KR100984624B1 - 분석물의 분광적 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 또는 각각 테르븀 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트를, 이 분석물에 특이적인 항체 및 유로퓸 크립테이트 형광단 또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단에 특이적인 항체와 함께 제공하는 단계, 및 분석물이 첨가될 때 발생하는 형광 켄칭을 분광기로 측정하는 단계에 의해 하나 이상의 분석물, 특히 병원체, 바이러스, 프라이온, 박테리아, 기생충, 약품, 항생제, 세포 증식 억제제, 정신 활성 물질, 마취제, 진통제, 심장 약물, 대사 산물, 응고 억제제, 호르몬, 인터류킨, 사이토카인, 경기력 향상 약물, 마약, 독소, 유독 물질, 살충제, 살곤충제, 목재 방부제, 제초제, 살진균제, 폭발물, 비타민 및 착향제의 검출 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트와, 분석물 검출용 키트에 관한 것이다.
검출 방법, 분석물, 유로퓸 크립테이트, 테르븀 크립테이트, 콘쥬게이트, 항체, 과산화수소, 형광, 형광단

Description

분석물의 분광적 검출 방법{Spectroscopic Method for the Detection of Analytes}
설명
본 발명은 분석물과 유로퓸 (또는 테르븀) 크립테이트 형광단 (fluorophore)의 콘쥬게이트를, 분석물에 특이적인 소정량의 항체 및 유로퓸 (테르븀) 크립테이트 형광단에 특이적인 소정량의 항체와 함께 제공하는 단계, 및 분석물이 첨가될 때 발생하는 형광 켄칭 (quenching)을 분광기로 측정하는 단계에 의해 하나 이상의 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 분석물과 유로품 (테르븀) 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트와, 하나 이상의 분석물의 검출에 필요한 구성 요소들을 포함하는 키트에 관한 것이다.
상이한 분석물의 검출을 위한 특이적 항체를 사용한 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 제　0 343　346　B호에는 형광 면역분석법이 기술되어 있다. 미국 특허 제4,261,968호에는 항체 및 형광 켄처 (quencher)를 사용함으로써 분석물을 검출하는 방법이 기술되어 있는데, 여기서, 형광 켄칭 정도는 측정할 분석물의 양과 직접적으로 상관 관계가 있다.
본 발명은 임의의 물질의 검출에 있어서 일반적으로 응용될 수 있는 단순한 방법을 제공하고, 이 방법에 적합한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이 목적은 본 발명의 독립항의 기술적 교시에 의해 달성된다. 본 발명의 추 가의 유리한 실시 양태는 종속항, 설명 및 실시예로부터 생긴다.
본 발명은 하나 이상의 분석물의 검출 방법에 관한 것이며, 여기서, 본 방법은
a) - 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트,
- 분석물에 특이적인 항체, 및
- 유로퓸 크립테이트 형광단에 특이적인 항체
의 세 가지 성분을 제공하는 단계
- 여기서, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의
단일 항체가 동시에 결합되게 함 - 와,
b) 분석물을 첨가하는 단계와,
c) 유로퓸 크립테이트 형광단의 형광을 분광기로 측정하는 단계
를 포함한다.
또한, 테르븀이 유로퓸 대신 사용될 수 있어서, 본 명세서에 주어진 모든 명세 사항은 유로퓸 및 테르븀 둘 모두에 대하여 유효하다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 분석물의 검출 방법에 관한 것이며, 여기서 이 방법은
a) - 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트,
- 분석물에 특이적인 항체, 및
- 테르븀 크립테이트 형광단에 특이적인 항체
의 세 가지 성분을 제공하는 단계
- 여기서, 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 동시에 결합되게 함 - 와,
b) 분석물을 첨가하는 단계와,
c) 테르븀 크립테이트 형광단의 형광을 분광기로 측정하는 단계
를 포함한다.
하기의 세 가지 성분이 본 발명에 따른 방법에 필요하다: 첫째, 검출할 물질, 즉, 분석물과 형광단의 콘쥬게이트, 및 둘째, 발견할 물질에 특이적인 항체, 및 셋째, 형광단에 특이적인 제2 항체. 과산화수소는 네 번째의 바람직한 성분이다. 상기 성분의 기능은 이하에서 더욱 더 상세하게 기술되어 있다. 분석물은 그의 존재 또는 그의 농도가 측정되며, 추가의 성분으로 간주될 수 있다. 그러나, 상기 성분은 본 발명에 따른 분석이 특정 분석물의 부재의 탐지에 또한 사용될 수 있기 때문에 필수적인 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형광" 또는 "형광 켄칭"이라는 용어는 임의의 냉광 발광 효과를 설명하고자 하는 것이며, 따라서, 이 용어는 인광 발광을 포함하여서, 각각 "형광" 또는 "형광 켄칭"이라는 용어는 각각 "인광" 또는 "인광 켄칭"을 또한 포함한다.
일반적으로, 모든 현재의 항체 유형, 예를 들어 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 2특이성 항체와, 항체 단편이 사용될 수 있으며, 단일클론 항체가 바람직하다.
항체 단편, 압타머 (aptamer), 미모토프 (mimotope), fab 단편, fc 단편, 펩티드, 렉틴, 뉴클레오티드, 펩티도미메틱 (peptidomimetic), 갭머 (gapmer), 리보 자임, CpG-올리고머, DNAzyme, 리보스위치 (riboswitch) 또는 지질이 항체 대신 사용될 수도 있다.
상기 화합물, 특히 항체 및 단일클론 항체의 제조 방법이 당업자에게 공지되어 있다.
바람직하게는, 분석물에 특이적인 항체 (분석물 특이성 항체), 및 분석물과 형광단의 콘쥬게이트에 특이적인 항체 (형광단 특이성 항체)가 정의되고 공지된 비로 사용된다. 분석물 특이성 항체라는 용어는 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 설명하는 것이며, 여기서, 상기 결합과 관련하여, 분석물에 항체가 완전히 결합하는지 또는 단지 부분적으로 결합하는지, 또는 링커 및/또는 형광단의 일부분에도 항체가 결합하는지, 또는 심지어 링커 및/또는 형광단이 이 결합에 완전히 연루되는지는 아무런 관련성이 없다. 단지 중요한 측면은, 제2 분석물 특이성 항체 및 형광단 특이성 항체 둘 모두가 결합할 수 없는 방식으로 결합이 일어나야 한다는 사실에 있다. 이와 유사하게, 형광단 특이성 항체와 관련하여, 이 항체가 형광단에 완전히 결합하는지 또는 단지 부분적으로 결합하는지, 그리고 링커 및/또는 분석물이 이 결합에 완전히 연루되는지 부분적으로 연루되는지는 아무런 관련성이 없다. 또한, 형광단 특이성 항체는 분석물 특이성 항체 및 추가의 형광단 특이성 항체 둘 모두가 결합할 수 없는 방식으로 결합되어야 한다. 이와 같이, 항체 결합의 유형은, 다른 항체가 동시에 결합할 수 없는 한은 본 발명에 필수적이지 않다.
분석물/형광단 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일한 항체가 동시에 그에 결합할 수 있도록 설계된다. 따라서, 두 가지의 분석물 특이성 항체들 또는 두 가지의 형 광단 특이성 항체들 또는 한 가지의 분석물 특이성 항체 및 한 가지의 형광단 특이성 항체가 동시에 결합하는 것은 제외된다.
또한, 본 발명은 분석물 형광단 콘쥬게이트의 형광이 분석물 특이성 항체의 결합에 의해 유의하게 영향을 받지 않는 반면, 형광단 특이성 항체의 결합은 형광이 켄칭되게 (quenched) 하거나 적어도 형광이 측정가능하게 감소되게 한다는 원리에 바탕을 둔다.
상기 세 가지 성분, 즉, 콘쥬게이트와, 분석물 특이성 항체와, 형광단 특이성 항체의 용액이 제공될 경우, 용액 중 콘쥬게이트에 두 항체 중 하나가 결합하며, 따라서 예를 들어 콘쥬게이트에는 분석물 특이성 항체가 50%의 정도로 결합하며 형광단 특이성 항체가 약 50%의 정도로 결합한다. 소량이 비결합 형태로 존재한다.
검출할 물질, 즉, 분석물을 포함하는 샘플 용액을 상기 용액에 첨가할 경우, 분석물과, 분석물을 포함하는 콘쥬게이트는 분석물 특이성 항체에서의 결합 부위에 대하여 경쟁한다. 따라서, 콘쥬게이트에 결합된 분석물 특이성 항체 중 일부분은 콘쥬게이트를 방출하고, 검출할 물질, 즉, 분석물에 결합한다. 상기 절차에 의해 자유 콘쥬게이트의 농도가 증가되지만, 이 자유 콘쥬게이트는 용액에 과량으로 존재하는 형광단 특이성 항체가 즉시 결합하게 된다. 형광단 특이성 항체의 결합으로 인하여, 형광이 켄칭되며, 이 사실은 분광기로 측정될 수 있다.
용액의 형광의 감소는 검출할 물질, 분석물의 존재를 나타내며, 여기서, 형광 켄칭 정도는 샘플 용액 중 분석물의 양을 밝혀 주는 것이다.
이와 같이, 본 발명의 방법은 형광의 감소와, 특정 분석물의 존재 및 농도와의 관계를 확립하는 일반적인 원리에 바탕을 둔다.
분명히, 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단)에 결합될 경우 또는 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단)의 콘쥬게이트에 결합될 경우 형광단의 형광을 향상시키거나 측정가능하게 증가시키는 항체가 형광 켄칭 항체 대신 사용될 수도 있음이 당업자에게는 자명하다. "측정가능하게 증가"라는 표현은, 분광 방법에 의해 독특하게 측정되고 배경 형광과 구별될 수 있는 증가를 설명하는 것이다. 상기 본 발명의 방법에 있어서, 형광의 증가 정도와, 측정할 분석물의 농도는 상관 관계가 있다.
이와 같이, 본 발명은 특히 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단) 및/또는 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단)의 콘쥬게이트에 결합할 수 있고, 상기 결합으로 인하여 형광단의 형광을 켄칭하거나 형광단의 형광을 측정가능하게 감소시킬 수 있는 항체에 관한 것이다.
다른 한편으로는, 본 발명은 또한 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단) 및/또는 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단)의 콘쥬게이트에 결합할 수 있고, 상기 결합 때문에 형광단의 형광을 향상시키거나 측정가능하게 증가시킬 수 있는 항체에 관한 것이다.
바람직하게 사용되는 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각, 테르븀 크립테이트 형광단)로는 본원에 기술된 것들이 있다.
본 발명의 항체는 표준 방법에 따라, 예를 들어 하이브리도마 기술에 의해 (문헌[(Koeler and Milstein, Nature 1975, 256, 495-497]), 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 제노(Xeno) 생쥐의 사용에 의해 또는 세포 배양에서 영구적으로 생육가능하고 항체를 생산하는 세포에 의해 (문헌[Pasqualini and Arap, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 6, 257-259]) 생성된다. 또한, 본 항체는 예를 들어 파지 디스플레이 (phage display) 또는 리보좀 디스플레이 (ribosome display) 또는 유사 기술에 의해 생성되는 재조합 항체 라이브러리 (library)로부터 유래될 수도 있다.
킬레이트 결합되거나 크립테이트 결합된 란탄족 원소, 특히 유로퓸 (Eu3+) 및 테르븀 (Tb3+)의 형광을 감소시키는 항체, 또는 킬레이트 결합되거나 크립테이트 결합된 란탄족 원소, 특히 유로퓸 (Eu3+) 및 테르븀 (Tb3+)의 형광을 향상시키는 항체가 다양한 측정 시스템의 확립에 사용될 수도 있다. 특히, 이것은 요망되는 특이성의 항체 생산 세포의 스크리닝 절차와, 공지된 항체의 결합 친화성과 관련한 항체 친화성의 결정에 있어서의 이들의 용도에 관계된다. 이와 유사하게, 이러한 항체는 FRET (fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 면역분석법의 개발에 사용될 수도 있다. 본원에 기술된 용도는 용액 형태의 균질한 분석물에서의 전술한 항체의 사용에 관한 것이다. 분명히, 고체상 분석물 중 그러한 항체, 특히 마이크로어레이 (microarray)의 형태의 항체는, 실시간 PCR 시스템이 실현될 경우 본 발명의 항체로서 또한 사용될 수 있다.
특히 하기 샘플이 샘플 용액으로서 사용될 수 있다: 타액 샘플, 혈액 샘플, 소변 샘플, 점액 샘플, 소화된 조직 샘플, 물 샘플, 폐수 샘플, 화학 제조 공정으로부터의 샘플, 추출된 토양 샘플, 식품 샘플, 생물학적 및 생화학적 제조 공정으로부터의 샘플, 발효액 등. 혈청 샘플과, 전술한 종류의 희석된 샘플 또는 예를 들어 희석된 토양 추출물 샘플, 점액 샘플, 발효액 등이 특히 바람직하다. 분광 분석 방법용의 적합하게 희석된 용액의 준비는 당업계의 숙련자에게 자명할 것이다.
항체를 생성할 수 있고 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)에 결합될 수도 있는 임의의 분석물이 검출할 물질로서 사용될 수 있다. 아마도 분석물의 링커를 통한 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)에의 공유 결합이 바람직하다. 이 링커는 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단) 사이에 위치하며, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단) 사이의 거리를 증가시키는 임의의 화학적 구성 요소 또는 단편으로 구성될 수 있고, 여기서, 상기 거리는 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단) 사이의 거리로 인하여 분석물 특이성 항체와 형광단 특이성 항체의 동시 결합이 가능해지도록 그렇게 크지 않아야 한다.
가능한 분석물의 예는 하기를 포함한다:
인간의 진단자로부터의 분석물:
병원체: 바이러스: 예를 들어, 홍역, 인플루엔자, SARS, HIV, 간염, 포진, 진드기 매개 뇌수막염 등
프라이온
박테리아: 예를 들어 결핵, 라임병 (Lyme disease), 콜레라, 백일해 등
기생충: 예를 들어, 말라리아, 라이슈마니아 (leishmania) 등
종양 마커
종양 마커의 예는 하기를 포함한다:
베타 2 마이크로글로불린, 페리틴, p53, 코르티코트로핀 (ACTH), 성장 호르몬 (GH, hGH), 프로락틴 (PRL), 융모막성 생식선 자극 호르몬 (chorionic gonadotropin) (hCG 및 CG), 칼시토닌 (CT), 티로글로불린 (tg), 암종 배아성 항원 (carcinoembryonic antigen) (CEA), CA 항원 125, 72-4, 15-3 및 19-9, 알파-태아단백 (alpha-fetoprotein) (AFP), 전립선 특이성 항원 (prostate specific antigen) (PSA), 갈락토실 트랜스퍼라아제 II.
병원체의 예는 하기를 포함한다:
브루셀라 (brucella)의 IgG 및 IgM; 클라미디아 뉴모니아 (chlamydia pneumonia)의 IgA, IgG 및 IgM; 클라미디아 트라코마티스 (chlamydia trachomatis)의 IgA, IgG 및 IgM; CMV IgG 및 IgM; 뎅기 (Dengue) 바이러스의 IgG 및 IgM; EBV-VCA의 IgA, IgG 및 IgM; 에이치. 파일로리 (H. pylori)의 IgA, IgG 및 IgM; HSV 1+2의 IgG 및 IgM; 홍역 바이러스의 IgG 및 IgM; 볼거리 바이러스 (mumps)의 IgG 및 IgM; 마이코플라즈마 (mycoplasma) IgG 및 IgM; 풍진 바이러스 (rubella)의 IgG 및 IgM; 살모넬라균 (salmonella)의 IgG 및 IgM; 톡소플라스마 (toxoplasma)의 IgA, IgG 및 IgM; 트레포니마 팔리둠 (treponima pallidum)의 IgG 및 IgM; VZV IgG 및 IgM; A형, B형, C형 간염 바이러스 (hapatitis A, B, C); HIV1, 2.
약품: 예를 들어,
항생제 (암피실린, 아목시실린, 페니실린 등)
세포 증식 억제제 (독수루비신, 시스플라틴 등)
정신 활성 물질
마취제
진통제
심장 약물
응고 억제제
대사 산물:
예를 들어, 호르몬 (스테로이드 호르몬, 생식선 자극 호르몬 등)
인터류킨 및 사이토카인 등
트리요오도티로닌
혈장 단백질
효소 (세크레타아제, 리파아제, 포스파타아제 등)
지질 (콜레스테롤 등)
질환 인자 (자가 면역 진단자 (autoimmune diagnostics) 등
스포츠 의학에서의 표적:
경기력 향상 약물 (암페타민, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴 등)
마약: 예를 들어, 헤로인, 코카인, LSD 등
독소: 미코톡신, 박테리아 독소: 콜레라 독소, 백일해 독소 등
항생제, 항곰팡이제 (antimycotics) 및 항바이러스약의 예는 하기를 포함한
다:
아시클로비르 (acyclovir), 암피실린, 아목시실린, 아미노글리코시드, 암포테리신 B, 아지트로마이신, 세파졸린, 세페핌 (cefepime), 세포탁심 (cefotaxime), 세포테탄 (cefotetan), 세프포독심 (cefpodoxime), 세프타지딤 (ceftazidime), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 세푸록심 (cefuroxime), 세팔렉신 (cephalexin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 클로트리마졸 (clotrimazole), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 클린다마이신 (clindamycin), 답손 (dapsone), 디클록사실린 (dicloxacillin), 독시사이클린 (doxycycline), 에리트로마이신 락토비오네이트, 플루코나졸 (fluconazole), 포스카르네트 (foscarnet), 간시클로비르 (ganciclovir), 가티플록사신 (gatifloxacin), 이미페넴 (imipenem)/실라스타틴 (cilastatin), 이소니아지드 (isoniazid), 이트라코나졸 (itraconazole), 케토코나졸 (ketoconazole), 메트로니다졸 (metronidazole), 나프실린 (nafcillin), 니트로푸란토인 (nitrofurantoin), 니스타틴 (nystatin), 펜타미딘 (pentamidine), 페니실린, 피페라실린 (piperacillin)/타조박탐　(tazobactam), 리팜핀 (rifampin), 퀴누프리스틴 (quinupristin)/달포프리스틴 (dalfopristin), 티카르실린 (ticarcillin)/　클라불라네이트 (clavulanate), 트리메토프림 술파메톡사졸 (trimethoprim sulfamethoxazole), 발라시클로비르 (valacyclovir), 반코마이신 (vancomycin)
호르몬의 예는 하기를 포함한다:
ACTH, C-펩티드, 코르티솔, DHEA-S, 에스트라디올, 에스트리올, 테스토스테론, 인슐린, 프로인슐린, 프로게스테론, PTH.
인터류킨, 사이토카인 및 성장 인자의 예는 하기를 포함한다:
에리트로포이에틴 (EPO), 인간 성장 호르몬 (human growth hormone, hGH), 인터류킨 1 내지 18, 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor)-α,　β (TNF-α,　β), 섬유아세포 성장 인자 (fibroblast growth factor, FGF), 과립구 콜로니 자극 인자, 대식 세포 콜로니 자극 인자, 과립구/대식 세포 콜로니 자극 인자 (granulocyte, macrophage, granulocyte/　macrophage colony stimulating factor, G-CSF, M-CSF, GM-CSF), 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 성장 인자 (platelet growth factor, PGF), 산화질소, 류코트리엔.
혈장 단백질 및 기타 혈장 분자의 예는 하기를 포함한다:
C-반응 단백질 (C-reactive protein, CRP), 알부민, 응고 인자, 보체 인자 (complement factor), 면역글로불린 (IgA, IgE, IgG, IgM), 포스포리파아제, 바소프레신, 호모시스테인, 미오글로빈, 트로포닌 I, 카스파아제, 인슐린, 혈액형 결정자 (blood group determination), Rh 인자 (rhesus factor), 알파 아밀라아제, 콜린에스테라아제, 크레아틴 키나아제, 감마-GT, GOT/　ASAT, GPT/　ALAT, LDH, 췌장 리파아제, 포스파타아제, 빌리루빈, 글루코스, 크레아티닌, 지단백질.
자가면역 진단자의 예는 하기를 포함한다:
ACA IgG, ANA 스크린 (Screen) IgG, 카디오리핀 (cardiolipin) IgA, 카디오리핀 IgG, 카디오리핀 IgM, 카디오리핀 전(total) ab, dsDNA IgG, 미토콘드리알 (MA) ab, RNP/Sm IgG, Scl-70, Sm IgG, SSA IgG, SSB IgG, 티로글로불린 (tg) ab, 갑상선 퍼옥시다아제 (thyroid peroxidase, TPO) IgG
스포츠 의학에서의 표적:
경기력 향상 약물 (암페타민, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴 등)
마약 예를 들어, 헤로인, 코카인, LSD 등과, 그의 분해 산물
독소 미코톡신, 박테리아 독소: 콜레라 독소, 백일해 독소 등
경기력 향상 약물의 예는 하기를 포함한다:
동화제류 (anabolic agents), 예를 들어 볼라스테론, 볼데논, 데히드로클로로메틸테스토스테론, 디히드로테스토스테론, 클로스테볼, 플루옥시메스테론, 메스테롤론, 메탄디에논, 메테놀론, 메틸테스토스테론, 난드롤론, 노르에탄드롤론, 옥산드롤론, 옥시메스테론, 옥시메톨론; 스타노졸롤, 테스토스테론 및 화학적 또는 약리학적 관련 화합물; 베타-2 작동제류 (예를 들어, 클렌부테롤); 암페타민류: 예를 들어, 아미넵틴, 암페타민,암페타미닐, 벤즈페타민, 디메틸암페타민, 에틸암페타민, 페네틸린, 펜프로포렉스, 푸르페노렉스, 메소카르브, 메톡시페나민, 메틸암페타민, 메틸페니데이트, 모라존, 페몰린, 펜디메트라진, 피프라돌, 피로발레론 및 화학적 또는 약리학적 관련 화합물; 경구 투여, 근육내 투여 또는 정맥내 투여용 코르티코스테로이드; 펩티드 호르몬 및 그의 유사체: 예를 들어, 융모막성 생식선 자극 호르몬 HCG (인간 성 호르몬), 코르티코트로핀 (ACTH), 성장 호르몬 (HGH, 소마토트로핀), 에리트로포이에틴 (EPO). 상기에 언급된 물질로부터 방출되는 임의의 상응하는 인자가 동일하게 금지된다.
촉진제 (stimulant): 예를 들어, 아미페나졸, 코페인, 카틴, 클로르펜테르민, 클로벤조렉스, 클로르프레날린, 크로프로파미드, 크로테타미드, 에페드린, 에타페드린, 에타미반, 펜캄파민, 메페노렉스, 메틸에페드린, 니케타미드, 펜테트라졸, 페닐프로판올아민, 프롤린탄, 프로필헥세드린, 스트리크닌 및 화학적 또는 약리학적 관련 화합물.
마취제/진통제: 예를 들어, 알파프로딘, 아닐레리딘, 부프레노르핀, 덱스트로모라미드, 덱스트로프로폭시펜, 디아모르핀, 디피파논, 에토헵타진, 에틸모르핀, 레보르파놀, 메타돈, 모르핀, 날부핀, 펜타조신, 페티딘, 트리메페리딘 및 화학적 또는 약리학적 관련 화합물.
마약류의 예는 하기를 포함한다:
암페타민, 바르비투레이트, 벤조디아제핀, 칸나비노이드, 코카인 대사 산물, 코티닌, 펜타닐, 플루니트라제팜, LSD, 메탐페타민, 모르핀, 오피에이트, PCP, 삼 환계 (tricyclics).
수의학적 약으로부터의 분석물:
병원체, 약품, 대사 산물, 경기력 향상 약물, 독소 등.
환경적 진단자 유래의 분석물 (공기, 물 및 토양 분석):
유독 물질: 살충제 (PCP, 아트라진 등)
살곤충제 (피레트로이드 (pyrethroid), 바실러스 투린기엔시스 (bacillus thuringiensis) 독소 등)
목재 방부제 (린단 (Lindan) 등)
제초제 (디우론 (diuron), 몬우론 (monuron) 등)
살진균제
독소 및 폭발물 (예를 들어, 다이옥신, TNT 등)
착색제 및 바니시 (varnish)
환경 오염 물질, 독성 물질
착색제 및 바니시의 예는 하기를 포함한다:
프탈레이트, 아조 염료, 글리콜 에테르, 글리콜 에스테르, 다이옥신.
살곤충제의 예는 하기를 포함한다:
디메토에이트, 델타메트린, 디플루벤주론, 알파-, 제타-시페르메트린, 페녹시카르브, 테부펜피라드, 피리미카르브, 아자디라크틴, 피페로닐 부톡시드, 피레트린, 플로코우마펜, 클로르피리포스, 페르메트린, 칼코그란, 데카디엔 카르복실산 메틸 에스테르, 입스디엔올, (S)-시스-베르베놀, 메틸부테놀
살충제의 예는 하기를 포함한다:
3,4,5-트리메타카르브, 3-히드록시카르보푸란, 5-히드록시-클레토딤 술폰, 5-히드록시 이미다클로프리드, 5-히드록시 티아벤다졸, 6-클로로-3-페닐-피리다진-4-(피리데이트 대사 산물), 아세페이트, 아세타미프리드, 아시벤졸라르-S-메틸, 아클로니펜, 아크리나트린, 알라클로르, 알디카르브, 알디카르브 술폭시드, 알독시카르브, 아메트린, 아미도설퍼론, 아미노카르브, 아닐라진, 아트라진, 아베르멕틴 B1a, 아베르멕틴 B1b, 아자메티포스, 아진포스-에틸, 아진포스-메틸, 아족시스트로빈, 벤알락실, 벤디오카르브, 벤푸라카르브, 벤설퍼론 메틸, 벤족시메이트, 비페녹스, 비테르타놀, 보스칼리드, 브로마실, 브로무코나졸, 부피리메이트, 부프로페진, 부토카르복심, 부토카르복심 술폭시드, 부톡시카르복심, 부투론, 카르브아릴, 카르벤다짐, 카르브에타미드, 카르보푸란, 카르보술판, 카르복신, 카르펜트라존-에틸, 클로르브로무론, 클로르펜빈포스, 클로르플루아주론, 클로리다존, 클로로톨루론, 클로록수론, 클로르피리포스, 클로르설퍼론, 클로르티오포스, 시노설퍼론, 클레토딤, 클레토딤 이민 술폰, 클레토딤 이민 술폭시드, 클레토딤 술폰, 클레토딤 술폭시드, 클로디나포프-프로파르길, 클로펜테진, 클로마존, 클로피랄리드, 클로퀸토세트-멕실, 쿠마포스, 시아나진, 시아노펜포스, 시아조파미드, 시클로에이트, 시목사닐, 시프로디닐, 시로마진, 다미노지드, 델타메트린, 데메톤-s-메틸, 데메톤-s-메틸-술폰, 데스메디팜, 데스메틸포름아미도-피리미카르브, 데스메틸-피리미카르브, 디알리포스, 디-알레이트, 디아지논, 디클로플루아니드, 디클로르보스, 디클로부트 라졸, 디에토펜카르브, 디페노코나졸, 디페녹수론, 디플루페니칸, 디메푸론, 디메타클로르, 디메탄아미드, 디메토에이트, 디메토모르프, 디니코나졸, 디페닐아민, 디술포톤, 디우론, 도데모르프, EPN, 에폭시코나졸, 에티오펜카르브, 에티오펜카르브 술폰, 에티오펜카르브 술폭시드, 에티온, 에티리몰, 에토푸메세이트, 에토프로포스, 에토펜프록스, 에트림포스, 파목사돈, 펜아미포스, 펜아리몰, 펜아자퀸, 펜부코나졸, 펜푸람, 펜헥사미드, 펜옥사프로프-에틸, 페녹시카르브, 펜피클로닐, 펜프로파트린, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜피록시메이트, 펜티온, 페누론, 플람프로프-이소프로필, 플람프로프-메틸, 플라자설퍼론, 플로라술람, 플루아지포프-부틸, 플루펜아세트, 플루페녹수론, 플루오메투론, 플루오로글리코펜-에틸, 플루퀸코나졸, 플루리돈, 플루록시피르-멥틸, 플루르타몬, 플루실라졸, 플루트리아폴, 폴페트, 포노포스, 포스티아제이트, 푸베리다졸, 푸라티오카르브, 할록시포프-에토틸, 할록시포프-메틸, 헵테노포스, 헥사코나졸, 헥사지논, 헥시티아족스, 이마잘릴, 이미다클로프리드, 인독사카르브, 요오도설퍼론-메틸, 이프로디온, 이프로발리카르브, 이사조포스, 이소펜포스, 이소프로투론, 이속사티온, 크레속심-메틸, 리누론, 말라옥손, 말라티온, MCPA-부토틸, 메카르밤, 메파니피림, 메탈락실, 메타미트론, 메타자클로르, 메트코나졸, 메타벤즈티아주론, 메타미도포스, 메트푸록삼, 메티다티온, 메티오카르브, 메토밀, 메톡시페노지드, 메토브로무론, 메토라클로르, 메토술람, 메톡수론, 메트리부진, 메트설퍼론-메틸, 몰리네이트, 모노크로토포스, 모노리누론, 모누론, 미클로부타닐, 날레드, 나프로파미드, 네부론, 니코설퍼론, 니코틴, 누아리몰, 오푸라세, 오메토에이트, 옥사딕실, 옥사밀, 옥사밀-옥심, 옥시카르 복신, 옥시데메톤-메틸, 파클로부트라졸, 파라옥손-메틸, 파라티온, 파라티온-메틸, 펜코나졸, 펜시쿠론, 펜디메탈린, 펜메디팜, 펜토에이트, 포레이트, 포레이트 술폭시드, 포살론, 포스메트, 포스파미돈, 폭심, 피콜리나펜, 피콕시스트로빈, 피리미카르브, 피리미포스-에틸, 피리미포스-메틸, 프리미설퍼론-메틸, 프로클로라즈, 프로시미돈, 프로페노포스, 프로메카르브, 프로메트린, 프로파클로르, 프로파모카르브, 프로파르기트, 프로페탐포스, 프로팜, 프로피코나졸, 프로폭수르, 프로피자미드, 프로술포카르브, 프로설퍼론, 프로티오포스, 피메트로진, 피라클로스트로빈, 피라조포스, 피리다벤, 피리다펜티온, 피리데이트, 피리메타닐, 피리프록시펜, 퀴날포스, 퀸메락, 퀴노클라민, 퀴녹시펜, 퀴잘로포프-에틸, 림설퍼론, 로테논, 시마진, 시메트린, 스피록사민, 술포설퍼론, 술포텝, 술프로포스, 테부코나졸, 테부페노지드, 테부펜피라드, 테부탐, 테부티우론, 테르바실, 테르부포스, 테르부메톤, 테르부틸아진, 테르부트린, 테트라클로르빈포스, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티아클로프리드, 티아메톡삼, 티펜숴ㄹ퍼론-메틸, 티오디카르브, 티오파녹스, 티오파녹스 술폰, 티오파녹스 술폭시드, 티오파네이트 (-에틸), 티오파네이트-메틸, 톨클로포스-메틸, 톨릴플루아니드, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리아설퍼론, 트리아조포스, 트리베누론-메틸, 트리클로르폰, 트리시클라졸, 트리에타진, 트리플록시스트로빈, 트리플루미졸, 트리플루설퍼론-메틸, 트리티코나졸, 바미도티온.
유독 물질 및 독성 물질의 예는 하기를 포함한다:
1,1,1-트리클로로에탄, 1,1,2,2-테트라클로로에탄, 1,1,2-트리클로로에탄, 1,1-디클로로에탄, 1,1-디클로로에텐, 1,2,3,4,6,7,8,9-옥타클로로디벤조푸란, 1,2,3,4,6,7,8-헵타클로로디벤조-p-다이옥신, 1,2,3-트리클로로벤젠, 1,2,3-트리클로로프로판, 1,2,4-트리클로로벤젠, 1,2-디브로모-3-클로로프로판, 1,2-디브로모에탄, 1,2-디클로로벤젠, 1,2-디클로로에탄, 트랜스-1,2-디클로로에텐, 1,2-디클로로에틸렌, 1,2-디페닐히드라진, 1,3,5-트리니트로벤젠, 1,3-부타디엔, 1,3-디클로로벤젠, 시스- 및 트랜스-3-디클로로프로펜, 1,4-디클로로벤젠, 2,3,4,7,8-펜타클로로디벤조푸란, 2,3,5,6-테트라클로로페놀, 2,3,7,8-테트라클로로디벤조푸란, 2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-다이옥신, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀, 2,4,6-트리니트로톨루엔, 2,4-디클로로페놀, 2,4-디메틸페놀, 2,4-디니트로페놀, 2,4-디니트로톨루엔, 2,6-디니트로톨루엔, 2-부타논, 2-클로로아닐린, 2-클로로페놀, 2-헥사논, 2-메틸나프탈렌, 3,3'-디클로로벤지딘, 4,4'-메틸렌비스(2-클로로아닐린), 4,6-디니트로-o-크레졸, 4-아미노비페닐, 4-니트로페놀, 아세나프텐, 아세톤, 아크롤레인, 알드린, 알파-클로르덴, 아모사이트 아스베스토스 (amosite asbestos), 아로클로르 (aroclor) 1016 , 1221, 1232, 1240, 1242, 1248, 1254, 1260, 1262, 비산, 아스베스토스, 벤젠, 벤지딘, 벤조(a)안트라센, 벤조(a)피렌, 벤조(b 또는 k)플루오란텐, 벤조플루오란텐, 벤조피렌, 비스(2-클로로에틸) 에테르, 비스(2-에틸헥실)아디페이트, 비스(2-메톡시에틸) 프탈레이트, 브로모디클로로에탄, 브로모포름, 부틸 벤질 프탈레이트, 부틸레이트, 비산칼슘, 카르바졸, 사염화탄소, 카르보페노티온, 클로르단, 클로르데콘, 클로로벤젠, 클로로디브로모메탄, 클로로에탄, 클로로메탄, 클로르피리포스, 크리센, 크리소틸 아스베스토스, 시스-클로르단, 콜타르 크레오소트, 파라-크레졸, 크레졸, 시아나이드, 시클로트리메틸 렌트리니트라민 (RDX), o,p'- 또는 p,p'- ddd, p,p'-dde, o,p'- 또는 p,p'-ddt, 디(2-에틸헥실)프탈레이트, 디아지논, 디벤조(a,h)안트라센, (염소화) 디벤조푸란, 디벤조티오펜, 디브로모클로로프로판, 디클로로벤젠, 디클로로에탄, 디클로로프로프, 디클로르보스, 디코폴, 디엘드린, 디메토에이트, 디메틸 포름아미드, 디메틸아르시닉산, 디-n-부틸 프탈레이트, 디니트로톨루엔, 디술포톤, (알파-; 베타-)엔도술판 (술페이트), 엔드린 (알데히드; 케톤), 에토프로프, 에틸 에테르, 에틸벤젠, 플루오란텐, 포름알데히드, 감마-클로르덴, 구티온, 헵타클로르, 헵타클로르 에폭시드, 헵타클로로비페닐, 헵타클로로디벤조푸란, 헵타클로로디벤조-p-다이옥신, 헥사클로로벤젠, 헥사클로로부타디엔, 알파-, 베타-, 델타-, 감마-헥사클로로시클로헥산, 헥사클로로시클로펜타디엔, 헥사클로로디벤조푸란, 헥사클로로디벤조-p-다이옥신, 헥사클로로에탄, 히드라진, 시안화수소, 인데노(1,2,3-cd)피렌, 메톡시클로르, 메틸 이소부틸 케톤, 메틸 파라티온, 메틸렌 클로라이드, 메틸머큐리, 날레드, 나프탈렌, n-니트로소디메틸아민, n-니트로소디-n-프로필아민, n-니트로소디페닐아민, 오르토-크레졸, 옥시클로르단, 파라티온, 펜타클로로벤젠, 펜타클로로 비페닐, 펜타클로로부타디엔, 펜타클로로디벤조푸란, 펜타클로로디벤조-p-다이옥신, 펜타클로로페놀, 페난트렌, 페놀, 포레이트, 폴로늄 (polonium)-210, 폴리브롬화 (polybrominated) 비페닐, 폴리염소화 (polychlorinated) 비페닐, 다환식 방향족 탄화수소, p-자일렌, 피렌, 피레트룸, s,s,s-트리부틸 포스포로트리티오에이트, 스트로반, 스티렌, 테트라클로로비페닐, 테트라클로로디벤조-p-다이옥신, 테트라클로로에탄, 테트라클로로에틸렌, 테트라클로로페놀, 티오시아네이트, 톨루엔, 톡사펜, 트랜스-클로르단, 트리부틸주석, 트리클로로벤젠, 트리클로로에탄, 트리클로로에틸렌, 트리클로로플루오로에탄, 트리플루랄린, 비닐 클로라이드.
농업적 물질 (agriculture) 및 임학적 물질 (forestry) 유래의 분석물:
식물 및 동물 병원체, 진균독, 환경 오염 물질 등.
공정 공학/식품 공학/ 생물 공학/화장품에서의 분석물:
화학적 및 생물 공학적 합성 생성물 (일차 산물, 중간 산물, 부산물 및 분해 산물을 포함), 예를 들어 비타민, 착향제, 약품, 독소, 지질, 아미노산, 글리세라이드, 탄수화물, 섬유, 감미제, 착색제, 방부제, 다당류, 진균독 등.
식품 첨가제의 예는 하기를 포함한다:
아세술팜 K, 아세틸화된 산화된 전분, 아세틸화 전분, 아세틸화 디스타치 아디페이트, 아세틸화 디스타치 포스페이트, 알루라 레드 (allura red) AC, 알파 토코페롤, 알루미늄 락커, 알루미늄 소듐 술페이트, 아마란트, 암모니아 카라멜 착색제, 암모니아 술파이트 카라멜 착색제, 아나토 (annato), 안토시안, 말산, 아스코르빈산, 아스파르탐, 아조루빈, 비트루트 레드 (beetroot ret), 벤토나이트, 벤조산, 벤질 알코올, 숙신산, 베타-아포-8'-카로테날, 베타-아포-8'-카로틴산 에틸 에스테르, 베타-시클로덱스트린, 밀랍 (백색 및 황색), 비페닐, 빅신, 붕산, 브라운 FK, 브라운 HAT, 브릴리언트 블루 (brilliant blue) FCF, 블릴리언트 블랙 BN, 부타디엔-스티렌 공중합체, 부틸히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 칼슘 5'-리보뉴클레오티드, 칸탁산틴, 캅산틴, 캅소루빈, 카르바미드, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르나우바 왁스, 카로틴 (혼합 카로틴, 베타 카로틴), 카라 기난, 셀룰로오스 (미정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말), 퀴놀린 옐로우, 엽록소, 클로로필린, 코케닐 (cochenille) 레드 A, 효소에 의해 가수분해된 카르복시메틸셀룰로오스, 에리트로신, 감마 토코페롤, 선셋 옐로우 (sunset yellow) S, 겔란, 그린 (green) S, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 디스타치 포스페이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 스타치, 인디고틴 I, 인버타아제, 엽록소의 구리 함유 복합체, 클로로필린의 구리 함유 복합체, 커큐민, 모노스타치 포스페이트, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 네오헤스페리딘 DC, 니신, 노르빅신, 산화된 전분, 페이턴트 블루 (patent blue) V, 펙틴류 (펙틴, 아미드화 펙틴), 포스페이트화된 디스타치 포스페이트, 인산, 폴리덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 폴리에틸렌 왁스 옥시데이트, 비-분지된 지방산 C2-C18의 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐폴리피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 리보플라빈, 리보플라빈 5'-포스페이트, 레드 2G, 사카린 및 그의 Na-, K-, 및 Ca-염 (사카린, 사카린 소듐, 사카린 칼슘, 사카린 포타슘), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 스타치 소듐 옥테닐숙시네이트, 탄닌, 타르트라진, 타우마틴, 트래거캔스, 가공 처리된 유케우마 (eucheuma) 해초, 결합된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 잔탄.
화장품 유래의 예는 하기를 포함한다:
PEG 및 PEG 유도체, 포름알데히드 수지, 사향 화합물, 텐시드, 파라핀, 방향족 아민, 메틸-, 부틸-, 에틸-, 프로필-, 이소부틸 파라벤, 폴록사머 (poloxamer) 184, 가수분해된 엘라스틴, 알란토인, 락트산 효소, 잔탄.
문헌에서, 다양한 양이온을 갖는 다양한 킬레이트는 형광단으로서 공지되어 있다. 심지어 소정량의 방향족 기를 포함하는 단백질 또는 항체가 형광단으로서의 역할을 할 수도 있다. 특히 유로퓸 크립테이트 형광단 및 테르븀 크립테이트 형광단은 본 발명과 관련하여 매우 유리한 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 형광단들이 측정할 샘플에 존재하는 단백질과 같은 다른 성분들의 가능한 형광단로부터 매우 잘 분리될 수 있는 특징적인 냉광 스펙트럼을 가지기 때문이다. 유로퓸 크립테이트 형광단 및 테르븀 크립테이트 형광단은 유로퓸 이온에의 직접적인 에너지 전달에 의해 그리고 크립테이트의 유기 부분에 의해 야기되는 흡광에 의해 구별된다. 유로퓸 이온은 3+의 산화 상태로 존재한다. 테르븀 이온도 3+의 산화 상태로 존재한다. 유로퓸 크립테이트 형광단은 바람직하게는 질소 레이저에 의해 337 nm의 파장에서 여기된다. 발광은 620 nm (테르븀의 경우, 545 nm)에서 측정된다. 유로퓸 크립테이트 형광단 및 테르븀 크립테이트 형광단의 형광은 측정되는 샘플의 다른 형광단 또는 다른 형광 성분의 것에 비하여 유의하게 더 길어서, 유로퓸 크립테이트 형광단 또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단의 형광은 다른 성분들 또는 기타 형광단들에 의해 야기되는 가능한 배경 형광에도 불구하고 우수하게 그리고 정확하게 측정될 수 있다.
직접적으로 또는 링커를 통하여 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)에 결합할 수 있는 약리학적 성분 또는 독소와 같은 작은 화학 분자인 소위 "작은 분자" 외에도, 거대분자를 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)에 결합시키는 것이 또한 가능하다. 형광단 특이성 항체는 또한 거대분자 및 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)로 구성된 콘쥬게이트에 결합하여서, 본원에 기술된 방법이 거대분자의 검출에 또한 사용될 수 있게 한다.
언급되는 거대분자는 특히 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA 단편, RNA 단편, 단백질, 당단백질, 지단백질, 다당류, DNA, RNA, 미모토프, fab 단편, fc 단편, 펩티드, 렉틴, 펩티도미메틱, 갭머, 리보자임, CpG 올리고머, DNAzyme, 리보스위치, 중합체, 호르몬, 비타민, 탄수화물, 글리세라이드 또는 지질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에서는 분석물 분자와 유로퓸 크립테이트 형광단 분자 사이의 콘쥬게이트 또는 각각의 복합체가 이용된다. 본 발명에 따르면, 각각 동일한 분석물 유래의 2개의 분자가 유로퓸 크립테이트 형광단에 결합하거나 두 가지의 상이한 분석물 유래의 하나의 분자가 유로퓸 크립테이트 형광단에 결합하는 것이 또한 가능하다. 반면, 2개의 동일하거나 심지어 상이한 유로퓸 크립테이트 형광단 분자가 분석물 분자에 결합하는 것도 가능하다. 이는 특정 분석물의 검출 정확도를 증가시키거나 여러 분석물의 동시 검출을 허용하는 데 유리할 수 있다. 또한, 당업계의 숙련자에게는 2개 초과의 분석물 분자 및/또는 유로퓸 크립테이트 형광단 분자의 콘쥬게이트, 예를 들어 3개의 동일하거나 상이한 분석물 분자 및 하나, 2개 또는 그 이상의 유로퓸 크립테이트 형광단 분자의 콘쥬게이트를 제공 하는 것이 자명할 것이다. 이는 테르븀에 대해서도 그러하다.
사용되는 바람직한 크립테이트는 시클릭, 특히 비시클릭 화합물이다. 크립테이트는 질소 브리지헤드 (bridgehead) 원자를 갖는 것이 또한 바람직하다. 또한, 크립테이트는 바람직하게는 하나 이상의 피리딘 잔기 또는 피리딘 구성 요소를 포함하며, 비피리딘 잔기 또는 각각 비피리딘 구성 요소 또는 비피리딘 단편이 특히 바람직하다. 이와 같이, 2개의 질소 브리지헤드 원자를 갖는 비시클릭 크립테이트가 특히 바람직하다.
또한, 피리딘 구성 요소는 바람직하게는 시클릭, 특히 비시클릭 시스템에 존재한다. 바람직한 크립테이트는 하기 일반식을 갖는다:
Figure 112007083368649-pct00001
식 중,
Figure 112007083368649-pct00002
는 서로 독립적으로 알킬 잔기, 알켄 잔기, 아릴 잔기, 헤테로아릴 잔기, 알킬아릴 잔기, 헤테로아릴알킬 잔기, 시클릴 잔기, 헤테로시클릴 잔기를 나타내며, 특히 메틸렌기, 에틸렌기, 에틸렌옥시기, 에테닐렌기, 알킬렌 아미노기, 알킬렌옥시기, 페닐기, 비페닐기, 피리딜기, 비피리딜기, 벤조피리딜기, 벤조 비피리딜기, 이미다졸기, 피롤리닐기 및/또는 피롤리디닐기를 포함한다.
16 내지 20개의 원자, 바람직하게는 17 내지 19개의 원자의 크기의 고리를 갖는 사이클이 특히 바람직하다. 이와 관련하여, 고리 크기는 유로퓸 또는 각각 테르븀에 근접한 가장 짧은 고리를 형성하는 원자만이 고려됨을 의미한다. 전술한 크기의 고리를 갖는 시클릭, 특히 비시클릭 고리가 유로퓸3 + (또는 각각 Tb3 +)의 혼입에 특히 매우 적합하다. 트리스-비피리딜 크립테이트, 피리딜 디비피리딜 크립테이트와, 디피리딜 비피리딜 크립테이트, 즉, 6, 5, 또는 4개의 피리딜 고리를 갖는 크립테이트가 특히 바람직하다.
이하에 Eu3 + 또는 각각 Tb3 +를 포함하거나 포함하지 않는 잠재적인 크립테이트의 몇몇 예가 예시되어 있으며, 여기서, Tb3 +는 Eu3 + 대신 사용될 수 있다.
Figure 112007083368649-pct00003
TBP 유로퓸 크립테이트
Figure 112007083368649-pct00004
Figure 112007083368649-pct00005
TBP4COOH 유로퓸 크립테이트 PBP4COOH 유로퓸 크립테이트
Figure 112007083368649-pct00006
Figure 112007083368649-pct00007
Figure 112007083368649-pct00008
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Figure 112007083368649-pct00014
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Figure 112007083368649-pct00018
Figure 112007083368649-pct00019
Figure 112007083368649-pct00020
Figure 112007083368649-pct00021
Figure 112007083368649-pct00022
분석물은 이온 상호작용, 공유 결합적 상호작용 또는 친유적 상호작용에 의해, 삽입 또는 혼입에 의해, 그리고 수소 결합을 통해 크립테이트에 결합할 수 잇으며, 공유 결합이 바람직하다.
따라서, 크립테이트가 적어도 하나의 고리에서 작용기를 지니는 것이 또한 바람직하며, 상기 기에는 분석물이 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 결합할 수 있다.
하기가 특히 적합한 작용기이다: 할로겐, 히드록시기, 카르복실레이트기, 카 르보닐기, 티올기, 아미노기, 시아네이트기, 이소시아네이트기. 분석물에의 결합은 바람직하게는 이민 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 알돌 부가, 케탈 결합, 아세탈 결합, 친핵성 치환, 카르보네이트 결합, 우레탄 결합, 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합 또는 우레아 결합에 의해 수행된다.
하기 구조는 바람직한 예를 예시하는 것이다.
Figure 112007083368649-pct00023
Figure 112007083368649-pct00024
Figure 112007083368649-pct00025
식 중, 카르복실기 또는 잔기 R은 분석물 분자의 잠재적인 결합 부위를 나타낸다.
바람직하게는, 검출할 물질의 단지 하나의 단일 분자가 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단) 분자에 결합된다. 또한, 단지 하나의 단일한 항체가 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단) 및 분석물로 구성된 콘쥬게이트 분자 당 결합된다는 것이 본 발명에 필수적이다. 따라서, 잠재적으로 사용되는 링커는 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)와 분석물 사이의 거리가 형광단 특이성 항체 및 분석물 특이성 항체가 결합하게 하기에 충분하게 되는 거리의 것이 아니어야 한다. 입체 효과 때문에, 두 항체가 하나의 콘쥬게이트에 결합하는 것은 제외된다. 상기에 언급된 물질은 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)에 분석물로서 결합될 수도 있다.
본원에서 언급된 크립테이트와 함께 사용될 경우, Eu3+ 및 Tb3+는 형광의 시간-해상 측정 (TRF: time resolved fluorescence)을 허용하며, 따라서 측정된 시그 널과 배경 시그널 사이의 명백한 구별을 허용한다.
본 발명의 다른 실시 양태는 분석물 그 자체를 검출하는 대신 유기체에 의해 형성되며 특정 분석물에 대하여 생성된 항체를 검출하는 것을 목적으로 한다. 상기 실시 양태에서, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)의 콘쥬게이트는 형광단 특이성 항체와 조합되어 사용되며, 형광 증가는 샘플 용액이 첨가될 때 측정되는데, 그 이유는 검출할 분석물 특이성 항체는 분석물 특이성 항체 및 형광단 특이성 항체의 동시 결합이 제외됨에 따라 화합물 중 형광단 특이성 항체가 콘쥬게이트로 적어도 부분적으로 대체되기 때문이다.
본원에 기술된 방법은 분석물의 정성적, 그리고 특히 정량적 측정을 허용한다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 모든 종래의 면역분석법 (특히, 모든 이종적 면역분석법, 예를 들어, ELISA)이 본 발명에 따른 방법에 채용될 수도 있다는 점에서 유리하다. 따라서, 작업 공정은 본 발명에 따른 방법이 동질적 분석법을 대표하기 때문에 상당히 용이해지며, 즉, 사용자는 단지 샘플을 측정용 샘플과 혼합하고 그 후 그의 형광을 측정하면 된다. 또한, 이 공정은 예를 들어 통상적인 진단에서 용이하게 자동화될 수 있으며, 이것에 의해 시간 및 돈이 유리하게 절약될 수 있다.
또한, 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)와 분석물의 콘쥬게이트와, 분석물 특이성 항체 및 형광단 특이성 항체를 포함하는 샘플 용액에 소정량의 과산화수소 (H2O2)를 첨가하는 것이 특히 바람직하다. 과산화수소는 형광단에 대하여 긍정적인 영향을 미치는데, 즉, 냉광 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 특히, 과산화수소는 냉광을 증강시키거나 각각 강화시키는 것으로 보이며, 이는 측정될 분석물의 측정 민감도를 유의하게 증가시키거나 각각 매우 소량의 분석물의 측정을 허용한다. 그러나, 과산화수소의 작용 양식은 명백하지 않다. 바람직하게는, 콘쥬게이트에 대하여 적어도 1당량의 양의 과산화수소가 첨가된다. 콘쥬게이트에 대하여 보다 많은 양, 예를 들어 2배 몰 과량 (2몰 당량), 3배의 몰 과량 (3몰 당량, 5배의 몰 과량 (5몰 당량) 또는 10배의 몰 과량 (10몰 당량)의 과산화수소가 동일하게 가능하다. 따라서, 과산화수소는 콘쥬게이트에 대하여 0.1:1 내지 50:1, 바람직하게는 0.5:1 내지 10:1, 더 바람직하게는 0.8:1 내지 4:1, 특히 바람직하게는 1:1 내지 2 (H2O2):1 (콘쥬게이트)의 몰비로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시 양태는, 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)와 분석물의 콘쥬게이트로부터의 것 뿐만 아니라 분석물 특이성 항체 및 형광단 특이성 항체로부터의 샘플 용액에 다른 냉광체 (luminophore)를 첨가하는 것을 포함한다. 이러한 추가의 냉광체는 FRET (fluorescence resonance energy transfer)에 의해 형광 (냉광)을 전달하거나 또는 각각 맏는 역할을 하여서, 측정용 샘플에서 상이한 분석물이 분석될 수 있게 한다. 상기 추가의 냉광체 또는 상기 추가의 냉광체들은 바람직하게는 소위 상이한 파장의 양자점 (quantum dot)이다. 콘쥬게이트, 2종의 항체 및 양자점으로 구성된 조성물은 하나의 측정용 샘플에서 여러 상이한 분석물의 다중 스크리닝을 허용한다.
또, 본 발명은 하기를 함유하는 조성물에 관한 것이다:
a) 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)의 콘쥬게이트 - 여기서, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 동시에 결합되게 함 - ;
b) 분석물에 특이적인 항체; 및
c) 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)에 특이적인 항체.
이 조성물은 추가의 성분으로서 과산화수소 및/또는 추가의 냉광체를 추가로 함유할 수도 있다.
그러한 조성물은 다양한 분석물 검출용 키트의 필수 구성 요소이다. 이러한 키트는 하나 이상의 분석물을 검출하기 위한 적어도 하나의 전술한 조성물, 및 반응 수행용의 하나 이상의 샘플 용기와, 이 반응을 실시하는 방법에 대한 설명서를 포함한다.
또한, 조성물은 상이한 분석물의 동일하거나 상이한 유로퓸 크립테이트 형광단 (또는 각각 테르븀 크립테이트 형광단)와의 상이한 콘쥬게이트와, 상이한 분석물 특이성 항체를 또한 함유하여 상이한 분석물의 존재를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 균질한 면역분석의 실현에 관한 것이다. 균질한 시스템에 있어서, 측정용 샘플 (복수개의 다른 성분 - 이것의 유형, 농도 및 측정 시스템에 대한 영향은 크게 알려진 바가 없음 - 및 분석물을 포함함) 및 측정 시스템 (측정 시그널을 생성하기 위한 성분을 포함함)이 조합된다. 그 직후, 측정이 수행 되며, 즉, 측정용 샘플의 모든 성분 (심지어, 측정 시스템, 그리고 그에 따라 측정 시그널에 비특이적으로 영향을 주며 결과적으로 그의 품질을 떨어뜨리는 것)이 시스템 내에 남아있다. 상기 간섭은 단지 측정이 규정된 매트릭스 (예를 들어 분석물의 수용액)에서 일어나는 한 제어될 수 있다. 그러나, 이러한 시스템에서는 실제적인 관련성이 결여되어 있다. 실제적으로 관련성이 있는 측정에 있어서 (예를 들어, 환자의 혈청 물질에서, 오물 샘플의 생성 잔류물 또는 소화물) 측정 시그널 및 배경 시그널은 구별되어야 한다. 이들 필수 조건이 충족될 경우에만, 측정 공정의 단순함에 대한 균질 시스템의 이점 및 그로 인해 생기는 시간과 노동의 감소가 명백해질 것이다.
본 발명에 따른 방법은 균질한 형광 켄칭 면역분석법이다. 이전에 설명한 정황도 이 시스템에서 유효하다. "간단한" 형광단 (예를 들어 플루오레세인)을 사용한 시스템이 약 20년 동안 알려져 왔으나, 이 시스템의 논란의 여지가 없는 기능 및 그의 명백한 이점에도 불구하고, 설명된 이유로 인하여 실제적인 관련성을 얻지 못하였다. 지금까지 해소되지 못한 문제는 설명된 매트릭스 효과에 있었다.
측정 샘플 및 측정 시스템의 혼합물에서 형광단 뿐만 아니라 측정 샘플 (예를 들어 혈청 단백질) 유래의 복수의 다른 성분들도 여기되어서 이들은 형광으로 된다. 이와 관련하여, 상기 형광단에서의 발광은 측정 샘플의 측정 혼합물에 남아있는 성분들의 발광과 동일한 시간창에서 일어난다. 배경 시그널의 유형 및 강도는 측정 샘플의 개개의 조성에 따라 달라지며, 미리 측정될 수 없다. 그 결과, 실제적으로 관련성이 있는 측정 샘플 (예를 들어 환자 혈청)의 측정이 실시될 수 없 다.
그러나, 이러한 문제는 TRF (time-resolved fluorescence measurement)에 의해 해소될 수 있다. 상기 목적에 있어서, 지금가지 사용된 형광단은 테르븀 및 유로퓸 원소의 킬레이트 또는 각각 크립테이트로 치환된다. 상기 복합체 내의 방사선 자유 에너지 전이로 인하여, 발광이 지연된다. 상기한 바와 같이, 측정 샘플의 성분들과, 형광단은 이들이 동시에 형광이 되도록 여기된다. 그러나, 측정 시그널은 일단 배경 형광이 사라지면 검출될 수 있다. 이와 같이, 실제적으로 관련성이 있는 샘플이 또한 분석될 수 있다. 이는, 균질 시험 원리와, TRF의 조합에 의해 가능해진다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은, 측정 샘플의 사전 정제를 필요로 함이 없이 복수개의 다른 성분들, 예를 들어 혈액 샘플 또는 오물을 포함하는 샘플의 측정에 특히 적합하다.
실시예 1:
1.) TBP 유로퓸 크립테이트에 대한 면역 혈청의 제조
다음을 사용한 balb/c 마우스의 면역화:
50　㎍의 스트렙타비딘 - TBP 유로퓸 크립테이트 제1 면역화
25　㎍의 스트렙타비딘 - TBP 유로퓸 크립테이트 제2 면역화 (1개월 후)
채혈 및 혈청 추출 (당업자에에 공지됨)
2.) 혈청에 의한 TBP 유로퓸 크립테이트의 결합의 검출 (도 1)
시험 콘쥬게이트의 제조:
당업자에에 공지된 방법에 따라 글루타르알데히드에 의한 유리 아미노산의 연결에 의한 TBP 유로퓸 크립테이트의 BSA에 대한 커플링
ELISA에서 BSA 콘쥬게이트에 대한 항체 결합의 검출
3.) TBP 유로퓸 크립테이트에 대한 항체 결합에 의한 형광 켄칭의 검출 (도 2)
측정 샘플 (150　㎕)은 다음으로 구성된다:
TBP 유로퓸 크립테이트 1:200000 (최종 농도) 75　㎕
TBP 유로퓸 크립테이트에 대한 면역 혈청 희석 시리즈 75　㎕
또는 각각
세 가지의 면역전 혈청 (원)
세 가지의 다른 항원에 대한 세 가지의 면역 혈청 (정사각형)
형광 측정:
여기: 337　nm; 발광: 620　nm:
4.) 분석물-결합 항체에 의한 형광단-결합 항체의 대체 검출 (도 3)
분석물 (플루오레세인) 및 형광단 (유로퓸 크립테이트)의 콘쥬게이트의 제조
플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 TBP 유로퓸 크립테이트 (0.03 mM)을 2:1의 몰비로 반응시켰다. PBS를 매질로 사용하였고, 반응 시간은 실온에서 4시간이었다.
측정 샘플 (150　㎕)은 다음으로 구성된다:
콘쥬게이트: 1:200000 (최종 농도) 75　㎕
TBP 유로퓸 크립테이트에 대한 면역 혈청 1:200 (최종 농도) 37.5　㎕
항체 DE1 (항-플루오레세인 항체) 또는 각각 항체 D35 (항-글루코스-옥시다아제 항체) 37.5　㎕
형광 측정:
여기: 337　nm; 발광: 620　nm
도 3은 측정 샘플 1 내지 4의 측정값을 보여준다.
측정 샘플
번호		 형광단 혈청 항체 측정
시그널
1 TBP 유로퓸 크립테이트
/플루오레세인		 항-TBP 유로퓸
크립테이트		 항-플루오레세인 2700
2 TBP 유로퓸 크립테이트
/플루오레세인		 항-TBP 유로퓸
크립테이트		 항-갈락토시다제 2191
3 TBP 유로퓸 크립테이트 항-TBP 유로퓸
크립테이트		 항-플루오레세인 2065
4 TBP 유로퓸 크립테이트 항-TBP 유로퓸
크립테이트		 항-갈락토시다제 2035
5 TBP 유로퓸 크립테이트 면역전 혈청 항-플루오레세인 8894
6 없음 없음 없음 578
실시예 2: 유로퓸 킬레이트에 대한 실험
목적:
혈청 샘플에서 유로퓸 킬레이트의 형광을 켄칭시키는 다클론 항체의 검출
모델 시스템:
시험 동물 (balb/c 마우스)를 유로퓸 킬레이트/ OVA 콘쥬게이트 (OVA = 오발부민)로 면역화시켰다. 제조된 혈청 샘플을 유로퓸 킬레이트/BSA 콘쥬게이트의 형광을 켄칭하는 특성에 대해 시험하였다. 사용된 유로퓸 킬레이트는 하기 화학식의 [EuL]이었고, 여기서 Ln은 유로퓸이다:
Figure 112007083368649-pct00026
유로퓸 킬레이트 /단백질 콘쥬게이트의 제조
유로퓸 킬레이트 [EuL]는 NHS 에스테르의 형태로 존재하였다. 캐리어 단백질 BSA (소 혈청 알부민) 및 OVA에 대한 커플링은 포스페이트 완충제 (pH 7.4) 중에서 실온에서 하룻밤 수행하였다.
커플링 후에, 콘쥬게이트를 PBS에 대해 투석하고, 사전 정제 또는 특성 분석을 수행하지 않고 시험에 사용하였다.
[ EuL ]-OVA를 사용한 면역화 및 혈청 추출
2 balb/c 마우스:
제1 면역화는 완전 프로인트 (Freund) 면역보강제 중에서 100　㎍의 콘쥬게이트로 수행하였다. 제2 면역화는 면역보강제 없이 50　㎍의 콘쥬게이트를 사용하여 1달 후에 수행하였다. 제2 면역화를 수행한 지 1주 후에 채혈하였다.
[ EuL ]-BSA 콘쥬게이트의 형광 켄칭에 대한 면역 혈청의 시험
측정 샘플은 75　㎕의 희석된 혈청 샘플 및 75　㎕의 [EuL]/ BSA 콘쥬게이트 (희석 1:10000; 최종 농도)로 구성된다. 측정 샘플의 모든 성분은 PBS-NKS (PBS 중의 5% 송아지 혈청)로 희석하였다.
형광을 크립터 (cryptor) (세잔 (Cezanne))로 1시간 후에 측정하였다. 여기는 337　nm에서 질소 레이저에 의해 야기하고; 시간 해상 (time-resolved) 형광 측정을 620　nm에서 수행하였다.
결과:
TW906-1 혈청 (면역화 906-1로부터의 혈청)은 요구되는 형광-켄칭 효과를 보였다. 즉, 항체가 혈청에 존재하고, 항체는 유로퓸 킬레이트의 형광을 (크립테이트와 유사하게) 켄칭하였다 (도 4 참조).
실시예 3: 합텐 유로퓸 크립테이트에 대한 실험
목적:
콘쥬게이트 내의 합텐에 결합하는 제2 분자 및 합텐의 농도를 결정하기 위한 상기 효과의 사용에 의한 합텐 (작은 분자) 및 형광단 (유로퓸 크립테이트)의 콘쥬게이트에 대한 그의 결합으로부터 유로퓸의 형광을 켄칭하는 단일클론 항체의 대체의 검출.
모델 시스템:
유로퓸 크립테이트 (형광단) 및 바이오틴 (비타민 H) (합텐, 분석물)의 콘쥬게이트를 사용하였다. 유로퓸 크립테이트의 형광을 켄칭하는 단일클론 항체 G24-BA9는 바이오틴에 결합하는 단백질 스트렙타비딘에 의해 형광관에 대한 그의 결합 으로부터 대체되었다. 상기 효과는 유리 분석물 (바이오틴)의 외부 투여에 의해 역저될 수 있다. 이와 관련하여 발생하는 형광 변화에 의해 유리 분석물 (바이오틴)의 농도를 결정할 수 있다.
유로퓸 크립테이트 / 바이오틴 (비타민 H) 콘쥬게이트 Eu ( NH 2 )- 바이오틴의 제조
재료:
크립테이트 NH2 (cisbio) (크립테이트 NH2 = TBP 유로퓸 크립테이트, 18페이지 참조)
바이오틴 NHS (Fluka)
커플링:
바이오틴 NHS 및 크립테이트 NH2를 DMSO에 미리 용해시켰다. 두 성분을 커플링 반응에서 7 (크립테이트) 대 1 (바이오틴)의 몰비로 혼합하였다. 커플링은 0.1 M 카르보네이트 완충제 (pH 9.0)에서 실온에서 하룻밤 수행하였다.
Eu(NH2) 바이오틴 콘쥬게이트를 추가로 정제하지 않은 상태로 사용하였다.
형광 켄칭 면역분석에서 바이오틴 (비타민 H) 농도의 결정
다음 4가지 성분을 구체적으로 제시된 최종 농도에서 각각 150　㎕의 측정 반응에서 혼합하였다:
크립테이트 Eu-NH2-바이오틴 희석 1:300000
켄쳐 G24-BA9 20　㎍/ml (크립테이트 항체)
대체 항체 스트렙타비딘 3　㎍/　ml
분석물 바이오틴 희석 시리즈 0 내지 100　ng/ml
측정 샘플의 모든 성분을 PBS-NKS (PBS 중의 5% 송아지 혈청)로 희석하였다.
형광을 1시간 후에 크립터 (세잔)로 측정하였다. 여기는 337　nm에서 질소 레이저에 의해 야기하고; 시간 해상 형광 측정을 620　nm에서 수행하였다.
결과:
스트렙타비딘은 유리 바이오틴에 의해 Eu-NH2-바이오틴에 대한 그의 결합으로부터 대체되었다. 따라서, G24-BA9는 형광단에 결합하여 형광 켄칭을 야기할 수 있었다. 사용된 물질 측면에서 (특히 사용된 콘쥬게이트의 원시성 (primitiveness) 측면에서), 분석은 놀라울 정도록 감도가 우수한다 (도 7 참조).
실시예 4: 단백질 유로퓸 크립테이트에 대한 실험
목적:
콘쥬게이트 내의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 단백질 (거대분자) 및 형광단 (유로퓸 크립테이트)의 콘쥬게이트에 대한 그의 결합으로부터 유로퓸의 형광을 켄칭하는 단일클론 항체의 대체의 검출.
모델 시스템:
유로퓸 크립테이트 (형광단) 및 퍼옥시다아제 (POD)의 콘쥬게이트 (분석물)을 사용하였다. 유로퓸 크립테이트의 형광을 켄칭하는 단일클론 항체 G24-BA9는 퍼옥시다아제 (POD)에 결합하는 항체에 의해 형광단에 대한 그의 결합으로부터 대 체되었다. 상기 효과는 유리 분석물 (POD)의 외부 첨가에 의해 역전될 수 있다.
유로퓸 크립테이트 / 퍼옥시다아제 (POD) 콘쥬게이트 Eu ( NH 2 )-POD의 제조
재료:
크립테이트 NH2 (cisbio) (크립테이트 NH2 = TBP 유로퓸 크립테이트, 17페이지 참조)
퍼옥시다아제 (sigma)
커플링:
반응성 알데히드기를 퍼옥시다아제의 당 잔기에 생성시키고, 이와 같이 활성화된 POD를 0.1 M NaHCO3에 대해 탈염시켰다. 이와 같이 제조된 POD를 등몰비로 크립테이트 NH2와 혼합하였다. 커플링은 실온에서 하룻밤 수행하였다. 비커플링된 알데히드기는 에탄올아민 (pH 8)에 의해 차단하고, 콘쥬게이트를 PBS에 대해 투석하였다.
Eu(NH2)-POD 콘쥬게이트를 추가로 정제하지 않은 상태로 사용하였다.
Eu ( NH 2 )-POD에 대한 그의 결합으로부터 G24 - BA9 의 항-POD 혈청에 의한 대체
다음 4가지 성분을 구체적으로 제시된 최종 농도에서 각각 150　㎕의 측정 반응에서 혼합하였다:
크립테이트 Eu-NH2-POD 희석 1:2000
켄처 G24-BA9 5　㎍/ml
대체 항체 항 POD 혈청 희석 1:1000
분석물 POD 20　㎍/ml
측정 샘플의 모든 성분을 PBS-NKS (PBS 중의 5% 송아지 혈청)로 희석하였다.
형광을 1시간 후에 크립터 (세잔)로 측정하였다. 여기는 337　nm에서 질소 레이저에 의해 야기하고; 시간 해상 형광 측정을 620　nm에서 수행하였다.
결과:
총 4개의 항-POD 혈청 중에서, TW738은 목적하는 효과를 보였다. 혈청에 포함된 다클론 항체는 부분적으로 G24-BA9를 Eu(NH2)-POD에 대한 그의 결합으로부터 대체할 수 있었다. 상기 효과는 유리 분석물 POD의 추가에 의해 역적될 수 있었다 (도 5 참조).
도 5에 대한 설명:
실험에서, POD (퍼옥시다아제)로 면역화된 4마리의 시험 동물의 혈청을 사용하였다 (a.POD). 면역전 혈청 및 BSA (소 혈청 알부민) 또는 각각 GFP (녹색 형광 단백질)에 대해 작용시킨 면역 혈청을 대조군으로 사용하였다. 혈청을 1:1000으로 희석하였다.
Eu(NH2)/POD 콘쥬게이트의 발광은 발광을 켄칭하는 항체 G24-BA9의 존재 하에 결정하였다. 실험은 면역 혈청 (a.POD)에 포함된 POD에 결합하는 항체가 항체 G24-BA9를 콘쥬게이트에 대한 그의 결합으로부터 대체할 수 있는 정도를 시험하기 위해 수행하였다. 상기 대체 결과로서, 발광의 증가를 예상할 수 있다. 혈청 TW738 a.POD는 상기 효과를 보여준다. 다른 면역 혈청, 및 면역전 혈청은 음성이었다.
혈청 TW738 a.POD에서 관찰된 효과는 과량의 유리 POD의 투여에 의해 역전될 수 있다. 콘쥬게이트에 결합된 POD-결합 항체는 주로 유리 POD에 결합하였고, 콘쥬게이트에는 결합하지 않았다. 따라서, G24-BA9에 결합된 콘쥬게이트 및 발광의 켄칭이 동시에 관찰되었다.
POD에 결합하는 단일클론 항체에 의한 G24 - BA9 의 Eu ( NH 2 )-POD에 대한 그의 결합으로부터의 대체
다음 4가지 성분을 구체적으로 제시된 최종 농도에서 각각 150　㎕의 측정 반응에서 혼합하였다:
크립테이트 Eu-NH2-POD 희석 1:2000
켄처 G24-BA9 5　㎍/ml
대체 항체 항-POD 항체 20　㎍/ml
분석물 POD 20　㎍/ml
측정 샘플의 모든 성분을 PBS-NKS (PBS 중의 5% 송아지 혈청)로 희석하였다.
형광을 1시간 후에 크립터 (세잔)로 측정하였다. 여기는 337　nm에서 질소 레이저에 의해 야기하고; 시간 해상 형광 측정을 620　nm에서 수행하였다.
결과:
목적하는 효과는 시험된 2개의 전체 33 POD-결합 단일클론 항체에서 관찰할 수 있었다. 단일클론 항체 B92-FG9 및 E17-DA3은 Eu(NH2)-POD에 대한 그의 결합으로부터 G24-BA9를 부분적으로 대체할 수 있었다. 상기 효과는 유리 분석물 POD의 첨가에 의해 역전될 수 있었다. 한 반응에서 두 항체의 조합이 특히 성공적인 것으로 입증되었다 (도 6 참조).
도 6에 대한 설명:
POD에 대해 작용하는 두개의 단일클론 항체 B92-FG9 및 E17-DA3을 실험에 사용하였다.
Eu(NH2)-POD 콘쥬게이트의 발광은 발광을 켄칭하는 항체 G24-BA9의 존재 하에 결정하였다. 실험은 POD에 결합하는 2개의 항체의 혼합물이 항체 G24-BA9를 콘쥬게이트에 대한 그의 결합으로부터 대체할 수 있는 정도를 시험하기 위해 수행하였다. 상기 대체 결과로서, 발광의 증가를 예상할 수 있다.
처음 막대는 POD에 결합하는 항체가 없을 때의 형광을 보여준다. 두번째 막대는 POD 결합 항체 존재 하의 비율을 보여준다. 발광의 증가가 관찰된다. 세번째 막대는 유리 POD의 첨가가 상기 효과를 역전시키고 발광을 유의하게 감소시킴을 보여준다.
실시예 5: 과산화수소에 의한 발광의 증가
과산화수소에 의한 유로퓸 크립테이트의 발광의 증가
TBP 유로퓸 크립테이트 (Eu(TBP)-스트렙타비딘, 10-8 M) 및 과산화수소 (우레아 과산화수소, 10-5 %)를 실험에 사용하였다. 측정 부피는 400　㎕이었다. 발 광은 ICCD (Andor) 그리드 분광계로 측정하였다.
그 결과, TBP 유로퓸 크립테이트의 발광은 과산화수소의 첨가에 의해 30% 증가하였다 (도 8 참조).
실시예 6: 테르븀 킬레이트에 대한 실험
목적:
혈청 샘플 내의 테르븀 킬레이트의 형광을 켄칭하는 다클론 항체의 검출
모델 시스템:
시험 동물 (balb/c 마우스)을 실시예 2에 기재된 바와 같이 테르븀 킬레이트/OVA 콘쥬게이트로 면역화시켰다. 유사하게, 실시예 2와 동일한 크립테이트를 사용하되, 본 실시예에서 Ln은 테르븀 [TbL]이다.
테르븀 킬레이트 / 단백질 콘쥬게이트의 제조
테르븀 킬레이트 [TbL]는 NHS-에스테르의 형태로 존재하였다. 캐리어 단백질 BSA (소 혈청 알부민) 및 OVA에 대한 커플링은 포스페이트 완충제 (pH 7.4)에서 실온에서 하룻밤 수행하였다.
커플링 후에, 콘쥬게이트를 PBS에 대해 투석하고, 사전 정제 또는 특성 분석을 수행하지 않고 시험에 사용하였다.
[ TbL ]-OVA를 사용한 시험 동물의 면역화 및 혈청 추출
2 balb/c 마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 면역화시켰다.
[ EuL ]-BSA 콘쥬게이트의 형광을 켄칭시키는 특성에 대한 면역 혈청의 시험
측정 샘플은 75　㎕의 희석된 혈청 샘플 및 75　㎕의 [TbL]-BSA 콘쥬게이트 (희석 1:10000; 최종 농도)로 구성되었다.
측정 샘플의 모든 성분을 PBS-NKS (PBS 중의 5% 송아지 혈청)로 희석하였다.
형광을 1시간 후에 크립터 (세잔)로 측정하였다. 테르븀 킬레이트의 형광을 545　nm에서 측정하였다.
결과:
두 혈청, 즉 TW907-1 (면역화 907-1로부터의 혈청) 및 TW907-2 (면역화 907-2로부터의 혈청)은 목적하는 형광 켄칭 효과를 보였다. 즉, 항체는 혈청에 존재하고, 항체가 테르븀 킬레이트의 형광을 (크립테이트와 유사하게) 켄칭시켰다 (도 9 참조).

Claims (18)

  1. 하나 이상의 분석물의 검출 방법으로서,
    a) - 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단 (fluorophore) 또는 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트,
    - 분석물에 특이적인 항체, 및
    - 유로퓸 크립테이트 형광단 또는 테르븀 크립테이트 형광단에 특이적인 항체를 제공하는 단계(여기서, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트 또는 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 결합되게 함);
    b) 분석물을 첨가하는 단계;
    c) 유로퓸 크립테이트 형광단의 형광을 분광기로 측정하거나 테르븀 크립테이트 형광단의 형광을 분광기로 측정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)에서 과산화수소를 더 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)에서 적어도 하나의 추가의 냉광단(luminophore)을 더 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물 분자와 유로퓸 크립테이트 형광단 분자 사이의 공유 결합이 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트에 존재하거나, 분석물 분자와 테르븀 크립테이트 형광단 분자 사이의 공유 결합이 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물은 병원체, 바이러스, 프라이온, 박테리아, 기생충, 약품, 항생제, 세포 증식 억제제, 정신 활성 물질, 마취제, 진통제, 심장 약물, 대사 산물, 응고 억제제, 호르몬, 인터류킨, 사이토카인, 경기력 향상 약물, 마약, 독소, 유독 물질, 살충제, 살곤충제, 목재 방부제, 제초제, 살진균제, 폭발물, 비타민 및 착향제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물 특이성 항체와 유로퓸 크립테이트 형광단 특이성 항체의 비가 정의되고, 분석물 특이성 항체와 테르븀 크립테이트 형광단 특이성 항체의 비가 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유로퓸 크립테이트 형광단 또는 테르븀 크립테이트 형광단이 트리스-비피리딘 크립테이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. a) 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트 - 여기서, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 결합되게 함 - ;
    b) 분석물에 특이적인 항체; 및
    c) 유로퓸 크립테이트 형광단에 특이적인 항체
    를 함유하는 조성물.
  9. a) 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트 - 여기서, 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 결합되게 함 - ;
    b) 분석물에 특이적인 항체; 및
    c) 테르븀 크립테이트 형광단에 특이적인 항체
    를 함유하는 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 과산화수소를 추가로 함유하는 조성물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 냉광단을 추가로 함유하는 조성물.
  12. a) 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트 - 여기서, 분석물과 유로퓸 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 결합되게 함 - ;
    b) 분석물에 특이적인 항체; 및
    c) 유로퓸 크립테이트 형광단에 특이적인 항체
    를 포함하는 적어도 하나의 분석물을 검출하기 위한 키트.
  13. a) 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트 - 여기서, 분석물과 테르븀 크립테이트 형광단의 콘쥬게이트는 단지 하나의 단일 항체가 결합되게 함 - ;
    b) 분석물에 특이적인 항체; 및
    c) 테르븀 크립테이트 형광단에 특이적인 항체
    를 포함하는 적어도 하나의 분석물을 검출하기 위한 키트.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 과산화수소를 추가로 포함하는 키트.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 냉광단을 추가로 포함하는 키트.
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  17. 삭제
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