CN110305111A - 一种新的亚铜离子近红外探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明设计并合成了一种在水溶液体系里对亚铜离子特异性响应，具有全新受体结构(N3O)的近红外荧光探针，主要解决了亚铜离子近红外荧光探针选择性较差、灵敏度低和的问题。其制备方法包括：中间体B与中间体5在乙醇溶剂中反应，粗品经柱层析纯化得到该具有全新识别基团的亚铜离子近红外荧光探针。本发明以N3O结构作为新型亚铜离子识别基团，qCy7为报告基团合成了该具有N3O结构的全新亚铜离子近红外探针，其对亚铜离子表现出了高灵敏度、高选择性，对其他干扰离子几乎没有响应。该具有N3O结构的全新亚铜离子近红外探针可作为水溶液中定量和活细胞中定性分析亚铜离子的工具，具有应用于亚铜离子及其相关生理、病理过程的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有全新识别基团的亚铜离子近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
铜是所有金属中使用最广泛的金属之一，并且是许多行业和技术的支柱之一，此外它还是国内管道中使用最广泛的材料之一。同时，铜元素是体内必不可少的微量元素之一，其氧化态(Cu2+，铜离子)和还原态(Cu+，亚铜离子)在生物体内都具有非常重要的意义。当其发生失衡，含量过高或者过低都会扰乱生命系统的正常功能，引起系列不良反应。在突变型超氧化物歧化酶-1所致肌萎缩性侧索硬化小鼠模型中，细胞核与细胞内铜转运有关，Cu+储存蛋白金属硫蛋白-1的过表达减弱了铜失调的停滞并延长了寿命。铜稳态的改变还与神经退行性疾病(阿尔茨海默氏症、朊病毒、帕金森病和肌萎缩侧索硬化)有关。在AD(阿尔茨海默氏症)中，铜分布不当，并在细胞外积累，这可能解释了AD影响的中枢神经系统组织铜缺乏的观察。因此对环境和生物体内的铜元素的检测显得尤为重要。Cu的特异性探针逐渐备受关注。
目前检测Cu+的探针相对较少；且通常在水溶液环境下选择性差、灵敏度低、易受其它离子的干扰。Cu+检测受到诸多限制。如果需要对活的组织细胞内进行Cu+检测，还要求探针具有较好的生物相容性，但现有的很多探针由于具有毒性，不能达到该要求。现有的Cu+检测探针还具有合成复杂、难以纯化的缺点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新型亚铜离子检测探针及其制备方法和应用。
本发明的技术方案包括：
一种具有高选择性的亚铜离子近红外荧光探针，其特征在于，它具有N3O结构，该结构可以识别亚铜离子；
所述N3O结构为：
式中Y表示氢或者卤素。
如前述的探针，其分子结构如式1所示：
其中R1、R2选自C1-3烷基；X为卤素。
优选地，式1中，R1为正丙基；和/或，R2为正丙基；和/或，X为Br。
前述探针的制备方法，它包括以下步骤：
(1)中间体A与中间体N3O在有机溶剂中反应成芳香醚，得中间体5；
中间体A的结构式为：
中间体N3O的结构式为：
式中Y为氢或卤素；
中间体5为4-羟基取代的间苯二甲醛，其结构式为：
(2)中间体B与中间体5在有机溶剂中反应，得到式1所示化合物；
中间体B为1-取代的2，3，3-三甲基吲哚盐，其结构式为：
式中R表示C1-3的烷基；
步骤(1)所述有机溶剂为醇类、DMF、THF或甲苯；
步骤(2)所述有机溶剂为醇类、DMF、THF或甲苯。
如前述的制备方法，步骤(1)中中间体N3O与中间体A的摩尔比是1∶(2～4)；
和/或，反应温度是50～100℃。
如前述的制备方法，步骤(1)中的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；和/或，步骤(2)中的有机溶剂为乙醇。
如前述的制备方法，步骤(2)中中间体5与中间体B的摩尔比是1∶(2～4)；
和/或，反应温度是50～100℃；
和/或，反应时间是2～6小时。
如前述的制备方法，步骤(2)的反应还需加入醋酸钠，醋酸钠的物质的量为中间体5的1～3倍。
前述探针在亚铜离子检测中的用途。
前述探针在制备亚铜离子检测试剂中的用途。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的探针能够在水溶液环境中实现有效检测。
2)本发明的探针特异性高，其对亚铜离子响应的荧光强度是其他干扰离子响应强度的7-35倍。
3)本发明的探针灵敏度高，能有效检测浓度低至1μM的亚铜离子。
4)本发明的探针适用于活体检测，其对细胞的半致死浓度高达200μM，且实验证明能够有效结合细胞内的亚铜离子，产生明显的阳性检测信号。
5)本发明的探针制备简单，纯化方便，得率较高。
本发明在生物化学、环境化学和生物医学等多个领域都有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明探针的核磁共振氢谱；
图2为本发明探针的核磁共振碳谱；
图3为本发明探针的高分辨质谱；
图4为本发明探针检测亚铜离子的紫外吸收光谱曲线变化；
图5为本发明探针检测亚铜离子的3D荧光图谱变化(图A为本发明的50μM探针本身荧光性质的二维和三维图谱，x轴显示其最大激发波长为～420nm，y轴显示其最大发射波长为～560nm，z轴显示对应的荧光强度；图B为本发明的50μM探针与500μM亚铜离子进行孵育60min后荧光性质的二维和三维图谱，x轴显示其最大激发波长为～560nm，y轴显示其最大发射波长为～710nm，z轴显示对应的荧光强度)；
图6为本发明探针检测亚铜离子荧光强度随反应时间的变化曲线；
图7为本发明探针检测亚铜离子荧光强度随Cu+浓度的变化曲线；
图8为本发明探针检测不同金属阳离子的荧光强度对比图谱；
图9为本发明探针的细胞成像激光共聚焦图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明并不仅仅局限于下面的实施例。
本发明实施例中所用的原料均为已知化合物，可由市场购得，或按照现有的方法合成得到。
实施例1制备中间体N3O
a.将SOCl2(15ml)缓慢滴加至2，6-吡啶二甲醇中搅拌1～3h后升温回3～8h，加入甲苯稀释反应液，调节pH＝7析出固体并洗涤干燥得中间体1a，产率87.3％。中间体1a的核磁共振数据为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.89(t，J＝8.0Hz，1H)，7.51(d，J＝8.0Hz，2H)，4.77(s，4H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.63，139.02，123.23，46.94.
b.冰盐浴下将乙醇胺与2-吡啶甲醛(1∶1～1.5，n∶n)均匀混合，随后室温反应2～6小时，分批加入NaBH4，粗品用DCM:MeOH(5～12％)体系纯化得化合物1b，产率98.70％。化合物1b的核磁共振数据为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.49(ddd，J＝5.2，2.0，1.2Hz，1H)，7.74(td，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.41(dt，J＝8.0，1.2Hz，1H)，7.23(ddd，J＝8.0，5.2，1.2Hz，1H)，3.80(s，2H)，3.48(t，J＝5.6Hz，2H)，2.60(t，J＝5.6Hz，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ160.66，149.19，136.89，122.31，122.25，60.81，54.92，51.69.
c.上述化合物1b与碳酸氢钠(1∶0.4～1，n∶n)均匀分散在乙腈中预先于50～60℃下搅拌30～90分钟，再加入中间体1c至反应结束，粗产品用MeOH/EA从2-10％进行纯化得橘色中间体，产率77.8％。中间体的核磁共振数据为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.47(d，J＝5.2Hz，1H)，7.81(t，J＝8.0Hz，1H)，7.75(t，J＝8.0Hz，1H)，7.55(dd，J＝8.0，5.2Hz，2H)，7.40(d，J＝8.0Hz，1H)，7.24(dd，J＝8.0，5.2Hz，1H)，4.74(s，2H)，4.53(s，1H)，3.80(s，4H)，3.52(t，J＝6.4Hz，2H)，2.60(t，J＝6.4Hz，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ160.12，159.83，155.79，149.05，138.04，136.83，123.01，122.42，122.33，121.76，60.52，60.45，59.46，56.57，47.25.
实施例2制备一种具有全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针(式1)
a.将实施例1中的中间体与对羟基间二甲苯(1∶1～3n∶n)和无水碳酸钾混合分散在无水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，50～100℃下反应至结束，冷却至室温后用有机溶剂萃取，经洗涤，干燥，过滤，浓缩的粗品经硅胶柱层析纯化得中间体5，产率72.5％。中间体5的核磁共振数据为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.47(s，1H)，9.95(s，1H)，8.46(d，J＝4.8Hz，1H)，8.26(d，J＝2.4Hz，1H)，8.14(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.83(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73(m，1H)，7.53(m，4H)，7.23(t，J＝8.0Hz，1H)，5.46(s，2H)，4.53(s，1H)，3.80(s，4H)，3.50(t，J＝6.4Hz，2H)，2.59(t，J＝6.4Hz，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ191.64，189.12，164.65，162.66，159.88，159.84，154.95，149.04，137.94，136.80，130.70，129.87，124.95，122.95，122.39，122.33，120.23，115.14，71.66，60.53，60.41，59.49，56.55.
b.将上述中间体5和中间体B(1∶2～4，n∶n)溶于无水乙醇中，再加入醋酸钠(1～3当量)，50～100℃下回流反应2～6小时，粗品经硅胶柱层析纯化得该全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针，产率61.9％。
所得近红外荧光探针的化学式如式I所示：
式中，R1、R2均为正丙基，X为Br。
产物的核磁共振氢谱和碳谱数据为：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.62(dd，J＝16.0，8.0Hz，2H)，8.59-8.54(m，1H)，8.45(d，J＝5.2Hz，1H)，8.15(d，J＝16.0Hz，1H)，8.03-7.96(m，2H)，7.95-7.85(m，4H)，7.78-7.72(m，1H)，7.66(dd，J＝12.0，5.6Hz，5H)，7.61(d，J＝12.0Hz，1H)，7.55(d，J＝8.0Hz，4H)，7.25-7.20(m，1H)，5.55(s，2H)，4.83(t，J＝7.4Hz，2H)，4.75(t，J＝7.4Hz，2H)，4.58(s，1H)，3.83(s，4H)，3.53(t，J＝6.4Hz，2H)，2.61(t，J＝6.4Hz，2H)，1.96-1.82(m，11H)，1.75(s，5H)，1.05(t，J＝7.2Hz，3H)，0.96(t，J＝7.2Hz，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：182.51，182.36，162.29，160.47，159.96，154.79，153.02，149.17，147.45，144.40，144.22，141.29，141.27，138.12，137.84，136.99，134.02，130.24，129.93，129.75，129.62，128.51，124.09，123.61，123.58，123.06，122.68，122.58，121.18，116.17，115.87，115.08，114.99，112.56，72.39，63.25，60.64，59.59，56.62，52.77，52.75，48.80，48.34，26.56，26.37，22.41，22.36，11.26，11.23.m/z[M+H]+：386.6984，calcd，386.7334.
实施例3一种具有全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针的体外分析检测
缓冲溶液的配制：用购买的PBS混合盐配置成浓度为25mM的溶剂体系(pH 7.2)，含2mM的GSH(谷胱甘肽)用于防止亚铜离子在空气中被氧化。
浓储的配制：本发明中所用的探针均用实施例2所制备的一种具有全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针(下文称“本发明的探针”)均以DMSO(二甲基亚砜)配置成10mM浓储，各种金属阳离子均用缓冲溶液配置成10mM浓储，本实施例3所用的浓度均为用缓冲液由浓储稀释而来。
1.紫外吸收光谱检测
将终浓度为50μM的本发明的探针溶液与终浓度500μM的亚铜离子溶液混合，检测探针与亚铜离子混合前后的紫外吸收光谱。
结果表明：本发明的探针自身在缓冲体系中的紫外最大吸收波长为415nm，而与底物亚铜离子反应后的体系的最大吸收波长达到560nm，发生近150nm的红移(图4)。
2.荧光图谱
将终浓度为50μM的本发明的探针溶液与终浓度500μM的亚铜离子溶液混合，检测探针与亚铜离子混合前后的吸收和发射光谱的变化。
结果表明：本发明的探针自身的最大激发和发射波长分别为～420nm和～565nm，与亚铜离子反应后的体系的最大激发和发射波长均发生～150nm的红移，分别达到了～560nm和～710nm。
3.荧光强度与亚铜离子反应时间的关系
将终浓度为50μM的本发明的探针溶液与终浓度500μM的亚铜离子溶液混合，孵育不同时间，检测荧光信号。
结果表明：其荧光强度在反应15min内迅速攀升，接下来荧光强度继续增加，，在反应90min后荧光强度趋于稳定，达到对应探针浓度下最大响应信号。总的来说，探针结合亚铜离子后的0～240min内的荧光强度都大大高于未结合亚铜离子的情形。
4.荧光强度与亚铜离子浓度的关系
将终浓度50μM的本发明的探针与终浓度0、2.5、5、10、20、30、40、50、100、200、400、500、800、1000μM的亚铜离子共孵育60min，使用560nm波长的激发光，于710nm波长处检测的荧光强度。
结果表明：荧光强度随着亚铜离子浓度升高而递增，当该亚铜离子近红外探针浓度为≥1μM时其荧光强度为空白组荧光强度的2～40倍，对亚铜离子表现出较优的灵敏度(图7)。
5.本发明的探针对不同金属离子的选择性
使用终浓度50μM的本发明的探针分别与终浓度为500μM的不同的离子溶液混合，离子包括：Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cr2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Gd2+和Pb2+，以超纯水为对照(Control)。
结果显示：该亚铜离子近红外探针对其他干扰离子在发射波长为710nm处的响应值近乎可以忽略，但对亚铜离子响应的荧光强度是其他干扰离子响应强度的7-35倍(图8)。
实施例4一种具有全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针的细胞毒性及细胞成像
根据实施例3所述的一种具有全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针能对水溶液环境中的亚铜离子高灵敏度、高选择性地响应，为了拓展其应用，发明人将本发明的亚铜离子探针进一步应用于分析检测细胞层面亚铜离子的水平方面的能力进行了探究。
a.细胞毒性：用MTT法进行细胞毒性测试，本实例中所用的探针均用细胞培养液将浓储梯度稀释成不同浓度工作液，且保证工作液里DMSO含量不会对细胞的存活率有影响。根据本发明的探针当浓度高达200μM时，细胞存活率为≥50％，对细胞存活率影响极低，可用于进一步应用于细胞水平亚铜离子的探测。
b.细胞成像：根据实施例2所描述的最适激发和发射波长下，亚铜离子共孵育的细胞组细胞成像发出鲜艳的红色荧光，而没有亚铜离子参与的空白对照组则是仅有微弱的光(图9)。
本实施例表明，本发明的探针可以适用于活细胞等活体的亚铜离子检测。
综上，本发明的一种具有全新亚铜离子识别基团的近红外荧光探针能对亚铜离子进行高选择性、高灵敏度的响应，并且可以低毒性应用于细胞水平亚铜离子的检测和分析，为生物化学、环境化学和生物医学等各领域提供有力的分析工具，在学习和探究亚铜离子含量及其生理、病理过程方面具有重大应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，均属于本发明的保护范畴。
Claims (11)
1.一种具有高选择性的亚铜离子近红外荧光探针，其特征在于，它具有N3O结构；
所述N3O结构为：
式中Y表示氢或卤素。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，其分子结构如式1所示：
其中R1、R2选自C1-3烷基；X为卤素。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，式1中，R1为正丙基；和/或，R2为正丙基；和/或，X为Br。
4.权利要求2所述探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)中间体A与中间体N3O在有机溶剂中反应成芳香醚，得中间体5；
中间体A的结构式为：
中间体N3O的结构式为：
式中Y为氢或卤素；
中间体5为4-羟基取代的间苯二甲醛，其结构式为：
(2)中间体B与中间体5在有机溶剂中反应，得到式1所示化合物；
中间体B为1-取代的2，3，3-三甲基吲哚盐，其结构式为：
式中R表示C1-3的烷基；
步骤(1)所述有机溶剂为醇类、DMF、THF或甲苯；
步骤(2)所述有机溶剂为醇类、DMF、THF或甲苯。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中中间体N3O与中间体A的摩尔比是1∶(2～4)；
和/或，反应温度是50～100℃。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；
和/或，步骤(2)中的有机溶剂为乙醇。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中中间体5与中间体B的摩尔比是1∶(2～4)；
和/或，反应温度是50～100℃。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的反应时间是2～6小时。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的反应还需加入醋酸钠，醋酸钠的物质的量为中间体5的1～3倍。
10.权利要求1-3任一所述探针在亚铜离子检测中的用途。
11.权利要求1-3任一所述探针在制备亚铜离子检测试剂中的用途。
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