CN106008361B - 一种阿苯达唑人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿苯达唑人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的阿苯达唑人工抗原为将式I所示的阿苯达唑半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供阿苯达唑人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于阿苯达唑抗体的制备，以及阿苯达唑药物残留检测具有重大价值。

Description

一种阿苯达唑人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药及化学领域，涉及一种阿苯达唑人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
阿苯达唑为一高效低毒的广谱驱虫药。临床可用于驱蛔虫、蛲虫、绦虫、鞭虫、钩虫、粪圆线虫等。在体内代谢为亚砜类或砜类后，抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗竭，或抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP的产生，使寄生虫无法存活和繁殖。在动物食品中的残留对人体健康有潜在的威胁。
目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在阿苯达唑的残留检测中起着越来越重要的作用。
影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿苯达唑人工抗原及其制备方法与应用。
本发明所提供的阿苯达唑人工抗原是在阿苯达唑半抗原的基础上构建所得的抗原。
所述阿苯达唑半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示。
本发明还提供了制备所述阿苯达唑半抗原的方法。
本发明所提供的制备所述阿苯达唑半抗原的方法，具体可包括如下步骤：将阿苯达唑与4-氨基丁酸按照质量比为500mg：550-580mg(如580mg)的比例进行反应，获得所述化合物。
其中，所述反应的温度具体可为70-80℃(如80℃)，时间具体可为4-5h(如5h)。所述反应的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)。
具体而言，制备所述阿苯达唑半抗原的方法包括如下步骤：将阿苯达唑溶于二甲基甲酰胺(DMF)中后，加入4-氨基丁酸，所述阿苯达唑、所述二甲基甲酰胺(DMF)和所述4-氨基丁酸的配比为500mg：20ml：550-580mg(如580mg)，70-80℃(如80℃)反应4-5h(如5h)，获得所述化合物。
在所述“70-80℃(如80℃)反应4-5h(如5h)”后还可包括如下步骤：向反应液中加入冰水，析出白色固体，过滤，水洗干燥，获得所述化合物。其中，所述阿苯达唑、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述4-氨基丁酸和所述冰水的配比为500mg：20ml：550-580mg(如580mg)：10ml。
在阿苯达唑半抗原的基础上构建所得的阿苯达唑抗原也属于本发明的保护范围。
所述阿苯达唑抗原，为将所述阿苯达唑半抗原(式I)与载体蛋白偶联所得的抗原。在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
所述阿苯达唑抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述阿苯达唑抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述阿苯达唑半抗原(式I)与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述阿苯达唑抗原。
其中，所述阿苯达唑半抗原(式I)与所述载体蛋白偶联的摩尔比为13.70：1。
在本发明中，所述阿苯达唑抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
(a1)将所述阿苯达唑半抗原(式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，20-25℃磁力搅拌反应3h，得到溶液I；
其中，所述阿苯达唑半抗原(式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的配比为15mg：1.5ml：26mg：25mg；
(a2)将所述载体蛋白置于0.1M碳酸缓冲液中，4000rpm搅拌10mn，充分溶解，得到溶液II；所述0.1M碳酸缓冲液的pH为9.6，溶剂为水，溶质及浓度如下：碳酸钠0.1mol/L，碳酸氢钠0.1mol/L；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为50-67mg：3.5ml；
其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，则所述牛血清白蛋白(BSA)与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为50mg：3.5ml；若所述载体蛋白为卵清蛋白(OVA)，则所述卵清蛋白(OVA)与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为67mg：3.5ml；
(a3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件A进行混合，混合后后于20-25℃磁力搅拌反应24h，得到溶液III；
所述条件A为：所述溶液I中的所述阿苯达唑半抗原(式I)与所述溶液II中的所述0.1M碳酸缓冲液的配比为15mg：3.5ml；
其中，将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在4℃条件下，将所述溶液I逐滴加入到所述溶液II中，边加边搅拌；
(a4)用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH＝7.4)，于4℃(对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述阿苯达唑抗原；所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾；所述磷酸二氢钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为0.27g/L，所述磷酸氢二钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为1.42g/L，所述氯化钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为8g/L，所述氯化钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2g/L；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
所述阿苯达唑半抗原(式I)或所述阿苯达唑抗原在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)定性或定量检测阿苯达唑；
(b)制备阿苯达唑抗体。
利用所述阿苯达唑抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。
所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。
本发明所提供的阿苯达唑半抗原，以及所述阿苯达唑抗原，合成方法简单，纯度高和产率高，对于阿苯达唑抗体的制备，以及阿苯达唑药物残留检测具有重大价值。
附图说明
图1为阿苯达唑半抗原的质谱检测结果图。
图2为BSA的MALDI-TOF-MAS图。
图3为阿苯达唑BSA复合物的MALDI-TOF-MAS图。。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
阿苯达唑：百灵威科技有限公司，其产品目录号为282654。
实施例1、阿苯达唑半抗原的制备
一、阿苯达唑半抗原的制备
在50ml圆底烧瓶中加入阿苯达唑500mg，20ml二甲基甲酰胺(DMF)(作为反应的溶剂)溶解后加入4-氨基丁酸580mg，80℃反应5h，TLC检测原料反应完毕后处理，将反应液滴加到10ml冰水中，析出白色固体，过滤，水洗干燥得320mg产品。
反应方程式如下：
二、阿苯达唑半抗原的结构鉴定
对所得320mg产品进行质谱检测，M+:M+H＝337.2,M+Na＝359.2，M-:M-H＝335.4，如图1所示。结果显示其化学结构式如式I所示(MW＝336.4)，即为阿苯达唑半抗原。
实施例2、阿苯达唑人工抗原的制备及结构鉴定
一、阿苯达唑人工抗原的制备
1、免疫原的合成
(1)将实施例1制备得到的半抗原(式I)15mg溶解于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)26mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)25mg，室温(20-25℃)磁力搅拌反应3h，得到溶液I。
(2)称取50mg牛血清白蛋白(BSA)，溶解于3.5mL 0.1M碳酸缓冲液中，400rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II。
其中，所述0.1M碳酸缓冲液的pH为9.6，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO31.59g/L，NaHCO3 2.94g/L。
(3)取上述溶液I，在冰水浴(4℃)环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌，室温(20-25℃)磁力搅拌反应24h，得到溶液III。
(4)将所述溶液III装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋(15cm)，1L 0.01M PBS(pH＝7.4)透析3天，4℃搅拌透析，每天更换透析液3次，透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
其中，所述0.01M PBS(pH＝7.4)的溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠1.42g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L。
2、包被原的合成
(1)将实施例1制备得到的半抗原(式I)15mg溶解于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)26mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)25mg，室温(20-25℃)磁力搅拌反应3h，得到溶液I。
(2)称取67.0mg卵清蛋白(OVA)，溶解于3.5mL 0.1M碳酸缓冲液pH＝9.6(配方同上)中，400rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II。
(3)取上述溶液I，在冰水浴(4℃)环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌，室温(20-25℃)磁力搅拌反应24h，得到溶液III。
(4)将所述溶液III装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋(15cm)，1L0.01M PBS(pH＝7.4)(配方同上)透析3天，4℃搅拌透析，每天更换透析液3次，透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
二、阿苯达唑人工抗原的鉴定
免疫原MALDI-TOF-MS鉴定结果显示偶联比为：R＝(70895.500-66288.367)/336.4＝13.70(图2和图3)。即免疫原中，所述阿苯达唑半抗原(式I)与牛血清白蛋白(BSA)偶联的摩尔比为13.70：1。
实施例3、阿苯达唑人工抗原免疫动物制备抗血清
一、动物免疫
用步骤实施例2获得的阿苯达唑人工抗原“阿苯达唑-BSA”作为免疫原免疫新西兰大白兔。每次免疫剂量为100～200μg，免疫方式为双肩部和后大腿皮下多点注射，每个区域大约用1/4的免疫原。首免时将免疫原用生理盐水稀释，然后与弗氏不完全佐剂进行1:1(体积比)混合制成乳化剂，每间隔2周取相同剂量免疫原加等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫一次，采用此方式共加免3次后，间隔3～4周再取相同剂量免疫原加弗式不完全佐剂进行末次免疫，耳动脉取血检测抗体效价。末次免疫7-10天后采用颈动脉放血，每只兔子可得血100-120ml左右，取完的血在4℃冰箱放置5～6小时，然后以5000rpm离心10min，分离血清。
二、抗血清效价测定
采用间接ELISA法测定步骤一所得血清的抗体效价，具体如下：
1)包被：在96孔酶标板中加入100μL浓度为2μg/mL的“阿苯达唑-OVA”溶液(用包被缓冲液进行稀释)，同时设置不包被抗原的对照，4℃包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。
包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO3 1.59g/L和NaHCO3 2.93g/L)。
2)封闭：加入150μL/孔的封闭液，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
封闭液：含有0.5％(体积百分含量)小牛血清、3％(3g/100ml)酪蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.4。
3)加待测样品：吸取不同稀释度的待测血清100μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
同时设置未经免疫的兔血清的对照；以PBS代替待检测样品的对照(阴性对照孔)。
4)加酶标二抗：取HRP标羊抗兔IgG抗体(Jackson ImmunoResearch公司，货号111-035-003)，按体积比1：5000倍稀释后，100μl/孔，37℃孵育20至30min,洗涤4次，拍干。
5)显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。
6)终止：加入终止液(2M H2SO4)50μl/孔。
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为血清效价的临界点。
ELISA结果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀释倍数表示。
结果表明血清中的抗体效价为1：20000。
实施例4、阿苯达唑酶联免疫试剂盒检测阿苯达唑
一、阿苯达唑酶联免疫试剂盒的组装
1、阿苯达唑酶联免疫试剂盒的组成包括如下：
(1)阿苯达唑标准品工作液：6瓶，1.5mL/瓶，浓度为0ng/ml、0.15ng/ml、0.45ng/ml、1.35ng/ml、4.05ng/ml、12.15ng/ml；
(2)阿苯达唑酶标板：1块(8孔×12条)，为包被了实施例2制备得到的“阿苯达唑-OVA”的酶标板。
(3)阿苯达唑抗体工作液：1瓶(7mL)，为抗体稀释液将抗体进行1:8000稀释，抗体稀释液为含6％(体积分数)山羊血清的0.2mol/L PBS，所述阿苯达唑抗体为实施例3制备得到的抗血清纯化所得的抗体。
(4)酶标记物工作液：1瓶(12mL)，酶标记物具体为经辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体。
(5)样品稀释液：1瓶(10×，15mL)，为0.01M pH7.4的PBS。
(6)洗涤液：1瓶(20×，25mL)，为0.01mol/L pH7.4的PBST溶液。
(7)底物A液、底物B液各1瓶(7mL)。其中，底物A为2％过氧化脲水溶液。底物B为1％四甲基联苯胺水溶液。
(8)终止液：1瓶(7mL)，为2mol/L H2SO4溶液。
(9)盖板膜；
(10)自封袋。
2、需要而未提供的设备和材料
(1)设备
酶标仪(检测波长450nm，参考波长630nm)、天平(精度：0.01g)、漩涡振荡器、离心机(4000g)、摇床(300rpm)、氮吹仪、微量移液器、计时器。
(2)试剂
样品提取液：称取NaCl 20g，K2HPO4·3H2O 26g于干净烧杯中，加入200mL去离子水溶解。
乙酸乙酯、正己烷。
3、贮存
该试剂盒贮存于2-8℃，切勿冷冻，有效期1年。
未使用完的酶标板条应密封，2-8℃保存。
4、试剂盒检测原理
样品中的阿苯达唑与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标记物，催化底物显色，根据显色的深浅来判断样品中阿苯达唑的含量。显色深，含量少，反之，含量多。
二、阿苯达唑酶联免疫试剂盒的使用方法
1、样品前处理
(1)鸡肉、鸭肉(稀释系数：1)
a)取2±0.02g组织样品于50mL离心管中，加入2mL样品提取液(见步骤一2)，充分涡动30s；b)加入8mL乙酸乙酯，涡动1min；c)摇床300rpm振摇10min；d)4000g以上，离心10min；e)取4mL上清液于新的4mL离心管中；f)50-60℃水浴中，氮气吹干；g)加入1mL样品稀释液，再加入2mL正己烷，充分涡动1min；h)4000g以上，离心5min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质；i)取50μL进行检测。
(2)原奶(稀释系数：2)
a)取2ml新鲜原奶于50mL离心管中，加入8mL乙酸乙酯，剧烈涡动1min(如果使用多管漩涡混合仪则需涡动2min)；b)4000g以上，离心10min；c)取2mL上清液于新的4mL离心管中(注：避免吸入上层漂浮杂质，否则影响检测结果)；d)50-60℃水浴中，氮气吹干；e)加入1mL样品稀释液，再加入2mL正己烷，充分涡动1min；f)4000g以上，离心5min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质；g)取50μL进行检测。
2、检测步骤
(1)将板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平行，未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2-8℃环境中；
(2)将50μL各浓度的阿苯达唑标准品工作液(或待测样品溶液)分别加入对应的标准品(或待测样品孔)中；
(3)在每孔中加入50μL阿苯达唑抗体工作液；
(4)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2℃)，避光反应20min；
(5)揭开盖板膜；
(6)倒掉板孔中液体，在每孔加入260μL洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30s；
(7)倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
(8)立即在每孔中加入100μL酶标记物工作液；
(9)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2℃)，避光反应20min；
(10)重复步骤(5)-(7)；
(11)立即在每孔中加入100μL底物A液和底物B液的混合液(底物A液、底物B液按体积1:1混合，必须充分混匀，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂)；
(12)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2℃)，避光反应15-20min；
(13)揭开盖板膜，在每孔中加入50μL终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；
(14)终止后5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值。
3、结果计算或判定
(1)各标准品(或待测样品)的平均吸光度值，除以零标(浓度为0ng/ml的标准品)吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值：
(2)以各标准品的百分吸光度值为纵坐标，以对应的阿苯达唑浓度为横坐标绘制标准曲线。
(3)将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线方程，可得出待测样品对应的浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，方得待测原样品中阿苯达唑的实际含量。
三、阿苯达唑酶联免疫试剂盒检测阿苯达唑
1、特异性检测
阿苯达唑酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的。交叉反应越小，特异性越好。
将阿苯达唑及其它类似物奥苯达唑、帕苯达唑、甲苯达唑和环苯达唑分别做系列稀释，分别按照如上步骤二2进行操作，以阿苯达唑及其它类似物的系列稀释液替代其中的“阿苯达唑标准品工作液”，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50％抑制浓度(IC50)，具体方法如下：得到纵坐标数值等于50％对应的阿苯达唑浓度(ng/mL)，即IC50值。用下式计算试剂盒对阿苯达唑和各类似物的交叉反应率。
结果如表1所示，从表1中可以看出，阿苯达唑酶联免疫试剂盒对各种类似物的交叉反应率均小于1％。这说明阿苯达唑酶联免疫试剂盒对阿苯达唑具有极高的特异性，可有效的排除其它类似物的干扰，可专门用于阿苯达唑的检测。
表1阿苯达唑酶联免疫试剂盒的特异性
药物名称 交叉反应率(％)
阿苯达唑 100
奥苯达唑 ＜1
帕苯达唑 ＜1
甲苯达唑 ＜1
环苯达唑 ＜1
2、不同样品的最低检测限测定
分别测定采用阿苯达唑酶联免疫试剂盒对鸡肉、鸭肉和原奶中阿苯达唑进行检测时的最低检测限。具体方法如步骤二。
结果显示，采用步骤二2(1)中的样品前处理方法处理鸡肉，测得的最低检测限可达1ng/g(即每g鸡肉中含有1ng的阿苯达唑即可被检测到，下同)；采用步骤二2(1)中的样品前处理方法处理鸭肉，测得的最低检测限可达1ng/g；采用步骤二2(2)中的样品前处理方法处理原奶，测得的最低检测限可达1ng/ml。
3、阿苯达唑酶联免疫试剂盒板内板间误差的测定
分别测定阿苯达唑酶联免疫试剂盒的板内误差和板间误差。具体方法如步骤二。
结果显示，试剂盒吸光度的板内误差小于10％，板间误差小于15％。
4、阿苯达唑酶联免疫试剂盒检测阿苯达唑的回收率测定
测定采用阿苯达唑酶联免疫试剂盒检测阿苯达唑的回收率。具体方法如下步骤二。
结果显示，采用阿苯达唑酶联免疫试剂盒检测阿苯达唑的回收率范围为70-100％。
5、阿苯达唑酶联免疫试剂盒的灵敏度测定
测定阿苯达唑酶联免疫试剂盒的灵敏度。具体方法如步骤二。
结果显示，阿苯达唑酶联免疫试剂盒的灵敏度为0.15ppb，标准曲线范围0.15ppb-12.15ppb(注：ppb＝μg/kg)。

Claims (11)

1.一种化合物，其结构如式I所示：
2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤：将阿苯达唑与4-氨基丁酸按照质量比为500mg：550-580mg的比例进行反应，获得所述化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为70-80℃，时间为4-5h；或
所述反应的溶剂为二甲基甲酰胺。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述包括如下步骤：将阿苯达唑溶于二甲基甲酰胺中后，加入4-氨基丁酸，所述阿苯达唑、所述二甲基甲酰胺和所述4-氨基丁酸的配比为500mg：20ml：550-580mg，70-80℃反应4-5h，获得所述化合物。
5.阿苯达唑抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。
6.根据权利要求5所述的阿苯达唑抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
7.权利要求5或6所述的阿苯达唑抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述阿苯达唑抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：权利要求1所述化合物与所述载体蛋白偶联的摩尔比为13.70：1。
9.根据权利要求7所述的阿苯达唑抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(a1)将权利要求1所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，20-25℃反应3h，得到溶液I；
所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺的配比为15mg：1.5ml：26mg：25mg；
(a2)将所述载体蛋白溶解于0.1M碳酸缓冲液中，得到溶液II；
所述载体蛋白与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为50-67mg：3.5ml；
(a3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件A进行混合，混合后后于20-25℃反应24h，得到溶液III；
所述条件A为：所述溶液I中的所述化合物与所述溶液II中的所述0.1M碳酸缓冲液的配比为15mg：3.5ml；
(a4)用磷酸盐缓冲液，于4℃对所述溶液III透析3天，得到所述阿苯达唑抗原。
10.权利要求1所述化合物或权利要求5或6所述阿苯达唑抗原在如下(a)或(b)中的应用：
(a)定性或定量检测阿苯达唑；
(b)制备阿苯达唑抗体。
11.利用权利要求5或6所述阿苯达唑抗原制备的抗体。
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