KR100777231B1

KR100777231B1 - β-지랄레놀 대량 생산균주[ＫＣＣＭ 10795Ｐ] 및 이를이용한 β-지랄레놀 생산방법

Info

Publication number: KR100777231B1
Application number: KR1020060119227A
Authority: KR
Inventors: 이인원; 이예련; 윤성환
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2007-11-28

Abstract

본 발명은 β-지랄레놀 대량 생산균주[KCCM 10795P] 및 이를 이용한 β-지랄레놀 생산방법에 관한 것으로서, β-지랄레놀을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)과 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)의 지랄레논의 생산경로 중 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 β-지랄레놀 생산증가 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 균주를 고체배양하여 β-지랄레놀을 생산하는 β-지랄레놀 대량 생산방법에 관한 것이다.

β-지랄레놀, 보리 붉은 곰팡이균, ZEB1, ZEB2

Description

β-지랄레놀 대량 생산균주[ＫＣＣＭ 10795Ｐ] 및 이를 이용한 β-지랄레놀 생산방법{Zeralenol Overproducing Microorganism and Methods of Zeralenol Overproduction By Using It}

도 1은 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)에서 ZEB1 제거 균주 GZ3639의 게놈으로부터 ZEB2를 과발현 시키기 위한 방법을 나타낸다. (A) E: EcoRI; β-튜브린(β-tubulin), 보리 붉은 곰팡이의 β-튜브린(β-tubulin) 유전자; ZEB2, ZEB2 ORF; gen, 제네티신(geneticin) 내성 유전자; amp, 앰피실린(ampicillin) 내성 유전자. (B) 과발현된 균주의 제노믹 DNA를 EcoRI으로 처리하여 만든 젤 블랏(gel blot). DNA 젤 블랏 하이브리다이제이션을 위하여 ZEB2 ORF의 일부분과 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터 지역의 일부분을 탐침으로 사용하였다. WT, 야생형균주(GZ3639); ODZ1-Z2, ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 균주; ODZ1-ect, 다른 위치에 형질전환 벡터를 가지고 있는 형질전환체. 람다(lambda) DNA 표준의 크기를 블랏의 왼쪽에 나타냈다. (C) PDA 배지에서 6일간 키운 균주 사진이다.

도 2는 개량된 CM 배지에서 배양한 GZ3639와 ODZ1-Z2균주의 균사량을 나타낸다. 결과는 세번 반복의 평균± 표준편차로 표현한다. WT, 야생형균주(GZ3639); ODZ1-Z2, ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 균주.

도 3은 PDA 배지(A)와 당근 배지(B)에서 측정한 두 균주의 성장 속도를 나타낸다. WT, 야생형균주(GZ3639); ODZ1-Z2, ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 균주.

도 4는 개량된 CM 배지(A)와 밀 기질(B)에서 야생형 균주와 ZEB2 과발현 균주들의 β- 지랄레놀(β-ZOL) 생산에 대한 시간 추이를 나타낸다. 결과는 세 번 반복의 평균± 표준편차로 표현한다. WT, 야생형균주(GZ3639); ODZ1-Z2, ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 균주.

도 5는 개량된 CM 배지에서 배양한 GZ3639균주와 ODZ1-Z2균주에서 3, 5, 7일째의 RNA 젤 블랏을 나타낸다. 각각의 탐침은 PKS13, PKS4, ZEB2이며 각각의 블랏 위에 나타냈다. 블랏팅 전에 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 아가로스 젤들은 왼쪽 패널에 나타냈다. WT, 야생형균주(GZ3639); ODZ1-Z2, ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 균주.

보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)(불완전세대: 푸자리움 그래미네아럼(Fusarium graminearum))은 지리적으로 광범위하게 분포하는 자낭균의 곰팡이로서 옥수수, 밀, 쌀과 같은 잡곡에 심각한 질병을 유발한다(McMullen, M. et al, Plant Dis., 81(1997) 1340-1348). 이 곰팡이들은 마이코톡신, 항생제, 색소들을 포함하는 다양한 범위의 2차 대사산물들을 생산한다(Marasas, W. F. O. et al, Toxigenic Fusarium Species; Identity and Mycotoxicology, The Pennsylvania State University Press(1984), Medentsev, A. G. et al, Phytochemistry, 47(1998) 935-959, Nelson, P. E. et al, Fusarium species-An Illustrated Mannual for Identification, The Pennsylvania State University Press(1983)).

이 대사산물들 중에서 지랄레논(zearalenone; ZEA)은 푸자리움(Fusarium)에 감염된 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수를 섭취한 돼지들에게 발정 장애를 유발시킨다(Mirocha, C. J. et al, Mycotoxins, (1974) 129-148). 많은 나라들에서 데옥시니발레놀(deoxynivalenol), 니발레놀(nivalenol), 트리코테센(trichothecene) 마이코톡신과 더불어 지랄레논의 발생은 G. zeae에 의해 감염된 곡물에 흔하게 일어난다(Tanaka, T. et al, J Agric Food Chem, 36(1988) 979-983). 또한 지날레논은 옥수수 가루, 콘 플레이크, 콘 포리지, 맥주를 포함하여 인간 소비를 위해 만들어진 식품들에서도 자연적으로 생성된다고 알려져 왔다(Marasas, W. F. O. et al, Toxigenic Fusarium Species; Identity and Mycotoxicology, The Pennsylvania State University Press(1984)).

지랄레놀(zearalenol; ZOL)을 포함하는 지랄레논과 그 파생물은 1′- 2′더블 본드(double bond)에서 모두 트랜스-배열(trans-configuration)이다. 지랄레논의 활성은 6´ -케톤의 변형에 의해 영향을 미치고, 1′- 2′더블 본드(double bond)는 활성을 높인다. α-지랄레놀(α-ZOL)은 지랄레논보다 3-4배정도 발정을 촉진한다. 그러나 β-지랄레놀(β-ZOL)의 발정효과는 지랄레논과 같거나 약간 적다(Hagler, W. M. et al, Appl Environ Microbiol, 37(1979) 849-853). 시스-이성체들(cis-isomers)은 강렬한 UV 광선을 사용한 트랜스-이성체(trans-isomer)의 투사(irradiation)에 의해 실험실에서 생산된다(Mirocha, C. J. et al, Appl Environ Microbiol, 35(1978) 986-987). 이 변형의 결과로 생성된 지라놀(Zeranol)이라고 불리는 파생물은 소의 성장촉진제로 사용된다(Ralgro; Pitman-Moore, Terre Haute, IN, USA). 더구나 동물에서의 호르몬 유사 활성을 가진 지랄레논은 G. zeae에서 유성생식의 조절에도 관여한다(Wolf, J. C. et al, Can J Microbiol, 19(1973) 725-734).

지랄레논은 보리 붉은 곰팡이균에서 폴리케타이드 합성효소(polyketide synthases; PKS) 유전자들로 암호화 된 PKS에 의해 합성된다. 총 16개로 추정되는 PKS 유전자들이 보리 붉은 곰팡이균 게놈에서 밝혀졌다(Kroken, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2003) 15670-15675). 보리 붉은 곰팡이균에서 목표 PKS 유전자들을 제거하는 방법을 사용함으로써, 최근에 연구자들은 지랄레논 생합성에 PKS4와 PKS13이 필요하다는 것을 알아냈다(Gaffoor, I. et al, Eukaryotic Cell, 4(2005) 1926-1933, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol., 58(2005) 1102-1113).

또한 지랄레논의 생합성에는 이소아밀 알코올 옥시다아제(isoamyl alcohol oxidase) 유전자와 높은 유사성을 보이는 지랄레논 생합성 유전자 1 (zearalenone biosynthesis gene 1; ZEB1)과 기본 지역(basic region) 류신 지퍼(leucine zipper)의 보존된 도메인을 갖는 지랄레논 생합성 유전자 2 (zearalenone biosynthesis gene 2; ZEB2)가 필요하다. ZEB1은 생합성 경로에서 β-지랄레놀(β-zearalenol; β-ZOL)을 지랄레논(ZEA)으로 화학적 전환하는데 필요하고 ZEB2는 클러스터 멤버의 전사를 조절한다. 이 유전자들의 전사는 영양 결핍이나 주위 pH 같은 다른 배양 조건에 따라서 강하게 영향을 받는다. 더구나 PKS13이나 PKS4가 제거된 유전자 도입 G. zeae 균주에서 ZEB2에 의해 조절되는 유전자 세트들은 극적으로 감소한다. 하지만 ZEB1 제거 균주에서는 그렇지 않다. 이는 G. zeae 균주에서 지랄레논(ZEA)이나 β-지랄레놀(β-ZOL)이 지랄레논 생합성에 필요한 유전자 클러스터의 전사 활성에 관여한다는 것을 나타낸다.

한국특허등록번호 10-0444124-0000호 (출원일: 2001.8.16)는 곰팡이 독소생성을 저해하는 조성물에 관한 것으로, 결명자 추출물을 포함하는 곰팡이 독소생성 저해용 조성물을 개시하고 있다. 또한 알리자린(Alizarin), 크리소파닌산(Chrysophanic acid), 단손(Danthron), 푸푸린(Purpurin) 및 퀴니자린(Quinizarin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 포함하는 곰팡이 독소생성 저해용 조성물에 대하여 개시하고 있다.

한국특허등록번호 10-0287382-0000호 (출원일: 1998.11.30)에서는 지랄레논에 이종 단백질을 결합시켜 지랄레논 단백질 접합체를 얻고, 상기 지랄레논 단백질 접합체를 동물에 투여하고, 상기 동물에서 생성된 항체를 회수하는 지랄레논 항체의 생산방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나, 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)를 이용하여, 지랄레논를 대량으로 생산하는 방법에 대한 언급이 없다.

지랄레놀은 지랄레놀 특이적 항체의 생산에 사용이 되고 있으며, 1g에 59,000,000원에 판매되고 있다(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/produ ctDetail/SIGMA/Z0166; 2006년 11월 22일접속). 따라서, 경제적인 방법으로 지랄레논을 대량생산하는 방법이 요구되고 있다. 본 발명자는 지랄레논의 생산경로 중 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현시켜서, β-지랄레놀이 대량생산되어지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

β-지랄레놀을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)[KCCM10795P]을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 β-지랄레놀을 대량생산하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위하여 본 발명은 β-지랄레놀을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae) [KCCM 10795P, 한국미생물보존센터(KCCM), 2006년 11월 22일]을 제공한다. β-지랄레놀을 대량 생산하는 균주는 데옥시니발레놀(deoxynivalenol; DON)과 지랄레논(zearalenone; ZEA)를 생산하는 GZ3639 보리 붉은 곰팡이 야생형 균주(O'Donnell, K. H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2000) 7905-7910)로부터 제조되었다. β-지랄레놀 생산을 위해서, 균주들의 기균사체(aerial mycelia)를 25ml의 개량된 CM 액체배지에 배양하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113). 또한 250ml 삼각플라스크에 밀 기질(wheat substrate)(30g)을 β-지랄레놀 생산을 위한 고체 배지로서 사용하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58(2005) 1102-1113).

본 발명에 따른 ODZ1-Z2 균주는 개량된 CM 액체 배지에서 GZ3639 보다 β-지랄레놀의 생산성을 증가시켰다. 더구나 ODZ1-Z2 균주에서의 향상된 β-지랄레놀 생산은 또한 밀 기질에서도 일어났다. 이는 ODZ1-Z2 균주에서 고체 밀 기질 배지가 개량된 CM 배지보다 β-지랄레놀을 더 많이 생산할 수 있음을 나타냈다(도 4).

ODZ1-Z2 균주는 GZ3639와 동일하게 격막을 갖는 사상형 자낭균으로 약간 살구색을 띄는 형태적 특성을 지니며 일반적으로 25 ℃, pH 5.6 정도의 약산성 조건에서 잘 자란다. ODZ1-Z2는 100ml의 개량된 CM 배지(NaNO3 2g, Sucrose 30g, KH2PO4 1g, MgSO4˙7H20 0.5g, KCl 0.5g, D.W)에 PDA에서 배양한 균사를 접종하고, 25℃, 150rpm에서 7일 동안 배양했을 때 약 35ppm의 b-ZOL을 검출할 수 있었다.또한 ODZ1-Z2 균주는 2006년 11월 22일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM 10795P로 균주기탁되었다.

본 발명의 제 2의 양태는 지랄레논 생산경로 중 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 β-지랄레놀을 대량생산하는 방법을 제공한다. ZEB1을 제거하는 방법은 생합성 유전자를 결실시키는 방법, 생합성 유전자의 안티센스 RNA를 이용하여 전사를 억제하는 방법, 생합성 유전자를 트랜스포존을 이용하여 녹아웃(knock-out)시키는 방법, 단백질의 활성을 억제시키는 억제제를 처리하는 방법이 이용될 수 있다. ZEB2를 과발현시키는 방법은 발현벡터를 사용하여 유전자를 멀티카피(multicopy)로 존재하게 하여 과발현시키는 방법, 염색체 삽입(chromosomal integration)을 통한 과발현 방법이 이용될 수 있다. 보다 상세하게는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)의 ZEB1 유전자를 결실시키고 ZEB2 유전자를 과발현 시키는 것을 특징으로 하는 β-지랄레놀 생산증가방법을 제공한다. 유전자를 결실시키는 방법은 유전자 재조합 방법을 사용하여 유전자를 결실시켰고 유전자를 과발현시키는 방법은 염색체 삽입(chromosomal integration)을 통한 과발현 방법을 사용하였다.

지랄레논은 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)(불완전세대: 푸자리움 그래미네아럼(Fusarium graminearum)) 이외에 여러 푸자리움 종에서 생산이 된다. 켄지 등은 F. roseum, F. tricinctum, F. lateritium 등에서 생산이 된다고 보고하였다(Kenji Shii et al, Applied Microbiology, Vol. 27, pp. 625-628). β-지랄레놀은 지랄레논의 생합성 과정 중에 생성되는 파생물이다. 따라서 지랄레논 생산경로 중 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현시켜, β-지랄레놀을 생산하는 방법은 상기 푸자리움 종에 모두 적용 가능할 것이다.

β-지랄레놀 생산 배양은 액체 배양 또는 고체배양 모두가 이용될 수 있다. 액체 배양 배지는 개량된 CM(CM modified media), 고체배양 배지는 밀 배지(wheat media)을 이용할 수 있다. 액체배지를 이용하였을 경우보다 고체배지에서 더 효과적으로 β-지랄레놀이 생산되었다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 형질전환 보리 붉은 곰팡이 균주들에서의 β-지랄레놀 대량생산

지랄레논의 생산경로 중 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현시키고, 이 균주의 배양을 통해서 β-지랄레놀을 대량생산하는 방법을 나타낸다.

균주 및 배지

GZ3639 균주를 데옥시니발레놀(deoxynivalenol; DON)과 지랄레논(zearalenone; ZEA)를 생산하는 보리 붉은 곰팡이 야생형 균주로 사용하였다(O'Donnell, K. H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2000) 7905-7910). 보리 붉은 곰팡이 균주 ODZ1-Z2와 ODZ1-ect는 GZ3639로부터 파생되었다. 전자는 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 균주이고, 후자는 다른 위치에 형질전환 벡터를 가지고 있는 형질전환체이다. DNA 분리를 위해서, 곰팡이 균주들을 3일 동안 25℃, 150rpm의 회전식 진탕 배양기에서 30ml의 완전배지(complete medium; CM)가 포함된 250ml 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)로 배양하였다(Correll, J. C. et al, Phytopathology 77(1987) 1640-1646). 총 RNA 추출과 β-지랄레놀 생산을 위해서, 균주들의 기균사체(aerial mycelia)를 25ml의 개량된 CM 액체배지에 배양하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113).

β-지랄레놀 생산을 관찰하기 위해서, 곰팡이 균주들을 포테이토-덱스트로즈 아가(potato-dextrose agar; PDA)(Difco Laboratories, Detroit, MI, U.S.A.), 개량된 CM 배지 및 당근 배지(carrot agar)에 25℃, 암소에서 배양하였다. 또한 250ml 삼각플라스크에 밀 기질(wheat substrate)(30g)을 β-지랄레놀 생산을 위한 고체 배지로서 사용하였다(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58(2005) 1102-1113).

핵산 조작

곰팡이 제노믹 DNA(genomic DNA)와 플라스미드 DNA(plasmid DNAs)들을 이전에 보고된 대로 추출하였다(Kereyi, Z. et al, Appl. Environ. Microbiol. 65(1999) 4071-4076). 1ml의 트리졸 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)을 사용하여 액체질소에 의해 갈려진 균사체(0.1g)로부터 총 RNA를 제조회사의 사용설명서에 따라 추출하였다. 제한효소처리, 라이게이션(ligation), 아가로스 젤 전기영동, 젤 블랏팅(gel blotting)으로 표준 절차들을 진행하였다(Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). P³²로 표지된 탐침을 DNA, RNA 젤 블랏 하이브리다이제이션(gel blot hybridization)에 사용하였다. PCR 프라이머를 바이오니아 올리고뉴클레오티드 합성팀으로부터 확보하였다(Bioneer Co., Chungwon, Korea).

더블 조인트 PCR (Double-Joint PCR)과 곰팡이의 형질전환

보리 붉은 곰팡이 균주 ZEB1의 유전자 5'과 3' 측면부위에 위치한 DNA 염기서열 상동성에 따라 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자(hygB)를 가지게 된 형질전환 DNA 단편은 보완된 더블 조인트 PCR (Double-Joint PCR; DJ PCR)을 사용하여 증폭되었다(Yu, J.-H. et al, Fungal Genet. Biol. 41(2004) 973-981).

β-튜브린(β-tubulin) 프로모터 부분을 증폭하기 위해 bpro-5 (5′-CGAAGC CGACGACGAACA-3′)(서열번호 1) / bpro3 (5′-ATTGACGGCTGTAGATGTAAT-3′)(서열번호 2)를 사용하였고 ZEB2 ORF를 증폭하기 위해 ZEB2 OEX-2 5R (5′-CATTACATCTACA GCCGTCAATAACGGCCGTGACCTTAATTCA-3′)(서열번호 3) / IAO-N-5'F ( 5′-CGTTTGATTC CCCGCAGTGT-3′)(서열번호 4)을 사용하였고, 융합 산물을 위해 네스티드 PCR (nested PCR) 프라이머 쌍(IAO 3'F (5′-GGAAGAATGTGCAAGTCAGC-3′)(서열번호 5) / bpro/5' (5′-CGAAGCCGACGACGAACA-3′)(서열번호 6))을 사용하였다. 그 결과, 각각 2.1kb와 1.2kb의 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터와 ZEB2 ORF를 얻었고, 이를 융합하여 3.3kb의 PCR 산물을 얻었다. 이 PCR 산물은 다시 TOPO 벡터에 클로닝 시킴으로서 최종적으로 6.8kb size의 벡터를 제작하였다.

곰팡이의 형질전환을 위해서, 드리세라제(Driselase, InterSpex Products, Inc., San Mateo, CA, U.S.A.)로 처리한 균사체에 의해 준비된 곰팡이의 원형질체 안으로 폴리에틸렌글라이콜(polyethyleneglycol)과 함께 DJ-PCR에 의해 얻은 약 5ug의 융합 PCR 산물을 직접 첨가하였다(Lee, T. et al, Appl. Environ. Microbiol. 68(2002) 2148-2154). hygB 유전자를 가진 안정적인 형질전환체들을 75ug/ml의 하이그로마이신 B(hygromycin B)가 포함된 재생 배지에서 선택하였고 25% 글리세롤이 포함되어 -80℃에 보관하였다.

화학적 분석

지랄레논, α-ZOL, β-ZOL의 표준시료를 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, U.S.A)로부터 구입하였다. 곰팡이 균주로부터 β-지랄레놀을 검출하기 위해서, 배양 여과액과 건조시킨 액체 배양액을 추출하고 고성능 액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC)로 분석하였다(Kim, J. E. et al, Appl. Environ. Microbiol. 71(2005) 1701-1708, Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113).

결과

1. 보리 붉은 곰팡이균( Gibberella zeae )에서의 목표 유전자 제거 및 발현

ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현 시킨 형질전환 보리 붉은 곰팡이 균주들을 만들기 위해서 목표 유전자 치환 기술(gene replacement strategy)을 사용했다.

ΔZEB1 균주는 이전에 제작된 균주(Kim, Y. T. et al, Mol. Microbiol. 58 (2005) 1102-1113)를 사용하였고, ZEB2의 과발현은 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터 부분과 ZEB2 ORF를 융합시킨 PCR 산물을 TOPO 벡터와 융합시켜 제작한 벡터를 ΔZEB1 균주에 제네티신(geneticin) 마커를 가지는 pII99 플라스미드와 동시에 형질전환함으로써 수행하였다. 형질전환체들은 일차적으로 제네티신 항생제 마커를 통해 선택하였고 2차적으로 형질전환체들의 제노믹 DNA(genomic DNA)를 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터내의 β-튜브린(β-tubulin) 프루브 3REV (5′-CGTCACTGCAGGT ACCACATCTTG-3′)(서열번호 7)와 zeb2 프루브 5FOR (5′-GATAGAAAGGCCTCGCTGTG-3′) (서열번호 8)를 통해 PCR하여 삽입 여부를 확인하였고 서던 블랏을 통해 삽입 위치를 확인하였다. 그 결과 ΔZEB1 균주의 β-튜브린(β-tubulin)프로모터 부분과 벡터가 교차를 통해 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 도 1(A)의 경우, ZEB2/β-튜브린(β-tubulin) 벡터가 제노믹 DNA상의 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터 부분과 교차를 통해 삽입되는 과정을 간단한 모식도로 나타낸 그림이다. 벡터는 교차를 통해 제노믹 β-튜브린(β-tubulin)의 5′ 쪽으로 삽입되어 진 것으로 예상된다. 도 1(B)는 도 1(A)의 방법으로 삽입되어졌다고 예상되는 형질전환체를 50mL의 액체 배지에 25℃, 150rpm에서 3일간 배양한 뒤, DNA를 추출하여 EcoRI을 처리한 후 서던 블랏을 수행한 결과이다. 탐침자로는 ZEB2 ORF의 일부분과 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터 지역의 일부분을 사용하였다. 그 결과 야생형균주인 GZ3639의 경우 EcoRI을 처리하면 약 11.5kb에서 ZEB2 밴드를 가 나오고 3.8kb의 위치에서 β-튜브린(β-tubulin) 프로모터 밴드가 나타난다. ODZ1-Z2의 경우에는 벡터가 삽입되면 EcoRI을 처리했을 때 벡터내에 EcoRI 사이트가 존재하므로 β-튜브린(β-tubulin)의 밴드는 3kb와 4.4kb의 두개의 밴드가 나타난다.

2. 형질전환된 PKS 제거 균주들의 표현형들

야생형 균주인 GZ3639와 ODZ1-Z2 균주의 균사체는 접종 6일이 되면 PDA배지에서 완전히 성장했다(도 1C). 개량된 CM배지에서 ODZ1-Z2 균주는 GZ3639 균주와 비교해서 균사량이 약 2배 증가함을 나타냈다(도 2). 그러나 PDA배지와 당근배지에서 측정한 ODZ1-Z2 균주의 성장 속도는 원조 야생형균주와 비슷했다(도 3).

3. 형질전환 보리 붉은 곰팡이 균주에서의 β-지랄레놀의 생산

개량된 CM 배지에서, 야생형 균주 GZ3639는 접종 후 7일째까지 β-지랄레놀을 거의 생산하지 않았다. 그러나 ODZ1-Z2 균주는 β-지랄레놀이 접종 3일 후에 검출되었고 7일째까지 점차적으로 증가하였다(도 4A). ODZ1-Z2 균주들에서의 향상된 β-지랄레놀 생산은 또한 밀 기질에서도 일어났다. 밀 기질 배양에서도 야생형 균주 GZ3639는 접종 후 4주째까지 β-지랄레놀을 거의 생산하지 않았지만 ODZ1-Z2는 접종 후 4주째까지 점차적으로 β-지랄레놀을 생산하였다(도 4B). 이는 고체 밀 기질 배지가 개량된 CM 배지보다 β-지랄레놀을 더 많이 생산할 수 있음을 나타낸다.

4. PKS 유전자들의 발현형태

도 5를 보면,개량된 CM 배지에서 야생형 균주인 GZ3639의 경우 지랄레논 생합성에 요구되는 두 개의 PKS 유전자 및 ZEB2 유전자의 발현은 전혀 나타나지 않았다. 그에 비하여 ODZ1-Z2 균주의 경우 7일째 PKS13의 전사체가 RNA 블랏에서 처음으로 검출 되었고 ZEB2의 경우에는 3일째 처음으로 검출 되었으며 7일째는 전사체의 띠세기가 강하게 증가되었다. PKS4의 전사체도 3일째 처음 검출되었으며 5일, 7일까지 전사체가 일정하게 발현되는 것이 검출되었다. PKS13과 ZEB2의 발현양이 증가한 7일째 β-지랄레놀의 검출양도 가장 증가 하였다. 그에 비하여 지랄레논 생합성 유전자의 발현이 전혀 유도되지 않았던 GZ3639 균주의 경우에는 β-지랄레놀이 전혀 검출되지 않았다.(도 4) 이는 지랄레논 생합성 유전의 발현이 β-지랄레놀 생산의 조절과 연관되어 있다는 것을 의미한다. 또한 ZEB2가 과발현된 균주의 경우 야생형 균주와 달리 외부환경의 영향을 적게 받는 다는 점을 의미한다.

본 발명에 따른 β-지랄레놀 대량 생산균주[KCCM 10795P]는 종래의 균주보다 β-지랄레놀의 생산성을 크게 증가시켰다. 또한, 상기 균주를 이용한 액체 또는 고체배양을 통한 β-지랄레놀 대량 생산방법은 저비용, 고효율적으로 β-지랄레놀을 생산할 수 있다.

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Claims

β-지랄레놀을 대량생산하는 보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)[KCCM 10795P].
보리 붉은 곰팡이균(Gibberella zeae)의 지랄레논 생산경로 중 ZEB1이 제거된 균주에 ZEB2를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 β-지랄레놀 생산증가방법.
제 1 항의 균주를 고체배양하여 β-지랄레놀을 생산하는 것을 특징으로 하는 β-지랄레놀 대량 생산방법.