CN114989144B - 一种苯醚甲环唑半抗原、完全抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种苯醚甲环唑半抗原、完全抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种苯醚甲环唑半抗原、完全抗原、抗体及其制备方法和应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的苯醚甲环唑半抗原的结构式如式1所示，该半抗原用于制备苯醚甲环唑完全抗原，再以该完全抗原免疫小鼠获得苯醚甲环唑单克隆抗体，该抗体对苯醚甲环唑具有更好的亲和力和很高的灵敏度，基于该抗体制备的检测主体对苯醚甲环唑的50％抑制浓度IC50为0.09ng/mL，最低检测限为0.015ng/mL，线性范围为0.023～0.35ng/mL。表明本发明制备的苯醚甲环唑完全抗原具有较高的免疫原性，可用于制备苯醚甲环唑的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为食品中苯醚甲环唑的残留检测提供有效的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种苯醚甲环唑半抗原、完全抗原、抗体及其制备方法和应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
苯醚甲环唑是一种广谱和系统的1,2,4-三唑杀菌剂，有效防治多种水果、蔬菜和作物的黑星病、黑痘病、白腐病、斑点落叶病、白粉病、褐斑病、锈病、条锈病、赤霉病等疾病。优良的防治效果使其已在世界范围内广泛使用，但其在明产品中的残留对人类健康和环境产生不良副作用。基于此，国家在农产品安全检测方面对于农药的残留具有严格的限制，因此，迫切需要建立一种快速、简便、灵敏的苯醚甲环唑检测方法。
酶联免疫法(ELISA)是一种低成本、快速且便携的免疫学检测方法，检测时对样本的纯度要求不高，但检测灵敏度较高且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测出结果。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。
中国专利CN114276335A公开了一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用，基于该半抗原制备人工抗原，再以人工抗原免疫动物制备获得针对苯醚甲环唑的单克隆抗体，基于该抗体所建立的检测苯醚甲环唑的免疫分析方法，其IC50仅为1.38ng/mL，最低检测限为0.32ng/mL，线性范围为0.49～3.90ng/mL，检测亲和力和灵敏度仍待提高，以便满足农产品中苯醚甲环唑痕量残留分析检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的苯醚甲环唑半抗原，用于提高现有技术中苯醚甲环唑免疫检测时的亲和力和灵敏度较低的问题；以该苯醚甲环唑半抗原为基础形成的免疫检测方法可以用于快速高效检测食品中苯醚甲环唑的痕量残留，并且亲和力好、检测灵敏度高，具有很好的开发应用前景。
本发明的第二个目的是提供一种苯醚甲环唑半抗原的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种苯醚甲环唑半抗原在制备苯醚甲环唑完全抗原中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种苯醚甲环唑完全抗原。
本发明的第五个目的是提供一种苯醚甲环唑完全抗原的制备方法。
本发明的第六个目的是提供一种苯醚甲环唑单克隆抗体。
本发明的第七个目的是提供一种苯醚甲环唑单克隆抗体的应用。
为了实现上述目的，本发明的苯醚甲环唑半抗原所采用的技术方案为：
所述苯醚甲环唑半抗原的结构式如下：
本发明的上述苯醚甲环唑半抗原的制备方法所采用的具体方案为：
所述苯醚甲环唑半抗原的合成路线如下所示：
进一步地，包括以下步骤：
1)在70℃～80℃条件下，向甲醇溶液中加入4-(4-羟基苯基)丁酸化合物1和H2SO4，搅拌3～5h，得到反应液，然后将反应液与水混合并用DCM萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，即得到呈黑色油状的化合物2；
2)在80℃～90℃条件下，将步骤1)得到的化合物2、化合物A和K2CO3分别加入到DMF中进行搅拌溶解，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物；通过柱色谱法纯化残余物获得呈黄色油状的化合物3；
3)在室温条件下，将步骤2)得到的化合物3和Br2加入到1，4-二恶烷溶液中、搅拌溶解过夜，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物，通过柱色谱法纯化残余物获得呈黄色油状的化合物4；
4)将上述步骤3)得到的化合物4与化合物B和对甲苯磺酸分别溶解于甲苯，在110℃～120℃条件下搅拌过夜，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物，通过柱色谱法纯化残余物获得呈黄色油状的化合物5；
5)将上述步骤4)得到的化合物5与化合物C、KI和Cs2CO3分别溶解于DMSO中，在140℃～160℃条件下搅拌15～18h，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物，通过HPLC纯化残余物获得呈白色固体状的目标物，即苯醚甲环唑半抗原。
本发明的苯醚甲环唑半抗原的应用所采用的技术方案为：
将上述所述的苯醚甲环唑应用于制备苯醚甲环唑完全抗原。
本发明的苯醚甲环唑完全抗原所采用的技术方案为：
由上述所述的苯醚甲环唑半抗原与载体蛋白偶联得到；优选地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白BSA、卵清蛋白OVA。
本发明的上述苯醚甲环唑完全抗原的制备方法所采用的技术方案，具体包括如下步骤：
1)将苯醚甲环唑半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌，活化6～8h，得到活化液；
2)将上述步骤1)得到的活化液逐滴加入载体蛋白溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到混合液；
3)将上述步骤2)得到的混合液，透析、分离，即得到苯醚甲环唑完全抗原。
优选地，步骤2)中所述载体蛋白溶液是将载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH为9.6)中，得到载体蛋白溶液。
本发明的苯醚甲环唑单克隆抗体所采用的技术方案为：
由上述所述的苯醚甲环唑完全抗原免疫小鼠所得。
本发明的苯醚甲环唑单克隆抗体的应用所采用的技术方案为：
用于制备苯醚甲环唑残留分析检测所用的检测主体；优选地，所述检测主体包括试剂、胶体金免疫层析试纸条、试剂盒。
进一步地，所述检测主体用于食品安全检测中苯醚甲环唑的残留分析检测。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种新的苯醚甲环唑半抗原，基于该半抗原为基础，能够制备出苯醚甲环唑完全抗原，进而制备出苯醚甲环唑单克隆抗体，为食品中苯醚甲环唑的残留检测提供了新的免疫学方法。
2、本发明获得的苯醚甲环唑单克隆抗体，特异性强、灵敏度高，对苯醚甲环唑有很高的检测灵敏度(IC50值为0.09ng/mL，最低检测限为0.015ng/mL，线性范围为0.023～0.35ng/mL)。
3、本发明获得的苯醚甲环唑单克隆抗体可制成用于免疫分析检测、食品中苯醚甲环唑残留检测的检测主体，具有很好的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明苯醚甲环唑单克隆抗体的标准抑制曲线图。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1苯醚甲环唑半抗原的合成
由于苯醚甲环唑小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将苯醚甲环唑偶联到载体蛋白上，使其获得免疫原性。
1)称取化合物1,4-(4-羟基苯基)丁酸(4.5g，25.0mmol)和2mL的H2SO4加入到MeOH(50mL)中，形成更混合溶液，将混合溶液在75℃下搅拌3小时，然后倒入100mL水中，再用DCM(50mL x 2)萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到呈黑色油状的化合物2(4.2g，87.5％)；
2)将化合物2(4.0g，20.6mmol)、化合物A(4.25g，24.7mmol)和K2CO3(4.8g，35.0mmol)在DMF(40mL)溶解并在90℃下搅拌6小时，然后倒入250mL水中，用EA(150mL x 2)萃取，合并有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物；通过柱色谱法(PE/EA＝10:1)纯化残余物以获得呈黄色油状的化合物3(6.3g，88.5％)；
3)在室温下向化合物3(5.0g，14.4mmol)和1，4-二恶烷(80mL)中的混合物中加入Br2(2.5g，15.8mmol)，在35℃搅拌过夜，然后将过夜后的反应混合物倒入300mL水中，用EA(100mL x 2)萃取，合并有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物；通过柱色谱法(PE/EA＝10:1)纯化残余物以获得呈黄色油状的化合物4(2.7g，45.0％)。
4)将化合物4(2.5g，5.8mmol)、化合物B(0.89g，11.7mmol)和对甲苯磺酸(0.2g，1.1mmol)分别加入到30mL甲苯中混合，得到混合液，然后将混合液在110℃搅拌过夜，过夜后的混合物倒入150mL水中，用EA(100mL×2)萃取，合并有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物；通过柱色谱法(PE/EA＝15:1)纯化残余物以获得呈黄色油状的化合物5(1.0g，35.7％)。
5)将化合物5(1.0g,2.0mmol)、化合物C(0.28g,4.1mmol)、KI(0.10g,0.6mmol)和Cs2CO3(1.3g,4.1mmol)分别加入15mL DMSO中溶解得到混合物，然后将混合物在140℃下搅15小时，之后倒入150mL水中，用EA(100mL×2)萃取，合并有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩得到残余物；通过HPLC纯化残余物以得到呈白色固体状的目标物(0.28g，29.7％)，即为苯醚甲环唑半抗原，其合成路线如下：
实施例2完全抗原的合成
上述步骤1制备的苯醚甲环唑半抗原与载体蛋白偶联得到苯醚甲环唑完全抗原。
所述苯醚甲环唑完全抗原制备方法如下：
1)称取4.5mg上述制备的苯醚甲环唑半抗原、5.0mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和3.7mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，使用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，室温搅拌，活化6h，得到活化液；
2)取15mg牛血清蛋白(BSA)溶解于3mL的碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH为9.6)中；将上述步骤1)得到的活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到混合液；
3)将上述步骤2)得到的混合液，透析、分离，得到完全抗原，即免疫原，-20℃分装保存；
同理，采用苯醚甲环唑半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到的完全抗原，即包被原。
实施例3苯醚甲环唑单克隆抗体的制备
1.动物免疫
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。首次免疫采用1mg/mL苯醚甲环唑完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化液作为注射剂，每只100μL；加强免疫使用1mg/mL苯醚甲环唑完全抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化液作为注射剂，每只100μL；冲刺免疫采用1mg/mL苯醚甲环唑完全抗原与等体积生理盐水混合均匀后作为注射剂，每只50μL；进行皮下多点注射，各次免疫间隔为三周。免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制率；选择抑制最好的小鼠，在五次免后18天进行冲刺免疫，准备融合。
2.细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a.在无菌条件下，取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数，得到脾细胞液备用；
b.收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c.将步骤a得到的脾细胞液和上述步骤b收集到的SP2/0细胞液按照2～10:1的计数比例混合，离心后去上清，然后从慢到快逐渐滴加PEG进行融合，时间为1min；融合后加入RPMI-1640基础培养液洗涤、离心，得到沉淀物，将沉淀物悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，即得到融合细胞。
3.细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔；第二步选用苯醚甲环唑为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对苯醚甲环唑有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测，重复三次，获得杂交瘤细胞。
4.苯醚甲环唑单克隆抗体的制备与鉴定
取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的苯醚甲环唑单克隆抗体，置于-20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对上述获得的苯醚甲环唑单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2a型，具体如表1所示。
表1.苯醚甲环唑单克隆抗体的亚型鉴定
| 抗体亚型亚类 | OD值 |
| IgA | 0.123 |
| IgG1 | 0.108 |
| IgG2a | 2.103 |
| IgG2b | 0.341 |
| IgG3 | 0.102 |
| IgM | 0.231 |
使用间接竞争ELISA法，测定苯醚甲环唑单克隆抗体对苯醚甲环唑的IC50为0.09ng/mL，并验证了其对嘧菌酯等的IC50及交叉反应率，具体如表2所示。
表2苯醚甲环唑单克隆抗体对苯醚甲环唑、嘧菌酯、霜霉威、噻呋酰胺的IC50及交叉反应率
| 杀虫剂种类 | IC50(ng/mL) | 交叉反应率 |
| 苯醚甲环唑 | 0.09 | 100％ |
| 嘧菌酯 | ＞500 | ＜5％ |
| 霜霉威 | ＞500 | ＜5％ |
| 噻呋酰胺 | ＞500 | ＜5％ |
结果表明，苯醚甲环唑单克隆抗体对苯醚甲环唑具有很高的灵敏度，可用于苯醚甲环唑免疫分析检测。
实施例4苯醚甲环唑单克隆抗体的应用
将实施例3制备的单克隆抗体应用于苯醚甲环唑ELISA添加回收试验。
1.苯醚甲环唑标准溶液制备：用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.002，0.006，0.046，0.132，0.396，1.188，3.564ng/mL的苯醚甲环唑标准溶液。
2.样品前处理：取新鲜的黄瓜样品5g，添加三个不同剂量的苯醚甲环唑标准品，分别为0.25ng、0.5ng、1ng；将其置于50mL离心管中，缓慢滴入50％氢氧化钾溶液1mL，在旋涡混合器上充分振荡，缓慢滴入乙酸乙酯20mL，在旋涡混合器上振荡10min，然后放入离心器中以3000r/min离心5min；移取4mL上清液于另一支离心管中，氮气吹干，加入1mL含有10％甲醇的PBS复溶，即得到待检测样品提取液。
3.溶液的配置：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.62g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％Tween20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，具体步骤如下：
(1)包被：将上述实施例1中的步骤2制备的苯醚甲环唑包被原用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释位浓度为0.1μg/mL的溶液，用于包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)封闭：用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)加样：将苯醚甲环唑标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔；然后每孔再加入50μL 1:16000稀释的上述制备的苯醚甲环唑单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；最后每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS 1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；
(4)显色：每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2mol/LH2SO4终止液，终止反应，得到反应液，将反应液于450nm测吸光值；
(5)计算结果：依据测定的吸光值绘制苯醚甲环唑单克隆抗体对苯醚甲环唑的标准抑制曲线图，见附图1；然后根据标准曲线计算出待测样品中苯醚甲环唑的浓度，然后计算样品的添加回收率。
计算结果：苯醚甲环唑的回收率分别为90.2％、103.1％、99.3％，符合国家农药残留检测标准，可用于食品安全检测中灭多威的残留分析检测。。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，其均应包含在本发明的权利要求范围当内。
Claims (10)
1.一种苯醚甲环唑半抗原，其特征在于：所述苯醚甲环唑半抗原的结构式如式1所示：
2.一种如权利要求1所述的苯醚甲环唑半抗原的制备方法，其特征在于：所述苯醚甲环唑半抗原的合成路线如式2所示：
具体包括以下步骤：
1)在70℃～80℃条件下，向甲醇溶液中加入4-(4-羟基苯基)丁酸化合物1和H2SO4，搅拌3～5h，得到反应液，然后将反应液与水混合并用DCM萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，即得到呈黑色油状的化合物2；
2)在80℃～90℃条件下，将步骤1)得到的化合物2、化合物A和K2CO3分别加入到DMF中进行搅拌溶解，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物；通过柱色谱法纯化残余物获得呈黄色油状的化合物3；
3)在室温条件下，将步骤2)得到的化合物3和Br2加入到1，4-二恶烷溶液中、搅拌溶解过夜，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物，通过柱色谱法纯化残余物获得呈黄色油状的化合物4；
4)将上述步骤3)得到的化合物4与化合物B和对甲苯磺酸分别溶解于甲苯，在110℃～120℃条件下搅拌过夜，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物，通过柱色谱法纯化残余物获得呈黄色油状的化合物5；
5)将上述步骤4)得到的化合物5与化合物C、KI和Cs2CO3分别溶解于DMSO中，在140℃～160℃条件下搅拌15～18h，得到反应液，然后将反应液与水混合、EA萃取，收集有机层并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩，得到残余物，通过HPLC纯化残余物获得呈白色固体状的目标物，即苯醚甲环唑半抗原。
3.一种如权利要求1所述的苯醚甲环唑半抗原在制备苯醚甲环唑完全抗原中的应用。
4.一种苯醚甲环唑完全抗原，其特征在于：由权利要求1所述的苯醚甲环唑半抗原与载体蛋白偶联得到。
5.根据权利要求4所述的苯醚甲环唑完全抗原，其特征在于：所述载体蛋白包括牛血清蛋白BSA、卵清蛋白OVA。
6.一种如权利要求4或5所述的苯醚甲环唑完全抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将苯醚甲环唑半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌活化6～8h，得到活化液；
2)将上述步骤1)得到的活化液加入载体蛋白溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到混合液；
3)将上述步骤2)得到的混合液，透析、分离，即得到苯醚甲环唑完全抗原。
7.根据权利要求6所述的苯醚甲环唑完全抗原的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述载体蛋白溶液是将载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲溶液中，得到载体蛋白溶液。
8.一种苯醚甲环唑单克隆抗体，其特征在于：由权利要求4所述的苯醚甲环唑完全抗原免疫小鼠所得。
9.如权利要求8所述的苯醚甲环唑单克隆抗体的应用，其特征在于：用于制备苯醚甲环唑残留分析检测所用的检测主体，所述检测主体包括试剂、胶体金免疫层析试纸条、试剂盒。
10.根据权利要求9所述的苯醚甲环唑单克隆抗体的应用，其特征在于：所述检测主体用于食品安全检测中苯醚甲环唑的残留分析检测。
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2022
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Patent Citations (4)
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