KR20010030885A

KR20010030885A - 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 새로운 형광콘쥬게이트, 이들의 제조방법 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20010030885A
Application number: KR1020007003578A
Authority: KR
Inventors: 바징에르베; 마티스제라르
Original assignee: 릴리앙 사르데; 시스 비오 엥떼르나씨오날(소시에떼 아노님)
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2001-04-16
Also published as: EP1025115A1; WO1999018114A1; AU751147B2; DE69815370D1; JP2001519354A; US6340747B1; DE69815370T2; ES2201533T3; FR2769315B1; AU9355698A; ATE242261T1; EP1025115B1; FR2769315A1; CA2305811A1

Abstract

본 발명은 뉴클레오시드 구조를 갖거나 또는 핵산과 상호작용할 수 있고 생물학적 또는 임상학적으로 중요한 핵산 또는 분자를 검출, 위치결정 및/또는 단리하기 위해 특히 유용한 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 새로운 형광 콘쥬게이트에 관한 것이다.

Description

뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 새로운 형광 콘쥬게이트, 이들의 제조방법 및 이들의 용도{Novel nucleoside or nucleotide fluorescent conjugates, preparation method and uses}

다음의 약어는 이하의 설명에 사용된다:

RNA: 리보핵산

DNA: 데옥시리보핵산

A: 아데노신

C: 시티딘

G: 구아노신

T: 티미딘

U: 우리딘

I: 이노신

접미사 MP: 모노포스페이트

접미사 DP: 디포스페이트

접미사 TP: 트리포스페이트

접두사 d: 데옥시

DNA의 효소 합성 반응은 RNA 또는 DNA 주형, 그 주형의 단편에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적절한 효소 및 4개의 데옥시뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(또는 dUTP)를 사용한다. E. coli DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, DNA 중합효소의 클레노우(Klenow) 단편, Taq DNA 중합효소 및 역전사효소 등의 다양한 효소가 알려져 있고, 주형을 필요로 하지 않는다는 특별한 특징을 갖는 말단 뉴클레오티딜 전이효소가 첨가될 수 있다. RNA의 합성은 필요한 프라이머 및 주형이 상이하고, 리보뉴클레오티드(ATP, CTP, GTP 및 UTP)가 RNA 중합효소의 존재하에서 사용되는 것을 제외하고는, 유사한 방법으로 수행된다.

뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 방사선물질(³H,³²P,¹⁴C,³⁵S 또는¹²⁵I)로 표지될 수 있다.

표지된 분자를 사용하면, 방사선 동위원소에 통상적으로 관련된 단점, 즉 방사능에 고유한 위험 뿐 아니라, 방사선 붕괴와 방사선 분해 현상에 의해 저장 및 유용성이 제한된다는 단점이 있다.

이러한 단점들을 회피할 수 있도록 하는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 약품 표지가 문헌에 기재되어 있다. 특히 dUTP 또는 UTP로부터 유도된 뉴클레오티드의 비오틴(biotin) 표지가 기재되어 있다(랑거 P.R., 왈드롭 A.A., 워드 D.C., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 78, 6633-37). 이들은 알킬아민 암(arm)에 의해 비오틴이 피리미딘 고리의 C-5 위치에 결합된 유도체들이다. 이들 표지된 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 중합효소의 작용에 의해 폴리뉴클레오티드로 생체외(in vitro) 함입되고, 도트-블롯(dot-blot) 반응을 통해 핵산의 측도계(colorimeter) 검출을 가능하게 한다(레리 J.J., 브리가티 D.J. 및 워드 D.D., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 80, 4045-49).

N-4-아미노알킬데옥시시티딘 및 N-6-아미노알킬데옥시아데노신의 유도체를 토대로 하는 비오틴-표지 뉴클레오티드의 다른 유사체가 미국특허 4,828,979호 및 게베게후 G.G 등., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4513-4534에 기재되어 있다.

또한 7-데아자퓨린의 C-8 위치에서 비오틴으로 치환될 뿐 아니라, C-7 위치에서도 치환 가능성이 있는 dUTP 및 dATP의 유도체가 기재되어 있다(EP 0 063 879호).

유도체 bio-15-dGTP도 역시 기재되어 있다(길리엄 I.C. 및 테너 G.M., 1989, Nucleoside ＆ Nucleotide, 8, 1453-62). 플루오레스세인 또는 로다민 등의 형광 유도체가 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트(dATP, dUTP, dCTP)(WO 93 19206호)에 의해 핵산에 함입될 수 있다. 퓨린 및 피리미딘에 대한 치환 위치 및 비록 서열검정용 사슬 종결제 전용이지만 플루오레스세인 유도체로 디데옥시뉴클레오티드를 표지하기 위해 사용될 수 있는 스페이서 암(spacer arm)의 속성에 대한 토의는 표지된 뉴클레오티드의 화학적 개관을 제공한다(콘팔론 P.T., 1990, J. Heterocyclic Chem., 27, 31-46).

상이한 추적자(tracer, 비오틴-11-dUTP, dig-11-dUTP 및 FITC-11-dUTP)로 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 함께 사용하면, 하이브리다이제이션 도중에 상이한 서열의 동시 시각화가 가능하다(리드 T. 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국(1992), 89, 1388-1392).

또한 Fl-dUTP 또는 Fl-dCTP 등의 플루오레스세인-표지된 데옥시뉴클레오티드는 표지된 화합물: dCTP/Fl-dCTP2:1로 천연 뉴클레오티드의 일부만을 치환함으로써 함입될 수 있다(WO 93/19206호). 동 특허는, 효소 및 실험조건을 선택함으로써 뉴클레오티드 전체를 표지된 뉴클레오티드로 치환할 수 있다는 것을 기재하고 있다.

이 문헌 자료는 트리포스페이트 콘쥬게이트의 함입 효율성이 비오틴 등의 분자로 커플링(coupling)함으로써 조절되고, 정도는 덜하지만 커플링을 가능하게 하는 암의 존재에 의해 조절됨을 나타내고 있다.

예컨대, DNA 중합효소의 존재하의 닉 번역(nick translation)반응에서, 다양한 트리포스페이트 유사체의 함입도를 동일한 반응시간(90분) 동안 기준(100% 함입)으로 취한 천연 뉴클레오시드와 비교하였다(게베예후 G 등., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4525).

뉴클레오시드 트리포스페이트로 콘쥬게이트된 분자(굳차일드, J. Bioconjugate Chem., 1990, p. 171; 크리카 J., Non isotopic Blotting, and Sequencing, 1995, Acadimic Press, p. 47; 쥬 Z. 등., Nucleic Acids Res., 1994, 3418-3422)는 중성 또는 음전하를 띠고, 주로 평면상을 갖는 상대적으로 작은 크기(〈800 달톤)의 분자이고; 따라서 이들의 부피는 감소하지만, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 효소 함입을 충분히 방해할 수 있다.

본 발명은 뉴클레오시드 구조를 갖거나 또는 핵산과 상호작용할 수 있고, 특히 생물학적 또는 임상학적으로 중요한 핵산 또는 분자를 검출, 위치결정 및/또는 단리하기 위해 사용할 수 있는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 새로운 형광 콘쥬게이트(fluorescent conjugates)에 관한 것이다.

도 1은 효소 복사 중에 반응시간의 함수로서 DF의 값을 그래프로 그린 도면이다.

도 2는 콘쥬게이트 K-11-dUTP의 화학식이다.

도 3은 콘쥬게이트 K-11-UTP의 화학식이다.

도 4는 효소 전사 중에 반응시간 함수로서 DF 값의 곡선을 나타낸 도면이다.

다음을 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 새로운 콘쥬게이트가 최근에 밝혀졌다.

- 하나 이상의 고리 탄소원자, 퓨린 또는 피리미딘 고리의 고리밖(exocyclic) 질소원자, 또는 펜토푸라노오스 고리의 다른 탄소원자가 형광 지표와의 결합에 관여할 수 있는, 천연의, 화학적 변형되거나 또는 하나 이상의 표지화 분자와 콘쥬게이트된 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드, 및

- 상기 원자(들)와 결합되고, 희토류 크립테이트(cryptate)로 된 하나 이상의 형광 지표.

바람직한 일 특징에 따르면, 상기 콘쥬게이트는 다음을 포함한다.

- 하나 이상의 고리 탄소원자 또는 퓨린 또는 피리미딘 고리의 고리밖 질소원자가 형광 지표와의 결합에 관여할 수 있는, 천연의, 화학적 변형되거나 또는 하나 이상의 표지화 분자와 콘쥬게이트된 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드, 및

- 상기 원자(들)와 결합되고, 희토류 크립테이트로 된 하나 이상의 형광 지표.

상기 콘쥬게이트는 사용시 주요 단점을 나타내는 것 없이, 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 임의의 용도에 사용될 수 있으며, 특히 이들은 단일가닥 또는 2중가닥 DNA로 함입하기 위한 고용량을 갖는다.

희토류 크립테이트는 고분자량(1400달톤을 넘음)의 분자이고, 구형면(globally plane) 분자에 비해 더 큰 입체 장애를 나타내는 3차원 구조를 갖으며, 이들에 양전하를 제공할 수 있는 착이온의 존재에 의해 이온성을 갖기 때문에 이들의 특성은 더욱 놀랄만한 것이다.

이러한 구조적 특징이라면, 희토류 크립테이트의 양전하는 트리포스페이트기의 음전하와 강하게 상호작용하고, 크립테이트의 형광성 뿐 아니라 반응성을 변형시킬 것으로 예상될 수 있다.

또한 중합효소 등의 효소의 활성은 반응배지에서 특정 착이온 또는 시약의 존재와 농도에 민감하기 때문에, 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 뉴클레오티드 트리포스페이트의 함입에 있어서 상당한 감소가 일어나고, 따라서 특히 폴리뉴클레오티드 합성 도중에 수율이 낮을 것으로 예상할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 콘쥬게이트를 사용하여 얻어진 결과는, 희토류 크립테이트가 효소 반응과 관련된 용도에 있어서 바람직스럽지 않은 영향은 갖지 않을 뿐 아니라, 이들이 이들 고유의 형광성을 보유하고 있다는 것을 나타내고 있다.

유리하게도, 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 새로운 형광성을 가지며, 특히 착화된 희토류 이온의 방출 수명이 유의적으로 증가되고 있다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 상기 콘쥬게이트는 직접 또는 간접적으로 형광을 측정함으로써 정량적 또는 정성적인 검출을 실시할 수 있는 모든 용도에서 형광 지표로서 사용될 수 있다.

바람직한 일 특징에 따르면, 본 발명은 AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me-AMP, 2Me-ADP, 2Me-ATP, 1Me-GMP, 1Me-GDP, 1Me-GTP, 5Me-CMP, 5Me-CDP, 5Me-CTP, 5MeO-CMP, 5Me0-CDP, 5MeO-CTP, 7-데아자-ATP 및 7-데아자-GTP로부터 선택된 리보뉴클레오티드, 또는 임의로 이들 리보뉴클레오티드에 대응하는 데옥시- 또는 디데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 데옥시리보뉴클레오티드, 및 특히

- 염기(주로 아미노알릴 또는 아미노프로핀 골격)의 5번 위치에서 관능화된 2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 또는 우리딘 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기(주로 아미노알릴 또는 아미노프로핀 골격)의 4번 위치 또는 5번 위치에서 관능화된 2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트 또는 시티딘 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 6번 또는 8번 위치에서 관능화된 2'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트 또는 아데노신 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 6번 또는 8번 위치에서 관능화된 2'-데옥시구아노신 5'-트리포스페이트 또는 구아노신 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 7번 위치에서 관능화된 2'-데옥시-7-데아자아데노신 5'-트리포스페이트 또는 7-데아자아데노신 5'-트리포스페이트 유도체, 및

- 염기의 7번 위치에서 관능화된 2'-데옥시-7-데아자구아노신 5'-트리포스페이트 또는 7-데아자구아노신 5'-트리포스페이트 유도체를 포함하는 뉴클레오티드의 형광 콘쥬게이트에 관한 것이다.

또한 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드는 트리포스페이트 부분, 이 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 특히 α-티오트리포스페이트 유도체를 포함한다.

또 다른 일 특징에 따르면, 본 발명은 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오시드가 A, G, C, U, T, 그에 대응하는 데옥시- 또는 디데옥시뉴클레오시드 및 이들의 화학적으로 변형된 유사체, 특히 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 및 그 유도체, 및 A, T, C, G, U 및 I의 2',3'-디데옥시 유사체로부터 선택되는 뉴클레오시드의 형광 콘쥬게이트에 관한 것이다.

형광 지표는 바람직하게는 테르븀, 유로퓸, 사마륨 또는 디스프로슘 크립테이트로부터 선택된 희토류 크립테이트로 된다.

이하, 용어 "크립테이트" 및 사용될 수 있는 거대고리 및 다중고리의 명명은 J.M. 레엔이 Struct. Bonding(베를린), 16, 1, 1973 및 Acc. Chem. Res., 11, 49(1978)에서 정의한 바와 같다.

바람직한 일 특징에 따르면, 상기 희토류 크립테이트는 하기 화학식(I)의 거대다중고리 화합물에 의해 착화된 하나 이상의 희토류염으로 된다.

상기 식에서, Z는 3- 또는 4가 원자이고, R은 아무것도 아니거나, 수소, 히드록실기, 아미노기 또는 탄화수소 라디칼이며, 2가 라디칼,및는 서로 독립적으로, 임의로 하나 이상의 헤테로원자를 함유하고, 임의로 사슬 중간에 헤테로거대고리를 포함하는 탄화수소이고, 라디칼,및중 하나 이상은 하나 이상의 분자 잔기를 함유하거나 또는 분자 잔기로 필수적으로 된 것으로, 상기 분자 잔기는 착화된 희토류 이온의 방출 수준보다 큰 3중 에너지를 갖는다.

상기 희토류 크립테이트는 바람직하게는 분자 잔기가 페난트롤린, 안트라센, 벤젠, 나프탈렌, 비- 및 테르페닐, 아조벤젠, 아조피리딘, 피리딘, 비피리딘, 비스퀴놀린 및 하기 화학식의 화합물로부터 선택되는 상기 화학식(I)의 크립테이트이다:

-C₂H₄-X₁-C₆H₄-X₂-C₂H₄-

-C₂H₄-X₁-CH₂-C₆H₄-CH₂-X₂-C₂H₄-

상기 식에서, X₁및 X₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, 산소, 질소 또는 황이고,

X는 산소 또는 수소이다.

바람직한 일 특징에 따르면, 형광 지표는 하기 거대고리 화합물 중 하나에 의해 착화된 테르븀 또는 유로퓸 이온으로 된 희토류 크립테이트이다:

(22) 페난트롤린; (22) 페난트롤린 아미드; (22) 안트라센; (22) 안트라센 아미드; (22) 비이소퀴놀린; (22) 비페닐-비스-피리딘; (22) 비피리딘; (22) 비피리딘 아미드; 및 트리스-비피리딘, 트리스-페난트롤린, 페난트롤린-비스-비피리딘, 비이소퀴놀린-비스-비피리딘 및 비스-비피리딘 디페닐비피리딘 거대다중고리.

특히 바람직한 하나의 지표는 유로퓸 크립테이트 Eu 트리스-비피리딘이다.

이러한 화합물들은 예컨대 유럽특허 180 492호에 기재되어 있다.

또한 희토류 이온을 착화하고, 분자 잔기가 비피라진, 비피리미딘 및 N-옥사이드기를 함유하는 질소 헤테로고리로 이루어진 군으로부터 선택된 거대다중고리 크립테이트 화합물을 사용할 수 있다.

비피라진 단위를 갖는 거대다중고리 화합물은 F. 보다-호우일론 등., New J. Chem., 1996, 20, 1041-1045에 기재되어 있다.

비피리미딘 단위를 갖는 거대다중고리 화합물은 J. M. 레엔 등., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221에 기재되어 있다.

N-옥사이드기를 함유하는 질소 헤테로고리를 포함하는 거대다중고리 화합물은 J.M. 레엔 등., Helv. Chim. Acta, 1991, 74, 572에 기재되어 있다.

또한 형광 지표로서 사용되는 희토류 크립테이트는 하기 화학식(II) 또는 (Ⅲ)에 의해 착화된 하나 이상의 희토류염으로 될 수 있다:

상기 식에서,

- 식의 고리는 하기 고리 중 하나이고:

{식중, n은 0 또는 1,

[N₂O₄] 거대고리 또는 (22) 고리

[N₂O₃] 거대고리 또는 (21) 고리}

거대고리 비스-피리딘

- Y는 임의로 하나 이상의 이중결합을 함유하고/하거나 임의로 산소, 질소, 황 또는 인 등의 하나 이상의 헤테로원자, 또는 하나 이상의 카르바모일 또는 카르복사미도기를 함유하는 선형 또는 분지형의 C₁내지 C₂₀알킬렌기, C₅내지 C₈시클로알킬렌기, 또는 C₆내지 C₁₄아릴렌기로부터 선택되는 2가 유기 라디칼로 된 기 또는 스페이서 암으로, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌 또는 아릴렌기는 임의로 알킬, 아릴 또는 술포네이트기로 치환되고;

- Z는 생물학적 물질과 공유결합할 수 있는 관능기이며;

- R은 메틸기 또는 -Y-Z 기이고;

- R'는 수소 또는 R"가 C₁내지 C₁₀알킬기, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 t-부틸기인 -COOR"이거나, 또는 R'는 -CO-NH-Y-Z기이다.

이러한 화합물은 예컨대 유럽특허 321 353호에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 콘쥬게이트 내에서, 상기 형광 지표는 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드에 직접 또는 스페이서 암에 의해 결합될 수 잇다.

"직접 결합"이란, 염기 또는 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드의 펜토푸라노오스 단위의 하나 이상의 원자에 미리 도입되거나 또는 생성된 관능기에 형광 지표가 결합하는 것을 의미한다.

본 명세서에서, 관능기는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 부분에 의해 수반되거나 또는 이 부분에 도입되고, 직접 또는 활성화 후에 크립테이트 또는 크립테이트에 의해 수반되는 스페이서 암에 존재하는 관능기와 공유결합할 수 있는 관능기를 의미한다. 이러한 관능기는 특히 NH₂, COOH, CHO, OH 또는 SH 관능기일 뿐 아니라, 치환(할라이드, 술포네이트, 에폭시드) 또는 첨가(말레이미드계의 이중결합)에 의해 공유결합할 수 있는 관능기이다. 이들 관능기는 일반적으로 그 자체가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 부분에 연결되는 탄화수소 사슬에 의해 수반된다.

이들 관능기의 도입방법은 특히 C. 케슬러, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2판, L.J. 크리카(1995), Academic Press사 출판, 런던, pp 66-72에 기재되어 있다.

이 스페이서 암은, 예컨대 임의로 하나 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 함유하고/하거나 임의로 산소, 질소, 황 또는 인 등의 하나 이상의 헤테로원자, 또는 하나 이상의 카르바모일 또는 카르복사미도기를 함유하는 선형 또는 분지형의 C₁-C₂₀알킬렌기; C₅-C₈시클로알킬렌기; 및 C₆-C₁₄아릴렌기로부터 선택된 2가 유기 라디칼로 된 것으로, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌 또는 아릴렌기는 임의로 알킬, 아릴 또는 술포네이트기로 치환된다.

특히, 다음과 같은 기에서 선택될 수 있다:

및

바람직한 일 특징에 따르면, 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 데옥시리보뉴클레오티드로서 데옥시우리딘을, 형광 지표로서 유로퓸 크립테이트 Eu 트리스-비피리딘을, 스페이서 암으로서 3-아미노알릴기를 포함한다.

또다른 일 특징에 따르면, 또한 본 발명은 상술한 콘쥬게이트의 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법은 하나 이상의 고리 탄소원자, 퓨린 또는 피리미딘 고리의 고리밖 질소원자 또는 펜토푸라노오스 단위의 탄소원자가 형광 지표와의 결합에 관여할 수 있는, 천연의, 화학적으로 변형되거나 또는 하나 이상의 표지화 분자와 콘쥬게이트된 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드는 상기 원자(들)에 결합되고 희토류 크립테이트로 된 하나 이상의 형광 지표와 반응하는 것, 및 얻어진 콘쥬게이트를 단리하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 제조방법에 사용될 수 있는 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드 및 형광 지표는 상술한 바와 같다.

리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 특히 폴리뉴클레오티드의 합성 또는 사용 도중에 정성적 또는 정량적 측정을 요하는 모든 용도에 적합하다.

특징들 중 하나에 따르면, 또한 본 발명은 구성(constituent) 뉴클레오티드로서 상술한 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 하나 이상의 형광 콘쥬게이트를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 콘쥬게이트의 함입에 의해 얻어진 폴리뉴클레오티드는 1보다 큰 다수의 콘쥬게이트, 따라서 1보다 큰 다수의 형광 지표를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 콘쥬게이트를 사용함으로써, 효소 방법으로 폴리뉴클레오티드의 다중 표지를 실시할 수 있다. 이 방법은 폴리뉴클레오티드를 보다 용이하게 표지할 수 있고, 종래의 화학적 방법에 의한 종래의 형광 표지화 기술을 사용할 때에 비해 양호한 재현성을 보장할 수 있다. 특히, 배지로부터 미반응 폴리뉴클레오티드 및/또는 미반응 관능화 형광 지표를 제거하는데 필요한 분리 단계를 피할 수 있다.

2관능화 크립테이트를 사용하면, 접합은 오직 하나의 암에서만 일어나 폴리뉴클레오티드 합성의 구성 내에서 콘쥬게이트의 함입이 항상 가능할 수 있음을 유의해야 할 것이다.

리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 화합물의 검출 및/또는 위치결정용으로 사용될 수 있다.

이러한 용도 중에서, 다음을 예로 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

- 예컨대 염색체의 지도작성(mapping) 또는 돌연변이의 검출을 위한 특징적 DNA 서열의 검출 및/또는 위치결정 및

- 생의학 연구 또는 임상학적 확진용으로 사용될 수 있는 탐침(probe)의 합성.

또한 이들은 핵산 합성반응에 관여하는 효소의 효소 활성, 예컨대 DNA 또는 RNA 중합효소, 역전사효소, 전이효소 또는 리가아제 활성을 측정하는 방법에 사용될 수 있으며, 이때 상기 콘쥬게이트에 의해 직접 또는 간접적으로 방출된 형광이 측정되는 것으로, 상기 형광 방출은 상기 콘쥬게이트의 합성된 핵산 폴리뉴클레오티드로의 함입도와 상관관계가 있다.

또한 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 핵산 기질을 가진 효소의 효소활성, 예컨대 포소포디에스테라아제, DNAse 또는 RNAse 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 것으로, 상기 콘쥬게이트에 의해 직접 또는 간접적으로 방출되는 형광은 상기 활성이나 상기 활성의 억제와 상관관계가 있다.

이들은 또한 헬리카아제(helicase) 또는 인테그라아제(integrase) 활성 등의 핵산 구조를 변형시키는 효소활성, 또는 위상이성질화 효소(topoisomerase) 활성 등의 핵산의 위상을 조절하는 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 콘쥬게이트는, 예컨대 검출 목적으로 상기 콘쥬게이트가 함입된 핵산을 포함하는 화합물의 제조를 위한 지표로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 콘쥬게이트에 의해 방출되는 형광은 "직접적" 즉 발광신호가 소정의 파장에서 여기한 후 콘쥬게이트에 의해 방출되거나, 또는 "간접적" 즉 발광 신호의 방출이 여기된 콘쥬게이트 간의 비복사 에너지 전이에 의해 유도되거나, 또는 "공여체 화합물", 및 다른 형광 분자, 또는 "수용체 화합물"일 수 있다.

이러한 특별한 경우, 다음의 조건이 만족된다:

- 한편으로는, 형광 수용체 화합물은 공여체의 방출 스펙트럼을 적어도 부분적으로 오버랩하고 이 오버랩 영역에서 높은 몰흡광도를 갖는 흡수 스펙트럼과 공여체가 약한 고유 방출을 갖는 파장 범위에 걸쳐 방출 스펙트럼을 갖는다.

- 다른 한편으로는, 수용체 및 공여체는 서로 근접하여 위치하며, 이들의 전이 쌍극자의 배향은 거의 평행이다.

비복사 에너지 전이의 기술원리는 특별히 G.마티스 등., Clin. Chem., 1993, 39, 1953-1959에 기재되어 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 설명되며, 실시예 중 몇몇 농도는 단위 부피(ml로 표기) 당 소정의 파장(nm로 표기)에서의 흡수 단위(AU)로 나타내고, 해당 용액의 광학밀도와 동일한 수로 표기한다.

실시예 1: 크립테이트 유로퓸 트리스-비피리딘으로 표지된 데옥시우리딘(콘쥬게이트 K-11-dUTP)의 합성

이 콘쥬게이트에서, 숫자 11은 스페이서 암 및 크립테이트 구조를 뉴클레오티드에 연결하는 관능기 중의 원자의 총수를 의미한다(이 경우, 피리미딘의 5번 위치에서 결합).

사용된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 N-히드록시숙신이미드 트리플루오로아세트아미도카프로에이트(M.S. 우르데아 등., Nucleic Acids Res., 1988, 4937)와 문헌(랑거 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국(1981), 78, 6633-6637)의 방법에 의해 제조되는 5-(3-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트를 반응시킨 다음, 암모니아성 디프로텍션(ammoniacal deprotection, 3% NH₄OH 수용액, 60℃에서 45분)을 수행하여 제조되는 5-[N-(6-아미노카프로일)-3-아미노알릴]-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트](AH-dUTP)이다. 이 화합물은 선형 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트 구배(0.1M 내지 0.3M) 하에서 DEAE-Sepharose^R(파마시아 제)로 정제하였다.

1) 방법 A

6μmol/ml를 함유하는 AH-dUTP 용액 68㎕(즉 0.4μmol)를 pH 7.8의 0.1M 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트(TEAB) 250㎕로 희석하고, 하기에서 제조되는 N-히드록시숙신이미드 크립테이트 용액(아세토니트릴 중 4mg/ml) 320㎕를 첨가하였다. 유럽특허출원 0 321 353호의 실시예 4, A절에 기재된 크립테이트 유로퓸[(비스-bpy)-(bpy-디에스테르)]를 RP-18 HPLC 칼럼(1% 수성 트리플루오로아세트산 중 아세토니트릴의 구배)에서 정제하였다. 얻어진 크립테이트, 유로퓸[(비스-bpy)-(bpy-디에시드)](4mg)을 무수 아세토니트릴 0.5ml에 용해하고, N-히드록시숙신이미드 1mg을 첨가한 후, 아세토니트릴 0.5ml에 용해된 디시클로헥실카르보디이미드 1.9mg의 용액을 첨가하였다. 16시간 반응 후, 디시클로헥실우레아의 침전물을 여과분리하고, N-히드록시숙신이미드 크립테이트 용액을 커플링을 위해 직접 사용하였다.

45분간 교반한 후, pH 8.5의 1M TEAB 15㎕를 첨가한 다음, 이 혼합물을 Superdex 30^RHR 10/30 칼럼(파마시아 제)에 주입하고, 아세토니트릴 10%를 함유하는 pH 7의 0.05M TEAB으로 용출하였다(유속 1ml/분).

Rt16.4분의 화합물을 회수한 다음, 이 분획을 분획 1이라 하고, 진공(speed-vac)하에서 부피 350㎕까지 농축하였고, 이것은 8AU_304nm를 함유하였다. 측정치 ε₃₀₄ 35,000에 의해, K-dUTP의 농도는 약 0.72mM인 것으로 측정된다.

이 분획 1의 일부(90㎕)를 동일한 칼럼에 주입하고, 아세토니트릴 5%를 함유하는 pH 7의 25mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액으로 용출하였다. 크로마토그램에서 유일한 피크에 해당하는 분획(16분〈Rt〈19분)을 회수하고, 진공(speed-vac)하에서 농축하여 1.95AU_304nm를 함유하는 K-dUTP 용액 150㎕를 얻었으며, 이것을 분획 2라 하였다.

이 화합물을 질량 스펙트럼으로 측정하여 분석하였다(포지티브 모드 전기분무):

(M-2H)⁺= 1431

(M - 2H + CH₃COOH)⁺= 1491

수중 UV 스펙트럼은 분자의 뉴클레오시드 부분의 특징인 241nm에서 최대(λ_max= 289nm, ε= 7100; λ_max= 240nm, ε= 10,700)를, 유로퓸 크립테이트의 특징인 λ_max305nm 근처인 304nm에서 최대를 가졌다. 비 A₃₀₄/A₂₄₁ 0.83으로 관찰되었고, 이는 제안된 구조에 부합하였다.

2) 방법 B

AH-dUTP 용액 0.08μmol을 pH 8.6의 0.1M 붕산염 완충액 80㎕에 용해시키고, 상술한 방법 A에 기재된 바대로 제조한 N-히드록시숙신이미드 크립테이트 용액 90㎕를 첨가하였다.

20℃에서 60분 후, pH 8.5의 1M TEAB 5㎕ 및 물 45㎕를 첨가하였다. 반응 혼합물 전체를 Superdex peptide HR 10/30칼럼(파마시아 제)에 주입하고, 아세토니트릴 10%를 함유하는 pH 7의 0.05M TEAB으로 용출하였다(유속 1ml/분).

304nm에서 최대이고, 비 A₃₀₄/A₂₄₁ 0.79인 Rt16.1분의 피크를 회수하여 화합물 K-11-dUTP 약 0.03μmol을 얻었다.

콘쥬게이트 K-11-dUTP의 화학식을 도 2에 나타낸다.

실시예 2: 이온교환에 의한 콘쥬게이트 K-11-dUTP의 정제

사용한 칼럼은 메탄올 10%를 함유하는 10mM TEAB 완충액으로 평형화한 DEAE Sepharose^RFast Flow(파마시아 제)로 충전된 C10/20 칼럼(파마시아 바이오텍., 업살라, 스웨덴)이다. 비콘쥬게이트되고 관능화된 유로퓸 트리스-비피리딘 크립테이트를 함유하는 K-11-dUTP 용액을 침착시키고, 칼럼을 완충액 A(메탄올 10%를 함유하는 10mM TEAB) 40ml로 용출하였다(8ml/분). 분획 4ml를 회수하고, 용출된 분획의 형광을 측정하였다(λ_여기= 337nm, λ_방출= 620nm). 비콘쥬게이트된 크립테이트를 분획 4 및 5에서, 즉 칼럼의 무용부피(dead volume) 바로 다음에서 용출하였다.

10mM TEAB, 10% 메탄올(100ml) 내지 200mM TEAB, 10% 메탄올(100ml)의 선형 구배하에서 용출을 계속하고(8ml/분), 분획 5ml를 회수하였다. 형광(620nm)이 튜브(43, 44)에서 농축됨을 관찰하였는데, 이는 K-11-dUTP가 농도0.16mM TEAB에서 용출됨을 의미한다. K-11-dUTP를 함유하는 분획을 조합하여 농축하였다.

실시예 3: 중합효소에 의한 단일가닥 DNA의 복사 도중에 콘쥬게이트 K-11-dUTP의 함입(PAGE 및 방사선 사진 분석)

다음의 프라이머에 의해 구획된 k-ras 유전자(엑손 I) 단편의 PCR(중합효소 연쇄반응) 증폭에 의해 주형 DNA를 얻었다:

k-ras EX1 센스 S 프라이머^5'd(GGC CTG CTG AAA ATG ACT GAA TAT)_3'

3AU₂₆₀/ml을 함유하는, 즉 약 1.2×10^-5M 원액

하기 PCR용 AS 프라이머는 그 5' 말단에서 비오티닐화하였다. 하기 실험계획을 이용하여 PCR로써 비오티닐화된 2중가닥 DNA를 합성하였다:

PCR 배지 BUAM(시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 10X 25㎕

안티센스-bio 프라이머 8㎕

센스 프라이머 8㎕

Taq 중합효소(1.25U/ml) 10㎕

dNTP(4개의 천연 dNTP, 각 5mM) 10㎕

인간 태반 DNA(시그마 제), 0.01㎍/㎕ 100㎕

milli-Q water 89㎕

PCR 배지를 5개의 마이크로튜브에 나누고(5×50㎕), 이 튜브들을 써모사이클러(thermocycler)에 두고, 실시예 5의 실험계획에 따라 PCR 31 사이클 처리하였다.

PCR에 의해 제조되는 2중가닥 DNA(비오틴 프라이머의 25pmol에 상당)를 Dynabeads-streptavidin M-280(다이날, N) 300g의 존재하에서 배양하였다.

세척 후, 단일가닥 DNA(SS DNA)를 0.1N 수산화나트륨 용액으로 용출한 후, 상청을 경사분리하고, 중화한 다음(묽은 HCl), 잔류 부피 60㎕까지 농축하였다.

J. 삼브루크 등., Molecular cloning, a laboratory manual, 1989에 기재된 바와 같이,³²P로 표지한 상술한 AS 프라이머(비-비오티닐화된)를 나머지 조작에 대해 사용하였다.

다음을 사용하여 복사반응용 배지를 제조하였다:

- 실시예 1에서 얻어진 K-11-dUTP 분획 1(Rt= 16.4분), 0.25mM까지 희석

- dTTP, 0.25mM

- 3개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP 및 dGTP)의 혼합물, 각 0.625mM

- Taq DNA 중합효소, 1.25U/㎕

- Taq(BUAM) 10X 완충액(시스 비오 인터내셔널 제)

- AS 프라이머(3AU₂₆₀/ml) 및³²P-표지한 AS 프라이머(0.06AU₂₆₀/ml)

K-11-dUTP를 dTTP(0.25mM) 0.6㎕로 치환하는 평행 대조 반응을 실시하여 배지 중 dTTP의 농도를 다른 3개의 트리포스페이트와 동일하였다.

콘쥬게이트 K-11-dUTP의 존재하에서 반응이 그 전장에 걸쳐 DNA의 복사에 대응하고, 4개의 천연 뉴클레오티드만이 도입되는 대조 반응에서 얻어지는 밴드(band)의 운동성에 근접한 밴드를 제조한다는 것을 증명하기 의해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 사용하였다. 또한 전기영동 형태는 어떤 경우에서나 판독 불연속성(reading discontinuity)을 나타낸다.

가변비 dTTP/K-11-dUTP, 특히 K-11-dUTP 0.3㎕와 dTTP 0.9㎕(dTTP/K-11-dUTP= 3)를 사용하여 동일한 조작을 수행하였다.

또한 DNA 중합효소 I, 클레노우 단편(37℃, 45분)의 존재하에서 복사반응을 수행하여 거의 동일한 결과를 얻었다.

이들 결과는 실제로 단일가닥 DNA의 복사 도중에 중합효소(Taq 중합효소 또는 클레노우 단편)에 의해 콘쥬게이트 dUTP/유로퓸 트리스-비피리딘 크립테이트가 함입됨을 나타낸다.

실시예 4: 중합효소에 의한 단일가닥 DNA의 복사 도중에 콘쥬게이트 K-11-dUTP의 함입(비복사 에너지 전이 및 시간분해(time resolved) 형광 측정에 의해 증명)

실시예 3에 기재된 단일가닥 DNA를 사용하였다.

다음을 함유하는 복사반응을 수행하기 위한 마이크로튜브(50㎕)를 제조하였다:

- K-11-dUTP: 실시예 1에서 얻어진 0.25mM 분획 1(Rt= 16.4분)

- dTTP: 0.25mM

- 각각 0.625mM의 3개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트: dATP, dCTP 및 dGTP의 혼합물

- 비오티닐화된 AS 프라이머(실시예 3 비교): 3AU₂₆₀/ml

- Taq DNA 중합효소: 1.25U/㎕

- Taq 완충액: BUAM 10X.

이 튜브들을 90℃에서 2분 동안 가열(변성)한 다음, 70℃의 써모사이클러에서 배양하였다. 샘플(9㎕)을 0, 5, 10, 15 및 20분에서 취하였다. 이 분획을 pH 8의 0.5M EDTA 용액 2㎕를 함유하는 튜브에 두었다.

이렇게 하여, 반응 혼합물 50㎕ 당 비오티닐화된 프라이머 12.5pmol 당량, 즉 10㎕ 당 25pmol을 얻었다. 또한 10㎕ 당 K-11-dUTP 150pmol도 있었다.

이 샘플들을 완충액 L(pH 7의 0.1M 포스페이트, 0.15M NaCl, 0.4M KF 및 0.1% BSA) 200㎕ 중 8㎕의 비율로 희석한 다음, 동일한 완충액에서 1/10로 희석하였다.

샘플(상술한 대로 희석한) 20㎕(비오틴 2×10^-14몰에 상당)를 피펫으로 마이크로플레이트(PACKARD HTRF-96 96-웰 편평 바닥면 흑색 저형광 마이크로플레이트)의 "시험" 웰로 옮겼다. 완충액 L(최종 농도 2×10^-8M)에서 희석한 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅(트렙타비딘과 화학적으로 변형된 알로피코시아닌의 콘쥬게이트, 시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 30㎕를 각 "시험"웰(SA 6.5×10^-13몰, 즉 비오틴 환산 30당량)에 첨가한 다음, 완충액 L 250㎕를 첨가하였다.

희석한 샘플 20㎕를 피펫으로 "바탕(blank)"웰로 옮기고, 여기에 완충액 L 280㎕를 첨가하였다.

배양(37℃에서 15분) 후, Discovery instrument(PACKARD HTRF 마이크로플레이트 분석기)으로 620nm 및 665nm에서 즉시 형광을 판독하였다.

각 시험에 대한 형광 세기비, Re= E665/E620 및 각 바탕에 대한 형광 세기비 Ro= B6655/B620을 계산한 다음, 퍼센트로 표시한 DF= (Re-Ro)/Ro의 값을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 1에 보고한다.

표에서, 나머지 실시예에서처럼 620nm 또는 665nm에서의 형광 측정은 측정에 사용된 기구에 따른 임의의 형광 단위로 표시하였다.

반응시간의 함수로서 DF의 값을 그래프로 그리면, 효소 복사 도중에 뉴클레오티드 함입의 반응속도론(kinetics)의 전형적인 형태를 나타낸다(도 1).

실시예 5: PCR 도중에 콘쥬게이트 K-11-dUTP의 함입(비복사 에너지 전이 및 시간분해 형광 측정에 의해 증명)

1) PCR:

실시예 3에 기재된 S 및 AS 프라이머에 의해 구획된 k-ras 유전자의 엑손 1의 부위를 증폭하였다.

이는 길이 117bp 및 다음의 서열(센스 가닥)을 갖는 증폭 산물을 생성하였다:

증폭된 서열(하기에 밑줄 침)의 중앙부에서 탐침(56% G + C)을 선택하였다. N-4-아미노헥실-dC 암을 사용하여 그 5' 말단에 비오틴을 도입하였다(A. 로제트 등., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 7643-7651): CP 탐침: 비오틴-dC.GCC TTG ACG ATA CAG C.

0.3AU₂₆₀/ml을 함유하는 , 즉 약 1.7×10^-6M 원액.

TEAAc 완충액(실시예 1, 방법 A 비교)으로부터 재정제한 K-11-dUTP 분획(13 AU₃₀₄/ml) 48㎕를 milli-Q water 32㎕, 즉 K-11-dUTP의 최종 농도 약 0.2mM로 희석하였다.

하기 4개의 천연 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 혼합물을 사용하였다:

5mM dATP, 5mM dCTP, 5mM dGTP 및 3.5mM dTTP.

하기 PCR 원료 혼합물을 제조하였다:

- BUAM 완충액(시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 10X 25㎕

- dNTP 10㎕

- S 프라이머 8㎕

- AS 프라이머 8㎕

- Taq DNA 중합효소 10㎕(즉 12.5U)

- milli-Q water 9㎕

PCR 마이크로튜브에서, PCR 배지를 하기 표에 따라 인간 태반 DNA(시그마 제) 0.01㎍/㎕를 사용하여 제조하였다.

하기 실험계획을 사용하여 PCR을 수행하였다:

1. 5분/95℃

2.1 1분/94℃(변성)

2.2 1분/60℃(순환)

2.3 1분/70℃(연장)

(31 사이클)

3.1 8분/70℃(최종 연장)

아가로오스 겔 전기영동에 의해 반응을 관찰하였다. DNA를 함유하는 튜브(T+, K1+ 및 K2+)만이 기대한 길이의 밴드(Boehringer marker VⅢ의 124bp와 비교에 의해)를 제공하였다.

2) 에너지 전이의 시간분해 측정:

측정원리는 증폭된 DNA 단편에 비오티닐화된 CP 탐침을 하이브리다이제이션한 다음, 하이브리드를 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅(실시예 4에서 정의함)와 접촉시키는 것으로 되어 있다. 유로퓸 크립테이트(공여체)로 표지된 염기의 함입은 공여체가 약 337nm에서 여기될 때, XL₆₆₅(수용체)로의 비복사 에너지 전이를 일으켰다.

이 경우, 수용체는 665nm에서 오랜동안 형광을 방출하며, 짧은 수명을 가진 수용체의 고유 형광으로부터 이 신호를 미분할 수 있다.

시간분해 형광 측정은 수용체의 존재("시험" E620 및 E665) 및 수용체의 부재("바탕" B620 및 B665)하의 620nm 및 665nm에서 한 다음, 비 Re= E665/E620 및 Ro= B665/B620를 계산하였다. 이후, 퍼센트로 환산한 DF= (Re-Ro)/Ro의 값을 계산하였다. DF 값의 증가는 에너지 전이의 존재를 나타내며, 따라서 크립테이트가 증폭된 DNA로 함입됨을 나타낸다.

PCR 유래 배지 K1-, K1+, K2- 및 K2+를 사용하였다. 각 PCR 배지 2㎕를 마이크로튜브에 침착시키고, CP 탐침 10㎕(0.03 AU₂₆₀/ml) 및 BUAM 완충액(2X) 13㎕를 첨가하며, 밀봉된 튜브를 94℃에서 10분 동안 가열한 다음, 써모사이클러를 통해 50℃에서 20분 동안 가열하였다. 하이브리다이제이션 배지 5㎕를 완충액 L 200㎕에서 희석하고, 이 희석액 40㎕를 피펫으로 마이크로티터(microtiter) 플레이트의 "시험"웰로 옮기고, "바탕"웰(Packard HTRF 96-웰 편평 바닥면 마이크로플레이트)로 40㎕를 옮겼다.

3×10^-8M SA-XL₆₆₅(시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 40㎕ 및 완충액 L 200㎕를 "시험"웰에 첨가하였다. 완충액 L 240㎕를 "바탕"웰에 첨가하였다.

37℃에서 15분 동안 배양한 후, Discovery instrument(패커드 제)으로 즉시 형광을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 2에 보고한다.

이 결과는, PCR 도중에 콘쥬게이트 K-11-dUTP가 함입됨을 나타낸다. 또한 증폭된 DNA에 결합된 크립테이트 분자의 존재는 이 증폭된 DNA에 대해 특이적인 탐침과의 하이브리다이제이션에 의해 설명할 수 있고, 크립테이트 및 하이브리다이제이션된 탐침에 결합된 수용체 간의 비복사 에너지 전이에 의해 설명할 수 있다.

실시예 6: 크립테이트 유로퓸 트리스-비피리딘으로 표지된 데옥시우리딘(K-4-dUTP)의 합성

이 화합물에서, 숫자 4는 크립테이트 구조를 뉴클레오티드에 연결하는 암 중의 원자의 총수를 의미한다(이 경우, 피리미딘의 5번 위치에서 결합됨).

사용된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 문헌(랑거 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국(1981), 78, 6633-6637)의 방법에 의해 제조되는 5-(3-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트(AA-dUTP)이다. 이 화합물을 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트 구배(10mM 내지 300mM) 하의 DEAE-Sepharose^R(파마시아 제)에서 정제하였다.

5.4μmol/ml을 함유하는 AA-dUTP 용액 60㎕(즉, 0.3μmol)을 pH 7.8의 0.1M 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트(TEAB) 240㎕로 희석하고, 아세토니트릴 중 4mg/ml를 함유하는 활성화된 크립테이트[TBP-(Eu³⁺)] 용액 300㎕, 즉 0.85μmol(약 3당량)을 첨가하였다. 이 활성화된 크립테이트[TBP-(Eu³⁺)]를 즉시 사용하기 위해 실시예 1, 방법 A에서 기재한 바와 같이 제조하였다.

35분 동안 진탕한 후, pH 8.5의 1M TEAB 15㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 반으로 농축한 다음, Superdex 30^RHR 10/30 칼럼(파마시아 제)에 주입하고, 아세토니트릴 10%를 함유하는 pH 9의 25mM TEAB로 용출하였다(유속 1ml/분).

Rt16.3분의 화합물을 회수하고; 이 분획을 분획 1이라 하고, 진공(speed-vac)하에서 부피 200㎕로 농축한 다음, 동일한 칼럼에 주입하여 아세토니트릴 5%를 함유하는 pH 7의 25mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액으로 용출하였다. 크로마토그램에서 유일한 피크에 해당하는 분획을 회수하고(16분〈Rt〈19분), 진공(speed-vac)하에서 농축하여 6.0 AU₃₀₃을 함유하는 K-4-dUTP 용액 260㎕를 얻었으며, 이것을 분획 2라고 하였다. ε₃₀₃측정치35,000을 통해, K-4-dUTP의 농도는 약 0.65mM인 것으로 측정되었다.

화합물을 질량 스펙트럼으로 측정 분석하였다(네가티브 모드 전기분무):

(M-4H)^-= 1315.5(C₅₀H₄₈EuN₁₁O₁₇P₃의 계산치; 1319)

수중 UV 스펙트럼은 뉴클레오시드의 특징인 243nm에서 최대(λ_max= 289nm, ε= 7100; λ_max= 240nm, ε= 10,700)를, 유로퓸 크립테이트의 특징인 λ_max= 305nm(ε= 27,000) 근처인 303nm에서 최대를 가졌다. 비 A₃₀₃/A₂₄₀ 0.82를 관찰하였고, 이것은 제안된 구조에 부합하였다.

콘쥬게이트 K-4-dUTP의 화학식을 도 2에 나타낸다.

실시예 7: 크립테이트 유로퓸 트리스-비피리딘으로 표지된 우리딘(K-11-dUTP)의 합성

이 화합물에서, 숫자 11은 크립테이트 구조를 뉴클레오티드에 연결하는 스페이서 암 중의 원자 총수를 의미한다(이 경우, 피리미딘의 5번 위치에서 결합이 일어남).

사용한 뉴클레오시드 트리포스페이트는 6-아미노카프로일-[5-(3-아미노알릴)우리딘 5'-트리포스페이트](AH-UTP)로, 실시예 1에서 지시한 대로 제조하였다. 이 화합물을 선형 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트 구배(25mM 내지 300mM)하에서 DEAE-Sepharose^R(파마시아 제)로 정제하였다.

pH 7.8의 0.1M 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트(TEAB) 중 1.1μmol/ml를 함유하는 AH-dUTP 용액 400㎕(즉, 0.44μmol)를 사용하고, 활성화된 크립테이트[TBP-(Eu³⁺)] 용액(아세토니트릴 중 3mg/ml) 360㎕를 첨가하였다. 이 활성화된 크립테이트[TBP-(Eu³⁺)]를 즉시 사용하기 위해 실시예 1, 방법 A에 기재된 대로 제조하였다.

45분 동안 교반한 후, pH 8.5의 1M TEAB 40㎕를 첨가한 다음, 이 혼합물을 Superdex peptide 30^RHR 10/30 칼럼(파마시아 제)에 주입하고, 아세토니트릴 10%를 함유하는 pH 7의 50mM TEAB로 용출하였다(유속 1ml/분).

Rt15.4분의 화합물을 회수하고; 이 분획을 분획 1이라 하고, 진공(speed-vac)하에서 부피 200㎕로 농축하였으며, 이것은 약 10 AU_304nm를 함유하였다. 측정치 ε₃₀₄35,000로 보아, K-11-UTP의 농도는 약 0.3mM이었다.

이 분획 1을 동일한 칼럼에 주입하고, 아세토니트릴 5%를 함유하는 pH 7의 25mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액으로 용출하였다. 크로마토그램에서 유일한 피크에 해당하는 분획을 회수하고(Rt16.5분), 진공(speed-vac)하에서 농축하여 7.5 AU_304nm를 함유하는 K-11-UTP 용액 202㎕를 얻고, 이것을 분획 2라 하였다.

이 화합물을 질량 스펙트럼으로 측정 분석하였다(네가티브 모드 전기분무):

(M-4H)^-= 1444.3(C₅₆H₅₈EuN₁₂O₁₉P₃의 계산치; 1448.0)

수중 UV 스펙트럼은 뉴클레오시드의 특징인 241nm에서 최대(λ_max= 289nm, ε= 7100; λ_max= 240nm, ε= 10,700)를, 유로퓸 크립테이트의 특징인 λ_max305nm(ε= 27,000) 근처인 303nm에서 최대를 가졌다. A₃₀₄/A₂₄₁비0.80을 관찰하였고, 이것은 제안된 구조에 부합하였다.

이 화합물을 FPLC(mono-Q 칼럼, 파마시아 제)로 분석하였다. 완충액 A: 아세토니트릴 10%를 함유하는 pH 5.2의 20mM 아세트산나트륨. 완충액 B: pH 5.0의 20mM 아세트산나트륨 및 아세토니트릴 10%를 함유하는 1M LiCl. 25분에 0 내지 30%의 선형 구배. 유속 1ml/분. K-11-UTP의 Rt는10.7분이었다.

콘쥬게이트 K-11-UTP의 화학식을 도 3에 나타낸다.

실시예 8: dUTP 및 UTP와 크립테이트 유로퓸 트리스-비피리딘의 콘쥬게이트 및 크립테이트 단독의 수명의 비교 측정

사용한 참조 크립테이트는 유럽특허출원 0 321 353호의 실시예 4에 기재된 크립테이트 유로퓸[(비스-bpy)(bpy-디(아미도에틸렌아민))]이다(이하, KNH₂라고 함).

수중 KNH₂의 원액을 제조하고, ε₃₀₆에 대해30,000의 값을 취해 306nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 그 농도를 결정하였다. 원액(6.7×10^-4M)을 pH 9의 0.1M Tris-HCl 완충액에서 1/100으로 희석한 다음; 이 중간 희석액 100㎕를 동일한 완충액 600㎕에서 희석하였다. 유사하게, 수중에서 K-11-dUTP, K-4-dUTP 및 K-11-UTP(실시예 1, 방법 A, 및 실시예 6 및 7에 따라 각각 제조됨)의 원액의 농도는 304nm에서 광학밀도를 측정함으로써 3×10^-5M(ε₃₀₄ 35,000)로 측정되었다. 각 원액을 pH 7.4의 0.1M Tris-HCl 완충액 1ml에서 또는 pH 9의 0.1M Tris-HCl 완충액에서 50㎕의 비율로 희석하였다.

유로퓸의 방출 수명값(τ, 단위 ms)을 LS50 시간분해 형광분광계(퍼킨-엘머 제) 및 Helma 5mm×5mm 셀을 사용하여 측정하였다.

그 결과를 하기 표 3에 보고한다:

이들 결과는, 기준 크립테이트에 비해 크립테이트 분자와 뉴클레오티드의 커플링의 경우 유로퓸의 수명이 증가하고, 크립테이트/뉴클레오티드 콘쥬게이트에 대한 새로운 형광성이 나타난다.

실시예 9: 말단 뉴클레오디딜 전이효소에 의한 올리고뉴클레오티드의 연장 도중에 K-11-dUTP의 함입(비복사 에너지 전이 및 시간분해 형광 측정에 의해 증명)

다음을 사용하여 연장 반응을 수행하기 위한 마이크로튜브를 제조하였다:

- pH 7.2의 0.2M Tris-아세테이트 완충액 25㎕

- 25mM 염화코발트 수용액 4㎕

- 2.4μM 올리고뉴클레오티드(5' 말단에서 비오티닐화된 조성 A₂C₃G₇T₃)의 수용액 5㎕

- 농도 0.04mM의 K-11-dUTP(분획 2, 실시예 7에 따라 제조됨) 2㎕

- 0.04mM dTTP 8㎕

- 물 5㎕

- 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TnT, EC 2.7.7.31)(시그마 제, 35U/㎕) 1㎕

반응 혼합물 2㎕를 취해 60mM EDTA 4㎕에 첨가하고(t_o= 0분의 대조군을 얻기 위해), 나머지는 반응속도론 연구를 위해 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 반응시간 5, 10, 20, 40, 60 및 80분 후, 반응 혼합물 2㎕를 취하고, 반응을 중지하기 위해 60mM EDTA 4㎕에 첨가하였다. 이렇게 하여 분획 t₅, t₁₀등을 얻었다. 이들 분획 t₀, t₅, t₁₀을 완충액 L(pH 7의 0.1M 포스페이트, 0.15M NaCl, 0.4M KF 및 0.1% BSA) 250㎕로 희석하였다.

상술한 바대로 희석한 샘플 50㎕(비오틴 2.3×10^-12몰에 상당)을 피펫으로 마이크로플레이트(PACKARD HTRF-96 96-웰 편평 바닥면 흑색 저형광 마이크로플레이트)의 "시험" 웰(E_o, E₅, E₁₀등)로 옮겼다. 완충액 L(1.5×10^-8M)에서 희석한 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅(시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 50㎕를 각 "시험"웰에 첨가한 다음, 완충액 L 150㎕를 첨가하였다.

효소를 물 1㎕로 치환한 상술한 반응 혼합물로부터 "바탕"을 제조하였다. 이 혼합물 2㎕를 취해 상술한 처리과정 및 희석 처리하였다. 이 희석된 샘플 50㎕를 피펫으로 "바탕" 웰로 옮기고, 여기에 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅50㎕ 및 완충액 L 150㎕를 첨가하였다.

배양(37℃에서 15분) 후, DISCOVERY instrument(PACKARD HTRF 마이크로플레이트 분석기)로 620nm 및 665nm에서 형광을 판독하였다.

각 시험에 대한 형광 세기비, Re= E665/E620, 각 바탕에 대한 Ro= B665/B620을 계산한 다음, 퍼센트로 환산한 DF= (Re-Ro)/Ro를 계산하였다. 그 결과를 하기 표 4에 보고한다.

각 바탕은 비 B665/B620가 0.064이었다. t₀에 대한 비 E665/E620는 0.063으로 관찰되었고, 그 전이는 DF= 100×(Re-Ro)/Ro= 100(0.63-0.64)/0.064, 즉 거의 0이었다. 이러한 방법으로 각 시간에 대한 DF를 계산함으로써, DF 값으로 환산한 에너지 전이는 경시적으로 증가하였으며, 이는 K-11-dUTP가 말단 뉴클레오티딜 전이효소에 의해 올리고뉴클레오티드 사슬로 함입됨을 나타내는 것이다.

실시예 10: 크립테이트 분자가 함입된 올리고뉴클레오티드의 광물리학적 특성

총량을 3배 증가시켜 TnT에 의한 K-11-dUTP의 함입반응을 실시예 9에 따라 수행하였다. K-11-dUTP의 함입이 동일한 반응속도론을 따름을 증명하기 위해 DF를 시간 함수로서 측정하였다. 반응 80분 후, 400mM EDTA 용액 12㎕로 반응을 중지시켰다. 이 반응 혼합물 105㎕를 취해 pH 7.4의 10mM 포스페이트 완충액으로 평형화한 NAP5 칼럼(파마시아 제) 상에 침착시켰다.

완충액 600㎕로 올리고뉴클레오티드를 용출하였다. 이 분획을 "분획 1"(배타 부피)이라 하고, 다음과 같이 분석하였다: 분획 1 50㎕를 마이크로플레이트의 웰에 침착하고, 완충액 L 200㎕를 부가하여 "크립테이트 바탕"을 얻었다. 분획 1 50㎕, 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅(시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 50㎕(완충액 L 중 1.5×10^-8) 및 완충액 L 150㎕를 인접한 "시험"웰에 침착하였다. DISCOVERY instrument(PACKARD HTRF 마이크로플레이트 분석기)로 620nm 및 665nm에서 형광을 판독하였다.

	F665	F620
바탕 K	2343	67,481
시험	42,982	37,722

DF는 100×(Re-Ro)/Ro= 100(1.14-0.0347)/0.0347= 3180%로 계산되었고, 따라서 이 분획은 크립테이트-표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하였다.

용출을 계속하여 얻어진 분획들(분획 2, 3...)은 F1과 비교하여 DF값이 낮고, 620nm에서 보정되지 않은 형광이 높아서, 이들은 과량의 함입되지 않은 K-11-dUTP를 함유하는 것으로 관찰되었다.

분획 F1(올리고뉴클레오티드 사슬로 함입된 크립테이트 분자에 대응)의 형광과 공지 농도의 크립테이트를 함유하는 표준 용액의 형광을 비교함으로써, 분획 F1에서 올리고뉴클레오티드의 측정량이 2×10^-11/2×10^-11= 올리고뉴클레오티드 사슬 당 2.5 크립테이트-표지된 뉴클레오티드이기 때문에, 분획 F1은 크립테이트 약 5×10^-11몰을 함유하는 것으로 측정할 수 있었다.

K-dUTP 및 dTTP가 동시에 또 무작위로 함입된다는 것을 유의해야 한다.

따라서, 가변수의 뉴클레오티드 T 및 평균 2 이상의 뉴클레오티드 K-dU가 각 올리고뉴클레오티드 사슬의 3' 말단에 함입되었다.

E₆₂₀= f(t)로 그래프를 그려 얻어진 직선의 기울기로부터 수명 τ를 계산하였다.

337nm에서 여기된 KRYPTOR 시간분해 형광계(시스 비오 엥떼르나씨오날 제)를 사용하여, 분획 1(pH 7.4의 10mM 포스페이트 완충액)에 함유된 표지된 올리고뉴클레오티드에 대해 620nm에서 방출 수명을 측정하였다. 수명 τ는 866μs이었다. 동일한 조건하에서 동시에 측정한 콘쥬게이트 K-11-dUTP의 수명(τ= 681μs)에 비해 길었다.

따라서, 올리고뉴클레오티드 사슬에 함입된 크립테이트의 수명 증가를 관찰하였다.

실시예 11: 크립테이트 유로퓸 트리스-비피리딘으로 표지된 아데노신(콘쥬게이트 K-9-ATP)의 합성

이 화합물에서, 숫자 9는 뉴클레오티드에 크립테이트 구조를 연결한 스페이서 암 중의 원자 총수를 의미한다(이 경우, 퓨린의 8번위치에서 결합됨).

사용한 뉴클레오시드 트리포스페이트는 [8-(6-아미노헥실)아데노신 5'-트리포스페이트](AH-ATP, 시그마 제)이었다. pH 8의 0.1M 트리에틸암모늄 히드로겐카르보네이트(TEAB) 100㎕ 중의 AH-ATP 0.1μmol 용액을 사용하였고, 활성화된 크립테이트[TBP-(Eu³⁺)] 용액(아세토니트릴 중 4mg/ml) 100㎕를 첨가하였다. 활성화된 크립테이트[TBP-(Eu³⁺)](아세토니트릴 중 NHS/DCC)를 즉시 사용하기 위해 실시예 1, 방법 A에 기재된 대로 제조하였다.

35분 교반한 후, 1M TEAB 5㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 반으로 농축한 다음, Superdex 30^RHR 10/30 칼럼(파마시아 제)에 주입하고, 아세토니트릴 10%를 함유하는 pH 8의 50mM TEAB로 용출하였다(유속 1ml/분).

Rt16.7분의 화합물을 회수한 다음; 이 분획을 분획 1이라 하고, 진공(speed-vac)하에서 부피 200㎕까지 농축한 다음, 동일한 칼럼에 주입하고, 아세토니트릴 5%를 함유하는 pH 7의 25mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액으로 용출하였다. 크로마토그램에서 유일한 피크에 해당하는 분획을 회수하고(Rt=17.2분), 진공(speed-vac)하에서 농축하였다.

수중 UV 스펙트럼은 245nm에서 최대를, 뉴클레오시드의 특징인 λ_max의 근처인 283nm에서 최대(λ_max= 279nm, ε= 21,000)를, 유로퓸 크립테이트의 특징인 λ_max= 305nm(ε= 27,000) 근처인 303nm에서 최대를 가졌다. A₃₀₅/A₂₈₀비는1로 관찰되었고, 이는 제안된 구조에 부합하였다.

콘쥬게이트 K-9-ATP의 화학식을 도 3에 나타낸다.

실시예 12: 생체외 전사반응 도중에 크립테이트 유로퓸 트리스-비피리딘(K-11-UTP)와 UTP 콘쥬게이트의 함입(비복사 에너지 전이와 시간분해 형광 측정에 의한 증명)

이 실시예는 생체외 전사에 의해 하나의 동일한 RNA 분자로의 K-11-UTP와 bio-14-CTP(CTP/비오틴 콘쥬게이트)의 동시 함입에 관한 것이다.

1/전사

SP6/T7 전사 키트(뵈링거-만하임 제)를 사용하여 프로모터를 함유한 2중가닥 DNA(T7 프로모터를 함유하고 EcoRI에 의해 선형화된 플라스미드 DNA pSTP18와 pSTP19)의 RNA에 대한 전사 반응을 수행하였다. 얻어진 전사산물은 1035 염기길이를 가졌다.

최종 농도 0.5mM의 리보뉴클레오티드 이외에, 전사 배지는 K-11-UTP 0.2% 및 bio-14-CTP 30%를 함유하였다. 이것은 사슬을 따라 무작위로 함입된다.

실시예 7에 기재된 분획 2인 K-11-UTP를 물로 희석하여 20μM의 농도를 얻었다.

시판 중인 10mM 비오틴-14-CTP(깁코-BRL/라이프 테크놀로지즈 제) 용액을 물로 희석하여 bio-14-CTP 용액을 제조하였다.

하기 표에 따라 PCR 마이크로튜브(0.5ml)에 전사 배지를 제조하였다.

효소 첨가 후, 반응 배지 2㎕를 취해 즉시 pH 8의 50mM EDTA 용액 38㎕로 희석하였다. 이후, 이 용액을 19㎕ 취해 그것을 완충액 L 114㎕로 희석하였다. 이 용액을 t₀= 0분의 배경 대조군(background control)으로서 사용한다.

이 반응 혼합물을 37℃의 써모사이클러에 두었다. 소정의 반응시간(60분, 90분 및 120분) 후, 반응 혼합물 2㎕을 취해 상술한 바와 같이 pH 8의 50mM EDTA 38㎕로 희석하였다. 이후, 이들 용액 19㎕를 취해 완충액 L 114㎕로 희석하였다.

0분, 60분, 90분 및 120분에 해당하는 각 희석용액 50㎕를 흑색 마이크로플레이트(PACKARD HTRF 96-웰 편평 바닥면 마이크로플레이트)의 웰에 침착시켰다.

2/에너지 전이의 시간분해 측정

배양(상온에서 15분) 후, DISCOVERY instrument(패커드 제)로 620nm 및 665nm에서 형광을 측정하였다.

고려된 각 반응시간에 대해, 비 Re= F665/F620을 계산하여 에너지 전이를 평가하였다. 시간 t₀에 대한 비 Ro= F665/F620은 배경수준의 평가를 가능하게 한다. 효소가 같은 부피의 물로 치환된 전사반응 혼합물 2㎕의 희석액에 대해 동일하게 측정하였더니, 동일한 배경수준이 얻어졌다.

각 시간에 대한 식 DF= (Re-Ro)/Ro에 의해 에너지 전이를 계산하였다. 그 결과를 하기 표 5에 보고한다.

전사된 RNA로 K-11-UTP와 bio-CTP의 함입에 기인한 에너지 전이의 증가를 의미하는 DF 값의 증가를 관찰하였다.

상술한 전사반응을 아가로오스 겔(33%)에서 전기영동에 의해 관찰하였다.

제조된 RNA 단편의 통합성(integrity)을 나타내는 큰 밴드가 관찰되었다. 이 밴드는 천연 rNTP 단독에 대해 실시된 전사로부터 제조된 밴드와 동일한 이동(migration)을 특징으로 하고 있다.

도 4에 반응시간 함수로서 나타낸 DF 값의 곡선은 효소 전사 도중에 뉴클레오티드 함입의 반응속도론의 전형적인 형태를 나타낸다. 이들 결과는 콘쥬게이트 K-11-UTP가 RNA 중합효소에 의해 효율적으로 함입됨을 나타낸다.

실시예 13: 생체외 전사반응 도중에 콘쥬게이트 K-11-UTP의 함입(수용체 탐침과의 하이브리다이제이션 후, 비복사 에너지 전이와 시간분해 형광 측정에 의한 증명)

전사 키트(깁코 BRL)에 의해 2중가닥 DNA의 RNA로의 전사반응을 수행하였다. T7 프로모터를 함유하는 2중가닥 DNA를 그 하나가 T7 RNA 중합효소의 프로모터 서열을 함유하는 한쌍의 프라이머로 수행된 PCR에 의해 얻었다(EC 2.7.7.6).

얻어진 전사산물은 이론적 염기길이가 115이다.

RNA 중합효소에 의한 전사의 일반원리는 "Mollecular Cloning, A Laboratory Manual", 2판, J. 삼브루크, E.F. 프리취 및 T. 마니아티스, CSH 출판 1989에 기재되어 있다.

또한 SP6 또는 T3 RNA 중합효소 등의 또다른 RNA 중합효소를 사용할 수 있으며, 이 경우 고려된 RNA 중합효소의 특이적 프로모터를 함입하기 위해 해당 PCR 프라이머의 서열이 조절될 수 있다.

프로모터의 함입은 "PCR: Clinical Diagnostics and Research', A. 롤프스 등., Springer-Verlag(1992)의 §13.5와 §23.2, 및 D.Y. 보쓰 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국(1989), 86, 1173-1177에 기재되어 있다.

1/RNA 중합효소의 프로모터를 함유하는 2중가닥 DNA의 제조

사용한 실험계획은 117bp의 1차 PCR 산물을 생성하기 위해 데옥시뉴클레오티드만을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 5에 기재된 바와 유사하다.

표적 DNA(DNA)로서 1차 PCR 산물의 1/100 희석액 2㎕를 사용하여 두 번째 PCR(2차 PCR)을 수행하였다. 이 2차 PCR에 대해, k-ras EX1 안티센스 프라이머를 다음과 같은 서열의 T7-AS라고 하는 프라이머로 치환하였다:

이 서열의 이탤릭체 부분은 T7 RNA 중합효소의 프로모터 서열에 대응한다.

k-ras EX1 센스 프라이머는 다음과 같은 서열을 가졌다:

이 2차 PCR 후 얻어진 2중가닥 DNA는 이론적 길이가 132bp이고, 다음과 같은 서열(센스 가닥)을 가졌다:

이탤릭체 부분은 T7 서열(센스 가닥)을 의미하고, 밑줄 친 부분은 하이브리다이제이션 단계 중의 탐침에 대응하는 서열을 의미한다.

전사는 다음과 같은 RNA 서열을 제조하며(전사된 DNA 단편의 안티센스 가닥과 상동인 서열), 밑줄 친 부분은 비오티닐화된 탐침에 의해 인식된 서열에 해당한다.

사용한 RAS12N 탐침은 그 5' 말단에서 비오티닐화되고, 다음과 같은 서열을 가졌다:

2/ 전사:

최종 농도 0.5mM의 천연 리보뉴클레오티드 이외에, 전사 배지는 K-11-UTP를 함유하며, 이는 RNA 사슬을 따라 무작위로 함입된다.

실시예 7에 기재된 K-11-UTP, 분획 2를 수중에서 희석하여 농도 100μM을 얻었다.

하기 표에 따른 PCR 마이크로튜브(0.5ml)에서 전사 배지를 제조하였다.

이 반응 혼합물을 40℃의 써모사이클러에 120분 동안 둔 다음, pH 8의 0.2M EDTA 4㎕로 반응을 중지시켰다.

반응 배지 2㎕를 PCR 마이크로튜브에 둔 다음, RAS12N 탐침 10㎕(수중 0.03 AU₂₆₀/ml)로 희석하고, 하이브리다이제이션 완충액(pH 7.4의 100mM 포스페이트 완충액, 0.1% BSA, 1M NaCl) 13㎕을 첨가하였다. 이 혼합물을 70℃에서 10분 동안 가열한 다음, 45℃의 써모사이클러에서 20분 동안 하이브리다이제이션하였다.

상기 하이브리다이제이션 배지 5.5㎕를 완충액 L(qsp 200㎕)에서 희석하여 희석된 하이브리다이제이션 배지 HT_pos를 얻었다.

표적 DNA를 함유하지 않은 네가티브 PCR 유래 PCR 배지와 동등 부피로 포지티브 PCR DNA를 치환한 것을 제외하고는, 상기 실험계획에 따라 전사를 실시하여 바탕을 제조하였다.

네가티브 전사 배지(2㎕)를 중지한 다음, 상술한 대로 하이브리다이제이션를 수행하고, 혼합물을 완충액 L에서 희석하여 희석된 하이브리다이제이션 배지 HT_neg를 얻었다.

3/에너지 전이의 시간분해 측정

스트렙타비딘/비오틴 쌍을 통해 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅(시스 비오 엥떼르나씨오날 제)로 표지된, RNA 서열에 상보적인 탐침과의 하이브리다이제이션에 의해 RNA 사슬로의 크립테이트의 함입이 시행되었다.

HT_pos배지 50㎕와 완충액 L에서 1.5×10^-10M까지 희석한 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅(시스 비오 엥떼르나씨오날 제) 50㎕를 흑색 마이크로플레이트(PACKARD HTRF 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트)의 웰에 침착시킨 다음, 완충액 L 100㎕를 첨가하였다. 이들 웰을 통해 실시예 5에서 상세히 기재한 대로 Re= E665/E620을 계산함으로써 에너지 전이를 측정할 수 있었다.

HT_neg배지 50㎕를 인접한 웰에 침착시키고, 상술한 바대로 콘쥬게이트 SA-XL₆₆₅50㎕와 완충액 L 100㎕를 첨가하였다. Ro를 계산함으로써 배경을 평가하기 위한 기준으로서 이들 웰을 제공하였다.

DISCOVERY instrument(패커드 제)로 620nm 및 665nm에서 형광을 측정하였다.

각 시간에 대해 식 DF= (Re-Ro)/Ro를 통해 에너지 전이를 계산하였다. 이 결과를 하기 표 6에 보고한다.

표적 DNA의 존재하에서 전사를 수행한 경우, 178%의 전이가 관찰되었다.

Claims

- 하나 이상의 고리 탄소원자, 퓨린 또는 피리미딘 고리의 고리밖 질소원자, 또는 펜토푸라노오스 단위의 다른 탄소원자가 형광 지표와의 결합에 관여할 수 있는, 천연의, 화학적 변형된 또는 하나 이상의 표지화 분자와 콘쥬게이트된 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드, 및

- 상기 원자(들)와 결합되고, 희토류 크립테이트로 된 하나 이상의 형광 지표를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 형광 콘쥬게이트.
- 하나 이상의 고리 탄소원자 또는 퓨린 또는 피리미딘 고리의 고리밖 질소원자가 형광 지표와의 결합에 관여할 수 있는, 천연의, 화학적 변형되거나 또는 하나 이상의 표지화 분자와 콘쥬게이트된 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드, 및

- 상기 원자(들)와 결합되고, 희토류 크립테이트로 된 하나 이상의 형광 지표를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 형광 콘쥬게이트.
제1항 또는 제2항에 있어서, AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me-AMP, 2Me-ADP, 2Me-ATP, 1Me-GMP, 1Me-GDP, 1Me-GTP, 5Me-CMP, 5Me-CDP, 5Me-CTP, 5MeO-CMP, 5Me0-CDP, 5MeO-CTP, 7-데아자-ATP 및 7-데아자-GTP로부터 선택된 리보뉴클레오티드, 또는 이들 리보뉴클레오티드에 대응하고 데옥시- 또는 디데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 형광 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드가

- 염기의 5번 위치에서 관능화된 2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 또는 우리딘 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 4번 또는 5번 위치에서 관능화된 2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트 또는 시티딘 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 6번 또는 8번 위치에서 관능화된 2'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트 또는 아데노신 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 6번 또는 8번 위치에서 관능화된 2'-데옥시구아노신 5'-트리포스페이트 또는 구아노신 5'-트리포스페이트 유도체,

- 염기의 7번 위치에서 관능화된 2'-데옥시-7-데아자아데노신 5'-트리포스페이트 또는 7-데아자아데노신 5'-트리포스페이트 유도체, 및

- 염기의 7번 위치에서 관능화된 2'-데옥시-7-데아자구아노신 5'-트리포스페이트 또는 7-데아자구아노신 5'-트리포스페이트 유도체

로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항에 있어서, 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오시드가 A, G, C, U, T, 그에 대응하는 데옥시- 또는 디데옥시뉴클레오시드 및 이들의 화학적으로 변형된 유사체로부터 선택되는 뉴클레오시드의 형광 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제5항에 있어서, 데옥시리보뉴클레오시드가 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 및 그 유도체, 및 A, T, C, G, U 및 I의 2',3'-디데옥시 유사체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 지표가 염기 또는 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드의 펜토푸라노오스 단위에 도입되거나 또는 생성된 관능기에 직접적으로 또는 스페이서 암을 통해 결합되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 지표가 테르븀, 유로퓸, 사마륨 또는 디스프로슘 크립테이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 지표가 하기 화학식(I)의 거대다중고리 화합물에 의해 착화된 하나 이상의 희토류염으로 된 희토류 크립테이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:

(I)

상기 식에서, Z는 3- 또는 4가 원자이고, R은 아무것도 아니거나, 수소, 히드록실기, 아미노기 또는 탄화수소 라디칼이며, 2가 라디칼,및는 서로 독립적으로, 임의로 하나 이상의 헤테로원자를 함유하고 임의로 사슬 중간에 헤테로거대고리를 포함하는 탄화수소 사슬이고, 라디칼,및중 하나 이상은 또한 하나 이상의 분자 잔기를 함유하거나 또는 분자 잔기로 필수적으로 된 것으로, 상기 분자 잔기는 착화된 희토류 이온의 방출 수준보다 큰 삼중 에너지를 갖는다.
제9항에 있어서, 형광 지표는 분자 잔기가 페난트롤린, 안트라센, 벤젠, 나프탈렌, 비- 및 테르페닐, 아조벤젠, 아조피리딘, 피리딘, 비피리딘, 비스퀴놀린 및 하기 화학식의 화합물로부터 선택되는 화학식(I)의 희토류 크립테이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:

-C₂H₄-X₁-C₆H₄-X₂-C₂H₄-

-C₂H₄-X₁-CH₂-C₆H₄-CH₂-X₂-C₂H₄-

상기 식에서, X₁및 X₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, 산소, 질소 또는 황이고,

X는 산소 또는 수소이다.
제9항 또는 제10항에 있어서, 형광 지표가 하기 거대고리 화합물 중 하나에 의해 착화된 테르븀 또는 유로퓸 이온으로 된 희토류 크립테이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:

(22) 페난트롤린; (22) 페난트롤린 아미드; (22) 안트라센; (22) 안트라센 아미드; (22) 비이소퀴놀린; (22) 비페닐-비스-피리딘; (22) 비피리딘; (22) 비피리딘 아미드; 및 트리스-비피리딘, 트리스-페난트롤린, 페난트롤린-비스-비피리딘, 비이소퀴놀린-비스-비피리딘 및 비스-비피리딘 디페닐비피리딘 거대다중고리.
제11항에 있어서, 형광 지표가 유로퓸 크립테이트 Eu 트리스-비피리딘인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 지표가 비피라진, 비피리미딘 및 N-옥사이드기를 함유하는 질소 헤테로고리로부터 선택된 분자 잔기를 포함하는 거대다중고리 화합물에 의해 착화된 하나 이상의 희토류염으로 된 희토류 크립테이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 지표가 하기 화학식(II) 또는 (Ⅲ)의 거대다중고리 화합물에 의해 착화된 하나 이상의 희토류염으로 된 희토류 크립테이트인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:

(II)

(Ⅲ)

상기 식에서,

- 식의 고리는 하기 고리 중 하나이고:

{식중, n은 0 또는 1,

[N₂O₄] 거대고리 또는 (22) 고리

[N₂O₃] 거대고리 또는 (21) 고리}

거대고리 비스-피리딘

- Y는 임의로 하나 이상의 이중결합을 함유하고/하거나 임의로 산소, 질소, 황 또는 인 등의 하나 이상의 헤테로원자, 또는 하나 이상의 카르바모일 또는 카르복사미도기를 함유하는 선형 또는 분지형의 C₁내지 C₂₀알킬렌기, C₅내지 C₈시클로알킬렌기, 또는 C₆내지 C₁₄아릴렌기로부터 선택되는 2가 유기 라디칼로 된 기 또는 스페이서 암으로, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌 또는 아릴렌기는 임의로 알킬, 아릴 또는 술포네이트기로 치환되고;

- Z는 생물학적 물질과 공유결합할 수 있는 관능기이며;

- R은 메틸기 또는 -Y-Z 기이고;

- R'는 수소 또는 -COOR"(R"는 C₁내지 C₁₀알킬기, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 t-부틸기)이거나, 또는 R'는 -CO-NH-Y-Z기이다.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 지표가 임의로 하나 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 함유하고/하거나 임의로 산소, 질소, 황 또는 인 등의 하나 이상의 헤테로원자, 또는 하나 이상의 카르바모일 또는 카르복사미도기를 함유하고, 임의로 알킬, 아릴 또는 술포네이트기로 치환되는 선형 또는 분지형의 C₁-C₂₀알킬렌기; C₅-C₈시클로알킬렌기; 및 C₆-C₁₄아릴렌기로부터 선택된 2가 유기 라디칼로 된 스페이서 암을 통해 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드에 결합되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
제15항에 있어서, 스페이서 암이 하기 기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:

및
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 데옥시리보뉴클레오티드가 데옥시우리딘이고, 형광 지표가 유로퓸 크립테이트 Eu 트리스-비피리딘이며, 스페이서 암이 3-아미노알릴기인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
하나 이상의 고리 탄소원자 또는 퓨린 또는 피리미딘 고리의 고리밖 질소원자 또는 펜토푸라노오스 단위의 다른 탄소원자가 형광 지표와의 결합에 관여할 수 있는, 천연의, 화학적으로 변형된 또는 하나 이상의 표지화 분자와 콘쥬게이트된 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오시드 또는 -뉴클레오티드가 상기 원자(들)에 결합되고 희토류 크립테이트로 된 하나 이상의 형광 지표와 반응하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 제조방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 지표로서의 용도.
제1항 내지 제3항 또는 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 핵산 합성반응에서 구성 뉴클레오티드로서의 용도.
제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 화합물의 검출 및/또는 위치결정용으로서의 용도.
제20항에 있어서, 합성 핵산 폴리뉴클레오티드로의 콘쥬게이트 함입도와 상관관계가 있는 방출 형광을 상기 콘쥬게이트에 의해 직접 또는 간접적으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 핵산 합성반응에 관여하는 효소의 효소 활성을 측정하는 방법에서의 용도.
제22항에 있어서, 효소 활성이 DNA 또는 RNA 중합효소, 역전사효소, 전이효소 또는 리가아제 활성인 것을 특징으로 하는 용도.
제20항에 있어서, 핵산 기질을 가진 효소활성을 측정하는 방법에서의 용도.
제1항 내지 제3항 또는 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 콘쥬게이트를 포함하는 폴리뉴클레오티드.