CN1180239C - 一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法 - Google Patents
一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1180239C CN1180239C CNB02128461XA CN02128461A CN1180239C CN 1180239 C CN1180239 C CN 1180239C CN B02128461X A CNB02128461X A CN B02128461XA CN 02128461 A CN02128461 A CN 02128461A CN 1180239 C CN1180239 C CN 1180239C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- concentration
- water
- absorbance
- infrared wavelength
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
涉及一种测定蛋白质的方法，尤其是一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法。步骤为在容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液；加入酸性缓冲溶液，以水稀释至满刻度；逐瓶加入花菁溶液；放置，以水或相应缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或测量吸光度的增加值。测定灵敏度高，测定波长位于近红外波长区，以减少样品中某些物质的干扰，工作曲线线性好；试剂无本底吸收，可用水或缓冲溶液做空白调零；蛋白质-染料复合物摩尔吸收系数大，在同等浓度的蛋白质条件下，所引起的测定体系的吸光度的增强最显著，测定的灵敏度高，测定波长大于900nm，位于近红外波长区，可消除样品中可能存在的长波强吸收物质，如溶血等对测定的干扰。
Description
(1)技术领域
本发明涉及一种测定蛋白质的方法，尤其是一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法。
(2)背景技术
花菁染料属一类化合物，访类染料最早作为光敏剂，应用于照相化学工业中，或作为能量转换与储存材料，例如太阳能电池用色素或激光染料。近年来发现该类化合物具有长波荧光(600～1000nm)发射，因而逐渐应用于荧光分析，结合激光诱导荧光(Laserinduced-fluorescence，LIF)技术及毛细管电泳(Caterpillar electroporesis，CE)技术或色谱分离技术，该类化合物已用于核酸的测序(Shealy，D.B.et al.Anal.Chem.，1995，67，247；Shealy，D.B.et al.Appl.Spectrosc.，1995，49，1815)以及蛋白质(Sauda，K.et al.Anal.Chem.，1986，58，2649；Williams，R.et al. Anal.Chem.，1993，65，601)、氨基酸(Flanagan，J.H.et al.Anal.Chem.，1995，67，341)及其它小分子(Imasaka，T.et al.Anal.Chem.，1984，56，1077)的超微量分析中。
利用蛋白质与一些染料在酸性溶液中的结合反应所形成的蛋白质-染料复合物吸光度的变化(一般倾向于采用吸光度的增加)可以对蛋白质进行定量测定，这就是染料结合法。染料结合法已在生物化学实验及临床分析中得到广泛应用，如考马斯亮蓝(CBB)G-250染料结合法(Bradford，M.M.Anal.Biochem.，1976，72，248)测定样品总蛋白及溴甲酚绿法(张德安等编著.生物大分子实验手册.吉林大学出版社，第1版，1991.377)测定血清白蛋白。人们还发表了许多利用染料结合法进行蛋白定量的方法，但其灵敏度相对考马斯亮蓝法而言并无实质性提高。
(3)发明内容
本发明旨在提供一种测定灵敏度高，测定波长位于近红外波长区，以减少样品中某些物质的干扰，工作曲线线性关系好的基于染料结合原理测定微量蛋白质的方法。
本发明的步骤如下：
1)在容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液；
2)加入酸性缓冲溶液，以水稀释至满刻度；
3)逐瓶加入花菁溶液；
4)放置，以水或相应缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或测量吸光度的增加值。
在一系列容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液，所用容量瓶最好不少于3个，蛋白质水溶液的系列浓度可落在相应的工作曲线线性范围内；所谓的相应工作曲线线性范围是指对应于所用花菁溶液浓度所决定的测定蛋白质浓度的线性工作曲线范围。
所加入的酸性缓冲溶液是指pH 1.0～4.0的各种酸性缓冲溶液。
所加入的花菁溶液为终浓度介于2.0×10-6～1.0×10-5mol/L所相应量的花菁溶液，加入花菁溶液后放置的时间在6分钟左右，可在883～922nm的波长范围内测定吸光度。
所说的花菁为：
分子式：C34H38N2ClS2O6Na
结构式：
英文名称：5-sulfoate-2-[4’-chloro-7’-(5”-sodiumsulfoate-1”-ethyl-3”，”-dimethylindolin-2”-ylidene)-3’，5’-(propane-1，3-diyl)-1’，3’，5’-heptatrien-1’-yl]-1-ethyl-3，3-dimethyl-3H-indolium
中文名称：水溶性七次甲基花菁，简称HMC或花菁。
所说的花菁依如下程序合成：
1)化合物(
1)(2，3，3-trimethylindoleninium-5-sulfonate)的合成：
在100mL圆底烧瓶中，加入3-甲基-2-丁酮25.2mL，对肼基苯磺酸15g以及冰醋酸45mL，混合物回流5小时。以旋转蒸发器抽除冰醋酸，得粉红色粘稠状物。在加热情况下以尽可能少的甲醇溶解，慢慢加入以KOH饱和的异丙醇溶液，至反应瓶中液体由棕红色变为土黄色(此时pH5～6)。于1～4℃中放置，有大量黄色固体析出。过滤，以无水乙醚洗涤。
2)化合物(
2)(1-ethyl-2，3，3-trimethylindoleninium-5-sulfonate)的合成：
取化合物(
1)3g以及15mL碘乙烷于50mL圆底烧瓶中回流24小时。反应混合物冷却，倾去未反应的碘乙烷。所得固体以丙酮处理三次(15mL×3)以除去生成的碘化钾，得亮紫色易吸湿固体，置干燥器中保存。
3)化合物(
3)(2-chloro-1-formyl-3-hydroxymethylenecyclohexene)的合成：
在以冰水浴冷却的40mL DMF及40mL CH2Cl2混合液中，逐滴滴入37mL POCl3与35mLCH2Cl2的混合液；然后再滴加10g的环己酮。滴加完毕后，混合液在氮气氛下回流3小时，冷却至室温，所得红色反应混合物慢慢加入到200g碎冰中(勿使水解剧烈而致温度升高)，放置过夜。滤去液体，所得棕红色固体以预先冷冻的丙酮洗涤数次至固体呈亮黄色。
4)目标化合物(花菁)的合成：
在50ml圆底烧瓶中，称取化合物(
2)1.02克，化合物(
3)0.347克，以30ml醋酸酐溶解，再加入470毫克无水NaAc。于氮气氛下室温搅拌6小时，倒出反应混合物，于其中加入适量无水乙醚至无沉淀析出，倾去上清液，沉淀物以甲醇溶解(不溶物为醋酸钠)，洗涤残渣，收集滤液，减压浓缩，以快速柱层析法分离，收集绿色组分，得270毫克草绿色且具金黄色金属反射光泽的晶体，产率约20％。
合成的目标化合物(花菁)结构表征数据如下：
1H NMR(500MHz)(ppm，DMSO-d6)：1.3(t，J＝7.0Hz，6H)，1.68(s，12H)，1.86(m，J＝5.6Hz，2H)，2.72(t，J＝5.7Hz，4H)，4.26(q，J＝7.0Hz，4H)，7.8(d，J＝1.2Hz，2H)，7.68(dd，J＝1.4Hz，8.3Hz，2H)，7.38(d，J＝8.3Hz，2H)，6.34(d，J＝14.1Hz，2H)，8.26(d，J＝14.1Hz，2H).IR(KBrPellet)：1640，1475，1390，1252，1167，1061，824，728，668cm-1MS，m/z：694.4(M++1，22)，693.4(M+，42)，671.4(M++1-Na，100).
Rf＝0.46(薄层层析用硅胶板，自制)CHCl3/MeOH＝4/1(v/v).
m.p.202-205℃
本发明所合成的七次甲基花菁染料在酸性条件下，蛋白质存在时，在904nm处出现一新的吸收峰，且吸光度(ABS)的增加与蛋白质含量的增多成正比，据此建立了以染料结合法为原理进行蛋白质定量的新方法。相对于传统的染料结合法，本发明的独特优点有：
试剂无本底吸收，因而可用水或缓冲溶液做空白调零；
蛋白质-染料复合物摩尔吸收系数大，在同等浓度的蛋白质条件下，本发明所引起的测定体系的吸光度的增强最显著，测定的灵敏度高(测定5000ng/mL牛血清白蛋白时，考马斯亮蓝法引起吸光度增加值为0.275OD(见Bradford，M.M.Anal.Biochem.，1976，72，248)，而测定2000ng/mL牛血清白蛋白时，本发明引起吸光度增加值为0.900OD；若以A＝0.02计，本发明的最低检出量为100～200ng/mL，比现有的各种染料结合法灵敏度提高近10倍。)；
测定波长大于900nm，位于近红外波长(700～1000nm)区，可消除样品中可能存在的长波强吸收物质，如溶血等对测定的干扰。
本发明的工作曲线线性关系良好，而考马斯亮蓝法有时会出现工作曲线的非线性现象。
(4)附图说明
图1为花菁染料及花菁-牛血清白蛋白(BSA)混合物在pH 2.6时的吸收光谱。
图2为花菁染料—蛋白质复合物的稳定性曲线。
图3为测定不同种类蛋白质的响应曲线。
(5)具体实施方式
以下给出优化条件下实验操作举例。
在一系列10mL容量瓶中依次加入0.0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL浓度为20ug/mL的人血清白蛋白(HSA)水溶液，再依次加入1.0mL pH2.6的甘胺酸一盐酸缓冲溶液，以水稀释至满刻度并摇匀。然后逐瓶加入0.3mL浓度为1.0×10-4mol/L的花菁溶液，摇匀。放置40min后，以缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或在904nm处测量吸光度。各组分参数见下表
以下给出其它条件下本发明对蛋白质的响应。
1)不同pH体系对蛋白质的响应
系列浓度蛋白质在不同pH时所引起的吸光度变化见下表。
| BSA终浓度(ng/mL) | 吸光度 | |
| pH 1.0a | pH 4.0b | |
| 0 | 0.000 | 0.000 |
| 200 | 0.035 | 0.021 |
| 400 | 0.085 | 0.069 |
| 1200 | 0.240 | 0.177 |
| 2000 | 0.481 | 0.376 |
| 2800 | 0.528 | O.411 |
| 4000 | 0.670 | 0.505 |
aHCl-KCl体系
bHac-NaAc体系
| BSA终浓度(ng/mL) | 吸光度 | |||
| pH 2.5a | pH 2.56b | pH 2.0c | pH 2.0d | |
| 0 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| 400 | 0.084 | 0.094 | 0.193 | 0.164 |
| 800 | 0.203 | 0.223 | 0.384 | 0.354 |
| 1200 | 0.303 | 0.383 | 0.530 | 0.510 |
| 1600 | 0.485 | 0.539 | 0.642 | 0.613 |
| 2000 | 0.664 | 0.657 | 0.988 | 0.850 |
a邻苯二甲酸氢钾-HCl体系
bBritton-Robinson体系
c0.01N HCl体系
d0.005N H2SO4体系
可见，在pH1.0～4.0范围内，可用七种体系来调控pH值：甘胺酸-HCl体系；HAc-NaAc体系；HCl-KCl体系；邻苯二甲酸氢钾-HCl体系；Britton-Robinson体系；稀浓度的HCl体系及稀浓度的H2SO4体系。
2)不同测定波长时体系对蛋白质的响应
不同波长处测定系列浓度蛋白质所引起的吸光度变化见下表。
| 883nm | 922nm | ||
| BSA浓度(ng/mL) | 吸光度 | BSA浓度(ng/mL) | 吸光度 |
| 0 | 1.000 | 0 | 0.000 |
| 400 | 0.064 | 400 | 0.057 |
| 800 | 0.120 | 800 | 0.129 |
| 1200 | 0.197 | 1200 | 0.197 |
| 1600 | 0.335 | 1600 | 0.303 |
| 2000 | 0.524 | 2000 | 0.512 |
3)体系在不同测定时间对蛋白质的响应
不同时间测定系列浓度蛋白质所引起的吸光度变化见下表。
| BSA终浓度(ng/mL) | 吸光度 | |
| 6分钟 | 120分钟 | |
| 0 | 0.000 | 0.000 |
| 200 | 0.035 | 0.043 |
| 300 | 0.099 | 0.085 |
| 400 | 0.140 | 0.124 |
| 800 | 0.272 | 0.280 |
| 1200 | 0.427 | 0.514 |
| 1600 | 0.556 | 0.698 |
| 2000 | 0.778 | 0.904 |
| 2400 | 1.020 | 1.108 |
不同时间测定同一浓度蛋白质的吸光度数值见下表。
| 测定时间(分钟) | 吸光度 | 测定条件 |
| 6 | 0.744 | 牛血清白蛋白(BSA)终浓度2000ng/mL；花菁终浓度3.0×10-6mol/L |
| 7 | 0.828 | |
| 8 | 0.899 | |
| 9 | 0.947 | |
| 10 | 1.012 | |
| 10.5 | 1.025 | |
| 11 | 1.034 | |
| 11.5 | 1.019 | |
| 12 | 1.032 | |
| 12.5 | 1.050 | |
| 13 | 1.067 | |
| 13.5 | 1.083 | |
| 15 | 1.093 | |
| 16.5 | 1.112 | |
| 20 | 1.096 | |
| 22 | 1.099 | |
| 25 | 1.107 | |
| 30 | 1.124 | |
| 34 | 1.101 | |
| 35 | 1.065 | |
| 40 | 1.079 | |
| 50 | 1.075 | |
| 70 | 1.037 | |
| 90 | 1.020 | |
| 100 | 1.015 | |
| 120 | 1.011 |
4)体系在不同花菁浓度时对蛋白质的响应
使用不同花菁浓度时系列浓度蛋白质所引起的吸光度变化见下表。
| BSA终浓度(ng/mL) | 吸光度 | |
| 花菁浓度：2.0×10-6mol/L | 花菁浓度：1.0×10-5mol/L | |
| 0 | 0.000 | 0.000 |
| 100 | 0.023 | 0.072 |
| 200 | 0.057 | 0.121 |
| 400 | 0.137 | 0.213 |
| 600 | 0.204 | 0.362 |
| 800 | 0.274 | 0.419 |
| 1000 | 0.297 | |
| 1200 | 0.318 | 0.577 |
| 1600 | 0.334 | |
| 2000 | 0.347 | |
| 2400 | 0.853 | |
| 4000 | 1.146 | |
| 6000 | 1.394 | |
| 7200 | 1.592 | |
| 30000 | 3.012 |
以下结合附图对本发明作进一步的说明。
1)近红外花菁染料的吸收光谱
图1为花菁染料及花菁-牛血清白蛋白(BSA)混合物在pH 2.6时的吸收光谱。
从图1中可以看出，当不存在BSA时，花菁最大吸收峰位于776nm，在904nm处无吸收；加入BSA后，776nm处的吸光度随BSA浓度增大而降低并略红移，而904nm处则出现新的吸收峰且其吸光度随BSA浓度增大而增大。在图1中，HMC的浓度为3.0×10-6mol/L；BSA的浓度(ng/mL)为(1)0，(2)400，(3)800，(4)1200，(5)1600；WL为测定波长。
2)染料—蛋白质复合物的稳定性
图2为花菁染料—蛋白质复合物的稳定性曲线。
在实验条件下，染料与蛋白质作用后，形成的染料—蛋白质复合物在40分钟时吸光度达到最大并至少在80分钟内是稳定的，在图2中，HMC的浓度为3.0×10-6mol/L；BSA的浓度2400ng/mL，甘胺酸-盐酸缓冲溶液pH：2.6。
3)对不同种类蛋白质的响应
图3为测定不同种类蛋白质的响应曲线。
在实验条件下建立测定不同种类蛋白质的标准工作曲线。测定BSA的线性范围是200～2000ng/mL，回归方程为A＝-0.085+4.874×10-4 C(C：ng/mL)，线性相关系数γ＝0.9976。对1200ng/mL BSA的七次平行测定的相对标准偏差(RSD)为2.19％。测定人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的线性范围是100～2400ng/mL，回归方程为：A＝-0.048+5.706×10-4C(C：ng/mL)，线性相关系数γ＝0.9987。测定人血丙球蛋白(IgG)的线性范围是200～3000ng/mL，回归方程为：A＝-0.060+3.427×10-4C A＝(C：ng/mL)，线性相关系数r＝0.9984。测定卵清蛋白(ovalbumin)的线性范围是300～4000ng/mL，回归方程为：A＝-0.027+2.425×10-4C A＝(C：ng/mL)，线性相关系数r＝0.9990。由此可见，该方法对于不同种类的蛋白质有不同的响应，因而在蛋白质测定时应以同源的蛋白质作为标准。
Claims (2)
1、一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于步骤如下：
1)在至少3个容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液，所说的蛋白质水溶液的系列浓度落在相应的工作曲线线性范围内，所说的相应工作曲线线性范围是指对应于所用花菁溶液浓度所决定的测定蛋白质浓度的线性工作曲线范围；
2)加入酸性缓冲溶液，以水稀释至满刻度，所说的酸性缓冲溶液的pH为：1.0≤pH＜4.0：
3)逐瓶加入终浓度介于2.0×10-6～1.0×10-5mol/L所相应量的花菁溶液；
4)放置，以水或相应缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或测量在883～922nm的波长范围内吸光度的增加值。
2、如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于加入花菁溶液后放置的时间至少6分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB02128461XA CN1180239C (zh) | 2002-09-06 | 2002-09-06 | 一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB02128461XA CN1180239C (zh) | 2002-09-06 | 2002-09-06 | 一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1401988A CN1401988A (zh) | 2003-03-12 |
| CN1180239C true CN1180239C (zh) | 2004-12-15 |
Family
ID=4745987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB02128461XA Expired - Fee Related CN1180239C (zh) | 2002-09-06 | 2002-09-06 | 一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1180239C (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100560583C (zh) * | 2006-04-26 | 2009-11-18 | 山东师范大学 | 检测细胞内锌离子的近红外荧光探针及合成方法和用途 |
| CN102507466B (zh) * | 2011-10-20 | 2013-07-31 | 济南大学 | 一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法 |
| EP2642276A1 (en) | 2012-03-22 | 2013-09-25 | Inoviem Scientific | Method of dynamic spectroscopy under physiological conditions |
| CN103383351A (zh) * | 2013-07-22 | 2013-11-06 | 上海嘉麟杰纺织品股份有限公司 | 一种助剂对分散染料增容量的测试方法 |
| CN103592255A (zh) * | 2013-11-22 | 2014-02-19 | 山东东阿阿胶股份有限公司 | 一种基于近红外光谱技术的阿胶化皮液中总蛋白含量的软测量方法 |
-
2002
- 2002-09-06 CN CNB02128461XA patent/CN1180239C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1401988A (zh) | 2003-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101723874B (zh) | 花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途 | |
| CA2015325C (en) | Fluorescent dye | |
| US5565554A (en) | Dimeric fluorescent energy transfer dyes comprising asymmetric cyanine azole-indolenine chromophores | |
| CN101638579B (zh) | 量子点-花菁染料-叶酸生物探针及其制备方法 | |
| CN108586506B (zh) | 一种氟硼荧乙烯基香豆素衍生物及其合成方法和应用 | |
| WO2006001944A1 (en) | Substituted azaporphyrins as fluorescence labels | |
| CN111004624B (zh) | 一种具有ptt效应及聚集诱导发光增强效应的近红外荧光探针的制备 | |
| CN1180239C (zh) | 一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法 | |
| CN108864056B (zh) | 具有aie性能的近红外荧光化合物及其制备方法和应用 | |
| CN103387830B (zh) | 一种铬离子比率型荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN103755620B (zh) | 一种镁离子荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN112939956A (zh) | 一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN113150575B (zh) | 一种近红外的萘酰亚胺染料及其制备方法与应用 | |
| Zelt et al. | Second derivative-high-performance liquid chromatographic-fluorometric detection of porphyrins in chick embryo liver cell culture medium | |
| CN105985291B (zh) | 一种快速高选择性分析氟离子的比色荧光探针 | |
| CN105418559B (zh) | 高灵敏性检测肼的试剂盒及其应用 | |
| CN111777548A (zh) | 一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针csp | |
| CN1181156C (zh) | 稀土荧光标记物及其应用 | |
| CN111303111A (zh) | 一类新型黄菁近红外二区染料、制备方法及荧光成像应用 | |
| CN103952142A (zh) | 一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针及合成方法 | |
| CN106009760B (zh) | 半菁类荧光染料 | |
| CN106674048A (zh) | 一种cn‑检测试剂及其合成方法和应用 | |
| CN108218748A (zh) | 一种芘类巯基乙胺席夫碱Al3+荧光探针的制备及其应用 | |
| CN101585875B (zh) | 一种柠檬黄完全抗原的合成方法 | |
| CN115850174B (zh) | 一种检测胺的荧光探针及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |