CN101228441A - 用于检测分析物的光谱法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测一种或一种以上分析物的方法，所述方法包括：提供分析物与铕穴合物荧光团或铽穴合物荧光团的接合物，以及对分析物特异的抗体，和对铕穴合物荧光团或铽穴合物荧光团特异的抗体；以及利用光谱法测定在添加分析物时所发生的荧光猝灭，其中分析物特别是病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素与细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料。此外，本发明涉及分析物与铕穴合物荧光团或铽穴合物荧光团的接合物，也涉及一种用于检测分析物的试剂盒。

Description

用于检测分析物的光谱法

技术领域

本发明涉及检测一种或一种以上分析物的方法，所述方法包括：提供分析物与铕(europium)(或铽(terbium))穴合物(cryptate)荧光团的接合物，以及指定量的对分析物特异的抗体，和指定量的对铕(铽)穴合物荧光团特异的抗体，以及光谱法测定在添加分析物时所发生的荧光猝灭(quenching)。此外，本发明涉及分析物与铕(铽)穴合物荧光团的接合物，也涉及一种含有检测一种或一种以上分析物所需的组分的试剂盒(kit)。

背景技术

已知使用特异性抗体来检测不同分析物的各种方法。举例来说，EP 0343346B描述了一种荧光免疫分析法。US 4,261,968描述了一种使用抗体和荧光猝灭剂来检测分析物的方法，其中荧光猝灭的程度与待测定的分析物的量直接相关。

发明内容

本发明旨在提供一种可普遍应用于任何物质的检测的简单方法，以及旨在提供适用于所述方法的化合物。

所述目的是通过本发明独立项的技术教示来实现的。本发明的其他有利实施例由附属项、描述以及实例产生。

本发明涉及一种检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供以下三种组分：

分析物与铕穴合物荧光团的接合物，

对分析物特异的抗体，以及

对铕穴合物荧光团特异的抗体，

其中分析物与铕穴合物荧光团的接合物仅允许同时结合一种单一抗体，

b)添加分析物，以及

c)光谱法测量铕穴合物荧光团的荧光。

同样，可使用铽代替铕，因此在本文中给出的任何详述对铕和铽都是适用的。因此，本发明涉及一种检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供以下三种组分：

分析物与铽穴合物荧光团的接合物，

对分析物特异的抗体，以及

对铽穴合物荧光团特异的抗体，

其中分析物与铽穴合物荧光团的接合物仅允许同时结合一种单一抗体，

b)添加分析物，以及

c)光谱法测量铽穴合物荧光团的荧光。

对于根据本发明的方法来说需要三种组分：第一，待检测的物质(即分析物)与荧光团的接合物，以及第二，对待判定的物质特异的抗体，以及第三，对荧光团特异的第二抗体。过氧化氢为第四优选组分。所述组分的功能更详细地描述于下文中。其存在或其浓度有待测定的分析物可被视为另一组分。然而，因为根据本发明的分析也可用于检测某一分析物的不存在，所以所述组分并非强制性的。

附图说明

图1：检测针对TBP铕穴合物的血清抗体对TBP铕穴合物的结合

图2：检测由于抗铕抗体与TBP铕穴合物结合而引起的荧光猝灭

图3：检测分析物结合抗体对荧光团结合抗体的置换

图4：免疫血清对[EuL]-BSA接合物荧光的猝灭

图5：检测利用抗POD血清对与Eu(NH₂)-POD形成键结的G24-BA9的置换

图6：检测利用结合POD的单克隆抗体对与Eu(NH₂)-POD形成键结的G24-BA9的置换

图7：在荧光猝灭免疫分析中测定生物素(维生素H)浓度

图8：利用过氧化氢增加TBP铕穴合物的发光

图9：测试免疫血清猝灭[EuL]-BSA接合物发光的特性

具体实施方式

如本文中所用的术语“荧光”或“荧光猝灭”旨在描述任何发光效应；因此其包含磷光，因此术语“荧光”或“荧光猝灭”也包括“磷光”或“磷光猝灭”。

一般来说，可使用目前所有类型的抗体，诸如多克隆抗体(polyclonalantibody)、单克隆抗体(monoclonal antibody)、人源化抗体(humanizedantibody)、人类抗体(human antibody)、嵌合抗体(chimeric antibody)、重组抗体(recombinant antibody)、双特异性抗体(bispecific antibody)以及抗体片段(antibody fragment)，其中优选单克隆抗体。

可使用抗体片段、适体(aptamer)、模拟表位(mimotope)、fab片段、fc片段、肽(peptide)、凝集素(lectin)、核苷酸(nucleotide)、肽模拟物(peptidomimetic)、gapmer、核糖酶(ribozyme)、CpG-寡聚物(CpG-oligomer)、DNA酶(DNAzyme)、核糖开关(riboswitche)或脂质(lipid)来代替抗体。

所属领域的技术人员已知制备所述化合物(尤其抗体以及单克隆抗体)的方法。

优选以限定且已知比率使用对分析物特异的抗体(分析物特异性抗体)和对分析物与荧光团的接合物特异的抗体(荧光团特异性抗体)。术语分析物特异性抗体描述与分析物特异性结合的抗体，其中，关于所述键结，无论分析物是完全或仅部分地被抗体结合，或无论连接基团及/或荧光团的一部分也被抗体结合，或无论甚至连接基团及/或荧光团完全牵涉进键结中，都没有关系。唯一重要的方面在于，结合应以使第二分析物特异性抗体或荧光团特异性抗体均不能结合的方式发生。类似地，关于荧光团特异性抗体来说，无论所述抗体是完全或仅部分地结合荧光团，且无论连接基团及/或分析物是完全或部分地牵涉进键结中，都没有关系。荧光团特异性抗体也应以使分析物特异性抗体或另一荧光团特异性抗体均不能结合的方式结合。因此，抗体键结类型不是本发明的实质方面，只要其他抗体不同时发生结合即可。

设计分析物/荧光团接合物使得仅一种单一抗体可同时与其结合。因此，两种分析物特异性抗体或两种荧光团特异性抗体或一种分析物特异性抗体与一种荧光团特异性抗体的同时结合被排除。

此外，本发明是基于以下原则：分析物荧光团接合物的荧光不受分析物特异性抗体结合显著影响，而荧光团特异性抗体的结合导致荧光猝灭或至少荧光可测量地降低。

如果提供所述三种组分(即接合物和分析物特异性抗体和荧光团特异性抗体)的溶液，那么溶液中的接合物是由两种抗体中的一者结合；因此，(例如)其在50％的程度上是由分析物特异性抗体结合，且在约50％的程度上是由荧光团特异性抗体结合。存在少量未结合形式。

如果将含有待检测物质(即分析物)的样品溶液添加到所述溶液中，那么分析物与含有分析物的接合物竞争分析物特异性抗体上的结合位点(bonding site)。因此，与接合物结合的分析物特异性抗体的部分释放接合物并与待检测物质(即分析物)结合。所述程序导致游离接合物的浓度增加，但是，游离接合物立即被溶液中过量存在的荧光团特异性抗体结合。由于荧光团特异性抗体的结合，荧光被猝灭，这可利用光谱法进行测量。

溶液荧光降低指示待检测物质(分析物)的存在，其中荧光猝灭的程度表明样品溶液中分析物的量。

因此，本发明的方法是基于以下一般原则：在荧光降低与某一分析物的存在以及浓度之间建立关系。

显然，所属领域的技术人员应显而易见，可使用在与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)结合时或在与分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的接合物结合时增强或可测量地增加荧光团的荧光的这些抗体来代替荧光猝灭抗体。表达“可测量地增加”描述能利用光谱法清楚测定且能从背景荧光识别的增加。在所述的本发明方法中，荧光增加的程度与待测量分析物的浓度相关。

因此，本发明特别涉及能够与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)及/或分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的接合物结合且由于所述键结而能够猝灭或可测量地降低荧光团荧光的抗体。

另一方面，本发明也涉及能够与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)及/或分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的接合物结合且由于所述键结而能够增强或可测量地增加荧光团的荧光的抗体。

优选使用的铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)为在本文中所述的那些。

本发明的抗体是根据标准方法(例如)利用杂交瘤技术(

知Milstein，Nature 1975，256，495-497)，通过使用Epstein Barr病毒、Xeno小鼠或利用在细胞培养物中永久存活且产生抗体的细胞(Pasqualini和Arap，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，6，257-259)来制备。此外，抗体可衍生自(例如)利用噬菌体呈现或核糖体呈现或类似技术所产生的重组抗体库。

降低螯合物结合(chelate bound)或穴合物结合镧系元素(尤其铕(Eu³⁺)以及铽(b³⁺))的荧光的抗体或增强螯合物结合或穴合物结合镧系元素(尤其铕(Eu³⁺)以及铽(b³⁺))的荧光的抗体可用于建立各种测量系统。特别是，这关系到这些抗体在具有所需特异性的抗体产生细胞的筛选程序以及相对于已知抗体的结合亲和力的抗体亲和力测定中的应用。类似地，这些抗体可用于发展基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)的免疫分析。在本文中所述的应用是针对在均相分析中在溶液中使用前述抗体。显然，正如本发明的抗体，当实现实时PCR系统时，也可使用固相分析(尤其微阵列形式)中的这些抗体。

以下样品可特别用作样品溶液：唾液样品、血液样品、尿样品、粘液样品、消化组织样品、水样品、废水样品、来自化学生产过程的样品、提取土壤样品、食物样品、来自生物以及生物化学生产过程的样品、发酵溶液以及其类似物。尤其优选血清样品以及前述种类的稀释样品或(例如)土壤样品、粘液样品、发酵溶液以及其类似物的稀释提取物。所属领域的技术人员应显而易见用于光谱分析方法的适合稀释溶液的制备。

针对其产生抗体且可与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)结合的任何分析物可用作待检测物质。优选可能经由分析物的连接基团与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)形成共价键。连接基团位于分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)之间，且可由增加分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)之间距离的任何化学组分或片段组成，其中所述距离不应过大，否则正是由于分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)之间的距离，会使分析物特异性抗体与荧光团特异性抗体的同时结合成为可能。

可能分析物的实例包含：

人类诊断学分析物：

病原体：病毒：例如麻疹(measles)、流感(influenza)、SARS、HIV、肝炎(hepatitis)、疱疹(herpes)、蜱媒脑膜脑炎(tick-bornmeningoencephalitis)等。

朊病毒

细菌：例如肺结核(tuberculosi)、莱姆病(Lyme disease)、霍乱(cholera)、百日咳(pertussis)等。

寄生虫：例如疟疾(malaria)、利什曼原虫(leishmania)等。

肿瘤标记

肿瘤标记的实例包含：

β2微球蛋白(beta 2 microglobulin)、铁蛋白(ferritin)、p53、促肾上腺皮质激素(corticotropin)(ACTH)、生长激素(growth hormone，GH、hGH)、催乳素(prolactin，PRL)、绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin，hCG和CG)、降钙素(calcitonin，CT)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin，tg)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、CA抗原125、72-4、15-3以及19-9、α-胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)、半乳糖基转移酶II(galactosyl transferase II)。

病原体的实例包含：

布鲁氏菌(brucella)IgG和IgM；肺炎衣原体(chlamydia pneumonia)IgA、IgG和IgM；沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)IgA、IgG和IgM；CMV IgG和IgM；登革病毒(Dengue virus)IgG和IgM；EBV-VCA IgA、IgG和IgM；幽门螺杆菌(H.pylori)IgA、IgG和IgM；HSV 1+2 IgG和IgM；麻疹IgG和IgM；腮腺炎(mumps)IgG和IgM；支原体(mycoplasma)IgG和IgM；风疹(rubella)IgG和IgM；沙门氏菌(salmonella)IgG和IgM；弓形虫(toxoplasma)IgA、IgG和IgM；梅毒螺旋体(treponima pallidum)IgG和IgM；VZV IgG和IgM；肝炎A、B、C；HIV1、2。

药物：例如

抗生素(氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、青霉素(penicillin)等)

细胞抑制剂(阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)等)

精神活性物质

麻醉剂

止痛剂

心脏药物

凝结抑制剂

代谢物：例如

激素(类固醇激素(steroid hormone)、促性腺激素(gonadotropin)等)

白细胞介素与细胞因子等

三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine)

血浆蛋白(plasma protein)

酶(分泌酶(secretase)、脂肪酶(lipase)、磷酸酶(phosphatase)等)

脂质(胆固醇(cholesterol)等)

疾病因子(自体免疫诊断学(autoimmune diagnostic)等)

运动医学靶标：

兴奋剂(安非他明(amphetamine)、生长激素(growth hormone)、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)等)

毒品例如海洛因(heroin)、可卡因(cocaine)、LSD等

毒素真菌毒素、细菌毒素：霍乱毒素、百日咳毒素等

抗生素、抗真菌素以及抗病毒药物的实例包含：

无环鸟苷(acyclovir)、氨苄西林、阿莫西林、氨基糖苷类、两性霉素B(amphote ricin B)、阿奇霉素(azithromycin)、头孢唑林(cefazol in)、头孢吡肟(cefepime)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢替坦(cefotetan)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢氨苄(cephalexin)、氯霉素(chloramphenicol)、克霉唑(clotrimazole)、环丙沙星(ciprofloxacin)、克拉霉素(clarithromycin)、克林霉素(clindamycin)、氨苯砜(dapsone)、双氯西林(dicloxacillin)、多西环素(doxycycline)、乳糖酸红霉素(erythromycin lactobionate)、氟康唑(fluconazole)、膦甲酸(foscarnet)、更昔洛韦(ganciclovir)、加替沙星(gatifloxacin)、亚胺培南(imipenem)/西司他丁(cilastatin)、异烟肼(isoniazid)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、甲硝唑(metronidazole)、萘夫西林(nafcillin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、制霉菌素(nystatin)、喷他脒(pentamidine)、青霉素、哌拉西林(piperacillin)/他唑巴坦(tazobactam)、利福平(rifampin)、奎奴普丁(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)、替卡西林(ticarcillin)/克拉维酸盐(clavulanate)、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(trimethoprim sulfamethoxazole)、伐昔洛韦(valacyclovir)、万古霉素(vancomycin)。

激素的实例包含：

ACTH、C-肽、皮质醇(cortisol)、DHEA-S、雌二醇(estradiol)、雌三醇(estriol)、睾酮(testosterone)、胰岛素(insulin)、胰岛素原(proinsulin)、孕酮(progestrone)、PTH。

白细胞介素、细胞因子以及生长因子的实例包含：

促红细胞生成素、人类生长激素(human growth hormone，hGH)、白细胞介素1至18、肿瘤坏死因子-α、β(tumor necrosis factor-，β，TNF-α、β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、粒细胞(granulocyte)、巨噬细胞(macrophage)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(colony stimulating factor)(G-CSF、M-CSF、GM-CSF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板生长因子(platelet growth factor，PGF)、氮氧化物(nitrogen oxide)、白三烯(leukotriene)。

血浆蛋白以及其他血浆分子的实例包含：

C-反应性蛋白(C-reactive protein，CRP)、白蛋白(albumin)、凝结因子(coagulation factor)、补体因子(complement factor)、免疫球蛋白(immunoglobulin)(IgA、IgE、IgG、IgM)、磷脂酶(phosoholipase)、加压素(vasopressin)、同型半胱氨酸(homocystein)、肌红蛋白(myoglobin)、肌钙蛋白I(troponin I)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)、胰岛素、血型鉴定(blood group determination)、恒河因子(rhesus factor)、α淀粉酶(alpha amylase)、胆碱酯酶(cholinesterase)、肌酸激酶(creatine kinase)、γ-GT、GOT/ASAT、GPT/ALAT、LDH、胰脂肪酶(pancreatic lipase)、磷酸酶、胆红素(bilirubin)、葡萄糖(glucose)、肌酐(creatinine)、脂蛋白(lipoprotein)。

自体免疫诊断学的实例包含：

ACA IgG、ANA Screen IgG、心磷脂(cardiolipin)IgA、心磷脂IgG、心磷脂IgM、心磷脂总ab、dsDNA IgG、线粒体(mitochondrial，MA)ab、RNP/Sm IgG、Sc1-70、Sm IgG、SSA IgG、SSB IgG、甲状腺球蛋白ab、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)IgG

运动医学靶标：

兴奋剂(安非他明、生长激素、促红细胞生成素等)

毒品例如海洛因、可卡因、LSD等以及其降解产物

毒素真菌毒素、细菌毒素：霍乱毒素、百日咳毒素等

兴奋剂的实例包含：

合成代谢剂，例如勃拉睪酮(bolasterone)、勃地酮(boldenone)、脱氢氯甲基睾酮(dehydrochloromethyltestosterone)、二氢睾酮(dihydrotestosterone)、氯司替勃(clostebol)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、美睾酮(mesterolone)、美雄酮(metandienone)、美替诺龙(metenolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、诺龙(nandrolone)、诺乙雄龙(norethandrolone)、氧雄龙(oxandrolone)、羟甲睾酮(oxymesterone)、羟甲烯龙(oxymetholone)；司坦唑醇(stanozolol)、睾酮以及化学或药学上相关的化合物；β-2激动剂(beta-2agonist)(例如克伦特罗(clenbuterol))；安非他明：例如安咪奈丁(amineptine)、安非他明、安非他尼(amphetaminil)、苄非他明(benzphetamine)、二甲基安非他明(dimethylamphetamine)、乙基安非他明(ethylamphetamine)、芬乙茶碱(fenetylline)、芬普雷司(fenproporex)、呋芬雷司(furfenorex)、美沙卡伯(mesocarb)、甲氧那明(methoxyphenamine)、甲安非他明(methylamphetamin)、哌甲酯(methylphenidate)、吗拉宗(morazone)、匹莫林(pemoline)、苯甲曲秦(phendimetrazine)、哌苯甲醇(pipradol)、吡咯戊酮(pyrovalerone)以及化学或药学上相关的化合物；用于口服、肌肉内或静脉内投药的皮质类固醇(corticosteroid)；肽激素以及其类似物：例如绒毛膜促性腺激素HCG(人类性激素(human sex hormone))、促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(HGH、促生长激素(somatotropin))、促红细胞生成素。自上述物质释放的任何相应因子同样被禁止。

刺激剂：例如阿米苯唑(amiphenazole)、咖啡因(coffein)、去甲伪麻黄碱(cathin)、氯苯丁胺(chlorphentermine)、氯苄雷司(clobenzorex)、氯丙那林(clorprenaline)、克罗丙胺(cropropamide)、克罗乙胺(crotethamide)、麻黄碱(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、香草二乙胺(etamivan)、芬坎法明(fencamfamin)、美芬雷司(mefenorex)、甲麻黄碱(methylephedrine)、尼可刹米(nikethamide)、戊四唑(pentetrazole)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、普罗林坦(prolintane)、丙己君(propylhexedrine)、士的宁(strychnine)以及化学或药学上相关的化合物。

麻醉剂/止痛剂：例如阿法罗定(alphaprodine)、阿尼利定(anileridine)、丁丙诺啡(buprenorphine)、右吗拉胺(dextromoramide)、右丙氧芬(dextropropoxyphen)、二醋吗啡(diamorphine)、地匹哌酮(dipipanone)、依索庚嗪(ethoheptazine)、乙基吗啡(ethylmorphine)、左啡诺(levorphanol)、美沙酮(methadone)、吗啡(morphine)、纳布啡(nalbuphine)、戊唑星(pentazocine)、哌替啶(pethidine)、三甲利定(trimeperidine)以及化学或药学上相关的化合物。

毒品的实例包含：安非他明、巴比妥酸盐(barbiturate)、苯并二氮卓(benzodiazepine)、大麻素(cannabinoid)、可卡因代谢产物(cocainemetabolite)、可替宁(cotinine)、芬太尼(fentanyl)、氟硝西泮(flunitrazepam)、LSD、甲安非他明、吗啡、鸦片剂(opiate)、PCP、三环化合物(tricyclic)。

兽医学分析物：

病原体、药物、代谢物、兴奋剂、毒素等。

环境诊断学分析物(空气、水以及土壤分析)：

有害物质：

农药(PCB、阿特拉津(atrazine)等)

杀虫剂(拟除虫菊酯(pyrethroid)、苏芸金杆菌(bacillusthuringiensis)毒素等)

木材防腐剂(林丹(Lindan)等)

除草剂(敌草隆(diuron)、灭草隆(monuron)等)

杀真菌剂

毒素以及爆炸物(例如二恶英(dioxin)、TNT等)

色料与清漆

环境污染物、有毒物质

色料与清漆的实例包含：邻苯二甲酸盐(phthalate)、偶氮染料(azodye)、乙二醇醚(glycol ether)、乙二醇酯(glycol ester)、二恶英。

杀虫剂的实例包含：乐果(dimethoate)、溴氰菊酯(deltamethrin)、除虫脲(diflubenzuron)、α-氯氰菊酯(alpha-cypermethrin)、ζ-氯氰菊酯(zeta-cypermethrin)、苯氧威(fenoxycarb)、吡螨胺(tebufenpyrad)、抗蚜威(pirimicarb)、印楝素(azadirachtin)、胡椒基丁醚(piperonylbutoxide)、除虫菊内酯(pyrethrine)、氟鼠灵(flocoumafen)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯菊酯(permethrin)、chalcogran、癸二烯甲酸甲酯(decadiene carboxylic acid methyl ester)、齿小蠹二烯醇(ipsdienol)、(S)-順-马鞭草烯醇((S)-cis-verbenol)、甲基丁烯醇(methylbutenol)。

农药的实例包含：3，4，5-混杀威(3，4，5-trimethacarb)、3-羟基呋喃丹(3-hydroxycarbofuran)、5-羟基-烯草酮砜(5-hydroxy-clethodimsulfone)、5-羟基吡虫啉(5-hydroxy imidacloprid)、5-羟基噻苯哒唑(5-hydroxy thiabendazole)、6-氯-3-苯基-哒嗪-4-(哒草特代谢物)(6-chloro-3-phenyl-pyridazine-4-(pyridate metabolite))、乙酰甲胺磷(acephate)、啶虫咪(acetamiprid)、甲基苯丙噻二唑(acibenzolar-S-methyl)、苯草醚(aclonifen)、氟丙菊酯(acrinathrin)、甲草胺(alachlor)、涕灭威(aldicarb)、涕灭威亚砜(aldicarb sulfoxide)、氧涕灭威(aldoxycarb)、莠灭净(ametryn)、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、灭害威(aminocarb)、敌菌灵(anilazine)、阿特拉津、阿维菌素Bla(avermectin Bla)、阿维菌素Blb、甲基吡啶磷(azamethiphos)、乙基谷硫磷(azinphos-ethyl)、甲基谷硫磷(azinphos-methyl)、嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜灵(benalaxyl)、噁虫威(bendiocarb)、丙硫克百威(benfuracarb)、苄嘧磺隆(bensulfuron methyl)、苯螨特(benzoximate)、甲羧除草醚(bifenox)、联苯菊酯(bitertanol)、啶酰菌胺(boscalid)、除草定(bromacil)、糠菌唑(bromuconazole)、乙嘧酚磺氨酯(bupirimate)、噻嗪酮(buprofezin)、丁酮威(butocarboxim)、丁酮威亚砜(butocarboxim sulfoxide)、丁酮砜威(butoxycarboxim)、炔草隆(buturon)、胺甲萘(carbaryl)、多菌灵(carbendazim)、卡草胺(carbetamide)、克百威(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)、萎锈灵(carboxin)、唑酮草酯(carfentrazone-ethyl)、氯溴隆(chlorbromuron)、毒虫畏(chlorfenvinphos)、氟虫隆(chlorfluazuron)、杀草敏(chloridazon)、绿麦隆(chlorotoluron)、枯草隆(chloroxuron)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯磺隆(chlorsulfuron)、虫螨磷(chlorthiophos)、醚磺隆(cinosulfuron)、烯草酮(clethodim)、烯草酮亚胺砜(clethodim imine sulfone)、烯草酮亚胺亚砜(clethodim iminesulfoxide)、烯草酮砜(clethodim sulfone)、烯草酮亚砜(clethodimsulfoxide)、炔草酸(clodinafop-propargyl)、四螨嗪(clofentezine)、广灭灵(clomazone)、二氯吡啶酸(clopyralid)、解毒喹(cloquintocet-mexyl)、蝇毒磷(coumaphos)、氰草津(cyanazine)、苯腈膦(cyanofenphos)、氰霜唑(cyazofamid)、环草特(cycloate)、霜脲氰(cymoxanil)、嘧菌环胺(cyprodinil)、灭蝇胺(cyromazine)、丁酰肼(daminozide)、溴氰菊酯(deltamethrin)、甲基内吸磷(demeton-s-methyl)、甲基内吸磷砜(demeton-s-methyl-sulfone)、甜菜安(desmedipham)、脱甲基甲酰胺基抗蚜威(desmethylformamido-pirimicarb)、脱甲基抗蚜威(desmethyl-pirimicarb)、氯亚胺硫磷(dialifos)、燕麦敌(di-allate)、二嗪农(diazinon)、苯氟磺胺(dichlofluanid)、敌敌畏(dichlorvos)、苄氯三唑醇(diclobutrazol)、乙霉威(diethofencarb)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、枯莠隆(difenoxuron)、吡氟草胺(diflufenican)、恶唑隆(dimefuron)、二甲草胺(dimethachlor)、二甲酚噻草胺(dimethenamid)、乐果、烯酰吗啉(dimethomorph)、烯唑醇(diniconazole)、二苯胺(diphenylamine)、乙拌磷(disulfoton)、敌草隆、吗菌灵(dodemorph)、EPN、氟环唑(epoxiconazole)、乙硫苯威(ethiofencarb)、乙硫苯威砜(ethiofencarb sulfone)、乙硫苯威亚砜(ethiofencarb sulfoxide)、乙硫磷(ethion)、乙嘧酚(ethirimol)、乙呋草黄(ethofumesate)、灭线磷(ethoprophos)、醚菊酯(etofenprox)、乙氧嘧啶磷(etrimfos)、恶唑菌酮(famoxadone)、苯线磷(fenamiphos)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)、喹螨醚(fenazaquin)、腈苯唑(fenbuconazole)、甲呋酰胺(fenfuram)、环酰菌胺(fenhexamid)、恶唑禾草灵(fenoxaprop-ethyl)、双氧威(fenoxycarb)、拌种咯(fenpiclonil)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、苯锈啶(fenpropidin)、芬普福(fenpropimorph)、唑螨酯(fenpyroximate)、倍硫磷(fenthion)、非草隆(fenuron)、麦草氟异丙酯(flamprop-isopropyl)、麦草氟甲酯(flamprop-methyl)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、双氟磺草胺(florasulam)、吡氟丁禾灵(fluazifop-butyl)、氟噻草胺(flufenacet)、氟虫脲(flufenoxuron)、伏草隆(fluometuron)、乙羧氟草醚(fluoroglycofene-ethyl)、氟喹唑(fluquinconazole)、氟啶酮(fluridone)、氟草烟(fluroxypyr-meptyl)、呋草酮(flurtamone)、氟硅唑(flusilazole)、粉唑醇(flutriafol)、灭菌丹(folpet)、地虫硫磷(fonofos)、噻唑硫磷(fosthiazate)、麦穗宁(fuberidazole)、呋线威(furathiocarb)、吡氟甲禾灵(haloxyfop-etotyl)、吡氟禾草灵(haloxyfop-methyl)、庚烯磷(heptenophos)、己唑醇(hexaconazole)、环嗪酮(hexazinone)、噻螨酮(hexythiazox)、抑霉唑(imazalil)、吡虫啉(imidacloprid)、茚虫威(indoxacarb)、碘甲磺隆(iodosulfuron-methyl)、异菌脲(iprodione)、异丙菌胺(iprovalicarb)、氯唑磷(isazophos)、异柳磷(isofenphos)、异丙隆(isoproturon)、恶唑磷(isoxathion)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、利谷隆(linuron)、马拉氧磷(malaoxon)、马拉硫磷(malathion)、MCPA-butotyl、灭蚜磷(mecarbam)、灭派林(mepanipyrim)、甲霜灵(metalaxyl)、苯嗪草酮(metamitron)、吡草胺(metazachlor)、叶菌唑(metconazole)、甲基苯噻隆(methabenzthiazuron)、甲胺磷(methamidophos)、呋菌胺(methfuroxam)、杀扑磷(methidathion)、灭梭威(methiocarb)、灭多威(methomyl)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、溴谷隆(metobromuron)、异丙甲草胺(metolachlor)、磺草唑胺(metosulam)、甲氧隆(metoxuron)、嗪草酮(metribuzin)、甲磺隆(metsulfuron-methyl)、禾草敌(molinate)、久效磷(monocrotophos)、绿谷隆(monolinuron)、灭草隆、腈菌唑(myclobutanil)、二溴磷(naled)、敌草胺(napropamide)、草不隆(neburon)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、烟碱(nicotine)、氟苯嘧啶醇(nuarimol)、呋酰胺(ofurace)、氧乐果(omethoate)、恶霜灵(oxadixyl)、杀线威(oxamyl)、杀线威肟(oxamyl-oxime)、氧化萎锈灵(oxycarboxin)、乙酰甲胺磷(oxydemeton-methyl)、多效唑(paclobutrazol)、甲基对氧磷(paraoxon-methyl)、对硫磷(parathion)、甲基对硫磷(parathion-methyl)、戊菌唑(penconazole)、戊菌隆(pencycuron)、二甲戊乐灵(pendimethalin)、甜菜宁(phenmedipham)、稻丰散(phenthoate)、甲拌磷(phorate)、甲拌磷亚砜(phorate sulfoxide)、伏杀硫磷(phosalone)、亚胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、辛硫磷(phoxim)、氟吡酰草胺(picolinafen)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、抗蚜威、乙基嘧啶磷(pirimiphos-ethyl)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、氟嘧磺隆(primisulfuron-methyl)、咪鲜胺(prochloraz)、腐霉利(procymidone)、丙溴磷(profenofos)、猛杀威(promecarb)、扑草净(prometryne)、毒草胺(propachlor)、霜霉威(propamocarb)、克螨特(propargite)、胺丙畏(propetamphos)、苯胺灵(propham)、丙环唑(propiconazole)、残杀威(propoxur)、戊炔草胺(propyzamide)、苄草丹(prosulfocarb)、氟磺隆(prosulfuron)、普硫松(prothiofos)、吡蚜酮(pymetrozine)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、吡嘧磷(pyrazophos)、达螨酮(pyridaben)、哒嗪硫磷(pyridaphenthion)、哒草特(pyridate)、嘧霉胺(pyrimethanil)、吡丙醚(pyriproxyfen)、喹硫磷(quinalphos)、喹草酸(quinmerac)、灭藻醌(quinoclamine)、喹氧灵(quinoxyfen)、精喹禾灵(quizalofop-ethyl)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、鱼藤酮(rotenone)、西玛津(simazine)、西草净(simetryn)、葚孢菌素(spiroxamine)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、治螟磷(sulfotep)、硫丙磷(sulprofos)、戊唑醇(tebuconazole)、虫酰肼(tebufenozide)、吡螨胺(tebufenpyrad)、牧草胺(tebutam)、丁噻隆(tebuthiuron)、特草定(terbacil)、特丁硫磷(terbufos)、特丁通(terbumeton)、特丁津(terbuthylazine)、特丁净(terbutryn)、杀虫畏(tetrachlorvinphos)、氟醚唑(tetraconazole)、噻苯哒唑(thiabendazole)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻磺隆(thifensulfuron-methyl)、硫双威(thiodicarb)、硫伐隆(thiofanox)、硫伐隆砜(thiofanox sulfone)、硫伐隆亚砜(thiofanoxsulfoxide)、(乙基)硫菌灵(thiophanate(-ethyl))、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、甲苯氟磺胺(tolylfluanid)、三泰芬(triadimefon)、三唑乙醇(triadimenol)、醚苯磺隆(triasulfuron)、三唑磷(triazophos)、苯磺隆(tribenuron-methyl)、三氯磷酸酯(trichlorfon)、三赛唑(tricyclazole)、草达津(trietazine)、肟菌酯(trifloxystrobin)、氟菌唑(triflumizole)、氟胺磺隆(triflusulfuron-methyl)、灭菌唑(triticonazole)、灭蚜硫磷(vamidothion)。

有害物质以及有毒物质的实例包含：1，1，1-三氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，1-二氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2，3，4，6，7，8，9-八氯二苯并呋喃、1，2，3，4，6，7，8-七氯二苯并对二恶英、1，2，3-三氯苯、1，2，3-三氯丙烷、1，2，4-三氯苯、1，2-二溴-3-氯丙烷、1，2-二溴乙烷、1，2-二氯苯、1，2-二氯乙烷、反-1，2-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、1，2-二苯基肼、1，3，5-三硝基苯、1，3-丁二烯、1，3-二氯苯、顺-3-二氯丙烯和反-3-二氯丙烯、1，4-二氯苯、2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃、2，3，5，6-四氯苯酚、2，3，7，8-四氯二苯并呋喃、2，3，7，8-四氯二苯并对二恶英、2，4，5-三氯苯酚、2，4，6-三氯苯酚、2，4，6-三硝基甲苯、2，4-二氯苯酚、2，4-二甲基苯酚、2，4-二硝基苯酚、2，4-二硝基甲苯、2，6-二硝基甲苯、2-丁酮、2-氯苯胺、2-氯苯酚、2-己酮、2-甲基萘、3，3′-二氯联苯胺、4，4′-亚甲基二(2-氯苯胺)、4，6-二硝基-邻甲酚、4-氨基联苯、4-硝基苯酚、苊、丙酮、丙烯醛、艾氏剂(aldrin)、α-六氯、铁石棉、多氯联苯1016、1221、1232、1240、1242、1248、1254、1260、1262、砷酸、石棉、苯、联苯胺、苯并(a)蒽、苯并(a)芘、苯并(b或k)荧蒽、苯并荧蒽、苯并芘、二(2-氯乙基)醚、己二酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙)酯、溴二氯乙烷、溴仿、邻苯二甲酸丁苄酯、苏达灭(butylate)、砷酸钙、咔唑、四氯化碳、三硫磷(carbophenothion)、氯丹(chlordane)、十氯酮(chlordecone)、氯苯、氯二溴甲烷、氯乙烷、氯甲烷、毒死蜱、屈(chrysene)、温石棉、顺氯丹、煤焦杂酚油、对甲酚、甲酚、氰化物、环三亚甲基三硝胺(RDX)、o，p′-或p，p′-ddd、p，p′-dde、o，p′-或p，p′-ddt、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、二嗪农、二苯并(a，h)蒽、(氯化)二苯并呋喃、二苯并噻吩、二溴氯丙烷、二氯苯、二氯乙烷、二氯丙烷(dichloroprop)、敌敌畏、三氯杀螨醇(dicofol)、狄氏剂(dieldrin)、乐果、二甲基甲酰胺、二甲基次胂酸、邻苯二甲酸二正丁酯、二硝基甲苯、乙拌磷、(α-；β-)硫丹(endosulfan)(硫酸盐)、异狄氏剂(endr i n)(醛；酮)、灭克磷(ethoprop)、乙醚、乙基苯、荧蒽、甲醛、γ-六氯、谷硫磷(guthion)、七氯(heptachlor)、环氧七氯、七氯联苯、七氯二苯并呋喃、七氯二苯并对二恶英、六氯苯、六氯丁二烯、α-、β-、δ-、γ-六氯环己烷、六氯环戊二烯、六氯二苯并呋喃、六氯二苯并对二恶英、六氯乙烷、肼、氰化氢、茚并(1，2，3-cd)芘、甲氧氯(methoxychlor)、甲基异丁基酮、甲基对硫磷、二氯甲烷、甲基汞、二溴磷、萘、n-亚硝基二甲基胺、n-亚硝基二正丙基胺、n-亚硝基二苯基胺、邻甲酚、氧氯丹(oxychlordane)、对硫磷、五氯苯、五氯联苯、五氯丁二烯、五氯二苯并呋喃、五氯二苯并对二恶英、五氯苯酚、菲、苯酚、甲拌磷、钋-210、多溴化联苯、多氯化联苯、多环芳香族烃、对二甲苯、芘、除虫菊(pyrethrum)、s，s，s-三丁基三硫磷酸酯、氯化松节油(strobane)、苯乙烯、四氯联苯、四氯二苯并对二恶英、四氯乙烷、四氯乙烯、四氯苯酚、硫氰酸酯、甲苯、毒杀芬(toxaphene)、反式氯丹、三丁基锡、三氯苯、三氯乙烷、三氯乙烯、三氯氟乙烷、氟乐灵(trifluralin)、氯乙烯。

农林学分析物：

植物以及动物病原体、真菌毒素、环境污染物等

工艺工程/食品技术/生物技术/化妆品分析物：

化学以及生物技术合成产物(包含主要产物、中间产物、副产物以及降解产物)，诸如维生素、香料、药物、毒素、脂质、氨基酸、甘油酯、碳水化合物、纤维、甜味剂、着色剂、防腐剂、多糖、真菌毒素等

食品添加剂的实例包含：安赛蜜K(acesulfam K)、乙酰化氧化淀粉、乙酰化淀粉、乙酰化二淀粉己二酸酯、乙酰化二淀粉磷酸酯、诱惑红(allurared AC)、α-生育酚、铝漆、硫酸铝钠、苋菜红、氨法焦糖色素、亚硫酸铵焦糖色素、胭脂树红(annatto)、花青素、苹果酸、抗坏血酸、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame)、偶氮玉红(azorubine)、甜菜根红(beetrootred)、膨润土、苯甲酸、苄醇、琥珀酸、β-阿朴-8′-胡萝卜素醛、β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯、β-环糊精、蜂蜡(白和黄)、联苯、胭脂树橙(bixin)、硼酸、棕色FK、棕色HAT、亮蓝FCF、亮黑BN、丁二烯-苯乙烯共聚物、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、5′-核糖核苷酸钙、角黄素(canthaxanthin)、辣椒红素(capsanthin)、辣椒玉红素(capsorubin)、尿素、羧甲基纤维素、巴西棕榈蜡、胡萝卜素(混合胡萝卜素、β胡萝卜素)、卡拉胶(carrageenan)、纤维素(微晶纤维素、纤维素粉末)、喹啉黄、叶绿素、叶绿酸、胭脂虫红A(cochenille red A)、酶水解羧甲基纤维素、赤藓红(erythrosin)、γ-生育酚、日落黄S、结冷胶(gellan)、绿色S(green S)、羟丙基纤维素、羟丙基二淀粉磷酸酯、羟丙基甲基纤维素、羟丙基淀粉、靛蓝I(indigotin I)、转化酶、叶绿素的含铜络合物、叶绿酸的含铜络合物、姜黄素(curcumin)、淀粉磷酸单酯、羧甲基纤维素钠、新橙皮苷DC(neohesperidin DC)、乳酸链球菌素(nisin)、降胭脂树橙(norbixin)、氧化淀粉、专利蓝V、果胶类(果胶、酰胺化果胶)、磷酸化二淀粉磷酸酯、磷酸、葡聚糖、聚乙二醇6000、氧化聚乙烯蜡、无分枝脂肪酸C2-C18的聚乙烯酯、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、核黄素(riboflavin)、核黄素5′-磷酸盐、红色2G、糖精以及其Na盐、K盐和Ca盐(糖精、糖精钠、糖精钙、糖精钾)、乙酸异丁酸蔗糖酯、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、辛烯基琥珀酸淀粉钠、丹宁酸(tannin)、柠檬黄(tartrazine)、甜味蛋白(thaumatin)、黄芪胶、加工过的麒麟菜属海藻(processed eucheuma seaweed)、交联羧甲基纤维素钠、黄原胶。

化妆品的实例包含：PEG和PEG衍生物、甲醛树脂、麝香化合物、表面活性剂(tenside)、石蜡、芳香族胺、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、伯洛沙姆184(poloxamer 184)、水解弹性蛋白(hydrolyzed elastine)、尿囊素(allantoin)、乳酸酶、黄原胶

在文献中，已知具有各种阳离子的各种螯合物为荧光团。甚至具有一定量芳香族基团的蛋白质或抗体也可充当荧光团。尤其证明铕穴合物荧光团和铽穴合物荧光团对本发明是极有利的，因为所述荧光团具有可与其他组分(诸如待测量样品中所存在的蛋白质)的可能荧光良好分离的特征性发光光谱。铕穴合物荧光团与铽穴合物荧光团的特征在于由穴合物有机部分引起的光吸收以及对铕离子的直接能量转移。铕离子是以氧化态3+存在。铽离子也是以氧化态3+存在。优选利用氮分子激光器在337nm的波长下激发铕穴合物荧光团。在620nm下测量发射(而在铽的情况下，在545nm下测量)。与所测量样品的其他荧光团或其他荧光组分的荧光相比，铕穴合物荧光团与铽穴合物荧光团的荧光显著更长，因此尽管可能存在由其他组分或其他荧光团所产生的背景荧光，但仍可良好且精确地测定铕穴合物荧光团或铽穴合物荧光团的荧光。

除所谓“小分子”(即，可直接或经由连接基团与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)结合的小化学分子，诸如药理成分或毒素)之外；也可能将大分子与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)结合。荧光团特异性抗体也与由大分子和铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)组成的接合物结合，因此本文中所述的方法也可用于检测大分子。

待提及的大分子特别包含多核苷酸(polynucleotide)、寡核苷酸(oligonucleotide)、DNA片段、RNA片段、蛋白质、糖蛋白(glycoprotein)、脂蛋白(lipoprotein)、多糖(polysaccharide)、DNA、RNA、模拟表位、fab片段、fc片段、肽、凝集素、肽模拟物、gapmer、核糖酶、CpG寡聚物、DNA酶、核糖开关、聚合物、激素、维生素、碳水化合物、甘油酯或脂质。

本发明的优选实施例使用分析物分子与铕穴合物荧光团分子或络合物(complex)之间的接合物。根据本发明，也可能将来自相同分析物的两个分子与铕穴合物荧光团分子结合，或分别将来自两个不同分析物的一个分子与铕穴合物荧光团结合。另一方面，也有可能使两个相同或甚至不同的铕穴合物荧光团分子与分析物分子结合。这对于增加某一分析物的检测精度或允许同时检测数种分析物来说可能是有利的。此外，所属领域的技术人员将显而易见可提供两种以上分析物分子及/或铕穴合物荧光团分子的接合物，诸如三种相同或不同分析物分子与一或两种或两种以上铕穴合物荧光团分子的接合物。这也适用于铽。

所用优选穴合物为环状化合物，并且尤其为双环化合物。此外优选穴合物具有氮桥头(bri此ehead)原子。此外穴合物优选含有一个或一个以上吡啶(pyridine)残基或吡啶组分，且尤其优选联吡啶(bipyridine)残基或联吡啶组分或联吡啶片段。因此，尤其优选具有两个氮桥头原子的双环穴合物。

此外，吡啶组分优选存在于环状中，尤其双环系统中。优选的穴合物具有以下通式：

其中

彼此独立地表示烷基(alkyl)残基、烯烃(alkene)残基、芳基(aryl)残基、杂芳基(heteroaryl)残基、烷芳基(alkylaryl)残基、杂芳基烷基(heteroarylalkyl)残基、环基(cyclyl)残基、杂环基(heterocyclyl)残基，且尤其包括亚甲基(methylene)、乙烯基(ethylene)、乙烯氧基(ehthyleneoxy)、亚乙烯基(ethenylene)、亚烃基氨基(alkylene amino)、亚烃基氧基(alkyleneoxy)、苯基(phenyl)、联苯基(biphenyl)、吡啶基(pyridyl)、联吡啶基(bipyridyl)、苯并吡啶基(benzopyridyl)、苯并联吡啶基(benzo bipyridyl)、咪唑基(imidazole)、吡咯啉基(pyrrolinyl)及/或吡咯烷基(pyrrolidinyl)。

尤其优选具有16至20个原子尺寸的环，优选17至19个原子尺寸的环。在此上下文中，环尺寸意思是仅考虑形成接近铕或铽的最短环的那些原子。具有前述尺寸的环的环状以及尤其双环环系统特别适合并入Eu³⁺(或Tb³⁺)。尤其优选三联吡啶基(tris-bipyridyl)穴合物、吡啶基二联吡啶基(pyridyl dibypyirdyl)穴合物以及二吡啶基联吡啶基(dipyridylbipyridyl)穴合物，即具有6、5或4个吡啶基环的穴合物。

在下文中，展示具有或不具有Eu³⁺或Tb³⁺的潜在穴合物的一些实例，其中可使用Tb³⁺来代替Eu³⁺。

TBP铕穴合物

TBP₄COOH铕穴合物

PBP₄COOH铕穴合物

分析物可利用离子、共价或亲脂相互作用，通过插入或并入以及经由氢键与穴合物结合，其中优选共价键。

因此，也优选穴合物在至少一个环上带有官能基，而且分析物可直接或经由连接基团间接与所述官能基结合。

以下为特别适合的官能基：卤素(halogen)、羟基(hydroxy)、羧酸酯基(carboxylate)、羰基(carbonyl)、硫醇基(thiol)、氨基(amino)、氰酸酯基(cyanate)、异氰酸酯基(isocyanate)。与分析物的键合优选借助于亚胺(imine)键、酰胺(amide)键、酯(ester)键、醚(ether)键、醇醛加成(aldoladdition)、缩酮(ketal)键、缩醛(acetal)键、亲核取代(nucleophilic substitution)、碳酸酯(carbonate)键、氨基甲酸酯(urethane)键、硫酯(thioester)键、硫醚(thioether)键或脲(urea)键实现。

以下结构说明优选实例。

其中羧基或残基R表示与分析物分子的可能结合位点。

优选地，待检测物质的仅一个单一分子与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的分子结合。此外，实质上对本发明来说，由铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)以及分析物组成的接合物的每个分子仅结合一个单一抗体。因此，可能使用的连接基团不应太长，否则就会使铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)与分析物之间的距离变得足以引起荧光团特异性抗体与分析物特异性抗体发生结合。正是由于空间效应，两个抗体与一个接合物的结合被排除。上述物质可能作为分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)结合。

如果与本文中所述的穴合物一起使用，那么Eu³⁺以及Tb³⁺允许荧光的时间分辨测量(时间分辨荧光(time resolved fluorescence，TRF))，并因此允许所测量信号与背景信号之间的清楚区别。

本发明的另一实施例旨在检测由生物体形成并且针对某一分析物的抗体，而非检测分析物自身。在所述实施例中，分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的接合物是与荧光团特异性抗体组合使用，且当添加样品溶液时测定荧光增加，这是因为由于分析物特异性抗体与荧光团特异性抗体的同时结合被排除，因此待检测分析物特异性抗体至少部分置换复合物中的荧光团特异性抗体与接合物。

本文中所述的方法允许分析物的定性以及特别是定量测量。此外，本发明方法的有利之处在于所有常规免疫分析(尤其所有非均相免疫分析，诸如ELISA)都可能适用于本发明的方法。因此，操作过程会相当便利，因为本发明方法是均相分析，即使用者仅需要将其样品与测量样品混合，且随后测定其荧光。此外，所述过程可容易地实现自动化，例如在常规诊断中，借助于自动化能够方便地省时省钱。

此外，尤其优选的是将特定量的过氧化氢(H₂O₂)添加到含有铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)与分析物的接合物以及分析物特异性抗体和荧光团特异性抗体的样品溶液中。已证实过氧化氢对荧光具有积极影响(即发光的影响)。特别地，过氧化氢似乎增加或相应地加强发光，从而使测量灵敏性显著增加或相应地允许极少量的待测量分析物。然而，过氧化氢的作用模式尚不清楚。

优选添加相对于接合物至少一等摩尔(equimolar)量的过氧化氢。相对于接合物而言更高量的过氧化氢，诸如2倍摩尔过量(2mol当量)、3倍摩尔过量(3mol当量)、5倍摩尔过量(5mol当量)或10倍摩尔过量(10mol当量)同样是可能的。因此，可以相对于接合物为0.1∶1至50∶1，优选0.5∶1至10∶1，进一步优选0.8∶1至4∶1，且特别优选1∶1至2(H₂O₂)∶1(接合物)，的摩尔比率来使用过氧化氢。

本发明的另一优选实施例包括向由分析物特异性抗体和荧光团特异性抗体以及铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)与分析物的接合物构成的样品溶液添加其他发光团。所述其他发光团借助于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)来转移或相应地接收荧光(发光)信号，使得在测量样品中的不同分析物可得到分析。所述其他发光团优选为所谓具有不同波长的量子点。由接合物、两种抗体以及量子点组成的组合物允许对在一个测量样品中的数种不同分析物进行多重筛选。

此外，本发明涉及一种组合物，其包括：

a)分析物与铕穴合物荧光团或(铽穴合物荧光团)的接合物，

其中分析物与铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的接合物仅允许同时结合一种单一抗体，

b)对分析物特异的抗体，以及

c)对铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)特异的抗体。

所述组合物可进一步含有作为另一组分的过氧化氢及/或其他发光团。

此组合物为用于检测各种分析物的试剂盒的基本组分。此试剂盒含有用于检测一种或一种以上分析物的前述组合物的至少一者和一种或一种以上用于实施反应的样品容器以及关于如何实施反应的说明书。

此外，组合物也可含有不同分析物与相同或不同铕穴合物荧光团(或铽穴合物荧光团)的不同接合物以及不同分析物特异性抗体，以同时检测不同分析物的存在。

本发明的方法涉及均相免疫分析的实现。在均相系统中，将测量样品(含有多个其他组分(其类型、浓度以及对测量系统的影响在很大程度上未知)以及分析物)与测量系统(含有用于产生测量信号的组分)组合。此后，立即进行测量，即测量样品的所有组分(甚至是未明确地影响且从而掺杂进测量系统并因此掺杂进测量信号的那些组分)保留在系统中。只要测量发生在限定基质(例如分析物的水溶液)中，那么所述干扰就会受到控制。然而，这些系统缺乏实用相关性。对于实用相关测量(例如在患者的血清物质、生产废渣或土壤样品的分解物中)来说，测量信号与背景信号应加以区别。仅在满足这些先决条件时，均相系统关于测量过程简便性以及由此得到的时间和劳力减少的优点才会变得显而易见。

本发明的方法是一种均相荧光猝灭免疫分析法。先前所述的上下文对于此系统也有效。迄今已知使用“简单”荧光团(诸如荧光素)的系统有约20年，尽管所述系统具有不容置疑的功能以及明显优点，但由于所述原因，其仍未获得实用相关性。目前尚未解决的问题在于所述的基质效应。在测量样品与测量系统的混合物中，不仅激发荧光团而且激发测量样品中的多个其他组分(例如血清蛋白)以使其发荧光。在此上下文中，所述荧光团的发光在与残留在测量样品测量混合物中组分发射相同的时间窗内发生。背景信号的类型以及强度取决于测量样品的个体组成并且不能事先确定。因此，不能实施实用相关测量样品(诸如患者血清)的测量。

然而，这些问题可借助于时间分辨荧光测量(TRF)得以解决。为此，用元素铽以及铕的螯合物或相应地穴合物替代目前所用的荧光团。由于所述络合物内的辐射自由能跃迁，导致发光延迟。如前所述，激发测量样品的组分以及荧光团，以使其同时发荧光。然而，只有在背景荧光消退后才可检测测量信号。因此，也可分析实用相关样品。这可以通过将均相测试原则与时间分辨荧光测量组合而成为可能。

因此本发明的方法尤其适用于测量包含多个其他组分的样品(诸如血液样品或土壤样品)，而无需预先对测量样品进行纯化。

实例

实例1：

1.)制备针对TBP铕穴合物的免疫血清

用以下物质使balb/c小鼠免疫：

50μg链霉亲和素(streptavidin)-TBP铕穴合物第1次免疫25μg链霉亲和素-TBP铕穴合物第2次免疫(1个月后)抽取血液以及提取血清(专家已知)

2.)检测血清对TBP铕穴合物的结合(图1)

制备测试接合物：

根据所属领域技术人员已知的方法，使用戊二醛，通过连接游离氨基，而将TBP铕穴合物与BSA偶联。

在ELISA中检测与BSA接合物结合的抗体。

3.)检测由于抗体与TBP铕穴合物结合而引起的荧光猝灭(图2)

测量样品(150μl)，由以下各物组成：

TBP铕穴合物1∶200000(最终浓度)     75μl

针对TBP铕穴合物的免疫血清  连续稀释75μl

或相应地

三种免疫前血清(圆形)

针对三种其他抗原的三种免疫血清(正方形)

荧光测量：

激发337nm；发射620nm：

4.)检测分析物结合抗体对荧光团结合抗体的置换(图3)

制备分析物(荧光素)与荧光团(铕穴合物)的接合物

使异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)与TBP铕穴合物(0.03mM)以2∶1的摩尔比率反应。PBS用作培养基，并且反应时间为室温下4小时。

测量样品(150μl)，由以下各物组成：

接合物1∶200000(最终浓度)75μl

针对TBP铕穴合物的免疫血清1∶200(最终浓度)37.5μl

抗体DE1(抗荧光素抗体)或相应地37.5μl

抗体D35(抗葡萄糖氧化酶抗体)

荧光测量：

激发337nm；发射620nm

图3显示第1至4号测量样品的测量值。

测量样品号	荧光团	血清	抗体	测量信号
					123456	TBP铕穴合物/荧光素TBP铕穴合物/荧光素TBP铕穴合物TBP铕穴合物TBP铕穴合物无	抗TBP铕穴合物抗TBP铕穴合物抗TBP铕穴合物抗TBP铕穴合物免疫前血清无	抗荧光素抗半乳糖苷酶抗荧光素抗半乳糖苷酶抗荧光素无	27002191206520358894578

实例2：关于铕螯合物的实验

目的：

检测血清样品中猝灭铕螯合物荧光的多克隆抗体。

模型系统：

用铕螯合物/OVA接合物(OVA＝卵白蛋白)使测试动物(balb/c小鼠)免疫。测试所制备血清样品猝灭铕螯合物/BSA接合物荧光的特性。所用铕螯合物为具有以下结构的[EuL]，其中Ln表示铕：

制备铕螯合物/蛋白接合物

铕螯合物[EuL]是以NHS酯的形式存在。在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.4.)中过夜进行与载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)以及OVA的偶联。

偶联后，将接合物对PBS透析并且不预先纯化或表征而用于测试中。

用[EuL]-OVA使测试动物免疫以及提取血清

2只balb/c小鼠：

在完全Freund佐剂中用100μg接合物进行第一次免疫。一个月后在不含佐剂下用50μg接合物进行第二次免疫。在第2次免疫一周后抽取血液。

用于猝灭[EuL]-BSA接合物荧光的免疫血清测试

测量样品由75μl经稀释血清样品以及75μl[EuL]/BSA接合物(1∶10000稀释；最终浓度)组成。用PBS-NKS(含5％牛血清的PBS)稀释测量样品的所有组分。

1小时后在cryptor(Cezanne)中测量荧光。利用氮分子激光器在337nm下产生激发；在620nm下实现时间分辨荧光测量。

结果：

TW906-1血清(来自免疫906-1的血清)显示所希望的荧光猝灭效应，即在血清中存在猝灭(类似于穴合物)铕螯合物荧光的抗体(参见图4)。

实例3：关于半抗原铕穴合物的实验

目的：

检测利用与接合物中半抗原结合的第二分子对与半抗原(小分子)与荧光团(铕穴合物)的接合物形成键结的猝灭铕荧光的单克隆抗体的置换，以及使用所述效应测定半抗原浓度。

模型系统：

使用铕穴合物(荧光团)与生物素(维生素H)(半抗原，分析物)的接合物。与荧光团形成键结的猝灭铕穴合物荧光的单克隆抗体G24-BA9被结合生物素的蛋白质链霉亲和素置换。所述效应可通过外部引入游离分析物(生物素)而逆转。在此上下文中发生的荧光改变允许测定游离分析物(生物素)的浓度。

制备铕穴合物/生物素(维生素H)接合物Eu(NH ₂ )-生物素

材料：

穴合物NH₂    (cisbio)    (穴合物NH₂＝TBP铕穴合物，参见第18页)

生物素NHS    (Fl uka)

偶联：

将生物素NHS以及穴合物NH₂预先溶解于DMSO中。以7(穴合物)比1(生物素)的摩尔比率将两种组分混合于偶联反应中。在室温下在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中过夜进行偶联。

在接合物未经进一步纯化的情况下使用Eu(NH₂)生物素接合物。

在荧光猝灭免疫分析中测定生物素(维生素H)浓度

以下四种组分以指定最终浓度各自混合于150μl的测量反应中：

穴合物     Eu-NH₂-生物素   1∶300000稀释

猝灭剂     G24-BA920μg/ml(穴合物抗体)

置换抗体   链霉亲和素      3μg/ml

分析物     生物素  连续稀释0至100ng/ml

用PBS-NKS(含5％牛血清的PBS)稀释测量样品的所有组分。

l小时后在cryptor(Cezanne)中测量荧光。利用氮分子激光器在337nm下产生激发；在620nm下进行时间分辨荧光测量。

结果：

与Eu-NH2-生物素形成键结的链霉亲和素可被游离生物素置换。因此，G24-BA9可与荧光团结合，从而猝灭荧光。鉴于所用材料(特别是鉴于所用接合物的原始性)，分析惊人地灵敏(参见图7)。

实例4：关于蛋白质铕穴合物的实验

目的：

检测利用与接合物中蛋白特异性结合的抗体对与蛋白质(大分子)与荧光团(铕穴合物)的接合物形成键结的淬灭铕荧光的单克隆抗体的置换。

模型系统：

使用铕穴合物(荧光团)与过氧化物酶(POD)(分析物)的接合物。与荧光团形成键结的猝灭铕穴合物荧光的单克隆抗体G24-BA9被结合过氧化物酶(POD)的抗体置换。所述效应可通过外部添加游离分析物(POD)而逆转。

制备铕穴合物/过氧化物酶(POD)接合物Eu(NH ₂ )-POD

材料：

穴合物NH₂(cisbio)(穴合物NH₂＝TBP铕穴合物，参见第17页)

过氧化物酶(sigma)

偶联：

在过氧化物酶的糖残基上产生反应性醛基，随后将因此活化的POD对0.1M NaHCO₃除盐。将如此制备的POD与穴合物NH₂以等摩尔比率混合。在室温下过夜进行偶联。利用乙醇胺(pH8)阻断未偶联的醛基，并且将接合物对PBS透析。

在接合物未经进一步纯化的情况下使用Eu(NH₂)-POD接合物。

利用抗POD血清置换与Eu(NH ₂ )-POD形成键结的G24-BA9

以下四种组分以指定最终浓度各自混合于150μl的测量反应中：

穴合物       Eu-NH₂-POD    1∶2000稀释

猝灭剂       G24-BA9  5μg/ml

置换抗体     抗POD血清     1∶1000稀释

分析物       POD    20μg/ml

用PBS-NKS(含5％牛血清的PBS)稀释测量样品的所有组分。

1小时后在cryptor(Cezanne)中测量荧光。利用氮分子激光器在337nm下产生激发；在620nm下进行时间分辨荧光测量。

结果：

在总共四种抗POD血清中，TW738显示所希望的效应。血清中所含多克隆抗体部分能够置换与Eu(NH₂)-POD形成键结的G24-BA9。所述效应可通过引入游离分析物POD而逆转(参见图5)。

图5的描述：

在实验中，使用经POD(过氧化物酶)免疫的四个测试动物的血清(a.POD)。使用针对BSA(牛血清白蛋白)或相应地GFP(绿色荧光蛋白)的免疫前血清以及免疫血清作为对照物。将血清稀释为1∶1000。

在猝灭发光的抗体G24-BA9存在下测定Eu(NH₂)/POD接合物的发光。实施实验以测试免疫血清(a.POD)中所含结合POD的抗体能够置换与接合物形成键结的抗体G24-BA9的程度。作为所述置换的结果，可预期发光会增加。血清TW738a.POD显示此效应。其他免疫血清以及免疫前血清呈阴性。

通过引入过量游离POD可逆转在血清TW738a.POD中所观测到的效应。在此情况下，与接合物结合的POD结合抗体主要与游离POD结合而非与接合物结合。因此，观测到被G24-BA9结合的接合物以及发光的同时猝灭。

利用结合POD的单克隆抗体置换与Eu(NH ₂ )-POD形成键结的G24-BA9

以下四种组分以指定最终浓度各自混合于150μl的测量反应中：

穴合物     Eu-NH₂-POD     1∶2000稀释

猝灭剂     G24-BA9  5μg/ml

置换抗体   抗POD抗体       20μg/ml

分析物     POD      20μg/ml

用PBS-NKS(含5％牛血清的PBS)稀释测量样品的所有组分。

1小时后在cryptor(Cezanne)中测量荧光。利用氮分子激光器在337nm下产生激发；在620nm下进行时间分辨荧光测量。

结果：

所测试的总共33种POD结合单克隆抗体中有两种抗体可观测到所希望的效应。单克隆抗体B92-FG9以及E17-DA3能够部分地置换与Eu(NH₂)-POD形成键结的G24-BA9。通过引入游离分析物POD可逆转所述效应。证明将两种抗体组合于一个反应中尤其成功(参见图6)。

图6的描述：

在实验中使用针对POD的两种单克隆抗体B92-FG9以及E17-DA3。

在猝灭发光的抗体G24-BA9存在下测定Eu(NH₂)-POD接合物的发光。实施实验以测试两种结合POD抗体的混合物能够置换与接合物形成键结的抗体G24-BA9的程度。作为所述置换的结果，可预期发光会增加。

第一个条形说明在不含结合POD的抗体情况下的发光。第二个条形说明在POD结合抗体存在下的比率。观测到发光增加。第三个条形说明添加游离POD逆转所述效应并显著降低发光。

实例5：由过氧化氢引起发光增加

由于过氧化氢而引起铕穴合物发光增加。

在实验中使用TBP铕穴合物(Eu(TBP)-链霉亲和素，10M-8M)以及过氧化氢(过氧化氢脲，10％-5％)。测量体积为400μl。在ICCD(Andor)栅格分光计中测量发光。

结果，由于添加过氧化氢，TBP铕穴合物的发光增加30％(参见图8)。

实例6：关于铽螯合物的实验

目的：

检测血清样品中猝灭铽螯合物荧光的多克隆抗体。

模型系统：

如实例2中所述用铽螯合物/OVA接合物使测试动物(balb/c小鼠)免疫。类似地，使用与实例2中相同的穴合物，而差别在于在本实例中Ln表示铽[TbL]。

制备铽螯合物/蛋白质接合物

铽螯合物[TbL]以NHS酯形式存在。在室温下在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中过夜进行与载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)以及OVA的偶联。

偶联后，将接合物对PBS透析，并且不预先纯化或表征而用于测试中。

用[TbL]-OVA使测试动物免疫以及提取血清

如实例2中所述使2只balb/C小鼠免疫。

测试免疫血清猝灭[EuL]-BSA接合物荧光的特性

测量样品由75μl经稀释血清样品以及75μl[TbL]-BSA接合物(1∶10000稀释；最终浓度)组成。用PBS-NKS(含5％牛血清的PBS)稀释测量样品的所有组分。

1小时后在cryptor(Cezanne)中测量荧光。在545nm下测定铽螯合物的荧光。

结果：

两种血清TW907-1(来自免疫907-1的血清)与TW907-2(来自免疫907-2的血清)显示所希望的荧光猝灭效应，即血清中存在猝灭(类似于穴合物)铽螯合物荧光的抗体(参见图9)。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1. 一种用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述用于检测一种或一种以上分析物的方法包括以下步骤：

a)提供以下三种组分：

所述分析物与铕穴合物荧光团或铽穴合物荧光团的接合物，

对所述分析物特异的抗体，以及

对所述铕穴合物荧光团特异或对所述铽穴合物荧光团特异的抗体，

其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物或所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)添加所述分析物，以及

c)光谱法测量所述铕穴合物荧光团的荧光或光谱法测量所述铽穴合物荧光团的荧光。

2. 根据权利要求1所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其进一步包括过氧化氢。

3. 根据权利要求1或2所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其进一步包括至少一种其他发光团。

4. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述分析物的分子与所述铕穴合物荧光团的分子之间的共价键存在于所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物中，或其中所述分析物的分子与所述铽穴合物荧光团的分子之间的共价键存在于所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物中。

5. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述分析物是选自由

病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素、细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料组成的群组。

6. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中限定对所述分析物特异的抗体与对所述铕穴合物荧光团特异的抗体的比率，且其中限定对所述分析物特异的抗体与对所述铽穴合物荧光团特异的抗体的比率。

7. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述铕穴合物荧光团或所述铽穴合物荧光团包括三联吡啶穴合物。

8. 一种组合物，包括：

a)分析物与铕穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铕穴合物荧光团特异的抗体。

9. 一种组合物，包括：

a)分析物与铽穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铽穴合物荧光团特异的抗体。

10. 根据权利要求8或9所述的组合物，其进一步包括过氧化氢。

11. 根据权利要求8、9或10所述的组合物，其进一步包括至少一种其他发光团。

12. 一种用于检测至少一种分析物的试剂盒，包括：

a)所述分析物与铕穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铕穴合物荧光团特异的抗体。

13. 一种用于检测至少一种分析物的试剂盒，包括：

a)所述分析物与铽穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铽穴合物荧光团特异的抗体。

14. 根据权利要求12或13所述的用于检测至少一种分析物的试剂盒，其进一步包括过氧化氢。

15. 根据权利要求12、12或14所述的用于检测至少一种分析物的试剂盒，其进一步包括至少一种其他发光团。

16. 一种分析物与铕穴合物荧光团的接合物或分析物与铽穴合物荧光团的接合物，其中所述分析物是选自由

病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素与细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料组成的群组，且所述铕穴合物荧光团或所述铽穴合物荧光团包括三联吡啶穴合物。

17. 根据权利要求16所述的分析物与铕穴合物荧光团的接合物或分析物与铽穴合物荧光团的接合物，其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团或所述铽穴合物荧光团是共价结合。

18. 一种根据权利要求16或17所述的分析物与铕穴合物荧光团的接合物或分析物与铽穴合物荧光团的接合物的用途，用于检测所述分析物，其中所述分析物是选自由

病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素与细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料组成的群组。

Claims (22)

1.一种用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述用于检测一种或一种以上分析物的方法包括以下步骤：

a)提供以下三种组分：

所述分析物与铕穴合物荧光团或铽穴合物荧光团的接合物，

对所述分析物特异的抗体，以及

对所述铕穴合物荧光团特异或对所述铽穴合物荧光团特异的抗体，

其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物或所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)添加所述分析物，以及

c)光谱法测量所述铕穴合物荧光团的荧光或光谱法测量所述铽穴合物荧光团的荧光。

2.根据权利要求1所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其进一步包括过氧化氢。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其进一步包括至少一种其他发光团。

4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述分析物的分子与所述铕穴合物荧光团的分子之间的共价键存在于所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物中，或其中所述分析物的分子与所述铽穴合物荧光团的分子之间的共价键存在于所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物中。

5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述分析物是选自由

病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素、细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料组成的群组。

6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中限定对所述分析物特异的抗体与对所述铕穴合物荧光团特异的抗体的比率，且其中限定对所述分析物特异的抗体与对所述铽穴合物荧光团特异的抗体的比率。

7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的用于检测一种或一种以上分析物的方法，其中所述铕穴合物荧光团或所述铽穴合物荧光团包括三联吡啶穴合物。

8.一种抗体，能够与铕穴合物荧光团及/或分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物结合，且能够借助于所述结合猝灭或可测量地降低所述铕穴合物荧光团的荧光。

9.一种抗体，能够与铕穴合物荧光团及/或分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物结合，且能够借助于所述结合增强或可测量地增加所述铕穴合物荧光团的荧光。

10.一种抗体，能够与铽穴合物荧光团及/或分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物结合，且能够借助于所述结合猝灭或可测量地降低所述铽穴合物荧光团的荧光。

11.一种抗体，能够与铽穴合物荧光团及/或分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物结合，且能够借助于所述结合增强或可测量地增加所述铽穴合物荧光团的荧光。

12.一种组合物，包括：

a)分析物与铕穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铕穴合物荧光团特异的抗体。

13.一种组合物，包括：

a)分析物与铽穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铽穴合物荧光团特异的抗体。

14.根据权利要求12或13所述的组合物，其进一步包括过氧化氢。

15.根据权利要求12、13或14所述的组合物，其进一步包括至少一种其他发光团。

16.一种用于检测至少一种分析物的试剂盒，包括：

a)所述分析物与铕穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铕穴合物荧光团特异的抗体。

17.一种用于检测至少一种分析物的试剂盒，包括：

a)所述分析物与铽穴合物荧光团的接合物，

其中所述分析物与所述铽穴合物荧光团的接合物仅允许结合一种单一抗体，

b)对所述分析物特异的抗体，以及

c)对所述铽穴合物荧光团特异的抗体。

18.根据权利要求16或17所述的用于检测至少一种分析物的试剂盒，其进一步包括过氧化氢。

19.根据权利要求16、17或18所述的用于检测至少一种分析物的试剂盒，其进一步包括至少一种其他发光团。

20.一种分析物与铕穴合物荧光团的接合物或分析物与铽穴合物荧光团的接合物，其中所述分析物是选自由

病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素与细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料组成的群组，且所述铕穴合物荧光团或所述铽穴合物荧光团包括三联吡啶穴合物。

21.根据权利要求20所述的分析物与铕穴合物荧光团的接合物或分析物与铽穴合物荧光团的接合物，其中所述分析物与所述铕穴合物荧光团或所述铽穴合物荧光团是共价结合。

22.一种根据权利要求20或21所述的分析物与铕穴合物荧光团的接合物或分析物与铽穴合物荧光团的接合物的用途，用于检测所述分析物，其中所述分析物是选自由

病原体、病毒、朊病毒、细菌、寄生虫、药物、抗生素、细胞抑制剂、精神活性物质、麻醉剂、止痛剂、心脏药物、代谢物、凝结抑制剂、激素、白细胞介素与细胞因子、兴奋剂、毒品、毒素、有害物质、农药、杀虫剂、木材防腐剂、除草剂、杀真菌剂、爆炸物、维生素以及香料组成的群组。

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