KR20000034544A - 지럴레논 독소의 항체를 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지럴레논에 이종 단백질을 결합시켜 지럴레논 단백질 접합체를 얻고,상기 지럴레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고,상기 동물에서 생성된 항체를 회수하는 지럴레논 항체의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 지럴레논 독소에 대한 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 이들 항체를 이용하여 지럴레논 독소를 정성적으로 그리고 정량적으로 검출함으로써 인체나 가축에 유해한 지럴레논 독소를 분석할 수 있다. 본 발명의 방법은 신뢰성이 높고 저렴한 비용으로 신속하게 지럴레논 독소를 검출할 수 있다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 지럴레논 독소의 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지럴레논 독소를 동물에 투여하여 생산된 항체를 수집하는 지럴레논 독소의 생산방법에 관한 것이다.
곡물이나 사료를 유통시키거나 보관하는 등 장기간 저장을 하는 경우에는 미생물이 번식하여 곡물이나 사료가 변질되거나 부패하기 쉬우며, 특히 곰팡이가 발생하는 경우에는 동물에 유해한 물질이 생성되는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 사료의 원료로서 옥수수나 콩은 수출입 과정 및 유통 과정이 길기 때문에, 미생물의 번식하여 유해 물질이 생성될 염려가 높다.
우리나라의 기후는 일본과 대만을 비롯한 다른 아시아의 기후와 비슷하여 Fusarium graminearum이 번식하기 좋은 조건을 갖추고 있어 이 미생물에 의한 독소 생산이 대량 생산되기 쉽다. 이러한 곰팡이의 독소 중에서 지럴레논(zearalenone)은 돼지에서 위발정을 일으켜 번식 장해를 가져오므로 경제적 손실이 크다.
또한 지럴레논은 간에서 α- 및 β-지럴레놀(zearalenol)으로 전환되어 그 대사산물들이 우유로 분비되어 나온다. 이 독소는 ㎕나 ng 정도의 미량이 사료 내에 함유되어도 이를 섭취한 동물은 건강에 심각한 문제가 야기될 수 있다. 그러므로, 오염된 사료로부터 이러한 독소를 민감하게 검출하는 방법의 개발이 시급히 요구되는 실정에 있다.
사료 내에 포함된 곰팡이 독소를 정량하는 방법으로는 TLC, GC, HPLC 또는 GC-MSD 등의 화학분석법이 있으나, 많은 시간과 다양한 화학제 및 고가의 기구와 전문 인력이 소요되므로 시간적 경제적 문제점이 많고 시료의 정제에 있어서의 안전성의 확보도 검증되어 있지 않다는 점이 지적된다. 또한 짧은 시간에 측정이 가능한 RIA 방법도 제시되고 있으나, 방사성 물질의 위험성과 폐기물의 처리가 문제점으로 남아 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 지럴레논 독소에 대한 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 지럴레논 독소의 항체를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 지럴레논 독소를 포함한 재료로부터 그것을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 지럴레논에 대해 단일클론 항체를 10배로 단계적으로 희석하여 450nm에서의 흡광도의 결과를 보인 그래프.
도 2는 지럴레논에 대하여 단일 클론의 450nm 흡광도의 결과를 보인 그래프.
본 발명에 따라서, 지럴레논에 이종 단백질을 결합시켜 지럴레논 단백질 접합체를 얻고, 상기 지럴레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물에서 생성된 항체를 회수하는 지럴레논 항체의 생산방법이 제공된다.
지럴레논 독소에 이종 단백질로서 소의 혈청 알부민을 결합시켜서 접합체를 형성하는 것이 바람직하다. 지럴레논 독소와 BSA(bovine serum albumin)의 결합을 위해 먼저 지럴레논의 옥심(Z-oxime)을 제조하고, 여기에 BSA를 결합시켜 분리한다.
얻어진 Z-옥심-BSA를 동물, 바람직하게는 쥐에 투여하여 항체의 생성을 유도하고, 일정한 기간이 지난 후에 쥐의 혈청으로부터 항체를 회수한다.
본 발명의 다른 양상으로, 지럴레논에 이종 단백질을 결합시켜 지럴레논 단백질 접합체를 얻고, 상기 지럴레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물에서 지럴레논 항체를 생산하는 세포를 분리하고, 상기 분리된 세포와 단일 클론을 생산하는 종양 세포를 융합시키고, 융합된 세포를 배양하여 지럴레논 단일 클론 항체를 회수하고, 상기 지럴레논 단일 클론 항체를 동물에 투여하고, 상기 동물로부터 생산된 항체를 회수는 단계를 포함하는 지럴레논 항체의 대량 생산방법이 제공된다.
동물에 지럴레논과 단백질 접합체를 투여하여 그 혈청으로부터 지럴레논 항체를 검출할 수 있으나, 항체를 산업적으로 이용하기 위해서는 대량 생산이 필요하다. 따라서, 지럴레논-단백질 접합체를 투여한 동물에서 항체를 생산하는 세포를 분리한 후 이를 모노클론 종양세포(myeloma cell)에 융합을 시킨다.
융합된 세포를 다시 동물에 투여한 후 복수와 같은 체액을 수집하여 지럴레논 항체를 회수함으로써 대량으로 생산한다.
본 발명의 또다른 양상으로, 플레이트를 모노클로날 안티-Ig 항체로 코팅하고, 지럴레논의 모노클론 항체를 상기 플레이트에 첨가하여 반응시키고, 상기 플레이트를 세척한 후 지럴레논 독소를 포함하는 재료를 투입하여 반응시키고, 상기 플레이트를 세척하여 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 하는 지럴레논 독소의 검출방법이 제공된다.
지럴레논 독소는 곡물이나 사료 등에 분포하는 곰팡이로부터 배출되므로, 이들 곡물이나 사료에 독소가 함유되었는지를 정성적으로 검출할 필요가 있다. 또한, 이들 독소가 포함된 경우에는 허용 기준치를 초과하는지를 판단하기 위하여 정량적으로 독소를 측정하여야 한다.
본 발명에 따라서, 단일 클론 안티-Ig 항체로 플레이트의 복수개의 마이크로웰을 코팅하고, 상기 마이크로웰의 일렬에 표준 지럴레논의 단계별 희석액을 주입하고, 지럴레논 독소를 함유하는 것으로 의심되는 시료의 추출액을 동일하게 단계별 희석액을 상기 마이크로웰의 다른 열에 주입하고, 지럴레논 효소 콘주게이트를 상기 각 마이크로웰에 첨가하여 반응시키고, 실온에서 반응시킨 후 결합되지 않은 미반응 물질을 세척하여 제거하고, 발색제를 주입하여 일정 시간 반응시킨 후 흡광도를 측정하여 표준 독소와 시료를 비교하는 것을 특징으로 하는 지럴레논 독소의 검출방법이 제공된다.
먼저 다수의 마이크로웰을 갖는 플레이트를 단일 클론 안티-Ig 항체로 코팅한다. 이 코팅된 웰에 단계별로 표준 지럴레논 독소의 단계별 희석액을 일렬로 주입하고, 다른 열에는 시료의 단계별 희석액을 주입하여 실온에서 반응시켜 결합이 이루어지도록 한다. 일정 시간 반응이 진행된 후에는 미반응 물질을 세척하여 제거한 다음, 발색제로서 크로모존(chromogen)인 OPD 등을 넣어 일정 시간 반응시킴으로써 흡광도를 측정하여 시료의 독소를 검출할 수 있다. 즉, 표준 독소의 희석액과 비교함으로써 정량적으로 시료의 독소 함량을 검증할 수 있는 것이다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 이 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. Z-oxime의 제조
50㎎의 지럴레논 독소(Sigma chemicals)를 2㎖의 피리딘 p-니트로페닐 포스페이트(pyridine p-nitrophenyl phosphate disodium, Sigma chemicals)과 보르텍스(vortex)로 2분간 용해시키고, 계속해서 100㎎의 카르복시메톡시아민 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)(Sigma chemicals)을 넣어 5분간 보르텍스로 혼합하였다. 이것을 진탕 배양기에서 60℃로 2일간 반응시켜서 진공을 가하여 증류기에서 3일간 건조시켰다.
그 잔유물에 소디움 하이드록사이드(sodium hydroxide) 및 pH 8.0의 증류수 25㎖를 넣어 다시 보르텍스로 5분간 용해시켰다. 여기에 다시 벤젠 25㎖(Sigma chemicals)를 가하여 물층에서 변화되지 않는 지럴레논을 제거하였다. 형성된 합텐(hapten)은 pH 1.0의 HCL을 가하여 결정화된 침전물의 형성으로 확인되었으며, 다시 에틸 아세테이트 100㎖를 4회에 걸쳐 추가로 첨가하여 합텐을 추출하였다.
추출된 합텐(Z-옥심)은 건조된 후 TLC(chloroform:methanol=1:1의 전개액을 이용한 후 염화알루미늄 메탄올 용액 40%(w/v)를 분사하고 60℃의 hot chamber에서 황산에 2일간 반응)로 다시 확인하고 진공상태로 증발기에서 완전 건조시켜 Z-옥심을 얻었다.
2. Z-oxime-BSA의 제조
생상된 합텐 25㎎을 디옥산 5㎖에 용해하고, pH 6.0의 증류수 10㎖에 용해시킨 50㎎의 BSA(fatty acid free bovine serum albumin)가 함유된 용액을 혼합하였다. 완전한 용해를 위해 소니케이터(Branson ultrosonics)에서 10분간 초음파 처리하였다. HCl로 pH 6.0을 유지하면서 카본디이미드(Sigma Chemicals) 300㎎을 1시간 동안 서서히 혼합하였다. 이 용액을 실온에서 24시간 진탕반응시킨 후 카본디이미드 300㎎을 추가하고 48시간 동안 진탕하였다.
얻어진 Z-옥심-BSA를 30% 디옥산 용액으로 5회 세척한 후 10분간 원심분리(600g)한 후 상층액을 취하여 투석하였다. Zearalenone-oxime-BSA 용액은 4℃의 탈이온수 2ℓ로 12시간 마다 탈이온수를 교체하면서 3일간 투석하였다.
항원의 농도는 PM10 멤브레인으로 고정된 Amicon cell에 초여과(ultrafilteration)한 후 측정하였다. 결국 1㎎ 단백질이 1㎖에 함유되도록 증류수로 희석하여 0.45㎕ 멤브레인 필터(Millipore사 제조)로 여과하여 멸균시켰다.
이 용액을 초자앰플에 1㎖씩 분병하여 동결건조한 후, -70℃의 냉동기에 보관하였다. BSA에 결합된 합텐의 양은 310nm의 흡광도로 측정되었고, 305nm에서 같은 농도의 BSA 용액 흡광도와 BSA-합텐의 흡광도를 비교하였다. 단백질의 농도는 Biuret의 방법으로 측정하였다.
3. Z-oxime-HRP의 제조
상기 Z-옥심-BSA의 제조방법에서 BSA 대신에 HRP(horse raddish peroxidase, Sigma Chemicals)를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법을 적용하여 Z-옥심-HRP를 제조하였다.
4. 면역 및 하이브리도마 생산
Z-옥심-BSA 접합체 1㎎/㎖(0.9% normal saline)을 프로인드 완전보조액(Freund-complete-adjuvant)에 유화시켜 1차 면역시킨 후, 재면역을 위해 부스터(booster)로서 4주 후에 1㎖의 프로인드 완전보조액에 유화시켰다. 8주령의 Balb/C 암컷 생쥐 3마리(한국유전공학연구소에서 입수)에 대해 보조액 0.3㎖ 중의 항원 150㎍을 0.2㎖는 피하주사로, 0.1㎖는 복강내 주사로 투여하여 1차 면역시켰다.
4주 후에 0.3㎖의 불완전 보조액에 유화된 항원 150㎍으로 추가로 생쥐들을 피하 주사하여 재면역시켰다. 쥐의 안저 정맥으로부터 100㎕씩 혈청을 수집하고, 간접 ELISA(indirect ELISA)로 스크린하여 항체의 역가를 측정하였다. 이들을 1차 면역된 항체와 비교하였다. 가장 높은 역가를 가진 생쥐에게 마지막 부스터를 위해 불완전 보조액 0.3㎖에 유화된 항원 150㎍을 투여하였다.
최종적으로 항원을 주사한 후 3일째 되는 날 가장 높은 역가를 지닌 생쥐를 경추 탈구로 희생시킨 후 비장을 분리하여 헤모리싱 버퍼(hemolysing buffer)로 RBC를 제거하고 200φ 필터로 여과하여 비장 세포를 회수하였다. 회수된 비장 세포를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) 배지에 부유시켰다. ATCC로부터 구입한 미엘로마 세포(SP2/0-Ag 14 mouse myeloma cell line)는 1개당 비장 세포 2의 비율로 DMEM 배지에 혼합하였다. 비장 세포와 미엘로마 세포를 혼합한 후 5분간 다시 원심분리(600g)하였다.
37℃의 항온실에서 DMEM 배지에 0.5㎖의 50% 폴리에틸렌 글리콜(Boeringer) 용액을 2분 동안 가한 후 22℃에서 10분간 조용히 진탕하여 융합시켰다. 융합된 세포의 농도는 HAT 배지에 ㎖당 106세포수로 희석하여 IRC 쥐에서 채취한 복강내 대식 세포인 피더 셀(feeder cell, 4×10/㎖)이 깔린 96-웰 피더 플레이트로 옮겼다.
4. 항체-생산 클론을 위한 간접 ELIZA 스크리닝
세포융합 2주 후에 항체 생산을 확인하기 위해 플레이트의 웰들을 검정하였다. Z-옥심-BSA로 코팅된 96웰 플레이트에서 각 셀라인(cell line)들은 간접 ELISA로 검정하였다. 이 플레이트들은 4℃에서 하루밤 동안 코팅(50ng/웰)한 후 결합되지 않은 Z-옥심-BSA를 제거하기 위해 용액(phosphate-buffered saline tween 20)으로 5회 세척하였다.
비결합부 고상 부위(solid phase site)의 특이성을 차단하기 위하여 1% BSA의 PBS 용액을 각 웰에 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척후 배양된 셀라인의 부유액 50㎕를 그 플레이트의 각 웰에 가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
이 플레이트를 다시 세척한 후, 고트 안티마우스 페록시다제-표지 Ig G(goat anti-mouse peroxidase-labelled Ig G) 50㎕가 PBS 1000에 대하여 항체 1의 비율로 희석되어 각 웰에 주입되었다. 이 플레이트를 다시 37℃에서 2시간 반응시킨 후 OPD(O-nitrophenyl diamine, Sigma Chemicals) 50㎍을 발색제로 첨가하였다. 플레이트는 20분 반응 후에 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 반응을 보인 클론을 같은 방법으로 재시험하였다. 항체 생산을 위하여 Z-옥심-BSA에 양성을 나타내고 BSA에 음성을 나타낸 셀라인을 같은 방법으로 재검사를 실시하였다.
5. 복수 생산
항체의 대량 생산을 위하여 Balb/c 생쥐(한국유전공학연구소)에 프로인드 불완전 보조액 0.5㎖를 복강내 주입한 1주일 후, PBS 5㎖중의 1×107/㎖ 비장 세포와 미엘로마 세포가 융합되어 배양된 항체 생산성이 좋은 하이브리도마 세포를 Balb/c 생쥐의 복강내로 주사하였다. 임신한 것처럼 복강이 종창된 쥐로부터 복수를 회수하고 φ0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
6. 모노클로날 항체의 아이소티핑
단일클론 항체의 아이소티핑(isotyping)을 위해서 이뮤토셀렉트(Gibco, Cat, No. 9660SA, Monoclonal Antibody based isotyping system for mouse immunoglobulin)를 사용하였다. 코팅 버퍼(Nuc. maxisorp) 내의 단일클론 랫 (rat) 안티마우스 Ig 항체 0.1㎖씩을 각 웰에 주입하고 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 웰들을 PBS/Tween 20으로 5회 세척하고 배양 중에 생산된 하이브리도마 세포의 상층액을 웰에 0.1㎖씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 웰들을 PBS/Tween으로 5회 세척하고, 폴리클로날 랫 안티-마우스 Ig-알칼라인 포스페이트 0.1㎖를 웰마다 주입하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후에 웰들을 PBS/Tween 20으로 5회 세척하고, 기질(pNPP, Sigma Chemicals)을 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. ELISA 리더(Bio-Tec instrument, EL311)로 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 특이성이 높은 하이브리도마 세포의 상층액이 단계별로 희석되어 goat-anti mouse peroxidase-labeled IgG와 항원항체 반응을 한 결과를 도 1에 나타낸다.
7. 직접 컴피티티프 ELISA
생성된 항체에 대한 전형적인 직접(direct) 컴피티티브 ELISA 스탠더드 커브(typical direct competitive ELISA standard curve)의 범위는 10ng에서 500ng/㎖ 사이였다. 지럴레논의 50% 저해치는 50ng으로 나타냈다. 결과를 도 2에 표시한다.
8. 특이성 측정
지럴레논, α-질러레놀, β-질러레놀, 지럴라논(zearalanone), α-지럴라놀 및 β-지럴라놀 등에 대하여 안티 지럴레논의 크로스 반응(crossreaction)을 측정하였다. 단일클론 항체의 아이소티핑은 IgG2a와 λ형 경쇄의 서브클라스로 이루어졌다. 다음 표 1에 나타내는 안티-지럴레논의 특이성(specificity)을 결정하는 크로스반응에서 지럴레논, α-지럴레놀, β-지럴레놀, 지럴라논(zearalanone), α-지럴라논 및 β-지럴라논 중에서 α-지럴레놀과 지럴라논은 각각 91%와 125%의 반응을 나타냈지만 α-지럴라놀은 43%, β-지럴레놀은 21% 및 β-지럴라놀은 8%를 나타냈다.
| 마이코톡신 | 지럴레논에 대한크로스 반응(%) |
| 지럴레논 | 100 |
| α-지럴레놀 | 91 |
| β-지럴레놀 | 21 |
| 지럴라논 | 125 |
| α-지럴라논 | 43 |
| β-지럴라논 | 8 |
9. 지럴레논 독소의 회수
옥수수 미세분말 5g에 순수한 지럴레논 독소 10 내지 500ng을 추출 하루 전에 첨가하였다. 1일 후에, 시료를 추출 용매(에탄올 80 : 물 20) 20㎖와 1시간 동안 진탕하였다. 추출물을 방치하여 침전시키고 상층액 100㎕를 1로 하여 PBS-Tween으로 1:25 또는 1:50으로 희석한 후, 다이렉트 컴피티티브(direct competitive) ELISA로 정량하였다. 생산된 항체반응에서 시료 중의 지럴레논의 표준곡선에 시료 중의 지럴레논을 비교하여 그 함량을 측정하였다. 결과를 다음 표 2에 나타낸다.
| 지럴레논 첨가량(ng/g) | 옥수수 | |
| 검출량(ng/g) | 회수율(%) | |
| 50 | 45 | 90 |
| 100 | 92 | 92 |
| 200 | 178 | 89 |
| 400 | 360 | 90 |
| 500 | 445 | 89 |
이상 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라서 인체나 가축에 유해한 지럴레논 독소에 대한 항체를 생산할 수 있으며, 이 항체를 이용하여 항원-항체의 결합반응을 이용하여 지럴레논 독소를 정성적으로 그리고 정량적으로 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 검출방법은 나노 그램 단위의 극미량의 지럴레논 독소도 검출할 수 있기 때문에, 기존의 분석방법으로 검출할 수 없었던 지럴레논 독소를 값싸고 간편하게 검출할 수 있다는 장점이 있다.
Claims (3)
- 지럴레논에 이종 단백질을 결합시켜 지럴레논 단백질 접합체를 얻고,상기 지럴레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고,상기 동물에서 생성된 항체를 회수하는 지럴레논 항체의 생산방법.
- 지럴레논에 이종 단백질을 결합시켜 지럴레논 단백질 접합체를 얻고,상기 지럴레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고,상기 동물에서 지럴레논 항체를 생산하는 세포를 분리하고,상기 분리된 세포와 단일 클론을 생산하는 종양 세포를 융합시키고,융합된 세포를 배양하여 지럴레논 단일 클론 항체를 회수하고,상기 지럴레논 단일 클론 항체를 동물에 투여하고,상기 동물로부터 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 지럴레논 항체의 대량 생산방법.
- 단일 클론 안티-Ig 항체로 플레이트의 복수개의 마이크로웰을 코팅하고,상기 마이크로웰의 일렬에 표준 지럴레논의 단계별 희석액을 주입하고,지럴레논 독소를 함유하는 것으로 의심되는 시료의 추출액을 동일하게 단계별 희석액을 상기 마이크로웰의 다른 열에 주입하고,지럴레논 효소 콘주게이트를 상기 각 마이크로웰에 첨가하여 반응시키고,실온에서 반응시킨 후 결합되지 않은 미반응 물질을 세척하여 제거하고,발색제를 주입하여 일정 시간 반응시킨 후 흡광도를 측정하여 표준 독소와 시료를 비교하는 것을 특징으로 하는 지럴레논 독소의 검출방법.
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| CN107915774A (zh) * | 2017-07-26 | 2018-04-17 | 华中农业大学 | 用于检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单抗及酶联免疫方法与试剂盒 |
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