CN109336965A - 一种卡拉洛尔人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种卡拉洛尔人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明其由卡拉洛尔与2‑氨基‑2‑甲基丙酸乙酯反应得到具有羧基的产物，即半抗原CLZ，用碳二亚胺法将半抗原CLZ与载体蛋白偶联，即得到卡拉洛尔人工抗原。本发明成功合成了卡拉洛尔的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种卡拉洛尔人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
卡拉洛尔(carazolol)是一种β-肾上腺素受体阻断剂，是一类能选择性与β-肾上腺素受体结合，从而拮抗神经递质对β-肾上腺素受体激动作用的药物。因其具有一定的镇静作用，在畜牧业养殖中常被非法用于促生长或抗应激，从而导致在动物可食性组织中残留，对人体健康造成威胁，β-受体阻断剂类药物已经成为兽医临床上常见的七类兽药残留之一。
酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。
发明内容
本发明的目的是提供一种卡拉洛尔人工抗原的合成方法，所制备的产品用于卡拉洛尔免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案，一种卡拉洛尔人工抗原的合成方法，其由卡拉洛尔与2-氨基-2-甲基丙酸乙酯反应得到具有羧基的产物，即半抗原CLZ，用碳二亚胺法将半抗原CLZ与载体蛋白偶联，即得到卡拉洛尔人工抗原；步骤为：
（1）半抗原CLZ的合成：
合成路线如下：
将2g，10.9mmol的化合物1溶于20mL异丙醇溶液中滴加NaOH水溶液476mg，11.9mmol，在室温下搅拌1h；然后一次性加入环氧氯丙烷2.32g，25.1mmol，将溶液在室温下搅拌过夜；将所得混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将合并的有机层用Na2SO4干燥；过滤后，将滤液减压浓缩，残余物用硅胶柱纯化，得到1.7g化合物2，为白色固体。
将1.7g，7.11mmol化合物2和491mg，3.56mmol K2CO3加入到20mL乙腈和5mL水的混合溶液中，然后加入2-氨基-2-甲基丙酸乙酯1.19g，7.11mmol，将混合物在80℃下搅拌过夜；将所得混合物冷却至室温并用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将合并的有机层用Na2SO4干燥；过滤后，浓缩滤液，用二氧化硅柱纯化残余物，得到1g化合物3，为黄色油状物。
将1g，2.69mmol化合物3加入10mL四氢呋喃和2mL水的混合物中，然后加入LiOH170mg，4.04mmol，将反应在室温下搅拌过夜；加入水，水层用乙酸乙酯萃取；将水相用6NHCl水溶液酸化至pH = 7并浓缩至干；通过二氧化硅柱纯化粗产物，得到目标化合物200mg，为白色固体半抗原CLZ。
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原CLZ，与BSA偶联得到偶联物完全抗原CLZ-BSA；或与KLH偶联得到偶联物完全抗原CLZ-KLH。
步骤（2）所述完全抗原CLZ-BSA制备方法如下：
a、称取步骤（1）制备所得半抗原CLZ 8.9 mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐15.54 mg，N-羟基琥珀酰亚胺9.8 mg，用500μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，称为A液，室温搅拌反应6-8h；称取牛血清蛋白BSA 10 mg，其中CLZ与BSA摩尔比为60:1，加入等体积硼酸缓冲溶液，得到B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CLZ-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CLZ-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CLZ-BSA。
卡拉洛尔的人工抗原的鉴定
（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
用PBS配制0.5 mg/mL的蛋白溶液与完全抗原溶液，以PBS建立基线，在波长200~500 nm间扫描，得到蛋白溶液与完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特征峰处的吸光值分别为A1，A2；用甲醇配制5~50μg/mL的半抗原即为Xμg/mL，以甲醇建立基线，在波长200~500 nm间扫描，得到半抗原紫外吸收特征峰处的吸光值A3，半抗原的相对分子质量为M1，蛋白的相对分子质量为M2，则偶联比=[(A2-A1) (X/M1)/A3]/(0.5/M2)
本发明的有益效果：本发明成功合成了卡拉洛尔的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。
附图说明
图1半抗原CLZ的NMR鉴定图。
图2半抗原CLZ的LC-MS鉴定图。
图3 CLZ-BSA人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
具体实施方式
实施例1 半抗原CLZ的合成
合成路线如下：
将化合物1（2.00g，10.9mmol）溶于异丙醇（20.0mL）溶液中滴加NaOH水溶液（476mg，11.9mmol），在室温下搅拌1h。然后一次性加入环氧氯丙烷（2.32g，25.1mmol），将溶液在室温下搅拌过夜。将所得混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩，残余物用硅胶柱纯化，得到化合物2（1.70g），为白色固体。
将化合物2（1.70g，7.11mmol）和K2CO3（491mg，3.56mmol）加入到乙腈（20.0mL）和水（5.00mL）的混合溶液中，然后加入2-氨基-2-甲基丙酸乙酯（1.19g，7.11mmol），将混合物在80℃下搅拌过夜。将所得混合物冷却至室温并用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥。过滤后，浓缩滤液，用二氧化硅柱纯化残余物，得到化合物3（1.00g），为黄色油状物。
将化合物3（1.00g，2.69mmol）加入四氢呋喃（10.0mL）和水（2.00mL）的混合物中，然后加入LiOH（170mg，4.04mmol）。将反应在室温下搅拌过夜。加入水，水层用乙酸乙酯萃取。将水相用6N HCl水溶液酸化至pH = 7并浓缩至干。通过二氧化硅柱纯化粗产物，得到目标化合物（200mg），为白色固体，制备得半抗原CLZ。
实施例2 完全抗原的制备
实例1中制备所得的半抗原CLZ，与BSA偶联得到偶联物完全抗原CLZ-BSA；或与KLH偶联得到偶联物完全抗原CLZ-KLH。
完全抗原CLZ-BSA制备方法如下：
a、称取实例1制备所得的半抗原CLZ 8.9mg，加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐15.54 mg，N-羟基琥珀酰亚胺9.8 mg，用500μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反6-8h。称取牛血清蛋白BSA 10 mg(CLZ与BSA摩尔比为60:1),加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CLZ-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CLZ-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CLZ-BSA。
实施例3 卡拉洛尔人工抗原的鉴定
（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶联中蛋白的含量。
实施例2中CLZ-BSA免疫原的紫外鉴定图如图3所示；
根据偶联比公式：
偶联物CLZ-BSA的特征吸收峰在286 nm处，此处的吸光值A2=0.536397517，BSA在此处的吸光值A1=0.346064597，CLZ的特征吸收峰A3=0.136500254，CLZ的相对分子质量M1=342.2，BSA的相对分子质量M2=67000，X为10μg/mL，则根据公式：
偶联比=[(A2-A1) (X/M1)/A3]/(0.5/M2)，CLZ-BSA中半抗原CLZ与蛋白BSA的偶联比为12.5:1。
Claims (5)
1.一种卡拉洛尔人工抗原的合成方法，其特征在于：其由卡拉洛尔与2-氨基-2-甲基丙酸乙酯反应得到具有羧基的产物，即半抗原CLZ，用碳二亚胺法将半抗原CLZ与载体蛋白偶联，即得到卡拉洛尔人工抗原。
2.根据权利要求1所述卡拉洛尔人工抗原的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）半抗原CLZ的合成：
合成路线如下：
将化合物1溶于异丙醇溶液中，滴加NaOH水溶液，在室温下搅拌1h；然后一次性加入环氧氯丙烷，将溶液在室温下搅拌过夜；将所得混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将合并的有机层用Na2SO4干燥；过滤后，将滤液减压浓缩，残余物用硅胶柱纯化，得到白色固体形态的化合物2；
将化合物2和K2CO3加入到乙腈和水的混合溶液中，然后加入2-氨基-2-甲基丙酸乙酯，将混合物在80℃下搅拌过夜；将所得混合物冷却至室温并用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将合并的有机层用Na2SO4干燥；过滤后，浓缩滤液，用二氧化硅柱纯化残余物，得到黄色油状物的化合物3；
将化合物3加入四氢呋喃和水的混合物中，然后加入LiOH，在室温下搅拌过夜；加入水，水层用乙酸乙酯萃取；将水相用6N HCl水溶液酸化至中性并浓缩至干；通过二氧化硅柱纯化粗产物，得到呈白色固体的目标化合物，半抗原CLZ；
（2）完全抗原的制备：将步骤（1）制备的半抗原CLZ，与BSA偶联得到偶联物完全抗原CLZ-BSA；或与KLH偶联得到偶联物完全抗原CLZ-KLH。
3.根据权利要求2所述卡拉洛尔人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）制备完全抗原CLZ-BSA的步骤如下：
a、取步骤（1）制备所得半抗原CLZ，和加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A液，室温搅拌反应6-8h；称取牛血清蛋白BSA，加入硼酸缓冲溶液，得到B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CLZ-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将步骤a制备所得偶联物CLZ-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CLZ-BSA。
4.根据权利要求2所述卡拉洛尔人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（1）半抗原CLZ的合成具体步骤如下：
将2g，10.9mmol的化合物1溶于20mL异丙醇溶液中滴加NaOH水溶液476mg，11.9mmol，在室温下搅拌1h；然后一次性加入环氧氯丙烷2.32g，25.1mmol，将溶液在室温下搅拌过夜；将所得混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将合并的有机层用Na2SO4干燥；过滤后，将滤液减压浓缩，残余物用硅胶柱纯化，得到1.7g化合物2，为白色固体；
将1.7g，7.11mmol化合物2和491mg，3.56mmol K2CO3加入到20mL乙腈和5mL水的混合溶液中，然后加入2-氨基-2-甲基丙酸乙酯1.19g，7.11mmol，将混合物在80℃下搅拌过夜；将所得混合物冷却至室温并用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将合并的有机层用Na2SO4干燥；过滤后，浓缩滤液，用二氧化硅柱纯化残余物，得到1g化合物3，为黄色油状物；
将1g，2.69mmol化合物3加入10mL四氢呋喃和2mL水的混合物中，然后加入LiOH 170mg，4.04mmol，将反应在室温下搅拌过夜；加入水，水层用乙酸乙酯萃取；将水相用6N HCl水溶液酸化至pH = 7并浓缩至干；通过二氧化硅柱纯化粗产物，得到目标化合物200mg，为白色固体半抗原CLZ。
5.根据权利要求3所述卡拉洛尔人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）制备完全抗原CLZ-BSA的具体步骤如下：
a、称取步骤（1）制备所得半抗原CLZ 8.9 mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐15.54 mg，N-羟基琥珀酰亚胺9.8 mg，用500μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，称为A液，室温搅拌反应6-8h；称取牛血清蛋白BSA 10 mg，其中CLZ与BSA摩尔比为60:1，加入等体积硼酸缓冲溶液，得到B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CLZ-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CLZ-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CLZ-BSA。
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|---|---|---|---|---|
| CN115452968A (zh) * | 2022-07-27 | 2022-12-09 | 宁波三生生物科技股份有限公司 | 一种利用hplc检测盐酸卡拉洛尔杂质的方法 |
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| WO2007042912A2 (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-19 | Orchid Research Laboratories Limited | Heterocyclic compounds as pstat3/il-6 inhibitors |
| CN102285910A (zh) * | 2011-07-04 | 2011-12-21 | 南京工业大学 | 一种制备(s)-卡维地洛的方法 |
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