KR100326769B1

KR100326769B1 - 티-2독소의항체를생산하는방법

Info

Publication number: KR100326769B1
Application number: KR1019980040517A
Authority: KR
Inventors: 윤화중
Original assignee: 윤화중
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2002-09-25
Also published as: KR20000021426A

Abstract

본 발명은 T-2 독소에 이종 단백질을 결합시켜 T-2 단백질 접합체를 얻고, 상기 T-2 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물로부터 항체를 수집하는 것을 특징으로 하는 T-2 항체의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 T-2 독소에 대한 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 이들 항체를 이용하여 T-2 독소를 정성적으로 그리고 정량적으로 검출함으로써 곡물이나 사료에 포함되어 인체나 가축에 유해한 T-2 독소를 분석할 수 있다.

Description

티-2 독소의 항체를 생산하는 방법

본 발명은 T-2 독소의 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 T-2 독소를 동물에 투여하여 생산된 항체를 수집하는 T-2 독소의 생산방법에 관한 것이다.

곡물이나 사료를 유통시키거나 보관하는 등 장기간 저장을 하는 경우에는 미생물이 번식하여 곡물이나 사료가 변질되거나 부패하기 쉬우며, 특히 곰팡이가 발생하는 경우에는 동물에 유해한 물질이 생성되는 것으로 보고되고 있다. 곰팡이가 배출하는 독소 중에서 마이코톡신(mycotoxin)의 일종인 티-2 독소(T-2 toxin)는 강한 독성을 나타내므로, 이들 독소에 대한 관심이 높아지고 있다. 주지하고 있는 바와 같이, 티-2 독소의 균주는 푸자리움 로제움(fusarium roseum)외 수종이 있다. 티-2 독소의 어원은 처음에 미국의 위스콘신(Wisconsin)대학에서 곰팡이가 난 옥수수에서 분리된 푸자리움 트라이싱툼(fusarium tricinctum) 티-2 균주가 생산한 독성성분이 추출분리되었으며, 그 독소를 생산한 균주의 이름을 따서 티-2 독소라 명명하였다. 티-2 독소의 성상은 백상침상결정체로 151∼152℃에서 용해되며, 쥐에 대한 독성은 경구투여시에 LD50이 4mg/kg이다.

동물용 사료에서 발생하는 T-2 독소는 무백증(aleukia)을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 사람이나 동물이 섭취하였을 때 식품이나 사료 1g 당 미크로 그램 또는 나노 그램의 양으로도 독성을 일으키는 맹독성을 나타낸다. T-2 독소 등 다른 마이코톡신의 화학적 및 독성학적 효과에 대해서는 자세히 연구되었지만, T-2 독소 자체에 대한 연구는 분석 방법의 적용상의 문제로 인해 진전되지 못하였다.

일반적으로, T-2 독소는 박막 크로마토그래피 또는 가스 크로마토그래피에 의해 검출될 수 있다. 그러나, 박막 크로마토그래피의 검출한계는 0.05㎍ 에 불과하며, 가스 크로마토그래피, 질량 스펙트로스코피 및 GC-MSD는 0.02 내지 0.03㎍의 T-2 독소를 검출하는 것으로 보고되고 있다. 이들 방법은 시간이 많이 걸리고 고가이며 과정이 복잡할 뿐만 아니라, 나노그램 정도의 양으로도 생물 독성을 유발하는 이 독소의 맹독성에 비추어 볼 때 이러한 분석 기법은 충분한 검출도구가 될 수 없음이 명백하며, 따라서 실용적이고 실효적인 분석 방법이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 T-2 독소에 대한 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, T-2 독소의 항체를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 T-2 독소을 포함한 재료로부터 그것을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 T-2 독소의 MCA 단계적 희석에 따른 450nm에서의 흡광도의 결과를 보인 그래프.

도 2는 T-2 독소 농도와 450nm 에서의 흡광도의 결과를 보인 그래프.

본 발명에 따라서, T-2 독소에 이종 단백질을 결합시켜 T-2 단백질 접합체를 얻고, 상기 T-2 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물로부터 항체를 수집하는 것을 특징으로 하는 T-2 항체의 생산방법이 제공된다.

T-2 독소에 이종 단백질로서 소의 혈청 알부민을 결합시켜서 접합체를 형성하는 것이 바람직하다. T-2 독소와 BSA의 결합을 위해 먼저 T-2에 헤미 숙시네이트(T-2 HS)를 제조하고, 여기에 BSA를 결합시킨다.

얻어진 T-2HS-BSA를 동물, 바람직하게는 쥐에 투여하여 항체의 생성을 유도하고, 일정한 기간이 지난 후에 쥐의 혈청으로부터 항체를 수집한다.

본 발명의 다른 양상으로, T-2 독소에 이종 단백질을 결합시켜 T-2 단백질 접합체를 얻고, 상기 T-2 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물로부터 항체를 수집하고, 상기 동물의 T-2 항체를 생산하는 세포와 모노 클론을 생산하는 종양 세포를 융합시키고, 융합된 세포를 동물에 투여하여 T-2 모노클론 항체를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 T-2 항체의 대량 생산방법이 제공된다.

동물에 T-2와 단백질 접합체를 투여하여 그 혈청으로부터 T-2 항체를 검출할 수 있으나, 항체를 산업적으로 이용하기 위해서는 대량 생산이 필요하다. 따라서,T-2-단백질 접합체를 투여한 동물에서 항체를 생산하는 세포를 분리한 후 이를 모노클론 종양세포(myeloma cell)에 융합을 시킨다.

융합된 세포를 다시 동물에 투여한 후 복수와 같은 체액을 수집하여 T-2 항체를 대량으로 생산한다.

본 발명의 또다른 양상으로, 플레이트를 모노클로날 안티-Ig 항체로 코팅하고, T-2의 모노클론 항체를 상기 플레이트에 첨가하여 반응시키고, 상기 플레이트를 세척한 후 T-2 독소를 포함하는 재료를 투입하여 반응시키고, 상기 플레이트를 세척하여 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 하는 T-2 독소의 검출방법이 제공된다.

T-2 독소는 곡물이나 사료 등에 분포하는 곰팡이로부터 배출되므로, 이들 곡물이나 사료에 독소가 함유되었는지를 정성적으로 검출할 필요가 있다. 또한, 이들 독소가 포함된 경우에는 허용 기준치를 초과하는지를 판단하기 위하여 정량적으로 독소를 측정하여야 한다.

본 발명에 따라서, 플레이트에 모노클로날 안티-Ig 항체를 먼저 코팅한 후 이 코팅면에 다시 앞에서 얻어진 T-2의 모노클론 항체를 상기 플레이트에 첨가하여 반응시킨다. 이 반응에 의해 코팅면에 T-2 모노클론 항체가 결합된다.

여기에, T-2 독소가 함유된 것으로 의심되는 재료(곡물이나 사료)를 미세한 분말 형태로 가하여 반응시킴으로써 항원-항체의 결합에 의해 T-2 독소가 플레이트에 결합된다. 이렇게 결합된 T-2 독소를 흡광 분석에 의해 검출한다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 이 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. T-2 HS-BSA 접합체의 제조

50㎎의 T-2 독소(Sigma chemicals)를 2㎖의 피리딘(Sigma chemicals)과 보르텍스(vortex)로 2분간 혼합하고, 계속해서 1,000㎎의 숙신 무수물과 보르텍스로 5분간 혼합하였다. 이것을 진탕 배양기에서 60℃로 2일간 반응시킨 후, 이 용액에 증류수를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응액에 다시 1,000㎎의 클로르포름을 첨가하고 5분간 보르텍스로 혼합한 후, 용액이 깨끗해질 때까지 HCl을 적가하였다. 바닥의 클로르포름층을 수집하여 후드에서 공기 건조함으로써, T-2 헤미숙시네이트 접합체(T-2 HS)를 제조하였다.

얻어진 T-2 HS 15㎎에 1.5 ㎖의 디메틸포름아미드(DMF, Sigma Chemicals)를 넣은 용액을 보르텍스로 10분간 혼합한 후 완전히 용해될 때까지 소니케이터(Branson ultrasonics Co. U.S.A.)로 10분간 초음파 처리하였다. BSA(fatty acid free bovine serum albumin) 40㎎을 0.01M 인산 완충 0.9% 식염수에 10㎎/㎖의 비율로 넣고, 여기에 1-에틸-3-(3-디-아미노프로필)카르보디이미드(EDPC, Sigma Chemicals)를 넣은 후 보르텍스로 2분간 혼합하였다.

이렇게 얻어진 BSA 용액을 상기 T-2 HS 용액에 한방울씩 적가하고 보르텍스로 5분간 혼합한 후, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 10분간 원심분리(×600g)하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 T-2 HS-BSA 용액을 2ℓ의 탈이온수로 4℃에서 3일간 투석하였다. 탈이온수는 12시간마다 교환하였다. 투석후용액을 2일간 동결건조하여 냉동고에 -70℃로 저장하였다.

2. T-2 HS-HRP의 제조

BSA 대신에 HRP(horse raddish peroxidase, Sigma Chemicals)를 사용한 것을 제외하고는 상기 T-2 HS-BSA를 제조한 방법과 동일한 방법으로 T-2 HS-HRP를 제조하였다.

3. 면역 및 세포 융합

T-2 HS-BSA 접합체(살린 용액) 1㎎/㎖를 1차 면역을 위해 1㎖의 프로인드 완전보조액(Freund-complete-adjuvant)에 유화시킨 후, 재면역을 위해 부스터(booster)로서 4주 후에 1㎖의 프로인드 완전보조액에 유화시켰다. 8주령의 Balb/C 암컷 생쥐 3마리(한국유전공학연구소에서 입수)에 대해 보조액 0.3㎖ 중의 항원 150㎍을 0.2㎖는 피하주사로, 0.1㎖는 복강내 주사로 투여하여 1차 면역시켰다.

4주 후에 0.3㎖의 불완전 보조액에 유화된 항원 150㎍으로 추가로 생쥐들을 피하 주사하여 재면역시켰다. 쥐의 안저 정맥으로부터 100㎕씩 혈청을 수집하여 항체 역가를 위해 직접 ELISA(direct ELISA)로 스크린하였다. 이들을 1차 면역된 항체와 비교하였다. 가장 높은 역가를 가진 생쥐에게 마지막 부스터를 위해 불완전 보조액 0.3㎖에 유화된 항원 150㎍을 투여하였다.

최종적으로 항원을 주사한 후 3일째 되는 날 가장 높은 역가를 지닌 생쥐를 경구 탈구로 희생시킨 후 비장을 분리하였다. DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) 배지 중의 비장 세포의 단일 세포 현탁액과 적절한 수의 비장 세포를 15ℓ 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포들을 22℃에서 5분간 원심분리(×600g)하고 5㎖ DMEM 배지에 재현탁시켰다. 미엘로마 세포(SP2/O-Ag 14 mouse myeloma cell line, ATCC)를 1 미엘로마 세포/2 비장 세포의 비율로 DMEM 배지중의 미엘로마 세포에 첨가하고, 세포의 혼합물을 다시 5분간 원심분리하였다(×600g). DMEM 배지에 50% PEG 1500(polyethylene glycol) 0.5㎖를 37℃에서 2분간 첨가하고 22℃에서 10분간 조용히 진탕하여 융합을 시행하였다. 융합된 세포의 농도는 HAT 배지(hypoxanthin aminoprotein thymidine, Gibco) ㎖당 10⁶세포수로 희석하고, IRC 쥐에서 채취한 복강내 대식 세포인 피더 셀(feeder cell, 4×10/㎖)이 깔린 96-웰 피더 플레이트로 옮겼다.

4. 항체-생산 클론을 위한 간접 ELIZA 스크리닝

세포융합 2주 후에 항체 생산을 확인하기 위해 플레이트를 스크린하였다. 각각의 셀라인(cell line)에 대해 T-2HS-BSA로 코팅된 96-웰 플레이트에서 간접 ELIZA로 시험하였다.

플레이트들은 4℃에서 하루밤 방치하여 코팅한 후, 인산-완충 살린-Tween(PBST)으로 5회 세척하여 비결합 입자들을 제거하였다. 1% BSA의 PBS 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 블로킹하였다. 세척 후에, 배양된 셀라인의 상층액 50㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에 플레이트들을 세척하고, 항체 1 대 PBS 1000의 비율로 희석된 고트 안티-마우스 페록시다제-표지IgG(goat anti-mouse peroxidase-labled IgG) 50㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 다시 37℃에서 2시간 배양한 후에, 플레이트들을 세척하고 기질 용액중의 OPD(O-nitrophenyl diamine, Sigma Chemicals) 50㎍을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 20분 반응 후에 450nm에서 색깔을 판독하였다. 양성 반응을 보인 클론을 같은 방법으로 재시험하였다. 계속해서 T-2 HS-BSA에 대해 양성을 나타낸 셀라인 및 BSA에 대해 음성을 나타낸 셀라인을 동일한 방법으로 재시험하였다.

5. 복수 생산

항체의 대량 생산을 위하여 Balb/c 생쥐(한국유전공학연구소)에 프로인드 불완전 보조액 0.5㎖를 복강내 주사하고, PBS 5㎖중의 1×10⁷/㎖ 하이브리도마 세포를 Balb/c 생쥐의 복강내로 주사하였다. 임신한 것처럼 복강이 종창된 쥐로부터 복수를 수집하였다. 수집된 복수를 φ0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

6. 모노클로날 항체의 아이소티핑

모노클로날 항체의 아이소티핑(isotyping)을 위해서 이뮤토셀렉트(Gibco, Cat, No. 9660SA, Monoclonal Antibody based isotyping system for mouse immunoglobulin)를 사용하였다. 코팅 버퍼(Nuc. maxisorp)중의 모노클로날 랫 (rat) 안티마우스 Ig 항체 0.1㎖를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 웰들을 PBS/Tween 20으로 5회 세척하고 하이브리도마 세포의 상층액을 웰에 0.1㎖씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰들을 PBS/Tween으로 5회 세척하고, 폴리클로날 랫 안티-마우스 Ig-알칼라인 포스페이트 0.1㎖를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후에 웰들을 PBS/Tween 20으로 5회 세척하고, 기질(pNPP)을 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. ELISA 리더(Bio-Tec instrument, EL311)로 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

7. 다이렉트 컴피티티프 ELISA

생성된 항체에 대한 T-2 독소의 전형적인 다이렉트 컴피티티브 ELISA 스탠더드 커브의 범위는 60ng에서 6㎍ 사이였다.

8. 특이성 측정

아세틸 T-2, HT-2, T-2HS 및 T-2 트리올에 대해 항 T-2 모노클로날 항체의 크로스 반응(crossreaction)을 측정하였다.

9. T-2 독소의 회수

옥수수 미세분말 5g에 순수한 T-2 독소 10 내지 2,000ng을 추출 하루 전에 첨가하였다. 1일 후에, 샘플을 추출 용매(89부의 아세토니트릴, 10부의 0.5% KCl 및 1부의 1% H₂SO₄) 20㎖를 1시간 동안 진탕하였다. 추출물을 방치하여 침전시키고 100㎕ 알리컷(aliquot)을 PBS-Tween으로 1:25 또는 1:50으로 희석한 후, 다이렉트 컴피티티브(direct competitive) ELISA로 분석하였다.

10. 결과

특이성이 높은 하이브리도마 세포의 상층액을 단계적으로 희석한 항원-항체의 반응의 결과는 도 1과 같다.

특이성이 높은 하이브리도마 세포를 주입한 쥐의 복수도 indirect ELISA로 검사한 결과 질이 좋게 나타났다. 도 2에서 T-2 독소의 다이렉트 컴피티티브 ELISA 스탠더드 커브의 반응 범위는 60ng 내지 6㎍ 사이였고, T-2 독소 농도의 50% 저해치(inhibition value)는 625ng으로 나타났다.

모노클로날 항체의 아이소티핑은 IgG와 κ-형 경쇄(κ-type light chain로 이루어졌다. 특이성 결정을 위한 항T-2의 크로스 반응은 표 1과 같다. T-2 HS 및 아세틸 T-2는 같았고 HT-2 및 T-2 트리올은 상이하였다.

[표 1]

다른 트리코테센에 대한 크로스 반응

T-2 독소가 첨가된 옥수수 분말에서 T-2 독소의 회수의 결과는 83%로 나타났다(표 2 참조).

[표 2]

옥수수에 첨가된 T-2 독소의 회수

이상 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 곡물이나 사료에 포함되어 인체나 가축에 유해한 T-2 독소에 대한 항체를 생산할 수 있다. 또한, 이 항체를 이용하여 항원-항체의 결합반응을 이용하여 T-2 독소를 정성적으로 그리고 정량적으로 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 검출방법은 나도 그램 단위의 극미량의 T-2 독소도 검출할 수 있기 때문에, 기존의 분석방법으로 검출할 수 없었던 T-2 독소를 검출할 수 있다는 장점이 있다.

Claims

T-2 독소에 이종 단백질을 결합시켜 T-2 단백질 접합체를 얻고,

상기 T-2 단백질 접합체를 동물에 투여하고,

상기 동물로부터 항체를 수집하는 것을 특징으로 하는 T-2 항체의 생산방법.
T-2 독소에 이종 단백질을 결합시켜 T-2 단백질 접합체를 얻고,

상기 T-2 단백질 접합체를 동물에 투여하고,

상기 동물로부터 항체를 수집하고,

상기 동물의 T-2 항체를 생산하는 세포와 모노 클론을 생산하는 종양 세포를 융합시키고,

융합된 세포를 동물에 투여하여 T-2 모노클론 항체를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 T-2 항체의 대량 생산방법.
플레이트를 모노클로날 안티-Ig 항체로 코팅하고,

T-2의 모노클론 항체를 상기 플레이트에 첨가하여 반응시키고,

상기 플레이트를 세척한 후 T-2 독소를 포함하는 재료를 투입하여 반응시키고,

상기 플레이트를 세척하여 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 하는 T-2 독소의 검출방법.