CN101585875B - 一种柠檬黄完全抗原的合成方法 - Google Patents

Abstract

一种柠檬黄完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以柠檬黄为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了柠檬黄的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对柠檬黄研究的需要。

Description

一种柠檬黄完全抗原的合成方法

技术领域

一种柠檬黄的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

柠檬黄色素(Tar)是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，其分子结构为偶氮化合物，在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的-芳香类化合物。因此，我国对在食品中的柠檬黄色素有严格限制。凡是肉类及其加工品，鱼类及其加工品等都不能使用人工合成色素，即使在适用的品种和范围内，使用剂量也有严格规定，决不允许过量使用。但实际上，我国食品中普遍存在柠檬黄色素的超标、超范围使用现象屡禁不止。如果人们长期或一次性大量食用柠檬黄含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，检测柠檬黄含量采取的方法是薄层分析及分光光度法，近年来，我国科研工作者在柠檬黄检测方面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外已经开展了对色素类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对柠檬黄的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备柠檬黄完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种柠檬黄完全抗原的合成方法。所制备的产品用于柠檬黄的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种柠檬黄完全抗原的合成方法，以柠檬黄为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：

(1)柠檬黄完全抗原的合成：

配制A液：取53.4mg(0.1mmol)柠檬黄溶于2mL二甲亚砜(DMSO)中，冰浴10min，加入51μL三正丁胺，冰浴10min，加入87μL氯甲酸异丁酯，4℃下，搅拌孵育1h，为A液，4℃保存备用；

配制B液：130mg(0.002mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液，为B液，4℃保存备用；

冰浴条件下把A液逐滴滴加入B液中，边加边摇，于4℃下孵育4h，即得柠檬黄完全抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

透析：将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄完全抗原；

(2)柠檬黄完全抗原的鉴定：柠檬黄完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸光系数ε：配制柠檬黄浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为427nm，在427nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

偶联比测定：配制150μg·mL^-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物人工抗原用20％乙醇稀释到150μg·mL^-1，在427nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：γ＝[(A₁-A₂)/ε]/(150×10^-3/66200)。

其中ε为摩尔吸光系数(L·mol^-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10^-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL^-1)。

本发明的有益效果：本发明合成了柠檬黄完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明

图1柠檬黄完全抗原制备前后的紫外扫描图。

具体实施方法

实施例1

(1)柠檬黄完全抗原的制备

配制A液：取柠檬黄53.4mg(0.1mmol)溶于2mL DMSO中，冰浴10min，加入51μL三正丁胺，冰浴10min，加入87μL的氯甲酸异丁酯，4℃下，搅拌孵育1h，为A液。

配制B液：130mg(0.002mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01mol/L PBS缓冲液，为B液。把A液逐滴滴加入B液中，边加边摇，于4℃下孵育4h，即得柠檬黄完全抗原混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

透析：将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄完全抗原。

(2)柠檬黄完全抗原的鉴定

摩尔吸光系数ε：配制柠檬黄浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为427nm，在427nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε＝25649.76L·mol^-1。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为3.35mg·mL^-1。

偶联比测定：配制150μg·mL^-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL^-1，在427nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：γ＝[(A₁-A₂)/ε]/(150×10^-3/66200)，本实验计算得r≈18。

其中ε为摩尔吸光系数(L·mol^-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10^-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL^-1)。

Claims (1)

1.一种柠檬黄完全抗原的合成方法，其特征是以柠檬黄为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：

(1)柠檬黄完全抗原的合成：

配制A液：取53.4mg柠檬黄溶于2mL DMSO中，冰浴10min，加入51μL三正丁胺，冰浴10min，加入87μL氯甲酸异丁酯，4℃下，搅拌孵育1h，为A液，4℃保存备用；

配制B液：130mg牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液，为B液，4℃保存备用；

冰浴条件下把A液逐滴滴加入B液中，边加边摇，于4℃下孵育4h，即得柠檬黄完全抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

透析：将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄完全抗原；

(2)柠檬黄完全抗原的鉴定：柠檬黄完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。 

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