CN105885831B - 氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂及其制备和应用 - Google Patents

氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基硫脲缩7‑羟基香豆素‑8‑醛探针试剂，以7‑羟基‑8‑醛基香豆素与氨基硫脲缩合反应，即得。本发明探针能同时实现金属离子、阴离子的选择性识别，可通过目视比色快速检测特定离子，还可应用于活细胞中特定离子成像检测，具备荧光增强和比率吸收的双模式检测，在检测灵敏度和准确性方面更具优越性，具有高灵敏度、高选择性、产率高等优点，且有利于复杂微观系统的定量、定性分析。

Description

氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种探针试剂及其制备方法和应用，特别是一种氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂及其制备方法和应用。
背景技术
相对于其他分析方法而言，荧光探针技术具有选择性好、灵敏度高、实时在线等优点，为一种理想且廉价的传感器，是微量检测中重要的方法。有机小分子荧光探针具有结构简单、合成简便、成本低廉、水溶性好、对细胞毒性小等优点，将其应用于生物体系的离子检测具有灵敏度高、选择性好、可视性强、快速、简便等特点。
生物相关离子的识别检测在生命、食品及环境研究中尤为重要。锌离子在生物体内生理过程中如细胞运输、增值、代谢、凋谢起重要作用。通过荧光探针识别检测微量锌离子、利用荧光成像技术检测活细胞内的锌离子，是生命科学技术领域中重要的研究手段，可以解释活细胞中的多种生命现象，具有研究意义和应用价值。
氟作为重要的阴离子，广泛存在于环境和生命活动过程中。其检测方法主要有离子电极和离子色谱技术。荧光探针法对氟离子简便、快速、准确的检测可在临床医学及食品、环境分析中得到应用。研制灵敏高、选择性好且具备荧光和吸收多重方式、不受共存离子干扰、同时具备裸眼识别快速检测的氟离子探针非常具有应用前景。
荧光探针对单一目标的检测已有很多报道，但能同时实现阳离子、阴离子的选择性识别的为数不多，特别是应用于活细胞中特定离子成像检测受探针的水溶性、穿透性及生物毒性等因素的限制。同时具备荧光增强和比率吸收检测的双模式探针，在检测灵敏度和准确性方面更具优越性。
香豆素是一类重要的有机杂环化合物，也是传统的荧光染料。基于香豆素衍生物独特的分子结构和性能，若在其结构上进行简单修饰，扩展分子的共轭结构，增强分子发光量子产率，改变其配位能力，提高对特定离子配合的选择性，从而开发出新型离子荧光探针试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂及其制备方法和应用，本发明探针试剂能同时实现金属离子、阴离子的选择性识别，可通过目视比色快速检测特定离子，还可应用于活细胞中特定离子成像检测，具备荧光增强和比率吸收的双模式检测，在检测灵敏度和准确性方面更具优越性，具有高灵敏度、高选择性、产率高等优点，且有利于复杂微观系统的定量、定性分析。
本发明的技术方案：一种氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂，所述探针试剂的化学结构式为：
一种氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的制备方法，所述探针试剂是以7-羟基-8-醛基香豆素与氨基硫脲缩合反应得到。
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的制备方法中，所述探针试剂是以7-羟基香豆素为原料，先制备7-乙酰氧基香豆素，再制备中间体7-羟基-8-醛基香豆素，最后由7-羟基-8-醛基香豆素与氨基硫脲经缩合反应得到。
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的制备方法中，按照以下路线合成：
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的制备方法中，按下述步骤进行制备：
7-乙酰氧基香豆素的合成：氮气保护的三口烧瓶中，在溶有7-羟基香豆素的二氯甲烷溶液中，加入乙酸酐，按摩尔比7-羟基香豆素:乙酸酐等于1:1.5～4，再加入催化量的哌啶，回流，反应12h，除去溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，过滤，除去溶剂，粗产品柱层析分离，即得；
反应温度：二氯甲烷回流温度
反应溶剂：二氯甲烷
柱层析分离用洗脱剂：氯仿；
所述催化量为按重量比计算，7-羟基香豆素:哌啶＝1:0.01-0.1；
7-羟基-8-醛基香豆素的合成：氮气保护冰浴下的三口烧瓶中，在溶有7-乙酰氧基香豆素的三氟乙酸溶液中，加入六次甲基四胺，按摩尔比7-乙酰氧基香豆素:六次甲基四胺等于1:1.5，0℃的冰浴下，以三氟乙酸为溶剂，反应1h后，再将反应温度逐渐升至室温，回流搅拌反应8h，除去溶剂，加入水，将温度升至60℃，搅拌30min，过滤，氯仿萃取，洗涤，干燥，过滤，除去溶剂，洗脱，柱层析分离，即得；
反应溶剂：三氟乙酸
洗脱剂：v/v，100/1，氯仿/甲醇；
氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的合成：氮气保护下的三口烧瓶中，在无水乙醇溶液中，加入7-羟基-8-醛基香豆素，升温搅拌待其溶解后，降至室温，按摩尔比7-羟基-8-醛基香豆素:氨基硫脲等于1:2～10加入氨基硫脲，加热回流反应，过滤，用氯仿甲醇重结晶，即得；
反应温度：无水乙醇回流温度
反应时间：30min
反应溶剂：无水乙醇
纯化溶剂：v/v，1:1，氯仿甲醇。
一种氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，所述应用包括：
1、作为荧光光谱法或紫外-可见吸收光谱法中用于检测溶液中微量Zn2+、F-的荧光探针试剂或比率吸收探针试剂；
2、作为目视法检测F-的探针试剂；
3、作为荧光成像试剂用于检测活性癌细胞中微量Zn2+。
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，所述应用作为荧光光谱法中用于检测溶液中微量Zn2+、F-的荧光探针试时的检测方法包括：
1、探针试剂在体积比为1/4的N,N-二甲基甲酰胺/水的溶液中作为荧光光谱法检测微量Zn2+的试剂，测定Zn2+时，以355nm为激发波长，测定475nm处的荧光强度，荧光强度与Zn2+浓度成线性关系；检测Zn2+的浓度线性范围为2.0×10-7～1.1×10-5M；检测限为4.33×10-8M；其它共存金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3 +，Cr3+，Ag+，Cu2+之一，在浓度与Zn2+相同时，对Zn2+的测定无干扰；
2、探针试剂在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中作为荧光光谱法检测微量F-的试剂，测定F-时，以410nm为激发波长，测定480nm处的荧光强度，荧光强度与F-浓度成线性关系；检测F-的浓度线性范围为2.0×10-7～1.0×10-5M，检测限为2.87×10-8M；其它共存阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰。
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，作为紫外-可见吸收光谱法中用于检测溶液中微量Zn2+、F-的比率吸收探针试剂，具体方法为：
1、探针试剂在体积比为1/4的N,N-二甲基甲酰胺/水的溶液中作为紫外-可见吸收光谱法检测微量Zn2+时，测定320nm和370nm波长处的吸光度比值，该吸光度比值与Zn2+浓度成线性关系；检测Zn2+的浓度线性范围为6.0×10-7～1.0×10-5M，检测限为3.78×10-7M；其它共存金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+之一，在浓度与Zn2+浓度相同时，对Zn2+的测定无干扰；
2、探针试剂在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中作为紫外-可见吸收光谱法检测微量F-时，测定325nm和390nm波长处的吸光度比值，该吸光度比值与F-浓度成线性关系；检测F-的浓度线性范围为4.0×10-7～1.1×10-5M，检测限为3.12×10-7M；其它共存阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-浓度相同时，对F-的测定无干扰。
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，作为探针试剂目视法检测F-时，在365nm紫外灯下，F-离子浓度分别为0、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10- 2M时，探针溶液荧光颜色变化由浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色至绿色；用浸有探针的滤纸条作F-测试条，F-离子浓度分别为1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2M时，滤纸条荧光颜色变化由浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色至绿色，检测F-，即可；检测限为10-5M。
前述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用中，作为荧光成像试剂用于检测活性癌细胞中微量Zn2+时，这样检测：人体前列腺癌活性细胞经复苏、传代、接种、培养、清洗后，将细胞浸入含探针试剂的培养液，在37℃，5％CO2以及饱和湿度为100％的培养箱中孵育，吸出含探针试剂的培养液，清洗细胞，用荧光显微镜检测，观察不到细胞的荧光图像；再将上述细胞浸入含Zn2+的培养液中孵化后，吸出含Zn2+的培养液，清洗细胞，用荧光显微镜检测，观察到绿色荧光细胞图像；细胞经探针孵化后、或探针孵化后再经Zn2+孵化，显微镜下观察，即可。
申请人对本发明合成的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针进行了结构表征测试，得出核磁共振氢谱数据见表1、质谱数据见表2、红外特征峰光谱数据见表3。根据所得波谱数据，证实了所得氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛的化学结构。
表1探针试剂的核磁共振氢谱数据
表2探针试剂的质谱数据
表3探针试剂的红外特征峰光谱数据
为验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验研究，部分实验过程和结果如下：
1、在浓度为10μM的探针的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)/H2O(v/v，1/4)溶液中，分别加入200μM金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+时，没有观察到探针的荧光光谱明显有变化；而加入200μM的Zn2+时，Zn2+离子使探针在475nm处的荧光强度显著增强。表明在此条件下探针仅对Zn2+有识别检测作用。附图1插图为365nm紫外灯下，探针溶液不发荧光、探针与Zn2+溶液发射强烈的绿色荧光、探针与上述其他金属离子的溶液不发荧光的照片。激发波长为355nm。
2、在浓度为10μM的探针的DMF溶液中，分别加入200μM阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到探针的荧光光谱有明显的变化；而加入200μM的F-时，F-离子使探针在480nm处的荧光强度显著增强。表明在此条件下探针仅对F-有识别检测作用。附图2插图为365nm紫外灯下，探针溶液不发荧光、探针与F-溶液发射强烈绿色荧光、探针与上述其他阴离子的溶液不发荧光的照片。激发波长为410nm。
3、在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，分别加入200μM金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+时，没有观察到探针的紫外-可见吸收光谱有明显的变化；而加入200μM的Zn2+时，Zn2+离子使探针在320nm处的紫外吸收峰降低，在370nm处出现新的吸收峰，在340nm处有等吸收点，370nm与320nm处形成比率吸收。表明在此条件下探针仅对Zn2+有识别检测作用。附图3插图为日光下，探针溶液呈无色、探针与Zn2+溶液呈黄色、探针与上述其他金属离子的溶液呈无色的照片。
4、在浓度为10μM的探针的DMF溶液中，分别加入200μM阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到探针的紫外-可见吸收光谱有明显的变化；而加入200μM的F-时，F-离子使探针在325nm处的紫外吸收峰降低，在390nm处出现新的吸收峰，在360nm处有等吸收点，390nm与325nm处形成比率吸收。表明在此条件下探针仅对F-有识别检测作用。附图4插图为日光下，探针溶液呈无色、探针与F-溶液呈黄色、探针与上述其他阴离子的溶液呈无色的照片。
5、在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，分别加入不同浓度Zn2+到探针溶液中，随Zn2+的加入，测得荧光光谱滴定曲线。探针在475nm处的荧光强度随Zn2+浓度的增加而线性增强。测试的激发波长为355nm。具体见附图5。
6、不同浓度的F-对探针的荧光光谱滴定图：在浓度为10μM的探针的DMF溶液中，分别加入不同浓度F-到探针溶液中，随F-的加入，测得荧光光谱滴定曲线。探针在480nm处的荧光强度随F-浓度的增加而线性增强。测试的激发波长为410nm。具体见附图6。
7、不同浓度Zn2+对探针的紫外-可见吸收光谱滴定图：在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，分别加入不同浓度Zn2+到探针溶液中，随Zn2+的加入，测得紫外-可见吸收光谱滴定曲线。探针在340nm处出现一个等吸收点，370nm与320nm波长处吸光度形成比率吸收，随Zn2+浓度而线性变化。具体见附图7。
8、不同浓度F-对探针的紫外-可见吸收光谱滴定图：在浓度为10μM的探针的DMF溶液中，分别加入不同浓度F-到探针溶液中，随F-的加入，测得紫外-可见吸收光谱滴定曲线。探针在360nm处出现一个等吸收点，390nm与325nm波长处吸光度形成比率吸收，随F-浓度而线性变化。具体见附图8。
9、共存金属离子对探针荧光光谱法检测Zn2+的影响。在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，加入200μM的Zn2+后探针在475nm处的荧光峰显著增强，测定475nm处的荧光强度。其他金属离子的加入则无此现象；再分别向探针-Zn2+混合溶液中加入200μM的其他金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+后测其荧光强度变化。黑色条表示在探针中加入不同金属离子后在波长475nm处的荧光强度。白色条表示在探针-Zn2+混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在波长475nm处的荧光强度变化。表明探针检测Zn2+的荧光强度不受上述其他金属离子共存的影响。测试的激发波长为355nm，荧光发射波长为475nm。具体见附图9。
10、共存阴离子对探针荧光光谱法检测F-的影响。在浓度为10μM的探针的DMF溶液中，加入200μM的F-后探针在480nm处的荧光显著增强，测定480nm处的荧光强度。其他阴离子的加入则无此现象；再分别向探针-F-混合溶液中加入200μM的其他阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -后测其荧光强度变化。黑色条表示在探针中加入不同阴离子后在波长480nm处的荧光强度。白色条表示在探针-F-混合溶液再分别加入上述其他共存阴离子后在480nm波长处的荧光强度变化。表明探针检测F-的荧光强度不受上述其他阴离子共存的影响。测试的激发波长为410nm，荧光发射波长为480nm。见附图10。
11、共存金属离子对探针紫外-可见吸收光谱法检测Zn2+的影响。在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，加入200μM的Zn2+后，探针在320nm处的吸收峰降低，同时在370nm处出现新的吸收峰，测定370nm与320nm处形成的吸光度比值。其他金属离子的加入无此现象；再分别向探针-Zn2+混合溶液中加入200μM的其他金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+后测定比率吸光度变化。黑色条表示在探针中加入不同金属离子后在波长370nm与320nm处比率吸收值。白色条表示在探针-Zn2+溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在波长370nm与320nm处的比率吸收值变化。表明探针检测Zn2+的比率吸收不受上述其他试验金属离子共存的影响。比率吸收波长为370nm与320nm。见附图11。
12、共存阴离子对探针紫外-可见吸收法检测F-的影响。在浓度为10μM的探针的DMF溶液中，加入200μM的F-后，探针在325nm处的紫外吸收峰降低，同时在390nm处出现新的吸收峰，测定390nm与325nm处形成的比率吸收。其他阴离子的加入无此现象；再分别向探针-F-混合溶液中加入200μM的其他阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -后测其比率吸光度变化。黑色条表示在探针中加入不同阴离子后在390nm与325nm波长处比率吸收值。白色条表示在探针-F-溶液再分别加入上述其他共存阴离子后在390nm与325nm波长处的比率吸收值变化。表明探针检测F-的比率吸收不受上述其他试验阴离子共存的影响。比率吸收波长为390nm与325nm。见附图12。
13、探针检测Zn2+的荧光光谱法校正曲线。在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中分别加入不同浓度Zn2+，测定荧光值。纵坐标为475nm波长处荧光强度，横坐标为Zn2+的浓度。激发波长为355nm。见附图13。
14、探针检测F-的荧光光谱法校正曲线。在浓度为10μM的探针的DMF溶液中分别加入不同浓度F-，测定荧光值。纵坐标为480nm波长处荧光强度，横坐标为F-的浓度。激发波长为410nm。见附图14。
15、探针检测Zn2+的紫外-可见吸收光谱法校正曲线。在浓度为10μM的探针的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中分别加入不同浓度Zn2+，测定比率吸收值。纵坐标为370nm与320nm波长处吸光度的比值，横坐标为Zn2+的浓度。见附图15。
16、探针检测F-的紫外-可见吸收光谱法校正曲线。在浓度为10μM的探针的DMF溶液中分别加入不同浓度F-，测定比率吸收值。纵坐标为390nm与325nm波长处吸光度的比值，横坐标为F-的浓度。见附图16。
17、浓度为10mM探针检测不同浓度F-的溶液颜色变化。在365nm紫外灯下观察，在F-的浓度0μM～10mM范围内，随F-浓度增加，探针检测F-离子溶液，随F-浓度从0M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M变化，溶液荧光颜色分别对应于浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色、绿色。通过目视法定性和半定量检测F-离子。见附图17。
18、滤纸条测试探针检测不同浓度F-的染色变化。在365nm紫外灯下观察，浸有浓度为0.1mM的探针的滤纸条分别检测F-，F-浓度从0M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M变化，溶液荧光颜色分别对应于浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色、绿色。通过目视法定性和半定量检测F-离子。见附图18。
19、探针荧光成像法检测活性细胞中Zn2+的荧光显微镜拍摄照片。见附图19。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明探针能同时作为Zn2+、F-的荧光增强和比率吸收检测试剂，检测限分别低至10-8M和10-7M。不仅能够定量检测F-，还可利用探针溶液或探针测试滤纸敏锐的颜色变化，快速检测溶液中微量F-，检测限低至10-5M。
2、本发明利用7-羟基香豆素为基本发光单元，通过简单缩合反应，构筑了席夫碱结构的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针。分子设计中引入氮、氧原子为配位原子，提供了选择性结合Zn2+、F-离子的作用位点；配合物的形成增大了分子的共轭程度，增强了分子的平面刚性结构。
3、本发明探针试剂合成的最后一步反应中，对反应物的投料比以及反应时间的控制，使得产率高。在无水乙醇中回流时，加入7-羟基-8-醛基香豆素醛与氨基硫脲摩尔比为1:1时，产率很低；当比例为1:15时，过多的氨基硫基脲不易除尽，影响产物纯度提高。最佳投料比应控制在摩尔比为1:7，反应时间为30min。
4、本发明探针试剂结构新颖、合成方法简单、成本低廉，产率较高。探针制备过程虽为三步，但基础原料7-羟基香豆素价格便宜，除中间体7-羟基-8-醛基香豆素外，其余两步的产率均较高，且反应条件温和易控制。
5、在活性癌细胞中，本发明探针能对细胞内Zn2+实现蓝色荧光成像检测。
6、荧光增强型检测方式和比率吸收检测方法是一类具有优越实用性能的光传感信号模式，这类传感系统的荧光和吸收响应往往具有较大的信号对比度，特别有利于复杂微观系统的定量分析。
附图说明：
图1探针与金属离子的荧光光谱；
图2探针与阴离子的荧光光谱；
图3探针与金属离子的紫外-可见吸收光谱；
图4探针与阴离子的紫外-可见吸收光谱；
图5不同浓度的Zn2+对探针的荧光光谱滴定图；
图6不同浓度的F-对探针的荧光光谱滴定图；
图7不同浓度Zn2+对探针的紫外-可见吸收光谱滴定图；
图8不同浓度F-对探针的紫外-可见吸收光谱滴定图；
图9共存金属离子对探针荧光法检测Zn2+的影响；
图10共存阴离子对探针荧光法检测F-的影响；
图11共存金属离子对探针紫外-可见吸收法检测Zn2+的影响；
图12共存阴离子对探针紫外-可见吸收法检测F-的影响；
图13探针检测Zn2+的荧光光谱法校正曲线；
图14探针检测F-的荧光光谱法校正曲线；
图15探针检测Zn2+的紫外-可见吸收光谱法校正曲线；
图16探针检测F-的紫外-可见吸收光谱法校正曲线；
图17浓度为10mM探针检测不同浓度F-的溶液颜色变化；
图18滤纸条测试探针检测不同浓度F-的染色变化；
图19探针荧光成像法检测活性细胞中Zn2+的荧光显微镜拍摄照片；
a：10μM探针对PC3细胞染色的明场显微照片，观察到细胞圆润饱满；b：10μM探针对PC3细胞染色的暗场荧光显微照片，用荧光显微镜的绿色通道(激发波长：450nm)检测，观测不到细胞的荧光图像；c：将经过10μM探针孵化过的细胞再浸入含20μM的Zn2+的培养液中，继续孵化40min后，用荧光显微镜的绿色通道检测，观测到细胞的明亮绿色荧光图像。
具体实施方式
实施例1：氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的合成：
合成路线：
具体步骤：
1、N2保护下，在250mL的三口烧瓶中加入二氯甲烷120mL，7-羟基香豆素(9.3g，57.3mmol)，搅拌溶解，再加入乙酸酐(11.7g，114.6mmol)，哌啶7～8滴(0.3,g)，室温下回流，反应12h，反应完成后先减压蒸馏除去溶剂，加入水后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，粗产品柱层析分离，洗脱剂为氯仿，得白色产品7-乙酰氧基香豆素11.16g，产率95.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3)，δ(ppm):2.36(s,3H,CH3),6.41(d,1H,J＝9.6Hz,ArH),7.07(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.14(s,1H,ArH),7.50(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.71(d,1H,J＝9.6Hz,ArH)；
2、N2保护的冰浴下，在250mL的三口烧瓶中加入7-乙酰氧基香豆素(15g，73.51mmol)，三氟乙酸100mL，搅拌，待温度降至0℃时，再加入六次甲基四胺(15g，106.26mmol)，冰浴下反应1h，将反应温度逐渐升至室温，再回流搅拌反应8h，减压蒸馏除去溶剂，在剩余溶液中加入水150mL，将混合物升至60℃搅拌30min，过滤，滤液用氯仿萃取，饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，沉淀部分合并，柱层析分离(洗脱剂：氯仿/甲醇，v/v，100/1)得乳白色7-羟基-8-醛基香豆素2.61g，产率18.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):6.343(d,1H,J＝9.6Hz,ArH),6.900(d,1H,J＝9.2Hz,ArH),7.619(d,1H,J＝8.8Hz,ArH),7.666(d,1H,J＝9.2Hz,ArH),10.617(s,1H,OH),12.242(s,1H,CHO)；
3、N2保护下，在250ml三口烧瓶中，加入7-羟基-8-醛基香豆素(0.6g，3mmol)和160mL无水乙醇，搅拌，升温待其溶解后，降至室温。将氨基硫脲(1.8g，20mmol)加入，加热回流反应30min。反应完成后过滤，用氯仿甲醇重结晶，得到氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂830mg，产率为68％。m.p.＞300℃；1H NMR(CDCl3,400MHz),δ(ppm):3.335(s,1H),6.295(d,1H,J＝9.6Hz),6.906(d,1H,J＝8.8Hz),7.599(d,1H,J＝8.8Hz),7.968(d,1H,J＝9.6Hz),8.317(s,1H),8.684(s,1H),10.547(s,1H),11.631(s,1H)；ESI-MS:m/z 286[M+Na]+。
实施例2：
各种试剂的配制方法是：
1、探针试剂溶液的配制方法：称取26.3mg的探针试剂，用DMF溶解，配制成100mL溶液，浓度为1mM；
2、Zn2+储备标准溶液配制方法：称取74.4mg分析纯Zn(ClO4)2，用乙腈溶解，配制成浓度为20mM的溶液10mL；其余金属离子配制方法同上；
3、F-储备液配制方法：称取四丁基氟化铵52.8mg，用乙腈溶解，配制成浓度为20mM的溶液10mL。其它阴离子溶液的配制同上。
4、75％的乙醇溶液：无水乙醇75mL加蒸馏水至100mL，混匀，室温保存备用；
5、磷酸盐缓冲溶液(D-hanks平衡盐溶液)：0.4g KCl、0.06g KH2PO4、8.0g NaCl、1.0g葡萄糖、0.35g NaHCO3、0.152g Na2HPO4·12H2O、10万IU双抗，调整pH为7.2～7.4，去离子水定容至1000mL，针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装备用；
6、1万单位(IU)/mL双抗溶液：将青霉素钠(80万单位)溶于40mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将硫酸链霉素(160万单位)溶于80mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的终浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用；
7、0.25％胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用；
8、0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)：将0.02g EDTA，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器(0.22μm进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用；
9、培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL培养基(改良型RPMI-1640)以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2～8℃保存备用。
光谱测试所用试剂为分析纯试剂，水为超纯水；细胞测试所用试剂为生物试剂，试验用水为生理盐水。
本发明所用紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，日本岛津公司生产；荧光分光光度计型号为Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；手提式紫外灯WFH-204B上海光学仪器厂；ThermoFisher 8000储水型CO2细胞培养箱；IX-71型荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AR1530/C电子天平；25cm2细胞培养瓶，美国Corning公司立式压力蒸汽灭菌器(LS-B75)；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。
实施例3：
(1)荧光光谱法对Zn2+检测
在10mL容量瓶中加入(1mM，100μL)，Zn2+(20mM，0～100μL)，用DMF/H2O(v/v，1/4)稀释至刻度，摇匀，进行荧光光谱测定；
设置荧光激发波长为355nm，在1cm的比色皿中加入3ml探针试剂(浓度为10μM)的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液进行光谱扫描，探针试剂在475nm波长处有荧光发射。分别加入20μM的金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+时，没有观察到荧光光谱明显的变化，只有Zn2+的加入使探针试剂在475nm处的荧光峰显著增强，如图1。
在DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，以410nm为荧光激发波长，在10μM探针试剂溶液中加入加不同浓度的Zn2+离子得到荧光光谱滴定曲线，如图5。测定Zn2+浓度变化时探针试剂在475nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线，如图13。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针试剂荧光法检测Zn2+的浓度线性范围和检出限列于表4。
探针试剂检测Zn2+在475nm处的荧光值在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针试剂-Zn2+混合溶液中，金属离子的共存对探针试剂检测Zn2+的荧光强度不干扰，如图9。
表4探针试剂荧光法检测Zn2+的分析参数
2、荧光光谱法对F-检测
在10mL容量瓶中加入探针试剂(1mM，100μL)，F-(20mM，0～100μL)，用DMF稀释至刻度，摇匀，进行荧光光谱测定。
设置荧光激发波长为410nm，在1cm的比色皿中加入约3ml探针试剂(浓度为10μM)的DMF溶液进行光谱扫描，探针试剂在480nm波长处有荧光发射。分别加入20μM的阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到荧光光谱明显的变化，只有F-的加入使探针试剂在480nm处的荧光峰显著增强，如图2。
在DMF溶液中，以410nm为荧光激发波长，在10μM探针试剂溶液中加入不同浓度的F-离子得到荧光光谱滴定曲线(如图6)。测定F-浓度变化时探针试剂在480nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线(如图14)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针试剂荧光法检测F-的浓度线性范围和检出限列于表5。
探针试剂检测F-在475nm处的荧光值在上述其他阴离子分别作为共存离子存在于探针试剂-F-混合溶液中，阴离子的共存对探针试剂检测F-的荧光强度不干扰(如图10)。
表5探针试剂荧光法检测F-的分析参数
3、紫外-可见吸收光谱法对Zn2+检测
在10mL容量瓶中加入探针试剂(1mM，100μL)，Zn2+(20mM，0～100μL)，用DMF/H2O(v/v，1/4)稀释至刻度，摇匀，进行紫外光谱测定。
在1cm的比色皿中加入约3ml探针试剂(浓度为10μM)的DMF/H2O(v/v，1/4)溶液进行紫外吸收光谱测试，分别加入20μM的金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+时，没有观察到紫外吸收光谱明显的变化，只有Zn2+的加入使探针试剂在320nm处的紫外吸收峰降低，同时在370nm处出现新的吸收峰，如图3。
在DMF/H2O(v/v，1/4)溶液中，在10μM探针试剂溶液中加入不同浓度的Zn2+离子得到吸收光谱滴定曲线，如图7。测定Zn2+浓度变化时探针试剂在370nm和320nm处的吸光度的比值，获得比率吸收校正曲线，如图15。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针试剂紫外吸收法检测Zn2+的浓度线性范围和检出限列于表6。
探针试剂检测Zn2+在370nm和320nm处的比率吸收值在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针试剂-Zn2+混合溶液中，金属离子的共存对探针试剂检测Zn2+的比率吸收不干扰，如图11。
表6探针试剂紫外-可见吸收法检测Zn2+的分析参数
4、紫外-可见吸收光谱法对F-检测
在10mL容量瓶中加入探针试剂(1mM，100μL)，F-(20mM，0～100μL)，用DMF稀释至刻度，摇匀，进行紫外-可见吸收光谱测定。
在1cm的比色皿中加入约3ml探针试剂(浓度为10μM)的DMF溶液进行紫外-可见吸收光谱测试，分别加入20μM的阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到紫外-可见吸收光谱明显的变化，只有F-的加入使探针试剂在325nm处的吸收峰降低，在390nm处出现新的吸收峰，(如图4)。
在DMF溶液中，在10μM探针试剂溶液中加入不同浓度的F-离子得到紫外-可见吸收光谱滴定曲线(如图8)。测定F-浓度变化时探针试剂在390nm和325nm处的吸光度的比值，获得比率吸收校正曲线(如图16)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针试剂紫外-可见吸收法检测F-的浓度线性范围和检出限列于表7。
探针试剂检测F-在390nm和325nm处的比率吸收值在上述其他阴离子分别作为共存离子存在于探针试剂-F-混合溶液中，阴离子的共存对探针试剂检测F-的比率吸收不干扰(如图12)。
表7探针试剂紫外-可见吸收法检测F-的分析参数
实施例4：
1.目视法检测溶液中F-
在DMF溶液中，探针试剂浓度为10μM，分别加入浓度为0M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M的F-，在365nm紫外灯下观察，随F-浓度增加，溶液的荧光颜色由浅蓝色逐渐变至绿色(如图17)。通过目视法定性和半定量检测F-离子。F-浓度从0M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M变化，溶液荧光颜色分别对应于浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色、绿色。
2.目视法试纸条检测F-浓度
将滤纸裁剪成1cm×2cm试纸条，浸入浓度为10μM的探针试剂的DMF溶液中，2～3min，让试纸条充分吸收探针试剂，取出，在空气中将溶剂挥发，然后再分别浸入浓度为0M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M的F-溶液中，2～3min，让试纸条上的探针试剂与F-充分作用，取出，待溶剂挥发。在365nm紫外灯下观察，随F-浓度增加，溶液的荧光颜色由浅蓝色逐渐变至绿色(如图18)。F-浓度从0M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M变化，溶液荧光颜色分别对应于浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色、绿色。
实施例5：
活性PC3细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗的培养基(改良型RPMI-1640)中，在温度为37℃，5％CO2以及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次。将细胞浸入含10μM探针试剂的培养液(10μM探针试剂培养液配制：900μL的培养液+100μL用生理盐水配制的100μM的探针试剂储备液)中孵化30min，吸出含探针试剂的培养液，用新鲜培养基清洗细胞2次。用荧光显微镜观察明场下的细胞照片(附图19a)，置于荧光显微镜下进行暗场拍照，用荧光显微镜的绿色通道检测，观测不到细胞的荧光图像(附图19b)。
将经含10μM探针试剂的培养液孵化过的细胞，再经Zn2+(20μM Zn2+培养液配制：900μL的培养液+100μL用生理盐水配制的200μM Zn2+储备液)孵化40min后，吸出含Zn2+的培养液，用新鲜培养基清洗细胞2次。用荧光显微镜的绿色通道检测，观测到细胞的绿色荧光图像(附图19c)。

Claims (7)

1.一种氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：包括：
(1)作为荧光光谱法或紫外-可见吸收光谱法中用于检测溶液中微量Zn2+、F-的荧光探针试剂或比率吸收探针试剂；
(2)作为目视法检测F-的探针试剂；
(3)作为荧光成像试剂用于检测活性癌细胞中微量Zn2+；
所述的作为目视法检测F-的探针试剂；是作为探针试剂目视法检测F-时，在365nm紫外灯下，F-离子浓度分别为0、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2M时，探针溶液荧光颜色变化由浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色至绿色；用浸有探针的滤纸条作F-测试条，F-离子浓度分别为1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2M时，滤纸条荧光颜色变化由浅蓝色、青色、蓝绿色、浅绿色至绿色，检测F-，即可；检测限为10-5M；
所述探针试剂的化学结构式为：所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂是以7-羟基-8-醛基香豆素与氨基硫脲缩合反应得到。
2.如权利要求1所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：所述探针试剂是以7-羟基香豆素为原料，先制备7-乙酰氧基香豆素，再制备中间体7-羟基-8-醛基香豆素，最后由7-羟基-8-醛基香豆素与氨基硫脲经缩合反应得到。
3.如权利要求1或2所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：所述的探针试剂按照以下路线合成：
4.如权利要求3所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂按下述步骤进行制备：
(1)7-乙酰氧基香豆素的合成：氮气保护的三口烧瓶中，在溶有7-羟基香豆素的二氯甲烷溶液中，加入乙酸酐，按摩尔比7-羟基香豆素:乙酸酐等于1:1.5～4，再加入催化量的哌啶，回流，反应12h，除去溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，过滤，除去溶剂，粗产品柱层析分离，即得；
反应温度：二氯甲烷回流温度
反应溶剂：二氯甲烷
柱层析分离用洗脱剂：氯仿；
所述催化量为按重量比计算，7-羟基香豆素:哌啶＝1:0.01-0.1；
(2)7-羟基-8-醛基香豆素的合成：氮气保护冰浴下的三口烧瓶中，在溶有7-乙酰氧基香豆素的三氟乙酸溶液中，加入六次甲基四胺，按摩尔比7-乙酰氧基香豆素:六次甲基四胺等于1:1.5，0℃的冰浴下，以三氟乙酸为溶剂，反应1h后，再将反应温度逐渐升至室温，回流搅拌反应8h，除去溶剂，加入水，将温度升至60℃，搅拌30min，过滤，氯仿萃取，洗涤，干燥，过滤，除去溶剂，洗脱，柱层析分离，即得；
反应溶剂：三氟乙酸
洗脱剂：v/v，100/1，氯仿/甲醇；
(3)氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的合成：氮气保护下的三口烧瓶中，在无水乙醇溶液中，加入7-羟基-8-醛基香豆素，升温搅拌待其溶解后，降至室温，按摩尔比7-羟基-8-醛基香豆素:氨基硫脲等于1:2～10加入氨基硫脲，加热回流反应，过滤，用氯仿甲醇重结晶，即得；
反应温度：无水乙醇回流温度
反应时间：30min
反应溶剂：无水乙醇
纯化溶剂：v/v，1:1，氯仿甲醇。
5.如权利要求1所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：所述应用作为荧光光谱法中用于检测溶液中微量Zn2+、F-的荧光探针试时的检测方法包括：
(1)探针试剂在体积比为1/4的N,N-二甲基甲酰胺/水的溶液中作为荧光光谱法检测微量Zn2+的试剂，测定Zn2+时，以355nm为激发波长，测定475nm处的荧光强度，荧光强度与Zn2+浓度成线性关系；检测Zn2+的浓度线性范围为2.0×10-7～1.1×10-5M；检测限为4.33×10- 8M；其它共存金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+之一，在浓度与Zn2+相同时，对Zn2+的测定无干扰；
(2)探针试剂在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中作为荧光光谱法检测微量F-的试剂，测定F-时，以410nm为激发波长，测定480nm处的荧光强度，荧光强度与F-浓度成线性关系；检测F-的浓度线性范围为2.0×10-7～1.0×10-5M，检测限为2.87×10-8M；其它共存阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰。
6.如权利要求1所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：作为紫外-可见吸收光谱法中用于检测溶液中微量Zn2+、F-的比率吸收探针试剂，具体方法为：
(1)探针试剂在体积比为1/4的N,N-二甲基甲酰胺/水的溶液中作为紫外-可见吸收光谱法检测微量Zn2+时，测定320nm和370nm波长处的吸光度比值，该吸光度比值与Zn2+浓度成线性关系；检测Zn2+的浓度线性范围为6.0×10-7～1.0×10-5M，检测限为3.78×10-7M；其它共存金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Hg2+，Sr2+，Al3+，Cd2+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Fe3+，Cr3+，Ag+，Cu2+之一，在浓度与Zn2+浓度相同时，对Zn2+的测定无干扰；
(2)探针试剂在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中作为紫外-可见吸收光谱法检测微量F-时，测定325nm和390nm波长处的吸光度比值，该吸光度比值与F-浓度成线性关系；检测F-的浓度线性范围为4.0×10-7～1.1×10-5M，检测限为3.12×10-7M；其它共存阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-浓度相同时，对F-的测定无干扰。
7.如权利要求1所述的氨基硫脲缩7-羟基香豆素-8-醛探针试剂的应用，其特征在于：作为荧光成像试剂用于检测活性癌细胞中微量Zn2+时，这样检测：人体前列腺癌活性细胞经复苏、传代、接种、培养、清洗后，将细胞浸入含探针试剂的培养液，在37℃，5％CO2以及饱和湿度为100％的培养箱中孵育，吸出含探针试剂的培养液，清洗细胞，用荧光显微镜检测，观察不到细胞的荧光图像；再将上述细胞浸入含Zn2+的培养液中孵化后，吸出含Zn2+的培养液，清洗细胞，用荧光显微镜检测，观察到绿色荧光细胞图像；细胞经探针孵化后、或探针孵化后再经Zn2+孵化，显微镜下观察，即可。
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