CN112574956A - 一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19180。所述杂交瘤细胞株ABC07分泌产生对霜霉威具有较好亲和力和较高灵敏度的单克隆抗体，对霜霉威的50%抑制浓度IC50为3.24 ng/mL，可用于制备霜霉威的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为食品中霜霉威的检测提供有力的检测方法及手段。

Description

一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
霜霉威是一种高效、广谱、安全的氨基甲酸酯类杀菌剂，属于内吸性杀菌剂，适用于叶面处理和土壤处理、种子处理。对藻状菌的真菌有效。例如，丝囊霉、盘梗霉、霜霉、疫霉、假霜霉、腐霉等真菌所致病害均有防治作用，对植物有刺激生长作用。对防治农作物，特别是蔬菜、果树的霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病、黑痉病有良好的效果。
有关霜霉威药物残留在动物组织中的检测方法，国内外已有少量报道，主要是用高效液相色谱～荧光检测器检测法及液相色谱一串联质谱法。提取的方法也各有不同，有液—液萃取、液—固萃取等。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明的目的在于提供一种对霜霉威具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对霜霉威具有较好的亲和力和灵敏度，可以用来建立霜霉威酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法。
本发明的技术方案：一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.19180，保藏日期2019年11月28日，分类命名：单克隆细胞株。
霜霉威单克隆抗体，其是由保藏编号CGMCC No.19180的杂交瘤细胞株ABC07分泌产生。
所述霜霉威单克隆抗体的应用，用于食品中霜霉威残留的检测。
本发明提供的ABC07细胞株的制备基本步骤为：
（1）半抗原的合成：通过4-(2-溴乙基)苯甲酸，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷与氯甲酸丙酯反应从而衍生出苯环和羧基，以便于连接载体蛋白。
霜霉威半抗原的制备方法，将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷和K2CO3在DMF中的混合物搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；
将化合物2 和TEA在DMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯；将反应混合物在室温搅拌过夜，将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。
进一步地，步骤如下：
将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸2.0g、8.73mmol，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷8.90g、87.3mmol和K2CO3 2.42g、17.5mmol在40mL DMF中的混合物在50℃下搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；
在0℃下，将化合物2 10.0g、8.73mmol和TEA 13.2g、131mmol在200mL DMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯21.5g、175mmol；将反应混合物在室温搅拌过夜；将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。
（2）免疫原的制备与鉴定：以霜霉威衍生物为原料，通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；
霜霉威免疫原的制备方法，取霜霉威半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化；另取牛血清蛋白BSA溶解于碳酸盐缓冲溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析，分装保存。
进一步地，步骤如下：取4.5mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和3.7mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化6h；另取15mg牛血清蛋白BSA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
霜霉威包被原的制备方法，取霜霉威半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌活化；另取OVA溶解于碳酸盐缓冲溶液溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析，分装保存。
进一步地，步骤为：取3mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0 mg EDC和3.7mg NHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mg OVA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CBS溶液中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
（3）小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐剂，剂量为100μL/只，加强免疫使用福氏不完全佐剂，剂量为50μL/只，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，剂量为25μL/只，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株ABC07；
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗IgG类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
本发明的有益效果：（1）本发明获得的霜霉威单克隆抗体，对霜霉威有较好的检测灵敏度和亲和力；（2）一种新的合成霜霉威半抗原和免疫原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。
附图说明
图1是免疫原的紫外吸收光谱表征。
图2是霜霉威单克隆抗体的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将霜霉威完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对霜霉威有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1：霜霉威单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC07的制备
1、霜霉威半抗原的合成： 其合成路线如下：
Figure 778179DEST_PATH_IMAGE001
将4-(2-溴乙基)苯甲酸﹙化合物1﹚（2.0g，8.73mmol），N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷（8.90g，87.3mmol）和K2CO3（2.42g，17.5mmol）在DMF（40mL）中的混合物在50℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温。浓缩混合物，得到粗产物（10.0g），为白色固体﹙化合物2﹚。
在0℃下，将化合物2（10.0g，8.73mmol）和TEA（13.2g，131mmol）在DMF（200ml）中的溶液中加入碳酰氯丙基酯（21.5g，175mmol）。将反应混合物在室温搅拌过夜。将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到（113mg，3.86％）黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。
2、完全抗原的合成：取4.5mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0 mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和3.7mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），使用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，室温搅拌，活化6h；另取15mg BSA（牛血清蛋白）溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CBS（碳酸盐缓冲溶液）溶液中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
霜霉威包被原的制备方法：取3mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0 mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和3.7mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），使用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mg OVA（鸡卵白蛋白）溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CBS（碳酸盐缓冲溶液）溶液中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出包被原PBS透析3天，-20℃分装保存。
3、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取霜霉威完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，剂量为50μL/只，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，剂量为25μL/只，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。
4、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照2～10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
5、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用霜霉威为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对霜霉威有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株ABC07。
6、单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型，具体如表1所示。
表1.霜霉威单克隆抗体的亚型鉴定
Figure 695320DEST_PATH_IMAGE002
使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对霜霉威的IC50为 3.24μg/L，并验证了其对他达拉非等的IC50及交叉反应率，具体如表2所示。
表2霜霉威单克隆抗体对霜霉威、甲霜灵、恶霜灵、腐霉利的IC50及交叉反应率
Figure 475057DEST_PATH_IMAGE003
7、抗体应用：将杂交瘤细胞株ABC07通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于霜霉威ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
（1）用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL的霜霉威包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；
（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；
（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2μg/L的霜霉威标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1：16000稀释的抗霜霉威单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；
（4）每孔加入100 μL 用含0.1% 明胶的PBS 1：3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；
（5）每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，450nm测吸光值；
（6）添加回收及样品前处理：取新鲜的黄瓜样品5g，添加三个不同剂量的霜霉威标准品，分别为5 ng、10ng、20ng。将其置于50 mL离心管中，缓慢滴入50%氢氧化钾溶液1mL，在旋涡混合器上充分振荡，缓慢滴入乙酸乙酯20mL，在旋涡混合器上振荡10 min，然后放入离心器中以3000 r/min离心5 min。移取4 mL上清液于另一支离心管中，氮气吹干，加入1mL含有10%甲醇的PBS 复溶，取50μL 用于检测。采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为90.2%、103.1%、99.3%。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，3.62 g Na2HPO4·12 H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% Tween20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1：5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (9)

1.一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.19180，保藏日期2019年11月28日，分类命名单克隆细胞株。
2.霜霉威单克隆抗体，其特征在于：其是由保藏编号CGMCC No.19180的杂交瘤细胞株ABC07分泌产生。
3.霜霉威半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：
将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷和K2CO3在DMF中的混合物搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；
将化合物2 和TEA在DMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯；将反应混合物在室温搅拌过夜，将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。
4.根据权利要求3所述霜霉威半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：
将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸2.0g、8.73mmol，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷8.90g、87.3mmol和K2CO3 2.42g、17.5mmol在40mL DMF中的混合物在50℃下搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；
在0℃下，将化合物2 10.0g、8.73mmol和TEA 13.2g、131mmol在200mL DMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯21.5g、175mmol；将反应混合物在室温搅拌过夜；将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。
5.霜霉威免疫原的制备方法，其特征在于：取霜霉威半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化；另取牛血清蛋白BSA溶解于碳酸盐缓冲溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析，分装保存。
6.根据权利要求5所述霜霉威免疫原的制备方法，其特征在于步骤如下：取4.5mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和3.7mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化6h；另取15mg牛血清蛋白BSA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
7.霜霉威包被原的制备方法，其特征在于：取霜霉威半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌活化；另取OVA溶解于碳酸盐缓冲溶液溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析，分装保存。
8.根据权利要求7所述霜霉威包被原的制备方法，其特征在于步骤为：取3mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0 mg EDC和3.7mg NHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mg OVA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CBS溶液中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
9.权利要求2所述霜霉威单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品中霜霉威残留的检测。
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