CN104946237A - 一种钯离子荧光探针化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种钯离子荧光探针化合物及其应用。本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP(其结构式如式1所示)，其是一粒新型的反应型探针，钯离子的存在促进了罗丹明的开环，出现比色和荧光的变化，而且最终导致了探针的水解，这种识别机理在以前的报道中并未见过。本发明首次通过水解的方式对钯离子进行检测。本发明探针灵敏度高，在ppb级别能对钯离子进行识别，并且不受其他重金属离子干扰，可信度高，抗干扰能力强，并且稳定性好，具有优良的选择性。

Description

一种钯离子荧光探针化合物及其应用

技术领域：

本发明属于化合物检测领域，具体涉及一种钯离子荧光探针化合物及其应用，适用于环境污染样品中的检测，及其在生物体中的检测应用。

背景技术：

钯元素被广泛应用于与人类生产生活相关的各种领域，随着科技的告诉发展，这种现象显得越来越剧烈。过去的几十年中，钯元素被广泛应用的同时，对环境也产生了巨大的污染。钯污染已经成为环境的第二大污染源，紧随第一大污染源镍之后。改革开放30年的发展，电子信息产业已经发展成为中国经济的重要产业。但电子产品造成的重金属钯污染严重，水质开始严重恶化。此外，大量汽车尾气中的钯元素，污染了公路周围的环境，雨水又会将其冲入河流水系统中，也是对水造成严重污染的原因。像汽车等动力机械的金属催化转化器，电子产品，石油精炼，化学生产催化剂等都是钯污染产生的主要场所。而利用快速、灵敏、廉价的荧光探针技术，随时监测河流土壤的钯离子污染，早期检测，早发现、早治理具有十分重大的意义。

典型的钯检测分析方法包括原子吸收光谱法(AAS)，等离子发射光谱法(ICP-AES)，固相微萃取高效液相色谱法(SPME-HPLC)，X射线荧光光谱法等。但是，这些方法通常需要大型分析检测仪器，复杂的样品预处理过程，而且需要经过专门训练的人员操作，使得这些检测方法成本很高，难于普及应用，因此应用受到很大的限制。荧光分子探针检测技术兼备选择性专一、灵敏度高和快速便捷等优点，逐渐成为化学、环境科学及生命科学等众多领域中应用前景非常广泛的分析检测技术。作为重金属离子，钯通常对荧光团有较强的荧光淬灭作用，因此荧光增强型钯探针的设计存在一定的难度。关于荧光增强型钯探针的报道还是相对较少，最大的问题是，一些金属离子(Hg²⁺、Pb²⁺、Ag⁺等)会对探针有微弱的响应，干扰探针的专一性，还有一些探针对Pt²⁺有完全相似的响应。因此，能在生物应用中的钯离子探针的报道就更加稀少。

发明内容：

本发明的第一个目的是克服现有技术中的荧光分子探针在选择性和生物体内成像的不足，提供一种具有高灵敏度、良好的稳定性、优良的选择性和抗干扰能力强的钯离子荧光探针化合物Rd-TP。

本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP，其特征在于，其结构式如式1所示：

本发明的第二个目的是提供上述钯离子荧光探针化合物Rd-TP在评估检测钯离子中的应用。

所述的应用是评估检测环境水样和土壤样品中的钯残留以及生物体中的钯。如应用于生物体中荧光成像，分析钯元素对生命体的影响，将极大提高探针的应用价值，为钯元素对生命体生理和疾病的研究提供重要的帮助。本发明能够在对模式生物斑马鱼和大型溞进行荧光成像染色，分析荧光成像结果与生物体毒理的关系，发现生物体在胚胎前期时，卵膜对幼体的保护作用非常好，阻碍了钯离子的侵入。对孵出时间1天内的幼体与孵出时间5天内的幼体生物体比较发现，随着年龄的增长，生物体抵抗由钯离子皮肤渗透进入而产生的危害的能力越来越强。由探针染色实验推测，孵出时间在5天大小的生物体受到钯离子的影响主要是通过呼吸作用或吞食水进入食道中。并且本发明人通过钯离子对斑马鱼和大型溞的毒性试验验证了这个推测。

本发明基于罗丹明为荧光母体染料，通过引入识别位点，不仅能够通过比色的方法检测钯离子的存在，而且还可以通过荧光的方法检测钯离子的存在，并且适合于检测低浓度的钯离子及其零价钯离子。

本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP，其是一粒新型的反应型探针，钯离子的存在促进了罗丹明的开环，而且最终导致了探针的水解，出现比色和荧光的变化，这种识别机理在以前的报道中并未见过。本发明首次通过水解的方式对钯离子进行检测。本发明探针灵敏度高，在ppb级别能对钯离子进行识别，并且不受其他重金属离子干扰，可信度高，抗干扰能力强，并且稳定性好，具有优良的选择性。

附图说明：

图1是10μM的钯离子荧光探针化合物Rd-TP，与各种金属阳离子存在下的干扰实验，图1a为钯离子荧光探针化合物Rd-TP与各种阳离子混合后的吸收曲线变化，从图中可以看出，只有钯离子有明显的增强变化；图1b为钯离子荧光探针化合物Rd-TP对各种阳离子的荧光曲线变化，只有钯离子有明显的增强变化。所选择的阳离子分别为：K⁺,Na+,Ag+,NH₄ ⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Ba²⁺,Pb²⁺,Pd²⁺，Cu²⁺,Hg²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pt²⁺Fe³⁺,Cr³⁺,Rh³⁺和Ru³⁺。钯离子荧光探针化合物Rd-TP的激发波长为520nm，探针发射波长为585nm。

图2是用本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP与ppb级浓度钯离子的荧光强度增强和浓度的线性关系图。钯离子荧光探针化合物Rd-TP的浓度为10μM，横坐标为钯离子浓度，纵坐标为荧光强度。

图3是本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP的光谱强度增强和钯离子浓度增加的关系图。钯离子荧光探针化合物Rd-TP的浓度是10μM，钯离子的浓度为从小到大顺序为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20μM。3a为吸收变化，3b为荧光变化。

图4是钯离子荧光探针化合物Rd-TP对不同类型和不同价态的钯的荧光变化，钯离子荧光探针化合物Rd-TP对PdCl₂、Pd(OAc)₂和Pd(PPh₃)₄都有荧光增强的效果。

图5是钯离子荧光探针化合物Rd-TP(10μM)与钯离子(10μM)在乙醇和水(1:1,体积比)条件下荧光强度随时间的变化关系。

图6是钯离子荧光探针化合物Rd-TP的荧光强度随不同pH值下的变化曲线，钯离子荧光探针化合物Rd-TP浓度为10μM，用氢氧化钠(1M)和盐酸(1M)调节pH滴定测试。

图7是钯离子荧光探针化合物Rd-TP对不同浓度钯离子响应后的质谱测定，7a为钯离子荧光探针化合物Rd-TP与钯离子比为1:0.5时质谱结果，7b为钯离子荧光探针化合物Rd-TP与钯离子比为1:1.5时质谱结果，反应时间为5分钟。

图8是钯离子荧光探针化合物Rd-TP(5μM)分别对浸泡在钯离子溶液(5μM)中的斑马鱼染色，8a、8b是对8a、8b新生斑马鱼胚胎染色，8c、8d是对斑马鱼胚胎后期染色，8e、8f是对1天年龄的斑马鱼染色，8g、8h是对5天年龄的斑马鱼在共聚焦显微镜下的染色成像，红色标线是100μm。

图9是钯离子荧光探针化合物Rd-TP(5μM)分别对浸泡在钯离子溶液(5μM)中的大型溞染色，9a、9b是对新生的孵出时间1天内大型溞，9c、9d是孵出时间5天内大型溞的共聚焦显微镜下的染色成像，红色标线是500μm.

图10是不同浓度Pd²⁺，对斑马鱼的72小时存活率的影响，10a为对孵出时间为1天年龄段斑马鱼的影响，10b为对孵出时间为5天年龄段斑马鱼的影响。

图11是不同浓度Pd²⁺，对大型溞的72小时存活率的影响，11a为对1天年龄段大型溞的影响，11b为对5天年龄段大型溞的影响。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

钯离子荧光探针化合物Rd-TP的合成方法：

(1)中间体A的合成

将罗丹明B(1.2g，2.5mmol)加入装有30ml乙醇的100ml单口烧瓶中。室温下剧烈搅拌，滴加80％的水合肼3ml(过量)，空气中回流反应2h，溶液颜色从深紫色先变为浅棕色，最后到浅粉红色。冷却到室温，减压蒸去乙醇。然后加入50ml盐酸(1M)，得到红色溶液；搅拌同时加入70ml氢氧化钠(1M)，至pH达到9～10之间，出现大量沉淀。过滤，并用15ml水洗涤滤饼3次。真空干燥后，色谱柱分离得到0.63g目标产物(中间体A)，产率55.2％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:1.15(t,12H),3.32(q,8H),3.65(s,2H),6.25(d,J＝8Hz,2H),6.4(m,4H),7.1(d,J＝8Hz,1H),7.45(m,1H),7.5(d,J＝16Hz,1H),8.1(d,J＝8Hz,1H),9.41(d,J＝8Hz,1H).HRMS-ESI:m/z calcd.M⁺for C₂₈H₃₂N₄O₂ ⁺,456.2525；found,456.2529。

(2)钯离子荧光探针化合物Rd-TP的合成：

将中间体A(500mg,1.2mmol)溶于装有150mL乙醇的250mL单口烧瓶中，搅拌下加入2-乙炔基苯甲醛(169.4mg,1.3mmol)，混合物回流反应48h。冷却至室温，减压蒸出溶剂后硅胶柱色谱分离，展开剂为二氯甲烷/乙酸乙酯＝3/1，得到浅粉色粉末状化合物(475.3mg,收率：69.3％)，即为钯离子荧光探针化合物Rd-TP，其结构式如式1所示。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.88(s,1H),7.92(d,J＝7.8Hz,1H),7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.56(t,J＝7.2Hz,1H),7.38(q,J＝1.8Hz,2H),7.32(t,J＝7.8Hz,1H),7.08(d,J＝7.2Hz,1H),6.45(d,J＝2.4Hz,2H),6.41(d,J＝8.4Hz,2H),6.36(q,J＝5.4Hz,2H),4.44(s,1H),3.34(p,8H),1.07(t,J＝6.6Hz,12H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ164.48,152.99,152.33,148.97,143.12,136.46,134.60,133.16,130.35,129.65,129.21,128.41,127.90,124.28,123.54,122.46，108.58,105.19,98.13,87.16,79.61,65.48,44.14,12.87.HRMS-ESI:m/z calcd.M⁺forC₃₇H₃₆N₄O₂,568.2838；found,568.2836。

实施例2钯离子荧光探针化合物RD-TP对钯离子的选择性：

将40μM浓度的金属阳离子加入到10μm的钯离子荧光探针化合物Rd-TP、乙醇和水(EtOH:H₂O＝1:1,体积比)溶液中，选择的金属阳离子分别为：K⁺,Na+,Ag+,NH₄ ⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Ba²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Hg²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pt²⁺Fe³⁺,Cr³⁺,Rh³⁺和Ru³⁺。结果如图1所示，在10分钟的静置过程中，钯离子荧光探针化合物Rd-TP对各种阳离子都没有吸收和荧光的变化，只有钯离子存在时，吸收和荧光才表现出明显的增强变化，所以本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP的选择性好，对其他阳离子没有选择性。

实施例3钯离子荧光探针化合物Rd-TP对钯离子的灵敏度测试：

使用本发明的钯离子荧光探针化合物Rd-TP对ppb级别的钯离子浓度进行测试。将钯离子荧光探针化合物Rd-TP(10μm)加入到含有0-100ppb浓度钯离子的乙醇和水(EtOH:H₂O＝1:1,体积比)溶液中，记录相应的荧光强度变化，结果如图2所示，从图2中可以看到钯离子荧光探针化合物Rd-TP在0-100ppb浓度的钯离子中有明显的强度变化，并且这种强度变化与加入的钯离子的浓度有很好的线性关系。这个结果表明，钯离子荧光探针化合物Rd-TP可以在极低浓度下进行使用。

实施例4钯离子荧光探针化合物Rd-TP与不同浓度的钯离子响应后光谱的变化：

将钯离子荧光探针化合物Rd-TP(10μm)加入到分别含有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和20μM浓度钯离子的乙醇和水(EtOH:H₂O＝1:1,体积比)溶液中，记录相应的荧光强度和吸收强度变化。如图3所示，随着钯离子浓度的逐渐增大，吸收和荧光都逐渐变强，在浓度达到10μM后，吸收和荧光都已经达到最大值，继续增加离子的浓度，吸收和荧光变化已经比较小，说明钯离子荧光探针化合物Rd-TP与钯离子是1比1的络合方式。

实施例5钯离子荧光探针化合物Rd-TP对不同状态钯离子盐的测试：

荧光探针化合物RD-TP与钯的浓度都为10μM。将不同钯盐溶液和不同价态钯加入钯离子荧光探针化合物Rd-TP的乙醇和水(EtOH:H₂O＝1:1,体积比)溶液中，记录应该强度变化。结果如图4所示，图4中的横坐标为不同盐和价态钯，纵坐标为探针变化的荧光强度。从图4可以看出，荧光相应都比较大，荧光变化明显。也就是说荧光探针化合物RD-TP能对不同价态和不同盐形式的钯都有识别效果，可广泛应用于钯元素的测试。

实施例6荧光探针化合物RD-TP与钯离子响应变化与时间关系

将荧光探针化合物RD-TP(10μM)与钯离子(10μM)置于乙醇和水(1:1,体积比)溶液中，每隔一分钟取样品测试荧光强度的变化，结果如图5所示，从图5可知，荧光探针化合物RD-TP在五分钟后达到荧光平稳的状态，荧光强度不再随时间呈现强度的增强。

实施例7pH对钯离子荧光探针化合物Rd-TP的干扰研究：

将10μM浓度的荧光探针化合物RD-TP溶液进行pH滴定测试。在10μM浓度的荧光探针化合物RD-TP溶液中，边搅拌边加入配好的用氢氧化钠(1M)和盐酸(1M)溶液调节pH。测定其pH在2.0～12.0时的溶液的荧光光谱变化。根据荧光强度和pH值，通过Origin软件拟核得到pK_a。结果如图6所示，荧光探针化合物RD-TP在pH 5-12之间没有荧光出现，因此荧光探针化合物RD-TP可以用于此pH范围内对钯离子检测，不受pH的影响。生物体的pH一般为中性条件，所以这为在中性条件下探针的应用奠定了基础。

实施例8钯离子荧光探针化合物RD-TP与不同浓度钯离子响应后的质谱测定：

将钯离子荧光探针化合物RD-TP分别加入到含有10μM和30μM的钯离子的乙醇和水(EtOH:H₂O＝1:1,体积比)溶液中，使钯离子荧光探针化合物RD-TP的浓度为20μM，然后进行反应，反应时间为5分钟。然后对反应液进行质谱的测定。结果如图7所示，结果显示，钯离子荧光探针化合物RD-TP：钯离子＝1:0.5时质谱中分别存在钯离子荧光探针化合物RD-TP和罗丹明B的分子量(图7A)，也就是说，钯离子荧光探针化合物RD-TP与钯离子反应后生成了罗丹明B，但钯离子浓度变成探针浓度的1.5倍量时，钯离子荧光探针化合物RD-TP完全消失，只有罗丹明B留在溶液中(图7B)，这也就说明了钯离子荧光探针化合物RD-TP与钯离子的响应为水解反应。

实施例9钯离子荧光探针化合物RD-TP对斑马鱼中钯离子识别染色：

选取斑马鱼胚胎，1天年龄和5天年龄的斑马鱼浸泡于含有10μM二价钯离子溶液中。浸泡1小时后，将溶液除去，清洗胚胎和斑马鱼幼体。再加入到含有荧光探针化合物RD-TP(5μM)溶液中，染色40分钟后清洗胚胎和斑马鱼，将粘附于表面的探针分子清洗掉，在激光聚焦显微镜下观察。结果如图8所示，钯离子荧光探针化合物RD-TP在对浸泡在钯离子溶液的胚胎染色后，对新生的胚胎着色点主要在卵膜上，并没有进入胚胎内部，也就是说卵膜保护着胚胎，污染物不能进入胚胎中。但随着时间的增长，卵膜在胚胎后期，通透性变好，离子和钯离子荧光探针化合物RD-TP都进入到胚胎中，对胚胎中的斑马鱼染色明显。在对孵出时间1天年龄的斑马鱼染色时发现，斑马鱼全身都被染色，而对比与孵出时间5天年龄的斑马鱼时，其主要着色于肠道和围心囊位置。从这个结果可以看出，孵出时间1天年龄的斑马鱼，由于孵出时间短，钯离子可以通过皮肤渗透入体内，而孵出时间5天年龄的斑马鱼主要是通过吞食和呼吸方式把离子运到体内。随着年龄的增长，皮肤渗透进入体内的重金属离子已经非常少，皮肤起到了保护的作用。

实施例10钯离子荧光探针化合物RD-TP对大型溞中钯离子识别染色：

选取1天年龄和5天年龄的大型溞浸泡于含有10μM二价钯离子溶液中。浸泡1小时后，将溶液除去，用曝气水清洗大型溞。再加入到含有荧光探针化合物RD-TP(5μM)溶液中，染色40分钟后再次用曝气水清洗胚胎和斑马鱼，将粘附于表面的探针分子清洗掉，在激光聚焦显微镜下观察。结果如图9所示，在对1天年龄的大型溞染色时发现，大型溞几乎全身都被染色，而对比与5天年龄的大型溞时，5天年龄的大型溞主要着色于肠道位置。从这个结果可以看出，1天年龄的大型溞由于年龄小，离子可以通过皮肤渗透入体内，而5天年龄的大型溞主要是通过吞食把钯离子运到体内。随着年龄的增长，皮肤渗透进入体内的重金属离子已经非常少，皮肤起到了一个保护的作用。

实施例11不同浓度钯离子对不同年龄段斑马鱼存活率的影响。

将两个不同孵出时间年龄段斑马鱼放置于多个钯离子浓度梯度中，每个浓度梯度设3组平行，每组10只。钯离子暴露组浓度分别为：1μm，3μm,5μm,7μm,9μm。统计72小时后实验组的存活率。

结果如图10所示，从图10可以看出，随着Pd²⁺浓度的增加，对斑马鱼的存活率有明显的影响。在低浓度Pd²⁺(1μm，3μm,)暴露组下，孵出时间5天年龄段斑马鱼与对照组差别不是很明显，存活率相对较高，但随着钯离子浓度的升高，孵出时间5天内的斑马鱼随着暴露时间的增长，存活率下降明显。相对于孵出时间5天内的斑马鱼，孵出时间1天内的斑马鱼变化更加明显，在低浓度(1μm，3μm,)的时候，其存活率就已经受到了明显的影响。随着Pd²⁺浓度的增加，1天年龄段的斑马鱼随着暴露时间的增加，存活率急剧降低。结果与钯离子荧光探针化合物RD-TP的荧光颜色结果得出的结论相同，随着年龄的增长，皮肤渗透进入体内的重金属离子已经非常少，皮肤起到了一个保护的作用，导致5天年龄段的斑马鱼的存活率明显高于1天年龄段的斑马鱼的存活率。

实施例12不同浓度钯离子对不同年龄段大型溞存活率的影响。

将两个不同年龄段大型溞放置于多个钯离子浓度梯度中，每个浓度梯度设3组平行，每组10只。钯离子暴露组浓度分别为：1μm，3μm,5μm,7μm,9μm。统计72小时后实验组的存活率。

结果如图11所示，从图11所知，随着Pd²⁺浓度的增加，对大型溞的存活率有明显的影响。在低浓度Pd²⁺暴露组下，5天年龄段大型溞与对照组差别不是很明显，存活率相对较高，但随着钯离子浓度的升高，5天年龄段的大型溞随着暴露时间的增长，存活率下降明显。相对而言，1天年龄段的大型溞随着Pd²⁺浓度的增加，存活率变化更加明显，在低浓度(1μm，3μm,)的时候，其存活率就已经受到了明显的影响。随着Pd²⁺浓度的增加，1天年龄段的大型溞随着暴露时间的增加，存活率急剧降低。这个结果也与钯离子荧光探针化合物RD-TP的荧光颜色结果得出的结论相同，随着年龄的增长，皮肤渗透进入体内的重金属离子已经非常少，皮肤起到了一个保护的作用，导致5天年龄段的撒行骚的存活率明显高于1天年龄段的大型溞的存活率。存活率实验验证了通过荧光染色我们所得出的结论。

Claims (3)

1.钯离子荧光探针化合物Rd-TP，其特征在于，其结构式如式1所示：

2.权利要求1所述的钯离子荧光探针化合物Rd-TP在评估检测钯离子中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是评估检测环境水样和土壤样品中的钯残留或生物体中的钯。