CN115418354A - 一株分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的苯氧威半抗原通过多次筛选和实验获得，再由该半抗原制备苯氧威完全抗原，并以该完全抗原免疫小鼠获得杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌的苯氧威单克隆抗体对苯氧威具有优异的亲和力和灵敏度，对苯氧威的50％抑制浓度IC₅₀达到0.88ng/mL，可用于制备苯氧威的免疫检测试剂盒等产品，为食品中苯氧威的残留检测提供高效的检测方法及手段。

Description

一株分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一株分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

苯氧威又称双氧威，苯醚威，是一种具有保幼激素活性的非萜烯类昆虫生长调节剂，于1982年由瑞士Dr.R.Maag(现属先正达公司)发现并开发杀虫谱广，兼具胃毒和触杀作用，高效防治抗性害虫，对天敌安全。与传统杀虫剂作用于昆虫神经系统的机制不同，其杀虫作用为非神经性，对大多数昆虫表现出强烈的保幼激素活性，可使卵不孵化、抑制成虫期变态及幼虫期蜕皮，造成幼虫后期或蛹期死亡。还可抑制成虫或幼虫的生长。可用于果树卷叶蛾类、棉叶蛾科和螟蛾科类、梨黄木虱、柑橘介壳虫类及仓储害虫、引红火蚁等。苯氧威在生产中应用广泛，但有研究表明其对一些有益生物可产生不良影响。有研究发现，苯氧威对天敌异色瓢虫成虫有触杀作用，并且能抑制其产卵及发育苯氧威对鲤鱼具有中等毒性。另有报道发现，苯氧威对斑马鱼胚胎孵化有明显抑制作用；心率是斑马鱼胚胎卵黄囊仔鱼阶段毒性试验最敏感的观察指标。

由于苯氧威等氨基甲酸酯类农药的不科学使用，食品安全问题频频发生，其在蔬菜水果中的农药残留问题引起普遍关注。GB 2763-2019对苯氧威有严格的限量规定。农药残留检测是食品安全风险监测的重要部分,蔬菜中农药残留品种复杂，监测工作异常艰巨。因此，建立快速、准确地测定苯氧威啶残留量的方法势在必行。

苯氧威的常规检测方法包括液相色谱法、超高效液相色谱串联质谱法、高效液相紫外检测、基于酶抑制作用的荧光法、分子印迹法等。但这些方法在不同程度上存在一些缺陷：耗时，昂贵的仪器和大量的样品预处理程序等。因此，这些方法不适合现场简便的进行苯氧威的高通量分析检测，在实际现场分析应用中受到限制。

酶联免疫法(ELISA)是一种低成本、快速且便携的免疫学检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测出结果。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。但现有技术中尚未有利用酶联免疫法用于苯氧威残留检测的相关报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种苯氧威半抗原，以此为基础用于建立免疫学检测方法，解决现有技术在苯氧威残留检测分析过程中样品量大、耗时、成本高、现场检测受限等问题。本发明基于苯氧威半抗原制备的完全抗原，再以完全抗原免疫动物制备杂交瘤细胞株，由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对苯氧威具有较高亲和力和检测灵敏度，能够用于苯氧威的快速检测分析，具有很好的开发应用前景。

本发明的第一个目的是提供一株分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45118。

本发明的第二个目的是提供一种分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

S1、将苯氧威半抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；

S2、对免疫动物进行采血，对免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力进行筛选；

S3、将步骤S2筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到所述分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

进一步地，在步骤S1中，所述动物免疫过程包括首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用完全抗原和完全弗氏佐剂，加强免疫采用完全抗原和不完全弗氏佐剂，冲刺免疫采用完全抗原。

进一步地，在步骤S1中，各次免疫间隔为20-25天。

进一步地，在步骤S1中，免疫过程包含1次首次免疫、3-5次加强免疫和1次冲刺免疫。

进一步地，所述动物为小鼠。

进一步地，在步骤S1中，所述苯氧威半抗原的结构如下所示：

进一步地，上述苯氧威半抗原的制备方法包括以下步骤：将2-(4-苯氧基苯氧基)乙胺和琥珀酸苷在溶剂存在的条件下进行反应，得到所述苯氧威半抗原。

进一步地，所述溶剂包括但不限于DMAP(4-二甲氨基吡啶)、DMF (N,N-二甲基甲酰胺)等。

进一步地，所述反应在10-30℃下进行。

进一步地，在步骤S1中，所述苯氧威完全抗原由上述苯氧威半抗原与载体蛋白偶联得到。

进一步地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白BSA、卵清蛋白OVA等。在杂交瘤细胞制备的过程中，半抗原的合成只是第一个阶段，完全抗原和包被原合成过程中，载体蛋白的选择、偶联方法、反应条件等都需要进行调试和优化，免疫阶段对动物抗血清进行筛选时，可能会出现效价低或无抑制(即抗体不能识别待测目标物)的情况。因此，发明人从包被原的合成方法、包被原的种类等进行多方面的尝试，确定以牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA 作为载体蛋白的效果最佳，达到对其的灵敏度等要求。

进一步地，上述苯氧威完全抗原的制备方法包括以下步骤：

S1、将上述苯氧威半抗原活化，得到活化液；

S2、将上述步骤S1得到的活化液加入载体蛋白溶液中，反应得到苯氧威完全抗原。

进一步地，在步骤S1中，所述的活化为，将苯氧威半抗原溶解，加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行反应。

进一步地，在步骤S2中，对反应后的溶液进行透析、分离，得到苯氧威完全抗原。

进一步地，在步骤S2中，所述载体蛋白溶液是通过将载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲溶液中得到。

进一步地，所述碳酸盐缓冲溶液为0.01-0.5mol/L(优选为0.05mol/L)， pH为9.0-10.0(优选为9.6)。

本发明的第三个目的是提供上述分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备苯氧威单克隆抗体中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株在苯氧威检测中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种苯氧威单克隆抗体，所述苯氧威单克隆抗体是通过上述杂交瘤细胞株分泌得到。

本发明的第六个目的是提供上述苯氧威单克隆抗体在苯氧威检测中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种苯氧威检测产品，所述苯氧威检测产品包括上述苯氧威单克隆抗体。当然，本领域技术人员可知晓，除试剂盒外，还可以制备成试剂、试纸条等其他任何形式的检测产品。

进一步地，上述苯氧威检测产品中还包括包被原，所述包被原由苯氧威半抗原与卵清蛋白偶联得到。

进一步地，上述苯氧威检测试剂盒用于食品安全检测中苯氧威的残留分析检测。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明提供的苯氧威半抗原、完全抗原、由完全抗原免疫小鼠得到的杂交瘤细胞株以及其分泌的单克隆抗体，对苯氧威具有较好的亲和力、特异性以及检测灵敏度(苯氧威单克隆抗体对苯氧威的IC₅₀为0.88ng/mL)，可实现对苯氧威残留量的检测，为食品中苯氧威残留的免疫检测提供了原料，具有实际推广应用价值。

(2)本发明中提供了一种新的合成苯氧威半抗原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成完全抗原的思路与方法。

生物材料保藏

单克隆细胞株，所述单克隆细胞株已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45118，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为苯氧威半抗原的化学合成路径图；

图2为实施例制备的苯氧威单克隆抗体的标准抑制曲线图；

图3为对比例制备的苯氧威单克隆抗体的标准抑制曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1半抗原的合成

将2-(4-苯氧基苯氧基)乙胺500mg(2.18mmol)和1g(10.9mmol琥珀酸苷溶解在DMF中，室温搅拌21小时。旋干溶剂，过柱机过柱得到苯氧威半抗原合成路径详见图1。

实施例2完全抗原的合成

上述实施例1制备的苯氧威半抗原与载体蛋白偶联得到苯氧威完全抗原。

所述苯氧威完全抗原制备方法如下：

1)称取5.4mg上述制备的苯氧威半抗原溶于0.6mL N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)，依次加入5.0mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)和3.7mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌，活化反应6h，得到活化液；

2)取15mg牛血清蛋白(BSA)溶解于3mL的碳酸盐缓冲溶液 (0.05mol/L，pH为9.6)中；将上述步骤1)得到的活化液逐滴加入BSA 溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到混合液；

3)将上述步骤2)得到的混合液，透析、分离，得到完全抗原，即免疫原，-20℃分装保存；

同理，采用苯氧威半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到的完全抗原，即包被原。

实施例3苯氧威单克隆抗体的制备

1.动物免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。首次免疫采用1mg/mL 苯氧威完全抗原与等量的弗氏完全佐剂混合乳化液作为注射剂，每只 100μL；加强免疫使用1mg/mL苯氧威完全抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合乳化液作为注射剂，每只100μL；冲刺免疫采用1mg/mL苯氧威完全抗原与等体积生理盐水混合均匀后作为注射剂，每只50μL；进行皮下多点注射，各次免疫间隔为三周。免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制率；选择抑制最好的小鼠，在五次免后18天进行冲刺免疫，准备融合。

2.细胞融合

在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为2000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a.在无菌条件下，取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，1200rpm离心8min，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，得到脾细胞液备用；

b.收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c.融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640 培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第 7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心 (800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的 RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃， 5％CO₂培养箱中培养。

3.细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640 过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔；第二步选用苯氧威为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对苯氧威有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，重复三次，获得杂交瘤细胞株，保藏。

4.苯氧威单克隆抗体的制备与鉴定

取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的抗苯氧威单克隆抗体，置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对上述获得的抗苯氧威单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型，具体如表1所示。

表1.苯氧威单克隆抗体的亚型鉴定

抗体亚型亚类	OD值
		IgA	0.134
IgG1	0.114
		IgG2a	0.228
IgG2b	2.021
		IgG3	0.104
IgM	0.073

使用间接竞争ELISA法，测定苯氧威单克隆抗体对苯氧威的IC₅₀为 0.88ng/mL，并验证了其对灭虫威等的IC₅₀及交叉反应率，具体如表2所示。表2苯氧威单克隆抗体对苯氧威、灭虫威、丁苯葳、吡菌苯威的IC₅₀及交叉反应率

	IC<sub>50</sub>(ng/mL)	交叉反应率
			苯氧威	0.88	100％
灭虫威	＞500	＜5％
			丁苯威	＞500	＜5％
吡菌苯威	＞500	＜5％

结果表明，苯氧威单克隆抗体对苯氧威具有很高的灵敏度，可用于苯氧威免疫分析检测。

实施例4苯氧威单克隆抗体的应用

将实施例3制备的单克隆抗体应用于苯氧威ELISA添加回收试验。

1.苯氧威标准溶液制备：用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，1，3，10，30，100，300，1000ng/mL的苯氧威标准溶液。

2.样品前处理：取新鲜或回温(冷藏保存)的牛奶5g，添加三个不同剂量的苯氧威标准品，分别为5ng、10ng、20ng；将其置于50mL离心管中，缓慢滴入50％氢氧化钾溶液1mL，在旋涡混合器上充分振荡，缓慢滴入乙酸乙酯20mL，在旋涡混合器上振荡10min，然后放入离心器中以3000r/min 离心5min。移取4mL上清液于另一支离心管中，氮气吹干，加入1mL含有10％甲醇的PBS复溶，即得待检测样品提取液。

3.溶液的配置：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.62g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

洗涤液(PBST)：含0.05％Tween20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中；A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

采用间接竞争ELISA进行苯氧威添加回收试验，具体步骤如下：

(1)包被：将上述实施例1中的步骤2制备的苯氧威包被原用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释为浓度为0.1μg/mL的溶液，用于包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)封闭：用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)加样：将苯氧威标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔；然后每孔再加入 50μL 1:16000稀释的上述制备的抗苯氧威单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；最后每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS 1:3000稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；

(4)显色：每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2mol/LH₂SO₄终止液，终止反应，得到反应液，将反应液于450nm 测吸光值；

(5)计算结果：依据测定的吸光值绘制苯氧威单克隆抗体对苯氧威的标准抑制曲线图，然后根据标准曲线计算出待测样品中浓度，计算样品的添加回收率。

计算结果：苯氧威回收率分别为91.2％、101.5％、95.6％，符合国家农药残留检测标准，可用于食品安全检测中苯氧威的残留分析检测。

对比例

(1)以下式结构所示的化合物为半抗原，与载体蛋白偶联得到苯氧威完全抗原。

所述苯氧威完全抗原制备方法如下：

1)称取将3.6mg半抗原溶解于75μL比例为5：1的戊二醛水溶液中， 4℃下搅拌活化4小时得到活化液；

2)取15mg牛血清蛋白(BSA)溶解于3mL的碳酸盐缓冲溶液 (0.05mol/L，pH为9.6)中；将上述步骤1)得到的活化液逐滴加入BSA 溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到混合液；

3)将上述步骤2)得到的混合液，透析、分离，得到完全抗原，即免疫原，-20℃分装保存；

同理，采用苯氧威半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到的完全抗原，即包被原。

(2)单克隆抗体的制备与实施例中的实验过程相同，制备所获得的抗体IC₅₀值为12.95ng/mL，见图3。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45118。

2.一种分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将苯氧威半抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；

S2、对免疫动物进行采血，对免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力进行筛选；

S3、将步骤S2筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到所述分泌苯氧威单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

其中，所述苯氧威半抗原的结构如下所示：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述苯氧威半抗原由以下步骤制备得到：将2-(4-苯氧基苯氧基)乙胺和琥珀酸苷在溶剂存在的条件下进行反应，得到所述苯氧威半抗原。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述苯氧威完全抗原由所述苯氧威半抗原与载体蛋白偶联得到。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白包括牛血清蛋白或卵清蛋白。

6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备苯氧威单克隆抗体中的应用。

7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在苯氧威检测中的应用。

8.一种苯氧威单克隆抗体，其特征在于：所述苯氧威单克隆抗体是通过权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到。

9.权利要求8所述的苯氧威单克隆抗体在苯氧威检测中的应用。

10.一种苯氧威检测产品，其特征在于：所述苯氧威检测产品包括权利要求8所述的苯氧威单克隆抗体。

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