CN108330103B - 一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法，属于食品安全免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.14695，是将BALB/c小鼠用完全弗氏佐剂进行首次免疫，不完全弗氏佐剂进行加强免疫，不含佐剂的阿昔洛韦完全抗原进行冲击免疫，使得BALB/c小鼠获得免疫；将高效价低IC50的获得免疫的小鼠脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到的细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对阿昔洛韦具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用于食品中阿昔洛韦的残留检测。

Description

一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法

技术领域

本发明涉及一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

阿昔洛韦是一种合成的嘌呤核苷类似物，主要用于治疗疱疹病毒(尤其是单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒)所致的各种感染，已成为疱疹病毒重症感染的首选药，然而，它的残留和蓄积对神经系统、血液系统、消化系统等具有一定的毒副作。

为了防止阿昔洛韦在动物饲料中的滥用以及阿昔洛韦的其他食品中的滥用行为导致阿昔洛韦在人体形成药物残留，严重危害人体健康，我们急需找到一种特异性强、灵敏度高的检测食品中阿昔洛韦残留的方法。

目前，检测阿昔洛韦的方法主要是液相色谱法(HPLC)，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)，紫外-可见分光光度法等，但是这些方法在实际样品分析过程中往往由于阿昔洛韦组分复杂且目标物含量低，杂质干扰大，影响整个过程的精确度和准确度。因此建立一种低成本、高通量、高灵敏的检测方法具有重要意义。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测阿昔洛韦的前提是得到对阿昔洛韦具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对阿昔洛韦具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明人尝试通过杂交瘤细胞制备阿昔洛韦单克隆抗体，但在制备能分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何获得阿昔洛韦完全抗原、如何建立小鼠免疫，还需进一步的研究，制备出的杂交瘤细胞株是否能分泌出阿昔洛韦单克隆抗体，也许进一步验证，分泌出的阿昔洛韦单克隆抗体特异性、灵敏度如何也许进一步验证。

发明内容

本发明的目的是获得一种能分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株及此细胞株的制备方法，采用本发明获得的能分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的阿昔洛韦单克隆抗体对阿昔洛韦具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为35g/ml)，可以用于建立阿昔洛韦的免疫学检测方法，检测食品中阿昔洛韦的残留，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。

本发明提供了一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2017年9月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14695。

本发明提供了一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

步骤一：以阿昔洛韦为起始反应物，通过戊二醛法与蛋白载体相连，之后通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

步骤二：将免疫原与佐剂乳化完全后，通过背部皮下注射多次免疫BALB/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化；加强免疫采用弗氏不完全佐剂乳化免疫原；

步骤三：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清中抗阿昔洛韦抗体的效价和特异性，筛选出能产生抗阿昔洛韦抗体的小鼠；

步骤四：将筛选出的小鼠用弗氏不完全佐剂再进行加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用阿昔洛韦完全抗原与生理盐水混合均匀后进行；

步骤五：通过聚乙二醇(PEG2000)法将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA筛选能产生抗阿昔洛韦抗体的杂交瘤细胞(阳性细胞)，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔上清对阿昔洛韦的抑制效果，通过有限稀释法将对阿昔洛韦有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选出获得能分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

步骤六：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

步骤七：将获得的单克隆抗体通过小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定其抗体亚型及亚类，通过ELISA法测定其分泌的抗体的灵敏度和特异性。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为取4mg阿昔洛韦，再加入30μL5％的戊二醛水溶液，室温搅拌，活化10min，另取10mgBSA(牛血清白蛋白)溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲溶液)溶液中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应1.5小时，4℃透析三天，-20℃分装保存获得阿昔洛韦完全抗原。

在本发明的一种实施方式中，对小鼠进行的免疫过程，所述步骤二、步骤四中，每次免疫之间间隔三周，首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫时免疫剂量为加强免疫剂量的一半。

在本发明的一种实施方式中，对小鼠进行的多次免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲击免疫。

在本发明的一种实施方式中，在第3次免疫过程结束后第7天对小鼠进行采血。

在本发明的一种实施方式中，采血后再进行2次加强免疫后进行冲击免疫。

在本发明的一种实施方式中，细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。

本发明提供了一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的应用，此杂交瘤细胞可用于制备阿昔洛韦单克隆抗体。

本发明提供了一种阿昔洛韦完全抗原的制备方法，以阿昔洛韦为起始反应物，通过戊二醛法与蛋白载体相连，之后通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定。

在本发明的一种实施方式中，取4mg阿昔洛韦，再加入30μL5％的戊二醛水溶液，室温搅拌，活化10min，另取10mgBSA(牛血清白蛋白)溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲溶液)溶液中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应1.5小时，4℃透析三天，-20℃分装保存获得阿昔洛韦完全抗原。

本发明提供了一种阿昔洛韦完全抗原的应用，可用于特异性识别阿昔洛韦。

本发明提供了一种阿昔洛韦单克隆抗体，此抗体是从保藏编号为：CGMCCNo.14695的杂交瘤细胞株中获得的。

本发明提供了一种阿昔洛韦单克隆抗体的应用，其特征在于，所述阿昔洛韦单克隆抗体用于特异性识别阿昔洛韦。

本发明提供了一种用上述分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的产物或上述阿昔洛韦单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。

有益效果：

(1)本发明获得的这种阿昔洛韦单克隆抗体细胞株对阿昔洛韦有较好的检测灵敏度和特异性。

(2)本发明得到的单克隆抗体的IC50为35μg/L，检测线性范围为12.5-97.8μg/L，最低检测限值(LOD)为6.3μg/L。

生物材料保藏

一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14695，保藏日期为：2017年9月5日。

附图说明

图1为本发明阿昔洛韦完全抗原的紫外表征图。

图2为本发明单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：阿昔洛韦完全抗原的合成

取4mg阿昔洛韦，再加入30μL5％的戊二醛水溶液，室温搅拌，活化10min；另取10mgBSA(牛血清白蛋白)溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲溶液)溶液中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应1.5小时，4℃透析三天，-20℃分装保存。(阿昔洛韦完全抗原的紫外表征效果如图1)

实施例2：分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1.动物免疫的获得

选择健康的6～8周龄的Balb/C小鼠进行免疫，将获得的阿昔洛韦完全抗原与等量油剂混合，再加入乳化剂，乳化后得到不完全弗氏佐剂，在不完全弗氏佐剂中加入分枝杆菌得到完全弗氏佐剂；将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射多次免疫BALB/c小鼠，先用完全弗氏佐剂进行首次免疫，再用不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫；3次免疫过程结束后第7天，将小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中阿昔洛韦抗体含量高的获得免疫的小鼠；将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行2次加强免疫，然后用不含佐剂的阿昔洛韦完全抗原进行冲击免疫，冲击免疫不使用佐剂，将完全抗原与生理盐水混合均匀后采用腹腔注射(首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫时免疫剂量为加强免疫剂量的一半)。

2.细胞融合

在冲击免疫三天后，按PEG(聚乙二醇，分子量为2000)方法进行细胞融合，步骤如下：

(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

(2)收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

(3)将脾细胞和SP2/0细胞按照5-10:1的比例混合，离心后用50％PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

3.细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔；第二步选用阿昔洛韦为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定，选择对阿昔洛韦标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测，重复三次，获得细胞株。

4.细胞株冻存

将该细胞株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，培养物名称为：单克隆细胞株，保藏编号为：CGMCC No.14695，保藏日期为：2017年9月5日。

实施例3：阿昔洛韦单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型。(单克隆抗体的亚型鉴定结果如表1)

使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体阿昔洛韦的IC50为：35μg/L，说明对阿昔洛韦有很好的灵敏度，可用于阿昔洛韦免疫分析检测。

实施例4：阿昔洛韦单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于间接竞争酶联免疫吸附法方法的建立，具体步骤如下：

1.用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的0.1μg/mL作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

2.用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

3.用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，2，5，10，20，50，100，200μg/L的阿昔洛韦标准溶液。将标准溶液分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个标准溶液重复3个孔，再每孔加入50μL1︰32000稀释的抗阿昔洛韦单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

4.每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS1：3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

5.每孔加入100μLTMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL2MH₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

6.标准曲线绘制：用origin8.5绘制标准抑制曲线。

以间接竞争酶联免疫吸附法检测的吸光值为纵坐标，以阿昔洛韦浓度为横坐标建立抗阿昔洛韦单克隆抗体对阿昔洛韦的标准抑制曲线，如图2所示。由所绘标准曲线可以计算出此单克隆抗体的IC5035μg/L，检测线性范围为6.0-87.0μg/L，最低检测限值(LOD)为3.0μg/L。

样品前处理及添加回收实验，以鸡肉为例进行测试，步骤如下：

称取4份1g鸡肉均质样品置入50mL离心管中，分别添加25μg/g、50μg/g和100μg/g阿昔洛韦，剩下一份鸡肉样品为空白样。向所有样品中加入含10mL1％的三氯乙酸的乙腈溶液(w/v)震荡均匀后，超声提取30min，5000r/min离心10min，取5mL上清液，氮气吹干后加入5mL正已烷，超声15min，5000r/min离心15min，取上清液，氮气吹干，加入0.5mLPBS溶解，采用间接竞争ELISA方法进行添加回收试验，添加回收率分别为89％，94％，91％。(回收率在80％-120％，说明此方法可用于实际样品的检测)

表1.单克隆抗体的亚型鉴定

二抗亚类	OD值
		IgA	0.029
IgG1	0.201
		IgG2a	0.106
IgG2b	2.128
		IgG3	0.302
IgM	0.123

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2017年9月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14695。

2.如权利要求1所述的一种分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，所述杂交瘤细胞可用于制备阿昔洛韦单克隆抗体。

3.一种阿昔洛韦单克隆抗体，其特征在于，所述抗体是从保藏编号为：CGMCC No.14695的杂交瘤细胞株获得的。

4.如权利要求3所述的一种阿昔洛韦单克隆抗体的应用，其特征在于，所述阿昔洛韦单克隆抗体可用于特异性识别阿昔洛韦。

5.应用权利要求1所述分泌阿昔洛韦单克隆抗体的杂交瘤细胞株的产物或权利要求3所述阿昔洛韦单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。

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