KR100777229B1

KR100777229B1 - 지랄레논 대량 생산균주[ｋｃｃｍ 10794ｐ] 및 이를 이용한지랄레논 생산방법

Info

Publication number: KR100777229B1
Application number: KR1020060119226A
Authority: KR
Inventors: 이인원; 정선요; 김정은; 윤성환
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2007-11-28

Abstract

본 발명은 지랄레논 대량 생산균주[KCCM 10794P] 및 이를 이용한 지랄레논 생산방법에 관한 것으로서, 지랄레논을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)과 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)의 오로푸사린 생합성 경로를 차단하는 것을 특징으로 하는 지랄레논 생산증가방법에 관한 것이다. 또한, 상기 균주를 고체배양하여 지랄레논을 생산하는 지랄레논 대량 생산방법에 관한 것이다.

지랄레논, 보리 붉은 곰팡이균, PKS12

Description

지랄레논 대량 생산균주[ＫＣＣＭ 10794Ｐ] 및 이를 이용한 지랄레논 생산방법{Zeralenone Overproducing Microorganism and Methods of Zeralenone Overproduction By Using It}

도 1은 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)에서 PKS4 제거 균주 GZ3639의 게놈으로부터 PKS12의 제거방법을 나타낸다. (A) 제거 기술. R: EcoRI; S: StuI; hygB, 하이그로마이신(hygromycin)-B-내성 유전자; gen, 제네티신(geneticin)-내성 유전자; //: 불연속. (B) StuI (왼쪽 패널) 또는 EcoRI (오른쪽 패널)으로 처리된 ΔPKS4, ΔPKS12, ΔPKS4::ΔPKS12 균주로부터 얻은 제노믹 DNA들의 젤 블랏(gel blot). DNA 젤 블랏 하이브리다이제이션을 위하여 PKS12의 3' 측면부위 또는 전체 ORF 부위를 탐침으로 사용하였다. 레인 1, 야생형균주(GZ3639); 레인 2, ΔPKS4 균주(TdPKS4-2) (Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113); 레인 3, ΔPKS12 균주(TdPKS12-1); 레인 4, 5, ΔPKS4::ΔPKS12 제거 균주들(TdPKS12/4-3, TdPKS12/4-5); 레인 6, 제대로 되지 않은 위치에 형질전환 벡터를 가지고 있는 형질전환체(TdPKS12/4-10). 람다(lambda) DNA 표준의 크기를 블랏의 왼쪽에 나타냈다. (C) PKS 제거 균주들의 색소 형성. 평판들에서 배양된 기균사체 윗면을 왼쪽에 나타냈고, 연관된 평판들의 아랫면을 오른쪽에 나타냈다. 양면의 위, GZ3639; 중간 왼쪽, TdPKS4-2; 중간 오른쪽, TdPKS12-1; 아래 왼쪽, TdPKS12/4-3; 아래 오른쪽, TdPKS12/4-10.

도 2는 PKS 제거에 따른 옥수수 자루에서의 독성검사를 나타낸다. 괴사성 증상은 접종 3일 후에 일어났다. NC, 접종하지 않은 음성대조구; WT, 야생형균주 GZ3639; ΔPKS4, PKS4 제거 균주; ΔPKS12, PKS12 제거 균주; ΔPKS4::ΔPKS12, PKS4와 PKS12가 둘 다 제거된 균주.

도 3은 스타치-글루타매이트(starch-glutamate; SG) 액체배지에서 야생형 균주 GZ3639의 지랄레논(zearalenone; ZEA)과 오로푸사린(aurofusarin; AUR) 생산에 대한 시간 추이를 나타낸다. 결과는 세 번 반복의 평균± 표준편차로 표현한다.

도 4는 SG 배지(A)와 쌀 기질(B)에서 야생형균주 GZ3639와 PKS 제거 균주들의 지랄레논과 β-ZOL 생산에 대한 시간 추이를 나타낸다. WT, 야생형균주 GZ3639; ΔPKS4, PKS4 제거 균주; ΔPKS12, PKS12 제거 균주; ΔPKS4::ΔPKS12, PKS4와 PKS12가 둘 다 제거된 균주. 결과는 세 번 반복의 평균± 표준편차로 표현한다.

도 5는 SG 액체 배지에서 12일 동안 배양한 보리 붉은 곰팡이균주의 형질전환 PKS 제거 균주에서의 RNA 젤 블랏을 나타낸다. 각 PKS 유전자의 탐침을 각 블랏 위에 나타냈다. 블랏팅 이전에 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색된 아가로스 젤들을 왼쪽 패널에 나타냈다. WT, 야생형균주 GZ3639; ΔPKS4, PKS4 제거 균주; ΔPKS12, PKS12 제거 균주; ΔPKS4::ΔPKS12, PKS4와 PKS12가 둘 다 제거된 균주

보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)(불완전세대: 푸자리움 그래미네아럼(Fusarium graminearum))은 지리적으로 광범위하게 분포하는 자낭균의 곰팡이로서 옥수수, 밀, 쌀과 같은 잡곡에 심각한 질병을 유발한다(McMullen, M. et al, Plant Dis., 81(1997) 1340-1348). 이 곰팡이들은 마이코톡신, 항생제, 색소들을 포함하는 다양한 범위의 2차 대사산물들을 생산한다(Marasas, W. F. O. et al, Toxigenic Fusarium Species; Identity and Mycotoxicology, The Pennsylvania State University Press(1984), Medentsev, A. G. et al, Phytochemistry, 47(1998) 935-959, Nelson, P. E. et al, Fusarium species-An Illustrated Mannual for Identification, The Pennsylvania State University Press(1983)).

이 대사산물들 중에서 지랄레논(zearalenone; ZEA)과 오로푸사린(aurofusarin; AUR) 같은 폴리케타이드의 생산은 보리 붉은 곰팡이균의 중요한 진균학적 특징이다. 지랄레논은 여러 상업적으로 중요한 동물종들의 발정 장애를 유발하는 마이코톡신이고(Marasas, W. F. O. et al, Toxigenic Fusarium Species; Identity and Mycotoxicology, The Pennsylvania State University Press(1984), Mirocha, C. J. et al, Mycotoxins, (1974) 129-148, Stob, J. et al, Nature, 196(1962) 1318), 오로푸사린은 기균사체에서 생산되는 이분자체(dimeric) 나프토퀴논(naphthoquinone) 색소이다(Dvorska, J. E. et al, Asian Austral. J. Anim., 17(2004) 434-440, Dvorska, J. E. et al, Brit. Poultry Sci., 42(2001) 643-649). 이 두 폴리케타이드들은 보리 붉은 곰팡이균에서 폴리케타이드 합성효소(polyketide synthases; PKS) 유전자들로 암호화 된 PKS에 의해 합성된다. 총 16개로 추정되는 PKS 유전자들이 보리 붉은 곰팡이균 게놈에서 밝혀졌다(Kroken, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2003) 15670-15675).

보리 붉은 곰팡이균에서 목표 PKS 유전자들을 제거하는 방법을 사용함으로써, 최근에 연구자들은 지랄레논 생합성에 PKS4와 PKS13이 필요하다는 것(Gaffoor, I. et al, Eukaryotic Cell, 4(2005) 1926-1933, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol., 58(2005) 1102-1113)과 오로푸사린 생합성에 PKS12가 필요하다는 것을 알아냈다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol., 71(2005) 1701-1708, Malz, S. et al, Fungal Genet. Biol., 42(2005) 420-433). PKS4나 PKS13 둘 중 하나가 제거됨으로써 유발되는 지랄레논 결핍은 보리 붉은 곰팡이균의 균사성장, 분생자 형성(conidiation), 자낭각 형성, 색소 생성과 같은 다른 표현형들에는 큰 영향을 미치지 않는다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol., 58(2005) 1102-1113). 반대로 색소 형성이 결여된 PKS12 제거 보리 붉은 곰팡이균주는 야생형 균주와 비교해서 증가된 균사성장, 감소된 지랄레논 생산을 포함하는 극적인 표현형 변화들을 나타낸다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol., 71(2005) 1701-1708, Malz, S. et al, Fungal Genet. Biol., 42(2005) 420-433). 비록 오로푸사린 결핍이 지랄레논 생산에 미치는 영향이 완전하게 밝혀진 것은 아니지만, 이전의 결과들도 보리 붉은 곰팡이균에서 이 두 폴리케타이드의 생산 사이에 가능한 관계에 초점을 맞추게 한다.

한국특허등록번호 10-0444124-0000호 (출원일: 2001.8.16)는 곰팡이 독소생성을 저해하는 조성물에 관한 것으로, 결명자 추출물을 포함하는 곰팡이 독소생성 저해용 조성물을 개시하고 있다. 또한 알리자린(Alizarin), 크리소파닌산(Chrysophanic acid), 단손(Danthron), 푸푸린(Purpurin) 및 퀴니자린(Quinizarin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 포함하는 곰팡이 독소생성 저해용 조성물에 대하여 개시하고 있다.

한국특허등록번호 10-0287382-0000호 (출원일: 1998.11.30)에서는 지랄레논에 이종 단백질을 결합시켜 지랄레논 단백질 접합체를 얻고, 상기 지랄레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물에서 생성된 항체를 회수하는 지랄레논 항체의 생산방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나, 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)를 이용하여, 지랄레논를 대량으로 생산하는 방법에 대한 언급이 없다.

지랄레논은 지랄레논 특이적 항체의 생산에 사용이 되고 있으며, 1g에 13,200,000원에 판매되고 있다(Http://www.sial.co.kr/function/order/order.asp; 2006년 9월 19일 접속). 따라서, 경제적인 방법으로 지랄레논을 대량생산하는 방법이 요구되고 있다. 본 발명자는 지랄레논의 생산경로에서 오로푸사린으로 가는 PKS 12를 제거함으로서, 지랄레논이 대량생산되어지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

지랄레논을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)[KCCM 10794P]을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 지랄레논을 대량생산하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위하여 본 발명은 지랄레논를 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)[KCCM 10794P, 한국미생물보존센터(KCCM), 2006년 11월 22일]을 제공한다. 지랄레논을 대량 생산하는 균주는 데옥시니발레놀(deoxynivalenol; DON)과 지랄레논(zearalenone; ZEA)를 생산하는 GZ3639 보리 붉은 곰팡이 야생형 균주(O'Donnell, K. H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2000) 7905-7910)로부터 제조되었다. 지랄레논 생산을 위해서, 균주들의 기균사체(aerial mycelia)를 25ml의 스타치-글루타매이트(starch-glutamate; SG) 액체배지에 배양하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113). 또한 250ml 삼각플라스크에 미립(rice grains)(50g)을 지랄레논 생산을 위한 고체 배지로서 사용하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58(2005) 1102-1113).

본 발명에 따른 ΔPKS12 균주들은 같은 액체 배지에서 GZ3639와 비슷한 형태로 지랄레논을 생산했다. 더구나 ΔPKS12 균주들은 GZ3639보다 지랄레논과 β-ZOL을 약 2배 더 생산했다. ΔPKS12 균주들에서의 향상된 지랄레논 생산은 또한 쌀 기질에서도 일어났다. 지랄레논과 β-ZOL의 생산은 4주 배양기간 동안 GZ3639와 ΔPKS12 균주 모두에서 점차적으로 증가하였다. 하지만 ΔPKS12 균주들에서 지랄레논과 β-ZOL의 생산량은 GZ3639 보다 2-3배 정도 더 많았다(도 4B).

ΔPKS12 균주는 GZ3639와 동일하게 격막을 갖는 사상형 자낭균으로 약간 살구색을 띄는 형태적 특성을 지니며 일반적으로 25 ℃, pH 5.6 정도의 약산성 조건에서 잘 자란다. ΔPKS12 균주는 100ml의 개량된 CM 배지(NaNO3 2g, Sucrose 30g, KH2PO4 1g, MgSO4˙7H20 0.5g, KCl 0.5g, D.W)에 PDA에서 배양한 균사를 접종하고, 25℃, 150rpm에서 7일 동안 배양했을 때 지랄레논을 검출할 수 있었다. 또한 ΔPKS12 균주는 2006년 11월 22일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM 10794P로 균주기탁되었다.

본 발명의 제 2의 양태는 색소물질인 오로푸사린의 생합성 경로를 차단하는 것을 특징으로 하는 지랄레논을 대량생산하는 방법을 제공한다. 오로푸사린의 생합성 경로를 차단하는 방법은 생합성 유전자를 결실시키는 방법, 생합성 유전자의 안티센스 RNA를 이용하여 전사를 억제하는 방법, 생합성 유전자를 트랜스포존을 이용하여 녹아웃(knock-out)시키는 방법, 단백질의 활성을 억제시키는 억제제를 처리하는 방법이 이용될 수 있다. 보다 상세하게는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)의 PKS12 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 지랄레논 생산증가방법을 제공한다. 유전자를 결실시키는 방법은 유전자 재조합 방법을 사용하여 유전자를 결실시켰다.

지랄레논은 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)(불완전세대: 푸자리움 그래미네아럼(Fusarium graminearum) 이외에 여러 푸자리움 종에서 생산이 된다. 켄지 등은 F. roseum, F. tricinctum, F. lateritium 등에서 생산이 된다고 보고하였다(Kenji Shii et al, Applied Microbiology, Vol. 27, pp. 625-628). 따라서, 오로푸사린의 생합성 경로를 차단하여, 지랄레논을 생산하는 방법은 상기 푸자리움 종에 모두 적용가능할 것이다.

지랄레논 생산 배양은 액체 배양 또는 고체배양 모두가 이용될 수 있다. 액체 배양 배지는 스타치-글루타매이트(starch-glutamate; SG), 고체배양 배지는 미립(rice grain)을 이용할 수 있다. 액체배지를 이용하였을 경우보다 고체배지에서 더 효과적으로 지랄레논이 생산되었다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 형질전환 보리 붉은 곰팡이 균주들에서의 지랄레논 대량생산

오로푸사린의 생산 경로인 PKS12를 제거해서 ΔPKS12 균주를 만들고, 이 균주의 배양을 통해서 지랄레논을 대량생산하는 방법을 나타낸다.

균주 및 배지

GZ3639 균주를 데옥시니발레놀(deoxynivalenol; DON)과 지랄레논(zearalenone; ZEA)를 생산하는 보리 붉은 곰팡이 야생형 균주로 사용하였다(O'Donnell, K. H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2000) 7905-7910). 보리 붉은 곰팡이 균주 T39ΔM2-1과 TdPKS4-2는 GZ3639로부터 파생되었다. 전자는 지랄레논(zearalenone; ZEA)와 오로푸사린(aurofusarin; AUR)를 둘 다 생산하는 mat1-2가 제거된(mat1-2-deleted) 자가불임성(self-sterile) 균주(Lee, J. et al, Mol. Microbiol. 50(2003) 145-152)이고, 후자는 오로푸사린을 생산하지만 PKS4의 제거(ΔPKS4로 지정) 때문에 지랄레논은 생산하지 않는다. DNA 분리를 위해서, 곰팡이 균주들을 3일 동안 25℃, 150rpm의 회전식 진탕 배양기에서 30ml의 완전배지(complete medium; CM)가 포함된 250ml 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)로 배양하였다(Correll, J. C. et al, Phytopathology 77(1987) 1640-1646). 총 RNA 추출과 지랄레논 생산을 위해서, 균주들의 기균사체(aerial mycelia)를 25ml의 스타치-글루타매이트(starch-glutamate; SG) 액체배지에 배양하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113). 오로푸사린 생산을 관찰하기 위해서, 곰팡이 균주들을 포테이토-덱스트로즈 아가(potato-dextrose agar; PDA)(Difco Laboratories, Detroit, MI, U.S.A.)나 SG 배지에 25℃, 암소에서 배양하였다. 또한 250ml 삼각플라스크에 미립(rice grains)(50g)을 지랄레논 생산을 위한 고체 배지로서 사용하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58(2005) 1102-1113). 캐롯 아가(carrot agar)를 유성 교배(sexual cross)에 사용하였다(Bowden, R. L. et al, Phytopathology 89(1999) 182-188).

핵산 조작

곰팡이 제노믹 DNA(genomic DNA)와 플라스미드 DNA(plasmid DNAs)들을 이전에 보고된 대로 추출하였다(Kereyi, Z. et al, Appl. Environ. Microbiol. 65(1999) 4071-4076). 1ml의 트리졸 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)을 사용하여 액체질소에 의해 갈려진 균사체(0.1g)로부터 총 RNA를 제조회사의 사용설명서에 따라 추출하였다. 제한효소처리, 라이게이션(ligation), 아가로스 젤 전기영동, 젤 블랏팅(gel blotting)으로 표준 절차들을 진행하였다(Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). P³²로 표지된 탐침을 DNA, RNA 젤 블랏 하이브리다이제이션(gel blot hybridization)에 사용하였다. PCR 프라이머를 바이오니아 올리고뉴클레오티드 합성팀으로부터 확보하였다(Bioneer Co., Chungwon, Korea).

더블 조인트 PCR (Double-Joint PCR)과 곰팡이의 형질전환

보리 붉은 곰팡이 균주 PKS12의 유전자 5'과 3' 측면부위에 위치한 DNA 염기서열 상동성에 따라 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자(hygB)를 가지게 된 형질전환 DNA 단편은 보완된 더블 조인트 PCR (Double-Joint PCR; DJ PCR)을 사용하여 증폭되었다(Yu, J.-H. et al, Fungal Genet. Biol. 41(2004) 973-981). 4.8kb 융합 PCR 산물을 GZ3639 균주의 제노믹 DNA에서 증폭하였다. PKS12 ORF의 5'과 3' 측면부위를 증폭하기 위해 프라이머 쌍인 P12-5'f (5'-GGGGGAGGCCATCTTTATCT-3')(서열번호 1) / P12-5'r (5'-CAGGTACACTTGTTTAGAGGAGAGGTAATGAAGCACAAT-3')(서열번호 2)과 P12-3'f (5'-TCAATATCATCTTCTGTCGCTTTGTATTGCGCTTCGTGTT-3')(서열번호 3) / P12-3'r (5'-CTAATATTCATCAGCTTTCACTCC-3')(서열번호 4)을 사용하였고, 융합산물을 위해 네스티드 PCR(nested PCR) 프라이머 쌍 (NP12-5'f, 5'-GATATCGCGACTG ACGTACTAACAGGTGG-3'(서열번호 5)와 NP12-3'r, 5'-GCGACACGTATGGGCCAAAGAATG-3'(서열번호 6))을 사용하였다. PCR 조건과 이후의 PCR 산물 처리는 이전에 보고된 대로 수행하였다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol. 71(2005) 1701-1708, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113).

곰팡이의 형질전환을 위해서, 드리세라제(Driselase, InterSpex Products, Inc., San Mateo, CA, U.S.A.)로 처리한 균사체에 의해 준비된 곰팡이의 원형질체 안으로 폴리에틸렌글라이콜(polyethyleneglycol)과 함께 DJ-PCR에 의해 얻은 약 5ug의 융합 PCR 산물을 직접 첨가하였다(Lee, T. et al, Appl. Environ. Microbiol. 68(2002) 2148-2154). hygB 유전자를 가진 안정적인 형질전환체들을 75ug/ml의 하이그로마이신 B(hygromycin B)가 포함된 재생 배지에서 선택하였고 25% 글리세롤이 포함되어 -80℃에 보관하였다.

이종교배(outcross)와 독성검사

형질전환된 보리 붉은 곰팡이균주와 T39ΔM2-1의 유성교배(sexual cross)를 이전에 보고된 대로 캐롯 아가 배지(carrot agar medium)에서 수행하였다(Lee, J. et al, Mol. Microbiol. 50(2003) 145-152). 유전적 분석을 위해 교배 평판(mating plate)에서 형성한 자낭각(perithecium) 당 두 개의 자낭포자(ascospore)를 분리하였다. 각 교배(cross)로부터 나온 후대들(progenies)의 쌀 기질에서 지랄레논 생산능력을 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)로 분석하였고 PDA에서의 오로푸사린 생산성을 색소 형성에 의해서 분석하였다.

독성을 검사하기 위해서, 캐롯 아가 배지에서 25℃, 2주 동안 배양된 균주들로부터 캐롯 아가 배양체를 이쑤시개로 긁어서 곰팡이 균사체를 모았다. 그리고 나서 어린 옥수수 자루(young corn ear)에 이쑤시개을 주입함으로써 옥수수에 접종하였다. 접종 후에, 옥수수 시료를 일주일 동안 습도를 유지하고 있는 플라스틱 상자로 옮겼다.

화학적 분석

지랄레논, α-ZOL, β-ZOL의 표준시료를 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, U.S.A)로부터 구입하였다. 곰팡이 균주의 SG 배양으로부터 지랄레논과 오로푸사린을 검출하기 위해서, 배양 여과액과 건조시킨 액체 배양액을 추출하고 고성능 액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC)로 분석하였다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol. 71(2005) 1701-1708, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113).

결과

1. 보리 붉은 곰팡이균( Gibberella zeae )에서의 목표 PKS 유전자 제거

PKS12의 제거 또는 PKS12, PKS4 둘 다 제거된 형질전환 보리 붉은 곰팡이 균주들을 만들기 위해서 목표 유전자 치환 기술(gene replacement strategy)을 사용했다. GZ3639 균주의 각 PKS 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 제거하였고 이전에 보고된 대로 곰팡이 선택적인 마커인 hygB을 치환하였다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol. 71(2005) 1701-1708, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113). 곰팡이 게놈과 벡터에 연관된 부위 사이에서 일어난 두 번의 상동재조합(homologous recombination)을 통해서 ΔPKS4 균주(TdPKS4-2)(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113)의 게놈 안으로 마커가 융합된 PKS12 ORF의 5'과 3' 부위를 가진 융합 PCR 산물을 삽입하였고 이로 인해 ΔPKS4::ΔPKS12를 만들었다(도 1A). 위에 설명한 것과 같은 방법을 사용하여 GZ3639의 ΔPKS12 균주를 만들었다(데이타 보이지 않음). PKS12의 3' 측면부위를 표지했을 때, 야생형 균주 GZ3639와 ΔPKS4 균주에서 나타나는 11.3kb 밴드 대신에 StuI으로 처리한 ΔPKS12와 ΔPKS4::ΔPKS12 균주의 제노믹 DNA는 6.8kb 밴드가 나타났다(도 1B). PKS12 단편을 표지했을 때, PKS12 ORF의 완전한 사본이 GZ3639와 ΔPKS4 균주 모두에서 검출되었으나 ΔPKS12나 ΔPKS4::ΔPKS12 균주에서는 검출되지 않았다. 다음 분석들을 위해서 각 PKS가 제거된 세 가지의 형질전환 균주들을 사용하였다.

2. 형질전환된 PKS 제거 균주들의 표현형들

야생형 균주인 GZ3639와 ΔPKS4 균주들의 균사체는 접종 5일 후부터 PDA에서 양홍색으로 변하면서 오로푸사린을 생산하기 시작했다(도 1C). 그러나 ΔPKS12나 ΔPKS4::ΔPKS12 균주는 배양액의 상부가 하얗게, 하부가 노랗게 될 때까지 충분한 배양시간을 두었는데도 불구하고 오로푸사린을 생산할 수 없었다. 제대로 된 위치에 형질전환 DNA를 가지고 있지 않은 형질전환 균주들은 GZ3639처럼 붉은 색소 형성을 나타냈다. 시험된 모든 ΔPKS4 균주들은 균사체의 성장이 원조 야생형균주와 비슷했다. 백화종인 ΔPKS12와 ΔPKS4::ΔPKS12 균주들은 GZ3639나 ΔPKS4 균주들과 비교해서 균사체 성장이 약 30% 증가함을 나타냈다(데이타 보이지 않음). 균사체 성장과는 반대로, 모든 PKS 제거 균주들은 옥수수에서의 독성이 GZ3639와 유사하게 나타났다(도 2). 트라이코쎄신(trichothecene)(DON과 그 파생물)과 같은 논폴리케타이드 마이코톡신(nonpolyketide mycotoxin)들을 생산했는데 GZ3639과 어느 정도 유사했다(데이타 보이지 않음).

3. 형질전환 보리 붉은 곰팡이 균주들에서의 지랄레논과 오로푸사린의 생산

SG 액체 배지에서, 야생형 균주 GZ3639는 접종 12일 후에 상당한 양의 지랄레논과 오로푸사린을 생산하였다. 그러나 오로푸사린 생산의 시작은 지랄레논과 비교해서 지연되었다. 지랄레논은 접종 3일 후에 처음으로 검출되었고 12일째까지 점차적으로 증가하였다. 오로푸사린은 접종 9일째에 처음으로 검출되었다(도 3). 백화종 ΔPKS12 균주들은 같은 액체 배지에서 GZ3639와 비슷한 형태로 지랄레논을 생산했다. 더구나 ΔPKS12 균주들은 GZ3639보다 지랄레논과 β-ZOL을 약 2배 더 생산했다. ΔPKS12 균주들에서의 향상된 지랄레논 생산은 또한 쌀 기질에서도 일어났다. 지랄레논과 β-ZOL의 생산은 4주 배양기간 동안 GZ3639와 ΔPKS12 균주 모두에서 점차적으로 증가하였다. 하지만 ΔPKS12 균주들에서 지랄레논과 β-ZOL의 생산량은 GZ3639 보다 2-3배 정도 더 많았다(도 4B). ΔPKS4와 ΔPKS4::ΔPKS12 균주들에서는 두 배지 모두 충분한 배양동안에도 지랄레논과 β-ZOL이 검출되지 않았거나 미량 검출되었다(도 4). 유사하게 Z03643 균주(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol. in press)로부터 파생된 오로푸사린 과생산 균주인 Odzg2-1은 같은 조건하에서 지랄레논을 생산하지 않았다(데이타 보이지 않음). 접종 후 2주 동안 GZ3639와 ΔPKS12 균주들에서는 모두 α-ZOL의 점차적인 증가를 관찰하였으나 지랄레논이나 β-ZOL과 비교했을 때 그 양은 무시할 만 했다(데이타 보이지 않음). 놀랍게도 SG 배지가 고체 쌀 배지(25%) 보다 총 지랄레논과 β-ZOL에 있어서 더 큰 β-ZOL 비율(75%)을 나타냈다. 지랄레논 생산과는 달리, 오로푸사린 생산은 ΔPKS4 균주들의 배양에서 달라지지 않았다. 이는 지랄레논의 결핍이 보리 붉은 곰팡이 균주에서의 오로푸사린 생산에 영향을 미치지 않는다는 사실을 나타낸다.

4. PKS 제거에 대한 유전적 분석

각 PKS 유전자 제거에 따른 형질전환 균주들에서의 지랄레논이나 오로푸사린 결핍에 대한 유전적 결합을 증명하기 위해서, PKS 제거 균주들을 mat1-2가 제거된(mat1-2-deleted) 자가불임성(self-sterile) 균주인 T39ΔM2-1에 이종교배(outcross)하였다(Lee, J. et al, Mol. Microbiol. 50(2003) 145-152). 이전에 보고된 대로, ΔPKS12(hygB:aur^-)의 이종교배로 인한 후대(progeny)는 항생제 내성과 색소 형성에 있어서 재조합 표현형을 나타내지 않았다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol. 71(2005) 1701-1708, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58(2005) 1102-1113). 유사하게 ΔPKS4::ΔPKS12 균주(hyg;aur^-:gen;zea^-)와 T39ΔM2-1의 이종교배에 의한 모든 후대는 gen과 zea^-사이, hygB와 aur^-사이의 유전적 결합을 나타냈다. 이는 시험된 모든 균주들에서 zea^-와 aur^-돌연변이들은 GZ3639 게놈과 연관되어 있는 PKS 유전자들의 목표된 제거에 의한 것임을 나타낸다. 유전자 기능을 확인하기 위해 이러한 유전적 분석들을 각 유전자의 완전한 사본을 이용하는 상보성 분석(complementation analyses)의 대안으로 사용할 수 있다.

5. PKS 유전자들의 발현형태

이전에 보고(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113)된 대로, SG 액체배양에서 야생형 균주인 GZ3639의 지랄레논 합성에 요구되는 두 개의 PKS 유전자들(PKS4와 PKS13)의 발현형태는 지랄레논 생산형태와는 달랐다. PKS4와 PKS13 둘 다의 전사체는 6일째의 RNA 블랏에서 처음으로 검출되었고 9일째 증가되었고 12일째 사라졌다(도 5). 그러나 지랄레논은 3일째 처음으로 검출되었고 12일째까지 점차적으로 증가되었다(도 3). 하지만 ΔPKS12 균주에서 PKS 전사체들은 GZ3639보다 빠른 3일째 처음으로 검출되었고, 각 PKS 전사체의 띠세기(band intensity)도 더 강하게 보여졌다(도 5). 이는 PKS12 유전자의 제거가 전사체 수준에서 지랄레논 생산의 조절과 연관되어 있다는 것을 의미한다. 이전에 보고(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113)된 대로, ΔPKS4에서 PKS13의 전사체 수준은 GZ3639와 비교하여 크게 감소되었다. 지랄레논 PKS 유전자의 경우와는 다르게, PKS12의 전사형태는 GZ3639와 ΔPKS4 균주 사이에서 서로 다르지 않았고 GZ3639에서 오로푸사린 축적형태와 서로 연관된 것처럼 보였다. PKS12의 발현은 접종 후 12일째 최고 수준에 도달했고, 같은 시간에 오로푸사린도 크게 축적되었다(도 3, 5). PKS4와 PKS12 전사체들은 충분한 배양기간 동안에도 ΔPKS4나 ΔPKS12 균주나 ΔPKS4::ΔPKS12 균주에서 검출되지 않았다. 이는 각 PKS 유전자의 제거가 형질전환 균주들에서 성공적으로 일어났음을 나타낸다. 흥미롭게도 ΔPKS4 균주에서 감소되었던 PKS13의 전사체 수준이 ΔPKS4::ΔPKS12 균주에서는 야생형균주 수준으로 회복되었다(도 5). PKS4와 PKS13 전사체 모두 오로푸사린 과생산 균주에서는 검출되지 않았다(데이타 보이지 않음).

본 발명에 따른 지랄레논 대량 생산균주[KCCM 10794P]는 종래의 균주보다 2-3배까지의 지랄레논을 생산하였다. 또한, 상기 균주를 이용한 액체 또는 고체배양을 통한 지랄레논 대량 생산방법은 저비용, 고효율적으로 지랄레논를 생산할 수 있다.

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Claims

지랄레논을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)[KCCM 10794P].
보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)의 오로푸사린 생합성 경로를 차단하는 것을 특징으로 하는 지랄레논 생산증가방법.
제 2 항에 있어서, 상기 오로푸사린 생합성 경로를 차단하는 방법은 PKS12 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 지랄레논 생산증가방법.
제 1 항의 균주를 고체배양하여 지랄레논를 생산하는 것을 특징으로 하는 지랄레논 대량 생산방법.