红外区,有很大的Stokes位移,对pH变化极不敏感,响应时间极短,测定灵敏度极其高,对细胞的渗透性和毒副作用小,使得这类探针作为正确测定生物体内锌离子的试剂是极其有用的。另外该系列探针分子结构简单,合成方法简单且效率高,使得极易推广实际应用。
附图说明
图1是本发明的荧光探针分子对锌离子具有良好的选择性;横坐标为各种离子,纵坐标为加入金属离子与未加金属离子的探针分子溶液的荧光强度的比值。
图2是本发明的荧光探针分子的荧光强度和锌离子浓度的关系;横坐标为波长(nm)纵坐标为荧光强度。
图3是本发明的荧光探针分子荧光强度与pH变化关系;横坐标为pH,纵坐标为相对荧光强度。
图4是本发明的荧光探针分子研究小鼠的巨噬细胞(RAW264.7)的激光共聚焦显微成像。
具体实施方式
参照附图1~4做进一步说明:
探针对锌离子选择性
使用上述合成的化合物评价对锌离子的选择性。将1μM的化合物加到各种金属离子的pH7.4的羟乙基哌秦乙硫磺酸缓冲溶液中(0.1mM),探针激发波长为731nm,发射波长为780nm,测试结果显示于图2中。图1中,对于纵轴的荧光强度,不添加金属离子时的荧光强度设为1,用数值表示添加各种金属离子时的荧光强度。从图1中可以看到,化合物对锌离子具有很高的灵敏,锌离子的加入产生很大的荧光增强,另外对锌离子也有很好的选择性,钠、钾、钙、镁、铁、钴、镍、铜、汞等金属离子对检测没有影响。
探针对pH的不敏感性
使用上述合成的化合物评价探针对pH的敏感性从图3中可以看出在pH6到8范围内,pH变化对荧光发射基本没有影响。因此探针可用于生理条件下锌离子的检测。
细胞培养
RAW264.7细胞由高糖的DMEM培养液培养,成像前,细胞贴壁于盖波片上,然后加入1μM探针的缓冲液中,37℃中孵育30分钟,然后将一部分细胞用激光共聚焦显微镜成像得到空白图像,然后将剩下的细胞一部分浸入含有锌离子及对锌离子选择性的离子载体中,分别用培养液冲洗后,进行激光共聚焦显微成像。然后将含有络合物的细胞浸入含有TPEN的溶液中,进行激光共聚焦显微成像。
激光共聚焦成像
利用激光共聚焦显微镜成像技术,研究小鼠的正常巨噬细胞(RAW264.7)内锌离子浓度变化对探针荧光强度的影响。通过图4(a):探针孵育过的巨噬细胞,可以看到有微弱的荧光;通过图4(b):当外加锌离子后,可以观察到细胞质内有很强的荧光;通过图4(c):在此基础上向其中加入对锌离子有极强络合性的TPEN后,荧光淬灭;图4(d)为亮场图像,以表明细胞在整个实验过程中仍保持良好的细胞活力。
实施例1:
探针的合成
在100ml三口烧瓶中,加入0.3克(5mmol)具有近红外荧光光谱的丙基花菁染料Cy.7和2克二(2-吡啶甲基)胺,加入约60ml N,N-二甲基甲酰胺至完全溶解,然后在氮气保护和66℃下反应4小时,室温下冷却至15℃,后经减压油泵减压、35℃下旋转蒸发至蒸干,冷却后用乙醚溶解成溶解液,再加入乙醚的1.2倍重量份的水于室温下萃取至分层,取萃取液I,然后再加入萃取液I的0.8倍重量份的乙酸乙酯萃取至分层,得萃取液II,最后向萃取液II中加入无水硫酸镁干燥,后经减压油泵减压、35℃下旋转蒸发,蒸除乙酸乙酯,得产品0.15克。产率50%。
1H NMR(DMSO-d6):δ0.97(t,6H,J=6.4Hz)1.61(m,2H,J=5.5Hz)1.68(s,12H)1.72-1.82(m,4H)2.73(t,4H,J=5.6Hz)4.02(s,4H)4.20(t,4H,J=6.8Hz)6.34(d,2H,J=14.0Hz)7.31(t,2H,J=7.32Hz)7.48(m,4H)7.64(t,2H,J=7.08Hz)7.80-8.17(m,6H)8.21(d,2H,J=14.0Hz)8.66(d,2H,J=5.1Hz)ESI-MS cal for[M]+=702.5,found 702.5。
实施例2:
用喹啉磺酰胺替换二(2-吡啶甲基)胺,其余同实施例1。
实施例3:
用4,7,10-三甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基替换二(2-吡啶甲基)胺,其余同实施例1。
Claims (7)
2、检测细胞内锌离子的近红外荧光探针的合成方法,其特征在于该合成方法按如下步骤进行:
a.以花菁染料Cy.7∶络合基团=1∶5~10的重量份配比为原料加入N,N-二甲基甲酰胺溶解,然后在惰性气体保护和60~70℃下反应2-5小时;
b.将a工序所得反应混合物室温下冷却至10~20℃,减压蒸干,后用乙醚溶解,再加入水萃取至分层,取萃取液I加入乙酸乙酯萃取至分层,得萃取液II;
c.取b工序所得萃取液II加无水硫酸镁干燥,后在30~40℃下减压蒸干,蒸除乙酸乙酯,得产品。
3、根据权利要求2所述的合成方法,其特征在于a工序所述的花菁染料Cy.7是具有近红外荧光光谱的花菁类染料。
4、根据权利要求2所述的合成方法,其特征在于a工序所述的络合基团选自二(2-吡啶甲基)胺、喹啉磺酰胺或4,7,10-三甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基。
5、根据权利要求2所述的合成方法,其特征在于b工序所述的水∶乙醚=1∶1~1.5的重量份;所述的乙酸乙酯∶萃取液I=1∶1~1.5的重量份;所述的萃取均在室温下进行。
6、根据权利要求2所述的合成方法,其特征在于:
b、c工序中所述的减压蒸干是指油泵减压,35~45℃旋转蒸发。
7、权利要求1所述的检测细胞内锌离子的近红外荧光探针用于化学模拟生物体系中锌离子的检测,生物活细胞和活组织内的锌离子的分析检测和荧光成像检测,以及临床医学上病变组织中锌离子的检测。
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