CN112266901B - 一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用,属于免疫检测技术领域。本发明公开了一株分泌嘧菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC04,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19175。本发明以嘧菌酯完全抗原免疫BALB/c小鼠,取高效价、低IC50小鼠脾细胞,通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合,经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆,得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体,对嘧菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.03 ng/mL),为食品中嘧菌酯残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用,属于免疫检测技术领域。
背景技术
嘧菌酯(Azoxystrobin),商品名为阿米西达,是由先正达公司开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,是一个广谱、高效杀菌剂,具有内吸性传导性好,渗透性强、持效期长等特点,对几乎所有真菌病害都具有保护、治疗和铲除作用,使用方式多样,不但可用于茎叶喷雾,也可用于种子处理和土壤处理。由于嘧菌酯防治病害的范围特别广,可适用于小麦、玉米、水稻等多种粮食作物,花生、棉花、芝麻、烟草等经济作物,番茄、西瓜、黄瓜、茄子、辣椒等蔬菜作物,苹果、梨树、猕猴桃、芒果、荔枝、龙眼、香蕉等果树,以及中药材、花卉等上百种作物。在我国农药检定所登记有400多个制剂,也是登记最多的一个杀菌剂品种。
《GB 2763—2019食品中农药最大残留限量》中规定了嘧菌酯在各种食品中的最大残留限量标准(MRL),如其在稻谷中的MRL为1 mg/kg,在糙米和小麦中的MRL均为0.5 mg/kg,在黄瓜中的MRL为0.5 mg/kg,在马铃薯中的MRL为0.1 mg/kg,以及在柑、橘和橙中的MRL均为1 mg/kg。
为了有效监督监测食品中嘧菌酯的使用情况,需要一种特异性好,灵敏度高的测定方法,而目前检测方法如气相色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等,其样品前处理过程较为复杂、成本昂贵,加上食品中干扰物较多,因此仪器方法并不适用于现场检测。免疫学检测方法是一种低成本、快速且高灵敏度高特异性的免疫学检测方法,而且操作简便,已广泛适用于药物残留检测领域。建立高效的免疫学检测方法,筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处,提供一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用,由该细胞株制备的抗体对嘧菌酯具有较高的检测灵敏度,可以用来建立嘧菌酯的免疫学检测方法。
本发明的技术方案,一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19175。
嘧菌酯单克隆抗体,它由所述保藏编号为CGMCC No.19175的杂交瘤细胞株ABC04分泌产生。
本发明提供的嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04的制备基本步骤为:
(1)半抗原的合成:
嘧菌酯半抗原的合成方案如上式所示。将嘧菌酯(25g,62mmol)加入三口瓶中,加入THF(375mL),控温30℃以下滴加配好的NaOH溶液(6.8g,170 mmol)25mL,随后升温至68℃反应5h。向反应液中滴加1N的HCl调pH至5,过滤固体,母液用EA萃取2次,有机相合并干燥,旋干溶剂,经硅胶柱纯化,纯化后溶于300mL的DMSO,中压(10 bar)制备色谱,再把产物用EA溶解,采用薄层色谱法得到嘧菌酯半抗原。
(2)完全抗原和包被原的制备:
完全抗原的制备:称取4.5 mg 嘧菌酯半抗原,用200μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,然后加入6.7 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐,4.0 mg N-羟基琥珀酰亚胺,混匀,室温持续搅拌反应6 h(称为嘧菌酯半抗原活化液)。将钥孔血蓝蛋白 10 mg,用3mL硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液),在室温条件,将嘧菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中,室温搅拌反应过夜,透析,即得完全抗原;
包被原的制备:称取7.8mg 嘧菌酯半抗原,用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,随后加入11.5 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐,6.9 mg N-羟基琥珀酰亚胺,混匀,室温持续搅拌反应6h(称为嘧菌酯半抗原活化液)。称取10 mg 鸡卵白蛋白OVA,溶解于2mL硼酸缓冲溶液中(称为B液),在室温条件下,将嘧菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中,室温搅拌反应过夜,透析,即得包被原。
(3)小鼠的免疫:嘧菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后,通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂。每一次加强免疫之间均间隔3周。最后一次加强免疫采用完全抗原(不含佐剂)进行腹腔注射;通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制率。
(4)细胞融合与细胞株建立:通过PEG法将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,通过HAT培养基选择性培养,ic-ELISA检测细胞孔的阳性和抑制率,通过有限稀释法对阳性及抑制率较高的杂交瘤细胞进行亚克隆,最终筛选获得嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04。
(5)杂交瘤细胞株性质的鉴定:通过ic-ELISA测定灵敏度。
取高效价低IC50小鼠的脾细胞,通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合,经过间接竞争酶联免疫法筛选和亚克隆,得到一株杂交瘤细胞株ABC04。
本发明的有益效果:本发明提供的细胞株ABC04分泌的单克隆抗体,对嘧菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.03 ng/mL),可实现对果蔬、谷物中嘧菌酯残留量的检测,为食品中嘧菌酯残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。
生物材料样品保藏:一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19175。
附图说明
图1本发明ABC04单克隆抗体对嘧菌酯的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明,不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将嘧菌酯完全抗原免疫小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养基培养,通过ic-ELISA筛选细胞上清,最终得到了对嘧菌酯有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株ABC04的制备
(1)半抗原的合成:
嘧菌酯半抗原的合成方案如上式所示。将嘧菌酯(25g,62mmol)加入三口瓶中,加入THF(375mL),控温30℃以下滴加配好的NaOH溶液(6.8g,170 mmol)25mL,随后升温至68℃反应5h。向反应液中滴加1N的HCl调pH至5,过滤固体,母液用EA萃取2次,有机相合并干燥,旋干溶剂,经硅胶柱纯化,纯化后溶于300mL的DMSO,中压(10 bar)制备色谱,再把产物用EA溶解,采用薄层色谱法得到嘧菌酯半抗原。
(2)完全抗原和包被原的制备:
完全抗原的制备:称取4.5 mg 嘧菌酯半抗原,用200μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,然后加入6.7 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐,4.0 mg N-羟基琥珀酰亚胺,混匀,室温持续搅拌反应6 h(称为嘧菌酯半抗原活化液)。将钥孔血蓝蛋白 10 mg,用3mL硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液),在室温条件,将嘧菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中,室温搅拌反应过夜,透析,即得完全抗原;
包被原的制备:称取7.8mg 嘧菌酯半抗原,用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,随后加入11.5 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐,6.9 mg N-羟基琥珀酰亚胺,混匀,室温持续搅拌反应6h(称为嘧菌酯半抗原活化液)。称取10 mg 鸡卵白蛋白OVA,溶解于2mL硼酸缓冲溶液中(称为B液),在室温条件下,将嘧菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中,室温搅拌反应过夜,透析,即得包被原。
(3)小鼠的免疫:嘧菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后,通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂。每一次加强免疫之间均间隔3周。最后一次加强免疫采用完全抗原(不含佐剂)进行腹腔注射;通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制率。
(4)细胞融合:在最后一次加强免疫三天后,按照常规PEG法进行细胞融合,具体步骤如下:
a、摘眼球取血,颈椎脱臼法处死小鼠后,立即放入 75% 酒精中消毒,浸泡 5min左右,无菌操作取出小鼠的脾脏,用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液,收集,离心(1200rpm,8min),用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次,最后一次离心后,将脾细胞稀释到一定体积,计数,备用;
b、收集SP2/0细胞:融合前 7-10 天,将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS(胎牛血清)RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1~ 4)×107,保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时,收集瘤细胞,悬浮于RPMI-1640基础培养液中,进行细胞计数;
c、融合过程7min。第1min,将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中;第2min,静置。第3min 和第4min,在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基;第5min 和第6min,在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基;第7min,每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。离心(800 rpm,8 min),弃上清,重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中,按照200μL/ 孔加到 96 孔细胞板,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立:在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液,第5天进行用含20% 胎牛血清,1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液,在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步:第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔,第二步选用嘧菌酯为标准品,用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对嘧菌酯标准品均有较好抑制的细胞孔,采用有限稀释法进行亚克隆,用同样的方法进行检测。重复三次,获得细胞株ABC04。
(6)单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL;7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞,从第七天开始收集腹水,将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下,正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白,然后离心,弃沉淀;再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体,离心,弃上清,用0.01 M PBS溶液(pH7.4)溶解后,透析脱盐,最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存;
6.1包被:将包被原TDF-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始倍比稀释,100μL/孔,37℃反应2h;
6.2洗涤:将板内溶液倾去,并用洗涤液洗涤3次,每次3min;
6.3封闭:拍干后,加入200μL /孔封闭液,37℃反应2h。洗涤后烘干备用;
6.4加样:将抗血清从1:1000开始倍比稀释,并加入到各稀释度的包被孔中,100μL/孔,37℃反应30min;充分洗涤后,加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG,100μL/孔,37℃反应30min;
6.5显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100μL的TMB显色液,37℃避光反应15min;
6.6终止和测定:每孔加入50μL终止液以终止反应,然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定嘧菌酯单克隆抗体的IC50为0.03ng/mL,说明对嘧菌酯有很好的灵敏度,可用于嘧菌酯免疫分析检测。
溶液的配置:碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59 g,NaHCO3 2.93 g,分别溶于少量双蒸水后混合,加双蒸水至约800mL混匀,调pH值至9.6,加双蒸水定容至1000mL,4℃贮存备用;
磷酸盐缓冲液(PBS):8.00g NaCl,0.2g KCl,0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4·12 H2O,溶于800mL纯水中,用NaOH或HCl调pH到7.2~7.4,定容至1000mL;
PBST:含0.05 % 吐温 20的PBS;
TMB显色液:A液:Na2HPO4 .12H2O 18.43g,柠檬酸 9.33g,纯水定容至1000mL;B液:60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液,现用现混。
Claims (3)
1.一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19175。
2.嘧菌酯单克隆抗体,其特征在于:它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19175的杂交瘤细胞株ABC04分泌产生。
3.权利要求2所述嘧菌酯单克隆抗体的应用,其特征在于:用于食品安全检测中嘧菌酯残留的分析检测。
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GR01 | Patent grant | ||
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