ES2201533T3 - Nuevos conjugados fluorescentes de nucleosidos o de nucleotidos, sus procedimientos de preparacion y sus utilizaciones. - Google Patents
Nuevos conjugados fluorescentes de nucleosidos o de nucleotidos, sus procedimientos de preparacion y sus utilizaciones.Info
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Abstract
Conjugado fluorescente de nucleósido o de nucleótido, caracterizado porque comprende: - un ribo- o desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o químicamente modificado o conjugado con una o más moléculas marcadoras, en el que al menos un átomo de carbono del anillo, o un átomo de nitrógeno exocíclico del anillo purínico o pirimidínico, o también un átomo de carbono de la unidad pentofuranósica, es susceptible de estar implicado en un enlace con un marcador fluorescente, y - al menos un marcador fluorescente enlazado a dicho o dichos átomos que constan de un criptato de tierras raras.
Description
Nuevos conjugados fluorescentes de nucleósidos o
de nucleótidos, sus procedimientos de preparación y sus
utilizaciones.
La invención se refiere a nuevos conjugados
fluorescentes de nucleósidos o de nucleótidos, utilizables
principalmente para detectar, localizar y/o aislar ácidos nucleicos
o moléculas de interés biológico o clínico con estructura
nucleosídica, o susceptible de interaccionar con ácidos
nucleicos.
En la siguiente descripción, se utilizarán las
siguientes abreviaturas:
ARN: ácido ribonucleico
ADN: ácido desoxirribonucleico
A: adenosina
C: citidina
G: guanosina
T: timidina
U: uridina
I: inosina
Sufijo MP: monofosfato
Sufijo DP: difosfato
Sufijo TP: trifosfato
Prefijo d: desoxi.
Una reacción de síntesis enzimática de ADN emplea
una matriz de ARN o de ADN, un cebador oligonucleotídico de
secuencia complementaria a un segmento de la matriz, una enzima
apropiada, y cuatro desoxinucleótidos: dATP, dCTP, dGTP y dTTP (o
dUTP). Se conocen diversas enzimas, como ADN polimerasa de E.
coli, ADN polimerasa de T7, el fragmento de Klenow de la ADN
polimerasa, la ADN polimerasa de Taq, una transcriptasa inversa, a
las cuales se puede añadir la
nucleotidil-transferasa terminal que presenta la
particularidad de no necesitar una matriz. La síntesis del ARN se
hace de manera similar, excepto que los cebadores y matrices
requeridos son diferentes, y excepto que se utilizan ribonucleótidos
(ATP, CTP, GTP y UTP) en presencia de ARN polimerasas.
Los nucleótidos o polinucleótidos pueden estar
marcados de forma radiactiva (^{3}H, ^{32}P, ^{14}C, ^{35}S
o ^{125}I).
La utilización de moléculas marcadas presenta los
inconvenientes asociados clásicamente con los isótopos radioactivos,
como son los riesgos asociados a la radioactividad, así como a un
almacenamiento y una disponibilidad limitados debido a la
disminución de la radioactividad y a los fenómenos de
radiolisis.
El marcado químico a nivel de los nucleótidos o
de los polinucleótidos permite evitar estos inconvenientes, que han
sido descritos en la bibliografía. Principalmente, se ha descrito
el marcado por la biotina de nucleótidos derivados del dUTP o del
UTP (Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C., 1981; Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 78, 6633-37). Estos son derivados en los
cuales la biotina está enlazada a la posición C-5
del núcleo pirimidínico por un brazo alquilamínico. Estos
nucleótidos marcados se incorporan in vitro en
polinucleótidos por acción de polimerasas de ADN o de ARN
(documento EP 0.063.879), y permiten una detección colorimétrica de
ácidos nucleicos mediante una reacción de "transferencia de
punto" (Leary J.J., Brigati D.J. y Ward D.D., 1983; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 80, 4045-49).
Otros análogos de nucleótidos marcados con la
biotina, basados en derivados de la
N-4-aminoalquil-desoxi-citidina
y de la
N-6-aminoalquil-desoxiadenosina,
se describen en la patente de EE.UU. 4.828.979 y en Gebeyehu G.G. et
al. Nucleic. Acids. Res., 1987, 15, 4513-4534.
Se describen igualmente (documento EP 0.063.879)
unos derivados de dUTP, de dATP sustituido por la biotina en
posición C-8, así como la posibilidad de
sustitución en C-7 de una
7-desazapurina.
Igualmente se ha descrito (Gilliam I.C. y Tener
G.M., 1989, Nucleoside & Nucleotide, 8, 1453-62)
el derivado bio-15-dGTP. Se pueden
incorporar unos derivados fluorescentes, tales como la fluoresceína
o la rodamina, en un ácido nucleico por medio de un trifosfato de
nucleósido (dATP, dUTP, dCTP) marcado (documento WO 93 19206). Una
discusión sobre la posición de las sustituciones sobre las purinas y
pirimidinas, así como sobre la naturaleza de los brazos espaciadores
utilizables para el marcado de didesoxinucleótidos con derivados de
la fluoresceína, aunque dedicada a los terminadores de cadena para
la secuenciación, da una visión general de la química de los
nucleótidos marcados (Confalone P.T., 1990, J. Heterocyclic Chem.,
27, 31-46).
La utilización conjunta de trifosfatos de
nucleósidos marcados con la ayuda de diferentes trazadores
(Biotina-11-dUTP,
dig-11-dUTP y
FITC-11-dUTP) permite una
visualización simultánea de diferentes secuencias durante una
hibridación (RIED T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89,
1388-1392).
La incorporación de desoxinucleótidos marcados
con la fluoresceína, tal como FI-dUTP o
FI-dCTP, se efectúa igualmente sustituyendo sólo
parcialmente el nucleótido natural por el compuesto marcado,
dCTP/FIdCTP \approx 2:1 (documento WO93/19206). Esta misma
patente describe que, mediante elección de la enzima y de las
condiciones experimentales, es posible sustituir la totalidad de un
nucleótido por un nucleótido marcado.
Los datos de la bibliografía muestran que la
eficacia de incorporación de un conjugado de trifosfato se modifica
por el acoplamiento de una molécula como la biotina, y, en menor
medida, por la presencia del brazo que permite el acoplamiento.
Por ejemplo, en una reacción de "traslación por
cortes" (en inglés "nick-translation") en
presencia de una polimerasa de ADN, se han comparado los
porcentajes de incorporación de diversos análogos de trifosfatos,
con el nucleósido natural tomado como referencia (100% de
incorporación) para un mismo tiempo de reacción (90 min.) (Gebeyehu
G. et al. Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4525).
Las moléculas conjugadas a trifosfatos de
nucleósidos (Goodchild, J. Bioconjugate chem., 1990, p. 171; Kricka
J. Non isotopic Blotting, and Sequencing 1995 Academic Press p. 47;
Zhu Z. et al. Nucleic Acids Res., 1994, 3418-3422)
son unas moléculas de tamaño relativamente pequeño (<800Da), bien
neutras o bien cargadas negativamente y de forma esencialmente
planas y, por consiguiente, se reduce su impedimento, pero queda el
suficiente para perturbar la incorporación enzimática del
trifosfato de nucleósido.
En la solicitud de patente EP 0 321 353 se
describen unos criptatos de tierras raras utilizables como
marcadores para la detección de sustancias.
La solicitud de patente WO92/14841 describe unos
conjugados que constan de un quelato de tierras raras que comprende
n unidades de triazina enlazadas de manera covalente a un
oligonucleótido que comprende al menos 4 + n desoxi- o
ribo-nucleótidos.
Se han encontrado ahora nuevos conjugados de
nucleósidos o de nucleótidos que comprenden:
- un ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o
químicamente modificado o conjugado a una o más moléculas
marcadoras, en el que al menos un átomo de carbono del anillo o un
átomo de nitrógeno exocíclico del anillo púrico o pirimidínico, o
también un átomo de carbono del anillo pentafuranósico, es
susceptible de estar implicado en un enlace con un marcador
fluorescente, y
- al menos un marcador fluorescente enlazado a
dicho o dichos átomos que constan de un criptato de tierras
raras.
En aspecto preferido, dichos conjugados
comprenden:
- un ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o
químicamente modificado o conjugado a una o más moléculas
marcadoras, en el que al menos un átomo de carbono del anillo, o de
nitrógeno exocíclico del anillo púrico o pirimidínico, es
susceptible de estar implicado en un enlace con un marcador
fluorescente, y
- al menos un marcador fluorescente enlazado a
dicho o dichos átomos constituido por un criptato de tierras
raras.
Dichos conjugados pueden ser utilizados en todas
la aplicaciones de nucleósidos o nucleótidos marcados sin presentar
mayores inconvenientes de utilización, y presentan principalmente
una capacidad elevada de ser incorporados en el ADN de hebra
sencilla o de doble hebra.
Estas propiedades son aún más sorprendentes
porque los criptatos de tierras raras son unas moléculas de masa
molecular elevada (superior a 1400 Da), que tienen una estructura
tridimensional que presenta más impedimento estérico que una
molécula globalmente plana, y que tienen un carácter iónico que
proviene de la presencia del ion complejado que le confiere una
carga positiva.
De hecho, de estas características estructurales
se podría esperar que las cargas positivas de un criptato de
tierras raras interaccionaran fuertemente con las cargas negativas
del grupo trifosfato y modificaran su reactividad así como las
cualidades de fluorescencia del criptato.
\newpage
Al igual que la actividad de las enzimas, tales
como las polimerasas, que son sensibles a la presencia y a la
concentración de algunos iones o agentes complejantes en el medio
de reacción, se podría esperar que los conjugados según la invención
acarrearan una fuerte disminución de la incorporación de los
trifosfatos de nucleótidos, y por tanto un bajo rendimiento,
principalmente en una síntesis de polinucleótidos.
De manera sorprendente, los resultados obtenidos
utilizando los conjugados según la invención muestran que no
solamente los criptatos de tierras raras no tienen influencia
desfavorable en las aplicaciones que hacen intervenir a las
reacciones enzimáticas, sino que conservan sus propiedades
fluorescentes intrínsecas.
De manera ventajosa, se ha encontrado igualmente
que los conjugados según la invención presentaban nuevas
características de fluorescencia y, en particular, que la duración
de vida de emisión del ion de tierras raras complejado estaba
significativamente aumentada.
Dichos conjugados pueden por tanto ser utilizados
como marcadores fluorescentes en todas los usos en los cuales se
efectúa una detección cuantitativa o cualitativa para medir la
fluorescencia directa o indirecta.
En un aspecto preferido, la invención se refiere
a conjugados fluorescentes de nucleótidos que comprenden un
ribo-nucleótido elegido entre AMP, ADP, ATP, GMP,
GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me AMP, 2Me
ADP, 2Me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP, 5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP,
5MeO CMP, 5MeO CDP, 5MeO CTP,
7-desaza-ATP,
7-desaza-GTP, o, llegado el caso, un
desoxirribo-nucleótido elegido entre los desoxi- o
didesoxi-ribonucleótidos correspondientes a sus
ribo-nucleótidos, y en particular:
- los derivados de
2'-desoxi-uridin-5'-trifosfato
o de uridin-5'-trifosfato
funcionalizados en la posición 5 de la base (principalmente la
cadena aminoalílica o aminopropínica),
- los derivados de
2'-desoxi-citidin-5'-trifosfato
o de citidin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 4 ó 5 de la base (principalmente la
cadena aminoalílica o aminopropínica por la posición 5),
- los derivados de
2'-desoxi-adenosin-5'-trifosfato
o de adenosin-5'-trifosfato
funcionalizados en la posición 6 u 8 de la base,
- los derivados de
2'-desoxi-guanosin-5'-trifosfato
o de guanosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 6 u 8 de la base,
- los derivados de
2'-desoxi-7-desaza-adenosin-5'-trifosfato
o de
7-desaza-adenosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 7 de la base, y
- los derivados de
2'-desoxi-7-desaza-guanosin-5'-trifosfato
o de
7-desaza-guanosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 7 de la base.
Los nucleótidos utilizables para el fin de la
invención comprenden igualmente nucleótidos modificados
químicamente en la parte trifosfato, en particular los derivados
\alpha-tiotrifosfatos.
Según otro aspecto, la invención se refiere a
conjugados fluorescentes de nucleósidos en los cuales el ribo- o
desoxirribo-nucleósido se elige entre A, G, C, U, T,
los desoxi- o didesoxinucleósidos correspondientes, y sus análogos
químicamente modificados, y en particular la
3'-azido-3'-desoxitimidina
y sus derivados; y los análogos 2',3'-didesoxi de
A, T, C, G, U, I.
El marcador fluorescente está constituido por un
criptato de tierras raras elegido preferentemente entre los
criptatos de terbio, de europio, de samario o de disprosio.
En la siguiente descripción, el término
"criptato", así como la nomenclatura de los macrociclos y
policiclos utilizables, son tal como se definen por J.M. Lehn en
Struct. Bonding (Berlin), 16, 1, 1973 y en Acc. Chem. Res. 11, 49
(1978).
Según un aspecto preferido, dicho criptato de
tierras raras está constituido por al menos una sal de tierras
raras complejada por un compuesto macropolicíclico de fórmula
en la que Z es un átomo que tiene 3 ó 4
valencias, R es nada o representa hidrógeno, el grupo hidroxi, un
grupo amino o un radical hidrocarbonado, los radicales bivalentes
\code{A}, \code{B} y \code{C} son independientemente cada uno
cadenas hidrocarbonadas que contienen opcionalmente uno o más
heteroátomos y están opcionalmente interrumpidos por un
heteromacrociclo, comprendiendo al menos uno de los radicales
\code{A}, \code{B} y \code{C} más o menos un resto molecular,
o estando esencialmente constituido por un resto molecular,
poseyendo dicho resto molecular una energía de triplete superior a
la del nivel emisor del ion de tierras raras
complejado.
Preferentemente, se trata de un criptato que
consta de al menos una sal de tierras raras complejada por un
compuesto macropolicíclico de fórmula (I) más abajo, en la cual el
resto molecular se elige entre fenantrolina, antraceno, benceno,
naftaleno, los bi- y ter-fenilos, azobenceno,
azopiridina, piridina, las bipiridinas, las bisquinoleínas y los
compuestos de las siguientes fórmulas:
- C_{2}H_{4} - X_{1} - C_{6}H_{4} -
X_{2} - C_{2}H_{4} -
- C_{2}H_{4} - X_{1} - CH_{2} -
C_{6}H_{4} - CH_{2} - X_{2} - C_{2}H_{4} -
X_{1} y X_{2} pueden ser iguales o
diferentes, que designan oxígeno, nitrógeno o azufre,
siendo X oxígeno o
hidrógeno.
En un aspecto ventajoso, el marcador fluorescente
es un criptato de tierras raras que consta del ion terbio o europio
complejado por uno de los compuestos macrocíclicos siguientes:
(22)fenantrolina;
(22)fenantrolin-amida; (22)antraceno;
(22)antracen-amida;
(22)bi-isoquinoleína;
(22)bifenil-bis-piridina;
(22)bipiridina;
(22)bi-piridin-amida; los
macropoliciclos tris-bipiridina,
tris-fenantrolina,
fenantrolin-bis-bipiridina,
bi-isoquinoleín-bis-bipiridina,
bis-bipiridin-difenilbipiridina.
Un marcador particularmente ventajoso es el
criptato de europio Eu trisbipiridina.
En la patente EP 180.492 se describen, por
ejemplo, tales compuestos.
Se pueden igualmente utilizar compuestos de
criptatos macropolicíclicos que complejan iones de tierras raras,
en los cuales el resto molecular se elige entre bipirazinas, las
bipirimidinas y los heterociclos nitrogenados que contienen grupos
N-oxido.
En F. Bodar-Houillon et al., New
J. Chem., 1996, 20, 1041-1045, se describen
compuestos macropolicíclicos con unidades bipirazínicas.
En J.M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75,
1221, se describen compuestos macropolicíclicos con unidades
bipirimidínicas.
En J.M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991, 74,
572, se describen compuestos macropolicíclicos que comprenden
heterociclos nitrogenados que contienen grupos
N-oxido.
El criptato de tierras raras, utilizado como
marcador fluorescente, puede igualmente constar de al menos una sal
de tierras raras complejada por un compuesto macropolicíclico que
responde a una de las fórmulas II o III siguientes:
en las
cuales:
- el ciclo de fórmula
es uno de los ciclos
siguientes:
- Y es un grupo o un brazo espaciador que consta
de un radical orgánico bivalente, elegido entre los grupos
alquileno lineales o ramificados de C_{1} a C_{20} que
contienen opcionalmente uno o más dobles enlaces y/o que contienen
opcionalmente uno o más heteroátomos tales como oxígeno, nitrógeno,
azufre, fósforo, o uno o más grupos carbamoilo o carboxamido; entre
los grupos cicloalquileno de C_{5} a C_{8}; o entre los grupos
arileno de C_{6} a C_{14}; estando dichos grupos alquileno,
cicloalquileno o arileno opcionalmente sustituidos con grupos
alquilo, arilo o sulfonato;
- Z es un grupo funcional susceptible de
enlazarse de manera covalente con una sustancia biológica;
- R es un grupo metilo o representa el grupo
-Y-Z;
- R' es hidrógeno o un grupo -COOR'' en el cual
R'' es un grupo alquilo de C_{1} a C_{10} y representa
preferentemente el grupo metilo, etilo o
terc-butilo, o bien R' es un grupo
-CO-NH-Y-Z.
En la patente EP 321.353 se describen, por
ejemplo, tales compuestos.
Dentro de los conjugados según la invención,
dicho marcador fluorescente puede estar enlazado al ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido, bien
directamente o bien por medio de un brazo espaciador.
Por "enlace directo" se entiende el enlace
del marcador fluorescente a un grupo funcional previamente
introducido o generado en uno o más átomos de la base o de la
unidad pentafuranósica del ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido.
En la presente descripción, se designa por grupo
funcional toda función llevada por la parte nucleosídica o
nucleotídica, o introducida en esta parte por todo método conocido
por el experto en la técnica, y capaz de enlazarse por enlace
covalente, directamente o después de la activación con una función
presente en el criptato o en el brazo espaciador que tiene el
criptato. Tales grupos funcionales son principalmente las funciones
NH_{2}, COOH, CHO, OH o SH, así como las funciones capaces de dar
enlaces covalentes por sustitución (halogenuros, sulfonatos,
epóxido) o por adición (dobles enlaces tipo maleimida). Estas
funciones son generalmente llevadas por una cadena hidrocarbonada
unida ella misma a la parte nucleosídica o nucleotídica.
En C. Kessler, Nonisotopic Probing, Blotting and
Sequencing, 2ª edición, L.J. Kricka (1995), Ed. Academic Press Ltd.,
Londres, p. 66-72, se describen principalmente
métodos de introducción de dichos grupos funcionales.
Este brazo espaciador consta, por ejemplo, de un
radical orgánico bivalente, elegido entre los grupos alquileno
lineales o ramificados de C_{1}-C_{20}, que
contienen opcionalmente uno o más dobles enlaces o triples enlaces,
y/o que contienen opcionalmente uno o más heteroátomos, tales como
oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, o uno o más grupos carbamoilo
o carboxamido; los grupos cicloalquileno de C_{5} -C_{8} y los
grupos arileno de C_{6} -C_{14}, estando dichos grupos
alquileno, cicloalquileno o arileno opcionalmente sustituidos con
grupos alquilo, arilo o sulfonato.
\newpage
En particular, se puede elegir entre los
grupos:
y
En un aspecto preferido, el conjugado según la
invención comprende un desoxirribonucleótido que es la
desoxiuridina, un marcador fluorescente que es el criptato de
europio Eu trisbipiridina, y un brazo espaciador que es un grupo
3-aminoalilo.
La invención se refiere también, según un aspecto
anterior, a un procedimiento de preparación de los conjugados
descritos más arriba.
Dicho procedimiento de preparación se caracteriza
porque se hace reaccionar un ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o
químicamente modificado o conjugado a una o más moléculas
marcadoras, cuyo al menos un átomo de carbono del anillo o un átomo
de nitrógeno exocíclico del anillo púrico o pirimidínico, o también
un átomo de carbono de la unidad pentofuranósica, es susceptible de
estar implicado en un enlace con un marcador fluorescente, con al
menos un marcador fluorescente enlazado a dicho o dichos átomos
constituidos por un criptato de tierras raras, y porque se aísla el
conjugado así obtenido.
Los ribo- o
desoxirribo-nucleósidos o nucleótidos, así como los
marcadores fluorescentes utilizables en este procedimiento de
preparación, son tales como los descritos más arriba.
Los conjugados según la invención, que comprenden
un ribo- o un desoxirribonucleótido, se adaptan particularmente a
todas las aplicaciones que necesitan una medida cualitativa o
cuantitativa durante la síntesis o la utilización de
polinucleótidos.
Según uno de sus aspectos, la invención se
refiere también a polinucleótidos que comprenden al menos un
conjugado fluorescente de ribo- o de
desoxirribo-nucleótido, tal como los descritos
anteriormente, como nucleótido constitutivo.
Ventajosamente, los polinucleótidos obtenidos por
incorporación de conjugados según la invención pueden comprender un
número de conjugados superior a 1, y por consiguiente un número de
marcadores fluorescentes superior
a 1.
a 1.
Utilizando los conjugados según la invención, es
también posible realizar el polimarcado de polinucleótidos por vía
enzimática. Esta técnica permite obtener polinucleótidos marcados
más fácilmente, y asegura una mejor reproducibilidad que cuando se
utilizan las técnicas clásicas de marcado fluorescente por vía
química. En particular, evita las etapas de separación necesarias
para eliminar del medio los polinucleótidos y/o los marcadores
fluorescentes funcionalizados que no han reaccionado.
Se observará que si se utilizan criptatos
bi-funcionalizados, la conjugación se hace sólo en
un brazo, lo que permite todavía la incorporación del conjugado en
el ámbito de una síntesis de polinucleótidos.
Los conjugados según la invención, que comprenden
un ribo- o un desoxirribonucleótido, pueden ser utilizados para la
detección y/o la localización de compuestos que contienen al menos
una secuencia de ácido nucleico.
\newpage
Entre sus usos, se pueden citar de manera no
limitativa:
- la detección y/o la localización de secuencias
específicas de ADN, por ejemplo con el fin de establecer el mapa de
cromosomas o la detección de una mutación;
- la síntesis de sondas utilizables en
investigación biomédica o para establecer un diagnóstico
clínico.
Igualmente, pueden ser utilizados en un
procedimiento de medida de la actividad enzimática de una enzima
implicada en una reacción de síntesis de ácido nucleico, por
ejemplo una actividad de ADN o de ARN polimerasa, transcriptasa
inversa, transferasa o ligasa, en la cual se mide la fluorescencia
emitida directa o indirectamente por dicho conjugado,
correlacionándose dicha emisión de fluorescencia con el porcentaje
de incorporación de dicho conjugado en el polinucleótido de ácido
nucleico sintetizado.
Los conjugados según la invención pueden ser
utilizados igualmente para medir la actividad enzimática de una
enzima que tiene por sustrato un ácido nucleico, por ejemplo una
actividad fosfodiesterasa, ADNasa o ARNasa, correlacionándose la
fluorescencia emitida directa o indirectamente por dicho conjugado,
bien con dicha actividad o bien con la inhibición de dicha
actividad.
Se pueden utilizar igualmente para medir una
actividad enzimática que modifica la estructura de un ácido
nucleico tal como una actividad helicasa o integrasa, o una
actividad que modifica la topología de un ácido nucleico, tal como
una actividad topoisomerasa.
Los conjugados según la invención pueden
igualmente ser utilizados como marcadores, por ejemplo para la
preparación de un compuesto que comprende un ácido nucleico en el
cual se incorpora dicho conjugado con el fin de una detección.
La fluorescencia emitida por los conjugados según
la invención puede ser "directa": la señal luminosa se emite
por el conjugado después de la excitación a una longitud de onda
dada, o bien "indirecta": la emisión de la señal luminosa se
induce por una transferencia de energía no radiante entre el
conjugado después de la excitación de dicho "compuesto dador"
y otra molécula fluorescente, denominada "compuesto
aceptor".
En este caso particular, se cumplen las
siguientes condiciones:
- por una parte, el compuesto fluorescente
aceptor tiene un espectro de absorción que cubre al menos
parcialmente el espectro de emisión del dador, y presenta una
absorbancia molar elevada en esta zona de recubrimiento, y un
espectro de emisión en un intervalo de longitud de onda en el que
el dador presenta una emisión intrínseca débil;
- por otra parte, el aceptor y el dador se sitúan
próximos entre sí, siendo aproximadamente paralela la orientación de
sus dipolos de transición.
En G. Mathis et al., Clin. Chem., 1993, 39,
1953-1959, se describe principalmente el principio
de la técnica de transferencia de energía no radiante.
La invención se ilustra por los ejemplos
siguientes, en los cuales algunas concentraciones se dan en unidad
de adsorción (UA) a una longitud de onda dada (expresada en nm) por
unidad de volumen (expresado en ml) y expresadas por la misma cifra
que la densidad óptica de la disolución referida.
En este conjugado, la cifra 11 indica el número
total de átomos del brazo espaciador y del agrupamiento funcional
que une la estructura del criptato al nucleótido (aquí, el enlace
se realiza en la posición 5 de la pirimidina).
El trifosfato de nucleósido utilizado es el
5-[N-(6-aminocaproil)-3-aminoalil]-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato]
(AH-dUTP) preparado por reacción del
trifluoroacetamido-caproato de
N-hidroxisuccinimida (M.S Urdea et al., Nucleic
Acids Res., 1988, 4937) sobre el
5-(3-aminoalil)-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato
preparado siguiendo un procedimiento de la bibliografía (Langer et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78,
6633-6637), seguido de una desprotección amoniacal
(NH_{4}OH acuoso al 3%, 45 min a 60ºC). El compuesto se purifica
en DEAE-Sepharose® (Pharmacia) en un gradiente
lineal de hidrogenocarbonato de trietilamonio (0,1 M a 0,3 M).
1) Método
A
Se diluyen 68 \mul de una disolución de
AH-dUTP hasta 6 \mumoles/ml (es decir, 0,4
\mumoles) en 250 \mul de hidrogenocarbonato de trietilamonio
(TEAB) 0,1 M pH 7,8, y se añaden 320 \mul de una disolución de
criptato de N-hidroxisuccinimida (4 mg/ml en
acetonitrilo) preparada como sigue. Se hidroliza mediante NaOH el
criptato de europio
[(bis-bpy)-(bpy-diéster)], descrito
en el ejemplo 4, sección A, de la solicitud de patente EP 0 321
353, y el criptato diácido obtenido se purifica en una columna
RP-18 de HPLC (gradiente de acetonitrilo en ácido
trifluoroacético al 1% en agua). El criptato de europio
[(bis-bpy)-(bpy-diácido)] así
obtenido (4 mg) se disuelve en 0,5 ml de acetonitrilo anhidro, y se
añade 1 mg de N-hidroxisuccinimida, y después una
disolución de 1,9 mg de diciclohexilcarbodiimida disuelta en 0,5 ml
de acetonitrilo. Después de 16 h de reacción, se filtra el
precipitado de diciclohexilurea, y la disolución de criptato de
N-hidroxisuccinimida se utiliza directamente para el
acoplamiento.
Después de 45 min en agitación, se añaden 15
\mul de TEAB 1M pH 8,5, y después se inyecta la mezcla en una
columna Superdex 30® HR 10/30 (Pharmacia), eluyendo mediante TEAB
0,05M pH 7 que contiene 10% de acetonitrilo (caudal 1 ml/min).
Se recoge el compuesto de Rt \cong 16,4 min, y
después esta fracción, denominada fracción 1, se concentra a vacío
(vacío rápido) hasta un volumen de 350 \mul y que contiene 8
UA_{304} nm. Estimando un \varepsilon_{304} \cong 35000,
se estima que la concentración de K-dUTP es de
alrededor de 0,72 mM.
Se inyecta una alícuota (90 \mul) de esta
fracción 1 en la misma columna eluida por un tampón de acetato de
trietilamonio 25 mM pH 7 que contiene 5% de acetonitrilo. Se recoge
la fracción correspondiente al único pico del cromatograma (16 min
< Rt < 19 min), y se concentra a vacío (vacío rápido). Se
obtienen 150 \mul de una disolución de K-dUTP,
denominada fracción 2, que contiene 1,95 UA_{304} nm.
El compuesto se analiza en espectrometría de
masas (modo de electropulverización positiva):
(M-2H)^{+} = 1431
(M-2H+CH_{3}COOH)^{+}
= 1491.
El espectro UV en agua presenta un máximo a 241
nm, característico de la parte nucleosídica de la molécula
(\lambdamax = 289 nm, \varepsilon = 7100, \lambdamax = 240
nm, \varepsilon = 10700), y un máximo a 304 nm cerca de
\lambdamax de 305 nm (\varepsilon = 30000), característico del
criptato de europio. Se observa una relación A_{304}/A_{241}
\cong 0,83 compatible con la estructura propuesta.
2) Método
B
Se disuelven 0,08 \mumoles de una disolución de
AH-dUTP en 80 \mul de tampón borato 0,1 M pH 8,6,
y se añaden 90 \mul de una disolución de criptato de
N-hidroxisuccinimida (4 mg/ml) preparada como se
describe anteriormente en el método A.
Después 60 min a 20ºC, se añaden 5 \mul de TEAB
1M pH 8,5, y 45 \mul de H_{2}O. Se inyecta la totalidad de la
mezcla de reacción en una columna de péptido Superdex HR 10/30
(Pharmacia) que se eluye por TEAB 0,05M pH 7 que contiene 10% de
acetonitrilo (caudal 1 ml/min).
Se recoge el pico Rt \cong 16,1 min, que
presenta un máximo a 304 nm y una relación A_{304}/A_{241}
\cong 0,79. Se obtienen alrededor de 0,03 \mumoles de compuesto
K-11-dUTP.
La fórmula del conjugado
K-11-dUTP se da en la figura 2.
Se utiliza una columna C10/20 (Pharmacia
Biotech., Uppsala, S) rellena de DEAE Sepharose® Fast Flow
(Pharmacia), equilibrada en un tampón TEAB 10 mM que contiene 10% de
metanol. Se coloca una disolución de
K-11-dUTP, que contiene igualmente
criptato de europio trisbipiridina funcionalizado no conjugado, y se
eluye la columna (8 ml/min) por 40 ml de tampón A (TEAB 10 mM que
contiene 10% de metanol). Se recogen fracciones de 4 ml, y se mide
la fluorescencia de las fracciones eluidas (\lambdaexcitación =
337 nm, \lambdaemisión = 620 nm). El criptato no conjugado se
eluye en las fracciones 4 y 5, es decir, poco después del volumen
muerto de la columna.
Se continúa la elución (8 ml/min) por un
gradiente lineal de 10 mM de TEAB en 10% de metanol (100 ml) hasta
200 mM de TEAB en 10% de metanol (100 ml), y se recogen fracciones
de 5 ml. Se observe que la fluorescencia (620 nm) se concentra en
los tubos 43 a 44, lo que indica que el
K-11-dUTP se eluye a una
concentración \cong 0,16 mM de TEAB. Se reúnen y se concentran
las fracciones que contienen el K-11- dUTP.
La matriz de ADN se obtiene por amplificación PCR
(del inglés "reacción en cadena de polimerasa") de un fragmento
del gen k-ras (exón I) limitado por los cebadores
siguientes:
Cebador k-ras EX_{1} sentido S
^{5'}d(GGC CTG CTG AAA ATG ACT GAA TAT)_{3'}
Disolución madre a 3 UA_{260}/ml, es decir,
alrededor de 1,2 x 10^{-5}M
Cebador k-ras EX_{1}
antisentido AS ^{5'}d(TGT TGG ATC ATA TTC GTC CAC AAA
ATG)3'
Disolución madre a 3 UA_{260}/ml, es decir,
alrededor de 1,2 x 10^{-5}M.
El cebador AS, utilizado aquí para la PCR a
continuación, se biotinila en su extremo 5'. Se sintetiza por PCR
un ADN de doble hebra biotinilado, siguiendo el protocolo a
continuación:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ Medio PCR \+ 25 \mu l BUAM (CIS bio international)10X\cr \+ 8 \mu l de cebador antisentido-bio\cr \+ 8 \mu l de cebador sentido\cr \+ 10 \mu l polimerasa de taq (1,25 U/ml)\cr \+ 10 \mu l dNTP (cuatro dNTP naturales, 5mM cada uno)\cr \+ 100 \mu l de ADN de placenta humana (Sigma)\cr \+ 0,01 \mu g/ \mu l\cr \+ 89 \mu l agua milli-Q.\cr}
El medio PCR se reparte en 5 microtubos (5 x 50
\mul), los tubos se colocan en un termociclador, y se someten a
31 ciclos de PCR siguiendo el protocolo del ejemplo 5.
El ADN de doble hebra obtenido de la PCR
(equivalente a 25 pmoles de cebador biotina) se incuba en presencia
de 300 \mug de Dynaperlas-estreptavidina
M-280 (Dynal, N).
Después del lavado, el ADN de hebra sencilla (SS
ADN) se eluye por NaOH 0,1 N, después se decanta y se neutraliza
(HCl diluido) el sobrenadante, y después se concentra hasta un
volumen residual de 60 \mul.
Para la continuación de la manipulación, se
utiliza un cebador AS (no biotinilado), tal como se define
anteriormente, marcado con ^{32}P, descrito en J. Sambrook et al.
Molecular cloning a laboratory manual, 1989.
Se preparan medios para la reacción de copia,
utilizando:
- K-11-dUTP,
fracción 1 (Rt = 16,4 min) obtenida en el ejemplo 1, diluida a 0,25
mM
- dTTP 0,25 mM
- Mezcla de 3 trifosfatos de desoxinucleótidos
(dATP, dCTP y dGTP), a razón de 0,625 mM cada uno
- ADN polimerasa de Taq 1,25 U/\mul
- Tampón Taq (BUAM) 10X (Cis bio
international)
- Cebador AS (3 UA_{260}/ml) y cebador AS
marcado con ^{32}P (0,06 UA_{260}/ml).
Paralelamente, se lleva a cabo una reacción de
control, en la cual el K-11-dUTP se
sustituye por 0,6 \mul de dTTP (0,25 mM), de manera que la
concentración en dTTP en el medio sea la misma que para los otros
tres trifosfatos.
Volumen (\mul) | |
BUAM 10 X | 1 |
ADN polimerasa de taq | 0,2 |
Cebador S ^{32}P | 2 |
Cebador S | 0,35 |
3 trifosfatos | 0,5 |
K-11-dUTP | 0,6 |
dTTP | 0,6 |
SS ADN | 5 |
Se verifica por electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) que la reacción en presencia de conjugado
K-11-dUTP produce una banda
correspondiente a una copia del ADN en toda su longitud, y que
presenta una movilidad cerca de la banda obtenida por la reacción
de control en la que sólo se introducen los cuatro nucleótidos
naturales. Por otra parte, en ambos casos, el perfil de la
electroforesis no muestra interrupción de lectura.
Se efectuó la misma manipulación utilizando
relaciones variables de
dTTP/K-11-dUTP, entre otras,
utilizando
0,3 \mul de K-11-dUTP y 0,9 \mul de dTTP (dTTP/K-11-dUTP = 3).
0,3 \mul de K-11-dUTP y 0,9 \mul de dTTP (dTTP/K-11-dUTP = 3).
Igualmente se efectuó la reacción de copia en
presencia de ADN polimerasa I, fragmento de Klenow (37ºC, 45 min),
y dio sensiblemente los mismos resultados.
Estos resultados muestran que el conjugado
dUTP-criptato de europio trisbipiridina se incorpora
bien por una polimerasa (polimerasa taq o fragmento de Klenow)
durante la copia del ADN de hebra sencilla.
Se utiliza el ADN de hebra sencilla descrito en
el ejemplo 3.
Se prepara un microtubo en el cual se desarrolla
la reacción de copia (50 \mul), que contiene:
- K-11-dUTP :
0,25 mM fracción 1 (Rt = 16,4 min) obtenida en el ejemplo 1
- dTTP : 0,25 mM
- Mezcla de 3 trifosfatos de desoxinucleótidos :
dATP, dCTP, dGTP, a razón de 0,625 mM cada uno
- Cebador AS biotinilado (véase ejemplo 3) : 3
UA_{260}/ml
- ADN polimerasa de Taq: 1,25 U/\mul
- Tampón Taq : BUAM 10 X
Volumen (\mul) | |
BUAM 10 X | 5 |
Polimerasa de Taq | 1 |
Cebador biotinilado | 1,75 |
Mezcla de 3 dNTP | 2,5 |
K-11-dUTP | 3 |
dTTP | 3 |
SS ADN | 30 |
Agua milli-Q | 3,75 |
Los tubos se calientan 2 min a 90ºC
(desnaturalización), y después se incuban a 70ºC en un
termociclador. Se efectúan tomas de muestras (9 \mul) a 0, 5, 10,
15 y 20 min. Las alícuotas se colocan en tubos que contienen 2
\mul de disolución EDTA 0,5 M pH 8.
Se obtiene el equivalente a 12,5 pmoles de
cebadores biotinilados por 50 \mul de reacción, es decir, 2,5
pmoles por 10 \mul. Por otra parte, se tienen 150 pmoles de
K-11-dUTP por 10 \mul.
Se diluyen las muestras a razón de 8 \mul en
200 \mul de tampón L (fosfato 0,1 M pH 7, NaCl 0,15 M, KF 0,4 M y
0,1% de BSA), y después se diluyen al 1/10 en el mismo tampón.
Se pipetean 20 \mul (equivalente a 2X10^{-14}
moles de biotina) de muestras (diluidas como se describe
anteriormente) en los pocillos "de ensayo" de una microplaca
(microplaca HTRF-96 PACKARD, de 96 pocillos, de
fondo plano, negra, de baja fluorescencia). Se añaden 30 \mul de
conjugado SA-XL_{665} (conjugado de
estreptavidina y de aloficocianina químicamente modificada, CIS bio
international) diluido en el tampón L (concentración final
2X10^{-8} M) en cada pocillo "de ensayo" (6,5X10^{-13}
moles de SA, es decir, 30 equivalentes con relación a la biotina), y
después 250 \mul de tampón L.
Se pipetean 20 \mul de muestra diluida en los
pocillos "en blanco", a los cuales se añaden 280 \mul de
tampón L.
Después de la incubación (15 min a 37ºC) se lee
inmediatamente la fluorescencia a 620 nm y a 665 nm en un aparato
Discovery (Microplaca HTRF - analizador PACKARD).
Se calculan las relaciones de las intensidades de
fluorescencia Re = E665/E620 para cada ensayo y Ro = B665/B620 para
cada blanco, y después se calcula el valor DF =
(Re-Ro)/Ro expresado en porcentaje, dándose los
resultados en la tabla 1 aquí debajo.
En la tabla, como en los ejemplos siguientes, las
medidas de fluorescencia a 620 nm o a 665 nm se expresan en
unidades arbitrarias de fluorescencia, que dependen del aparato
utilizado para la medida.
Tiempo | E665 | E620 | Re = | B665 | B620 | Ro = | DF |
(min) | E665/E620 | B665/B620 | |||||
0 | 1590 | 35770 | 0,044 | 1615 | 39423 | 0,041 | 8% |
5 | 3670 | 42016 | 0,087 | 1718 | 42961 | 0,040 | 118% |
10 | 4077 | 40448 | 0,100 | 1713 | 42234 | 0,040 | 149% |
15 | 4185 | 38670 | 0,108 | 1633 | 40089 | 0,040 | 166% |
20 | 5357 | 49403 | 0,108 | 1993 | 51777 | 0,038 | 182% |
Poniendo el valor DF en función del tiempo de
reacción, se obtiene el perfil típico de una cinética de
incorporación de nucleótido durante una copia enzimática (Figura
1).
1/PCR:
Se amplifica una región del exón 1 del gen
k-ras limitado por los cebadores S y AS descritos
en el ejemplo 3.
Se genera así un producto de amplificación de una
longitud de 117 bp y de secuencia (hebra sentido)
^{5'}d(GGC CTG CTG AAA ^{1}ATG ACT GAA
TAT AAA CTT GTG GTA GTT ^{10}GGA GCT GGT GGC GTA GGC AAG AGT
GCC TTG ^{20}ACG ATA CAG CTA ATT CAG AAT CAT TTT GTG
^{30}GAC GAA TAT GAT CCA ACA)_{3'}
Se elige una sonda (56% G + C) en la parte
central de la secuencia amplificada (subrayada anteriormente), y se
introduce una biotina en su extremo 5' con la ayuda de un brazo
N-4-aminohexil-dC (A
Roget et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17,
7643-7651): sonda CP: biotina-dC
.GCC TTG ACG ATA CAG C
Disolución madre a 0,3 UA_{260}/ml, es decir,
alrededor de 1,7X10^{-6} M.
Se utilizan 48 \mul de la fracción
K-11-dUTP (13 UA_{304}/ml)
repurificada en un tampón TEAAc (véase ejemplo 1, método A) que se
diluye por 32 \mul de agua milli-Q, es decir, una
concentración final de K-11-dUTP de
alrededor de 0,2 mM.
Se utiliza una mezcla de los 4 trifosfatos de
desoxinucleótidos naturales, respectivamente: dATP 5 mM, dCTP 5 mM,
dGTP 5 mM y dTTP 3,5 mM.
\newpage
Se prepara la mezcla madre PCR siguiente:
- 25 \mul Tampón BUAM (CIS bio international)
10X
- 10 \mul dNTP
- 8 \mul de cebador S
- 8 \mul de cebador AS
- 10 \mul de ADN polimerasa de taq (es decir
12,5 U)
- 9 \mul de agua milli-Q.
En microtubos para PCR, se preparan los medios
PCR según la tabla siguiente, utilizando un ADN de placenta humana
(Sigma) a 0,01 \mug/\mul.
T- | T+ | k1- | k1+ | k2- | k2+ | |
Mezcla (\mul) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |
dTTP (\mul) | 1,5 | 1,5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
K-11-dUTP (\mul) | 0 | 0 | 1 | 1 | 2 | 2 |
ADN (\mul) | 0 | 10 | 0 | 10 | 0 | 10 |
Agua milli-Q (\mul) | 16,5 | 6,5 | 17 | 7 | 16 | 6 |
[K-11-dUTP] (\muM) | 0 | 0 | 8 | 8 | 16 | 16 |
[dTTP] (\muM) | 200 | 200 | 140 | 140 | 140 | 140 |
[K-11-dUTP]/[dTTP] | - | - | 0,06 | 0,06 | 0,12 | 0,12 |
Se efectúa la reacción PCR utilizando el
protocolo siguiente:
1. | 5 min / 95ºC |
2.1 | 1 min / 94ºC (desnaturalización) |
2.2 | 1 min / 60ºC (circularización) |
2.3 | 1 min / 70ºC (alargamiento) |
(31 ciclos) | |
3.1 | 8 min / 70ºC (alargamiento final) |
Se controlan las reacciones por electroforesis en
gel de agarosa. Solamente tubos que contienen el ADN (T+, K1+ y
K2+) presentan una banda de longitud esperada (por comparación con
la banda 124 bp del marcador VIII Boehringer).
2) Medidas de transferencia de energía de
resolución temporal:
El principio de la medida consiste en hibridar la
sonda CP biotinilada en el fragmento de ADN amplificado, y después
poner al híbrido en presencia del conjugado
SA-XL_{665} (definido en el ejemplo 4). La
incorporación de bases marcadas con criptato de europio (dador) se
traduce en una transferencia de energía no radiante a XL665
(aceptor) cuando el dador se excita a alrededor de 337 nm.
En este caso, el aceptor emite fluorescencia a
665 nm con una duración de vida larga, lo que permite diferenciar
esta señal de la fluorescencia propia del aceptor, que presenta una
duración de vida corta.
Se mide la fluorescencia de resolución temporal a
620 nm y a 665 nm en presencia del aceptor ("ensayo" E620 y
E665) y en ausencia del aceptor ("blanco" B620 y B665), y
después se calcula la relación Re = E665/E620 y Ro = B665/B620.
Después se calcula el valor DF = (Re-Ro)/Ro
expresado en porcentaje; un aumento del valor DF muestra la
presencia de una transferencia de energía y por tanto la
incorporación de criptato en el ADN amplificado.
Se utilizan los medios K1-, K1+, K2- y K2+ que
provienen de las reacciones de PCR. En los microtubos, se colocan 2
\mul de cada medio de PCR, en los cuales se añaden 10 \mul de
sonda CP (0,03 UA_{260}/ml) y 13 \mul de tampón BUAM (2X), y
los tubos sellados se llevan 10 min a 94ºC, y después 20 min a 50ºC
con la ayuda de un termociclador. Se diluyen 5 \mul de medio de
hibridación en 200 \mul de tampón L, y se pipetean 40 \mul de
esta dilución en los pocillos de "ensayo" de una placa de
microtitulación, y 40 \mul en los pocillos del "blanco"
(microplaca de 96 pocillos, de fondo plano, HTRF, Packard).
Se añaden 40 \mul de SA-XL665
de 3x10^{-8}M (CIS bio international) a los pocillos de
"ensayo", y 200 \mul de tampón L. Se añaden 240 \mul de
tampón L a los pocillos del "blanco".
Se incuba 15 min a 37ºC, y se efectúa
inmediatamente la medida de fluorescencia en un aparato Discovery
(Packard).
Los resultados se dan en la tabla 2, a
continuación.
Tubo | E665 | E620 | Re | B665 | B620 | Ro | DF |
K1- | 889 | 16053 | 0,0554 | 847 | 16825 | 0,0503 | 10% |
K1+ | 2406 | 28392 | 0,0847 | 1366 | 32494 | 0,0420 | 102% |
K2- | 1320 | 29015 | 0,0455 | 1273 | 31452 | 0,0405 | 12% |
K2+ | 3304 | 36615 | 0,0902 | 1491 | 36278 | 0,0411 | 120% |
Los resultados muestran que el conjugado
K-11-dUTP se incorpora durante una
reacción de PCR. Además, la presencia de las moléculas de criptato
enlazadas al ADN amplificado se puede poner en evidencia por la
hibridación de una sonda específica de este ADN amplificado, y se
puede demostrar por una transferencia de energía no radiante entre
el criptato y un aceptor enlazado a la sonda hibridada.
En este compuesto, la cifra 4 indica el número
total de átomos del brazo que enlaza la estructura de criptato al
nucleótido (aquí el enlace se hace en posición 5 de la
pirimidina).
El trifosfato de nucleósido utilizado es el
5-(3-aminoalil)-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato
(AA-dUTP) preparado siguiendo el procedimiento de
la bibliografía (Langer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981),
78, 6633-6637). El compuesto se purifica en
DEAE-Sepharose® (Pharmacia) en un gradiente de
hidrogenocarbonato de trietilamonio (10 mM a 300 mM).
Se diluyen 60 \mul de una disolución de
AA-dUTP de 5,4 \mumoles/ml (es decir, 0,3
\mumoles) en 240 \mul de hidrogenocarbonato de trietilamonio
(TEAB) 0,1 M pH 7,8, y se añaden 300 \mul de una disolución de
criptato [TBP-(Eu3+)] activado en 4 mg/ml de acetonitrilo, es decir
0,85 \mumoles (alrededor de 3 equivalentes). El criptato
[TBP-(Eu3+)] activado se prepara recientemente, como se describe en
el ejemplo 1, método A.
Después de 35 min en agitación, se añaden 15
\mul de TEAB 1M pH 8,5, se concentra hasta la mitad, y después se
inyecta la mezcla en una columna Superdex 30® HR 10/30 (Pharmacia)
eluyendo por un TEAB 25 mM pH 9 que contiene 10% de acetonitrilo
(caudal 1ml/min).
Se recoge el compuesto de Rt \cong 16,3 min;
esta fracción, denominada Fracción 1, se concentra a vacío (vacío
rápido) hasta un volumen de 200 \mul, después se inyecta en la
misma columna eluida por un tampón acetato de trietilamonio 25 mM pH
7 que contiene 5% de acetonitrilo. Se recoge la fracción
correspondiente al único pico del cromatograma (16 min <Rt<
19 min), y se concentra a vacío (vacío rápido), obteniéndose 260
\mul de una disolución de
K-4-dUTP, denominada Fracción 2,
que contiene 6,0 UA_{303}. Estimando un \varepsilon_{303}
\cong 35000, se estima que la concentración de
K-4-dUTP es de alrededor de 0,65
mM.
El compuesto se analiza en espectrometría de
masas (modo de electropulverización negativa):
(M-4H)^{-}=
1315,5 (C_{50}H_{48}EuN_{11}O_{17}P_{3} Calculado:
1319)
El espectro UV en agua presenta un máximo a 243
nm, característico del nucleósido (\lambdamax = 289 nm
\varepsilon = 7100, \lambdamax = 240 nm \varepsilon = 10700),
y un máximo a 303 nm cerca del \lambdamax de 305 nm (\varepsilon
= 27000), característico del criptato de europio. Se observa una
relación A303/A240 \cong 0,82, compatible con la estructura
propuesta.
La fórmula del conjugado
K-4-dUTP se da en la figura 2.
En este compuesto, la cifra 11 indica el número
total de átomos del brazo espaciador, que enlaza la estructura de
criptato al nucleótido (aquí el enlace se hace en posición 5 de la
pirimidina).
El trifosfato de nucleósido utilizado es el
6-aminocaproil-[5-(3-aminoalil)-uridin-5'-trifosfato]
(AH-UTP) preparado como se indica en el ejemplo 1.
El compuesto se purifica en DEAE-Sepharose ®
(Pharmacia) en un gradiente lineal de hidrogenocarbonato de
trietilamonio (25 mM a 300 mM).
Se utilizan 400 \mul de una disolución de
AH-dUTP de 1,1 \mumoles/ml (es decir, 0,44
\mumoles) en hidrogenocarbonato de trietilamonio (TEAB) 0,1 M pH
7,8, y se añaden 360 \mul de una disolución de criptato
[TBP-(Eu3+)] activado (3 mg/ml en acetonitrilo). El criptato
[TBP-(Eu3+)] activado se prepara recientemente, como se describe en
el ejemplo 1, método A.
Después de 45 min en agitación, se añaden 40
\mul de TEAB 1M pH 8,5, y después se inyecta la mezcla en una
columna de péptido Superdex 30 ® HR 10/30 (Pharmacia), eluyendo con
TEAB 50 mM pH 7 que contiene 10% de acetonitrilo (caudal 1
ml/min).
Se recoge el compuesto de Rt \cong 15,4 min, y
esta fracción, denominada Fracción 1, se concentra a vacío (vacío
rápido) hasta un volumen de 200 \mul que contiene \cong 10
UA_{304} nm. Estimando un \varepsilon304 \cong 35000, se
estima que la concentración en
K-11-UTP es de alrededor de 0,3
mM.
Esta fracción 1 se inyecta en la misma columna
eluida por un tampón de acetato de trietilamonio 25 mM, pH 7, que
contiene 5% de acetonitrilo. Se recoge la fracción correspondiente
al único pico del cromatograma (Rt \cong 16,5 min), y se
concentra a vacío (vacío rápido), obteniéndose 202 \mul de una
disolución de K-11-UTP, denominada
fracción 2, que contiene 7,5 UA_{304} nm.
El compuesto se analiza en espectrometría de
masas (modo de electropulverización negativa):
(M-4H)^{-}=
1444,3 (C_{56}H_{58}EuN_{12}O_{19}P_{3}; calculado:
1448,0)
El espectro UV en agua presenta un máximo a 241
nm, característico del nucleósido (\lambdamax = 289 nm
\varepsilon = 7100, \lambdamax = 240 nm \varepsilon = 10700),
y un máximo a 303 nm próximo a \lambdamax de 305 nm (\varepsilon
= 27000), característico del criptato de europio. Se observa una
relación A_{304}/A_{241} \cong 0,80, compatible con la
estructura propuesta.
El compuesto se analiza por FPLC (columna
mono-Q, Pharmacia). Tampón A: Acetato de sodio 20
mM, pH 5,2, que contiene 10% de acetonitrilo. Tampón B: Acetato de
sodio 20 mM, pH 5,0, y LiCl 1M que contiene 10% de acetonitrilo.
Gradiente lineal de 0 a 30% de B en 25 min. Caudal 1 ml/min. El
K-11-UTP presenta un Rt = 10,7
min.
La fórmula del conjugado
K-11-UTP se da en la figura 3.
Se utiliza como criptato de referencia el
criptato de europio [(bis-
bpy)(bpy-di(amidoetilenamina)], descrito en
el ejemplo 4 de la solicitud de patente EP 0 321 353 (en lo
sucesivo denominado KNH_{2}).
Se prepara una disolución madre de KNH_{2} en
agua, y se determina su concentración por medida de la densidad
óptica a 306 nm, tomando un \varepsilon_{306} \cong 30000. La
disolución madre (6,7 x 10^{-4} M) se diluye al 1/100 en un tampón
Tris-HCl 0,1M, pH 9; se diluyen después 100 \mul
de esta dilución intermedia en 600 \mul del mismo tampón.
Paralelamente, se prepara una disolución madre de
K-11-dUTP,
K-4-dUTP y
K-11-UTP (preparados respectivamente
según los ejemplos 1, método A; 6 y 7) en agua, en la que la
concentración se estima que es 3x10^{-5} M por medida de la
densidad óptica a 304 nm (\varepsilon_{304} \cong 35000). Cada
disolución madre se diluye hasta 50 \mul en 1 ml de tampón
Tris-HCl 0,1M, pH 7,4, o en un tampón
Tris-HCl 0,1M, pH 9.
Se miden los valores de la duración de vida de la
emisión del europio (\tau en ms), utilizando un
espectrofluorímetro de resolución temporal, del tipo LS50
(Perkin-Elmer), y cubetas Helma 5 mm x 5 mm.
\newpage
Los resultados se dan en la tabla 3 a
continuación:
Compuesto | Duración de vida \tau (ms) en un | Duración de vida \tau (ms) en un |
tampón Tris 0,1M pH 7,4 | tampón Tris 0,1M pH 9 | |
K-11-dUTP | 0,587 | 0,596 |
K-4-dUTP | 0,621 | 0,651 |
K-11-UTP | 0,636 | 0,640 |
KNH_{2}(referencia) | 0,368 | 0,265 |
Estos resultados muestran que el acoplamiento del
nucleótido en la molécula de criptato genera un aumento de la
duración de vida del europio, y de nuevas características de
fluorescencia por el conjugado criptato-nucleótido
en comparación con el criptato de referencia.
Se prepara un microtubo en el cual se desarrolla
la reacción de alargamiento, utilizando:
- -
- 25 \mul de tampón Tris-acetato 0,2M pH 7,2
- -
- 4 \mul de una disolución acuosa de cloruro de cobalto 25 mM
- -
- 5 \mul de una disolución de un oligonucleótido (composición A_{2}C_{3}G_{7}T_{3} biotinilado en 5'). 2,4 \muM en H_{2}O
- -
- 2 \mul de K-11-dUTP (fracción 2, preparada según el ejemplo 7) a una concentración de 0,04 mM
- -
- 8 \mul de dTTP: 0,04 mM
- -
- 5 \mul de agua
- -
- 1 \mul de desoxinucleotidil-transferasa terminal (TnT, EC 2.7.7.31) (Sigma, 35 U/\mul).
Se toman 2 \mul de la mezcla de reacción que se
añaden a 4 \mul de EDTA 60 mM (para obtener un testigo a t_{0}
= 0 min), y se incuba el resto a 37ºC para hacer un estudio
cinético. Después de 5, 10, 20, 40, 60 y 80 min de reacción a 37ºC,
se toman, para cada tiempo, 2 \mul de mezcla de reacción que se
añaden a 4 \mul de EDTA 60 mM para detener la reacción. Se
obtienen así las fracciones t_{5}, t_{10}, etc. Estas
fracciones t_{0}, t_{5}, t_{10} se diluyen por 250 \mul de
tampón L (fosfato 0,1M pH 7, NaCl 0,15M, KF 0,4M, y 0,1% BSA).
Se pipetean 50 \mul (equivalentes a
2,3x10^{-12} moles de biotina) de muestras, diluidas como se
describen más arriba, en los pocillos de "ensayo" (denominados
E_{0}, E_{5}, E_{10} etc.) de una microplaca (microplaca
HTRF-96 PACKARD de 96 pocillos, de fondo plano,
negra, de baja fluorescencia). Se añaden 50 \mul de conjugado
SA-XL_{665} (CIS bio international) diluido en el
tampón L (1,5x10^{-8}M), en cada pocillo de "ensayo", y
después 150 \mul de tampón L.
Se realiza un "blanco" a partir de una
mezcla de reacción, descrita anteriormente, en el cual no se ha
añadido la enzima sino que se ha sustituido por 1 \mul de agua, se
toman muestras de 2 \mul de esta mezcla, y se someten a los
tratamientos y diluciones descritos anteriormente. Se pipetean 50
\mul de esta muestra diluida en los pocillos denominados
"blancos", a los cuales se añaden 50 \mul de conjugado
SA-XL_{665} y 150 \mul de tampón L.
Después de la incubación (15 min a 37ºC), se lee
la fluorescencia a 620 nm y a 665 nm sobre un aparato DISCOVERY
(Microplaca HTRF-analizador PACKARD).
Se calculan las relaciones de las intensidades de
fluorescencia Re=E665/E620 para cada ensayo, y Ro=B665/B620 para
cada blanco, y después se calcula el valor DF =
(Re-Ro)/Ro expresado en porcentaje, dándose los
resultados en la tabla 4 a continuación.
Tiempo (min) | 0 | 5 | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 |
F665 | 602 | 1585 | 2186 | 3610 | 5347 | 8204 | 5542 |
F620 | 9559 | 10757 | 9921 | 11023 | 10754 | 10589 | 8971 |
Re=F665/F620 | 0,063 | 0,147 | 0,22 | 0,327 | 0,497 | 0,77 | 0,618 |
DF | 0 | 129 | 242 | 409 | 673 | 1104 | 865 |
El blanco presenta una relación
B_{665}/B_{620} = 0,064. Para t_{0} se observa una relación
E_{665}/E_{620} = 0,063, siendo la transferencia de DF = 100x
(Re-R_{0})/R_{0} = 100
(0,063-0,064)/0,064, es decir, una transferencia
prácticamente nula. Se calcula así el DF para cada tiempo, se
observa que la transferencia de energía expresada por el valor DF
aumenta con el transcurso del tiempo, lo que demuestra que el
K-11-dUTP se incorpora en la cadena
oligonucleotídica por la
desoxinucleotidil-transferasa terminal.
Se efectúa una reacción de incorporación de
K-11-dUTP por la TnT siguiendo el
ejemplo 9, multiplicando todas la cantidades por 3. Se verifica que
la incorporación de K-11-dUTP sigue
la misma cinética, realizando la medida de DF en función del
tiempo. Después de 80 min de reacción, se detiene por 12 \mul de
disolución de EDTA 400 mM. Se toman 105 \mul de la mezcla de
reacción, y se colocan en una columna NAP5 (Pharmacia) equilibrada
en un tampón fosfato 10 mM pH 7,4.
El oligonucleótido se eluye por 600 \mul de
tampón. Esta fracción, denominada "fracción 1" (volumen de
exclusión), se analiza como sigue: en los pocillos de una
microplaca se colocan 50 \mul de fracción 1 a la cual se añaden
200 \mul de tampón L, lo que constituye el "blanco de
criptato". En los pocillos siguientes se colocan 50 \mul de
fracción 1 y 50 \mul de conjugado SA-XL_{665}
(CIS bio international) (1,5x10^{-8} M en un tampón L), y 150
\mul de tampón L, lo que constituye el pocillo de "ensayo".
Se mide la fluorescencia a 620 nm y a 665 nm en un aparato DISCOVERY
(Microplaca HTRF - analizador PACKARD).
F665 | F620 | |
Blanco K | 2343 | 67481 |
Ensayo | 42982 | 37722 |
Se calcula DF = 100 x
(Re-R_{0})/R_{0} = 100
(1,14-0,0347)/0,0347 = 3180%, conteniendo entonces
esta fracción el oligonucleótido marcado con criptato.
Se observa que las fracciones obtenidas
continuando la elución (fracción 2, 3,...) presentan un valor de DF
débil con relación al de la F1, y una fluorescencia bruta elevada,
a 620 nm, conteniendo entonces el exceso de
K-11-dUTP no incorporado.
Comparando la fluorescencia obtenida en la
fracción F1 (que corresponde a las moléculas de criptato
incorporadas en la cadena oligonucleotídica) con la fluorescencia
de disoluciones patrón que contienen un criptato a una concentración
conocida, se puede estimar que la fracción F1 contiene alrededor de
5x10^{-11} moles de criptato, y, dado que la cantidad de
oligonucleótido estimada en la fracción F1 es de 2x10^{-11}, se
observa un número n = 5x10^{-11} / 2x10^{-11} de nucleótido
marcado con criptato por cadena oligonucleotídica.
Se observará que la incorporación de
K-dUTP y de dTTP se hace de manera simultánea y de
manera estadística.
En el extremo 3' de cada cadena oligonucleotídica
se incorpora entonces un número variable de nucleótidos T y, como
media, al menos 2 nucleótidos K-dU.
La duración de vida \tau se calcula a partir de
la pendiente a la derecha obtenida trazando Log E_{620} =
f(t).
\newpage
Se mide la duración de vida de la emisión a 620
nm para el oligonucleótido marcado contenido en la fracción 1
(tampón fosfato 10 mM, pH 7,4) utilizando un fluorímetro de
resolución temporal KRYPTOR (CIS bio international) con una
excitación a 337 nm. Se obtiene una duración de vida \tau = 866
\mus. Esta duración de vida es superior a la duración de vida del
conjugado K-11-dUTP (\tau = 681
\mus) medido simultáneamente en las mismas condiciones.
Se observa entonces un aumento de la duración de
vida del criptato incorporado en una cadena oligonucleotídica.
En este compuesto, la cifra 8 indica el numero
total de átomos del brazo espaciador que enlaza la estructura de
criptato al nucleótido (aquí el enlace se hace en posición 8 de la
purina).
El trifosfato de nucleósido utilizado es el
[8-(6-aminohexil)-adenosin-5'-trifosfato]
(AH-ATP, Sigma). Se utiliza una disolución de 0,1
\mumoles de AH-ATP en 100 \mul de
hidrogenocarbonato de trietilamonio (TEAB) 0,1 M pH 8, y se añaden
100 \mul de una disolución de criptato [TBP-(Eu3+)] activado (4
mg/ml en acetonitrilo). El criptato [TBP-(Eu3+)] activado (NHS/DCC
en acetonitrilo) se prepara recientemente, como se describe en el
ejemplo 1, método A.
Después de 35 min en agitación, se añaden 5
\mul de TEAB 1M, se concentra hasta la mitad, y después se
inyecta la mezcla en una columna Superdex 30 ® HR 10/30 (Pharmacia)
eluyendo por un TEAB 50 mM pH 8 que contiene 10% de acetonitrilo
(caudal 1 ml/min).
Se recoge el compuesto de Rt \cong 16,7 min, y
esta fracción, denominada Fracción 1, se concentra a vacío (vacío
rápido) hasta un volumen de 200 \mul, y después se inyecta en la
misma columna eluida por un tampón de acetato de trietilamonio 25
mM, pH 7, que contiene 5% de acetonitrilo. Se recoge la fracción
correspondiente al único pico del cromatograma (Rt = 17,2 min), y se
concentra a vacío (vacío rápido).
El espectro UV en agua presenta un máximo a 245
nm, un máximo a 283 nm cerca de la \lambdamax, característico del
nucleósido (\lambdamax= 279, \varepsilon = 21000), y un máximo
a 303 nm cerca de la \lambdamax de 305 nm (\varepsilon = 27000),
característico del criptato de europio. Se observa una relación
A_{305}/A_{280} \cong 1 compatible con la estructura
propuesta.
La fórmula del conjugado
K-8-ATP se da en la Figura 3.
Se utiliza la incorporación simultánea de
K-11-UTP y de
Bio-14-CTP (conjugado
CTP-Biotina) en una misma molécula de ARN por
transcripción in vitro.
La reacción de transcripción de un ADN de doble
hebra, que implica un promotor (ADN plasmídico pSTP18 y pSTP19 que
contienen el promotor T7 y linealizado por Eco R1) de ARN, se
realiza con la ayuda de un kit de transcripción SP6/T7
(Boehringer-Mannheim). El transcripto obtenido tiene
una longitud de 1035 bases.
El medio de transcripción contiene, además de los
ribonucleótidos a una concentración final de 0,5 mM, 0,2% de
K-11-UTP y 30% de
bio-14-CTP que se incorporarán
estadísticamente a lo largo de la cadena.
Se utiliza la fracción 2 de
K-11-UTP, descrita en el ejemplo 7,
que se diluye en agua a fin de obtener una concentración de 20
\muM.
La disolución de
bio-14-CTP se prepara por dilución
en agua de una disolución comercial 10 mM de
Biotina-14-CTP
(Gibco-BRL/Life Technologies).
El medio de transcripción se prepara en unos
microtubos para PCR (0,5 ml), siguiendo la tabla a continuación:
\newpage
Volumen | Concentración | rNTP marcado/ | |
final | rNTP marcado + | ||
rNTP natural | |||
Tampón de transcripción (10X) | 2\mul | ||
Plásmido de ADN (T7) (0,5 \mug/\mul) | 2\mul | ||
ATP (5 mM) | 2\mul | 0,5 mM | |
GTP (5 mM) | 2\mul | 0,5 mM | |
UTP (5 mM) | 2\mul | 0,5 mM | |
K-11-UTP (20 \muM) | 2\mul | 2 \muM | 0,4% |
CTP (3,5 mM) | 2\mul | 0,35 mM | |
Bio-14-CTP (1,5 mM) | 2\mul | 0,15 mM | 30% |
Inhibidor de ARNasa (20 U/\mul) | 1\mul | ||
H_{2}O | 1\mul | ||
RNA polimerasa de T7 | 2\mul | ||
Volumen total | 20\mul |
Después de añadir la enzima, se toman 2 \mul de
medio de reacción que inmediatamente se diluyen mediante 38 \mul
de una disolución EDTA 50 mM pH 8, y esta disolución después se
diluye tomando 19 \mul que se diluyen mediante 114 \mul de
tampón L. Esta disolución servirá para constituir un testigo de
ruido de fondo a t_{0} = 0 min.
La mezcla de reacción se lleva a 37ºC en un
termociclador. Después de tiempos de reacción determinados (60 min,
90 min y 120 min), se toman 2 \mul de mezcla de reacción que se
diluyen como anteriormente mediante 38 \mul de EDTA 50 mM, pH 8.
Estas disoluciones se diluyen después tomando 19 \mul que se
diluyen mediante 114 \mul de tampón L.
Se colocan 50 \mul de cada disolución diluida,
que corresponden a los tiempos 0 min, 60 min, 90 min y 120 min, en
los pocillos de una microplaca negra (microplaca HTRF, Packard, de
96 pocillos, de fondo plano).
Se añaden 50 \mul de una disolución de
SA-XL_{665} (CIS bio international) a una
concentración de 6,25x10^{-7} M en un tampón L. Se añaden después
100 \mul de tampón L.
Después de la incubación (15 min a temperatura
ambiente), se efectúa una medida de la fluorescencia a 620 nm y a
665 nm en un aparato DISCOVERY (Packard).
Para cada tiempo de reacción considerado, se
evalúa la transferencia de energía calculando la relación Re =
F665/F620. La relación Ro = F665/F620 para el tiempo t0 permite
evaluar el nivel de ruido de fondo; la misma medida, realizada en
una dilución de 2 \mul de una mezcla de reacción de
transcripción, en la cual la enzima se ha sustituido por un volumen
equivalente de agua, da el mismo nivel de ruido de fondo.
La transferencia de energía se calcula por la
fórmula DF = (Re-Ro)/Ro para cada tiempo. Los
resultados se dan en la tabla 5 a continuación.
Tiempo (min) | F665 | F620 | Re = F665/F620 | DF = (Re-Ro)/Ro (%) |
0 | 2108 | 14672 | 0,143 | 0 |
60 | 6329 | 18755 | 0,337 | 135 |
90 | 6672 | 17026 | 0,392 | 174 |
120 | 7386 | 18179 | 0,406 | 184 |
Se observa que aumenta el valor de DF, lo que se
traduce en un aumento de la transferencia de energía que proviene
de la incorporación del K-11-UTP y
del bio-CTP en el ARN transcrito.
Se controla la reacción de transcripción,
descrita más arriba, mediante electroforesis en gel de agarosa
(3%).
Se observa una banda de medida elevada, que
muestra la integridad del fragmento de ARN producido,
caracterizándose esta banda por una migración idéntica a la banda
producida a partir de una transcripción realizada a partir de los
rNTP naturales solos.
La curva de valores de DF en función del tiempo
de reacción, dada en la figura 4, muestra el perfil típico de una
cinética de incorporación de nucleótido durante una transcripción
enzimática. Esto resultados muestran que el conjugado
K-11-UTP se incorpora eficazmente
mediante una RNA polimerasa.
La reacción de transcripción de un ADN de doble
hebra en ARN se realiza con la ayuda de un kit de transcripción
(Gibco BRL). El ADN de doble hebra, que implica el promotor T7, es
el mismo obtenido mediante una PCR realizada con un acoplamiento de
cebadores, en el cual uno de los cebadores contiene la secuencia del
promotor de la T7 RNA polimerasa (EC 2.7.7.6).
El transcrito obtenido tiene una longitud teórica
de 115 bases.
El principio general de la transcripción mediante
una RNA polimerasa se describe en p. 5.58 y 5.59 de "Molecular
Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición, J. Sambrook, E.F.
Fritsch y T. Maniatis CSH Press 1989.
Se puede igualmente utilizar otra RNA polimerasa
tal como la SP6 o T3 RNA polimerasa: en este caso, la secuencia del
cebador de PCR implicada se modificará para incorporar el promotor
específico de la RNA polimerasa considerada.
La incorporación de un promotor se describe en el
capítulo 13.5 y capítulo 23.2 de "PCR: Clinical Diagnostics and
Research", A. Rolfs et al., Springer-Verlag
(1992), así como en D.Y. Kwoth et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
(1989), 86, 1173-1177.
Se utiliza un protocolo análogo al descrito en el
ejemplo 5, pero se utiliza únicamente desoxinucleótidos a fin de
generar un producto PCR primario de 117 bp.
Se efectúa una segunda PCR (PCR secundaria)
utilizando como ADN diana (DNA) 2 \mul de una dilución al 1/100
del producto de la PCR primaria. Para esta PCR secundaria, se
sustituye el cebador k-ras EX_{1} Antisentido por
el siguiente cebador, denominado T7-AS de
secuencia
^{5'}d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TGG
ATC ATA TTC GTC CAC AAA ATG)_{3'}.
La parte de esta secuencia escrita en cursiva
corresponde a la secuencia del promotor de la T7 RNA
polimerasa.
El cebador k-ras EX1 Sentido
tiene la secuencia siguiente:
^{5'}d(CTG.CTG.AAA.ATG.ACT.GAA.TAT)_{3'}.
\newpage
Al final de esta PCR secundaria, se obtiene un
ADN de doble hebra de una longitud teórica de 132 pb y de secuencia
siguiente (hebra sentido):
La parte en cursiva representa la secuencia T7
(hebra sentido), y la parte subrayada representa la secuencia
correspondiente a la sonda durante la etapa de hibridación.
La transcripción producirá la secuencia de ARN
siguiente (secuencia homóloga a la hebra antisentido del fragmento
de ADN transcrito), en la cual la parte subrayada corresponde a la
secuencia que es reconocida por la sonda biotinilada:
Se biotinila en 5' la sonda RAS12N utilizada, y
tiene la secuencia siguiente:
Biotina-^{5'}d(GTT.GGA.GCT.GGT.GGC.GTA.GG)_{3'}.
El medio de transcripción contiene, además de los
ribonucleótidos naturales a una concentración final de 0,5 mM, 2%
de K-11-UTP, que se incorporara
estadísticamente a lo largo de la cadena de ARN.
Se utiliza el
K-11-UTP, fracción 2, descrita en el
ejemplo 7, que se diluye en agua a fin de obtener una concentración
de 100 \muM.
El medio de transcripción se prepara en unos
microtubos para PCR (0,5 ml) según la tabla siguiente:
\newpage
Volumen | Concentración | K-11-UTP/ | |
final | (K-11-UTP + UTP) | ||
Tampón de transcripción (5X) | 10 \mul | ||
ADN de PCR positivo(T7) (0,5 \mug/\mul) | 25 \mul | ||
DTT 0,1M | 2 \mul | ||
Mezcla de los rNTP (5 mM cada uno) | 5 \mul | 0,5 mM | |
K-11-UTP (100 \muM) | 5 \mul | 10 \muM | 2% |
Inhibidor de ARNasa (20 U/\mul) | 2 \mul | ||
H_{2}O | 0,5 \mul | ||
T7 RNA polimerasa (50 U/\mul) | 0,5 \mul | ||
Volumen total | 50 \mul |
La mezcla de reacción se pone en un termociclador
a 40ºC durante 120 min, y después se detiene la reacción mediante 4
\mul de EDTA 0,2 M pH 8.
En un microtubo para PCR, se toman 2 \mul del
medio de reacción, se diluyen mediante 10 \mul de sonda RAS12N
(0,03 UA_{260}/ml en H_{2}O), y se añaden después 13 \mul de
tampón de hibridación (tampón fosfato 100 mM pH 7,4 / BSA 0,1% NaCl
1M). Se lleva durante 10 min a 70ºC, y después se hibrida 20 min a
45ºC en un termociclador.
Se diluyen en tampón L (c.s. 200 \mul) 5,5
\mul del medio de hibridación arriba mencionado, para dar el
medio de hibridación diluido HT_{pos}.
Se constituye un blanco efectuando una
transcripción según el protocolo arriba mencionado, pero se
sustituye el ADN de PCR positivo por un volumen equivalente de
medio PCR, que proviene de una reacción de PCR negativa que no
contiene el ADN diana.
Se detiene el medio de transcripción negativo (2
\mul), y después se efectúa una hibridación, como descrito
anteriormente, y se diluye en un tampón L. Se obtiene así el medio
de hibridación diluido HT_{neg}.
La incorporación del criptato en la cadena de ARN
se pone en evidencia por la hibridación de una sonda complementaria
a la secuencia de ARN, estando esta sonda marcada con un conjugado
SA-XL665 (Cis bio international) por medio de un par
de estreptavidina-biotina.
En los pocillos de una microplaca negra
(microplaca HTRF, Packard, de 96 pocillos, de fondo plano), se
colocan 50 \mul de medio HT_{pos} y 50 \mul de conjugado
SA-XL665 (Cis bio international) diluido a
1,5x10^{-10}M en tampón L, y se añaden después 100 \mul de
tampón L. Estos pocillos permitirán la medida de la transferencia
de energía mediante el cálculo de Re = E665/E620 detallado en el
ejemplo 5.
En los pocillos vecinos, se colocan 50 \mul de
medio HT_{neg}, se añaden 50 \mul de conjugado
SA-XL665 y 100 \mul de tampón L como se ha
descrito anteriormente. Estos pocillos constituyen una referencia
para evaluar el ruido de fondo por el cálculo de Ro.
Se efectúa una medida de fluorescencia a 620 nm y
a 665 nm en un aparato DISCOVERY (Packard).
La transferencia de energía se calcula mediante
la fórmula siguiente DF = (Re-Ro)/Ro para cada
tiempo, dándose los resultados en la tabla 6 a continuación.
\newpage
Medio | E665 | E620 | Re = E665/E620 | DF (%) |
HT_{neg} | 738 | 17900 | 0,041 | |
HT_{neg} | 1714 | 15010 | 0,114 | 178 |
Se observa una transferencia de 178% en el caso
en el que la transcripción se realiza en presencia del ADN
diana.
Claims (25)
1. Conjugado fluorescente de nucleósido o de
nucleótido, caracterizado porque comprende:
- un ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o
químicamente modificado o conjugado con una o más moléculas
marcadoras, en el que al menos un átomo de carbono del anillo, o un
átomo de nitrógeno exocíclico del anillo purínico o pirimidínico, o
también un átomo de carbono de la unidad pentofuranósica, es
susceptible de estar implicado en un enlace con un marcador
fluorescente, y
- al menos un marcador fluorescente enlazado a
dicho o dichos átomos que constan de un criptato de tierras
raras.
2. Conjugado fluorescente de nucleósido o de
nucleótido, caracterizado porque comprende:
- un ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o
químicamente modificado o conjugado con una o más moléculas
marcadoras, en el que al menos un átomo de carbono del anillo, o de
nitrógeno exocíclico del anillo purínico o pirimidínico, es
susceptible de estar implicado en un enlace con un marcador
fluorescente, y
- al menos un marcador fluorescente enlazado a
dicho o dichos átomos que constan de un criptato de tierras
raras.
3. Conjugado según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque es un conjugado fluorescente de
nucleótido que comprende un ribo-nucleótido elegido
entre AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP,
TMP, TDP, TTP, 2Me AMP, 2Me ADP, 2Me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP,
5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP, 5MeO CMP, 5MeO CDP, 5MeO CTP,
7-desaza-ATP,
7-desaza-GTP, o un
desoxirribo-nucleótido elegido entre los desoxi- o
didesoxi-ribonucleótidos correspondientes a estos
ribonucleótidos.
4. Conjugado según una de las reivindicaciones 1
a 3, caracterizado porque el ribo- o
desoxirribo-nucleótido se elige entre:
- los derivados de
2'-desoxi-uridin-5'-trifosfato
o de uridin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 5 de la base,
- los derivados de
2'-desoxi-citidin-5'-trifosfato
o de citidin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 4 ó 5 de la base,
- los derivados de
2'-desoxi-adenosin-5'-trifosfato
o de adenosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 6 u 8 de la base,
- los derivados de
2'-desoxi-guanosin-5'-trifosfato
o de guanosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 6 u 8 de la base,
- los derivados de
2'-desoxi-7-desaza-adenosin-5'-trifosfato
o de
7-desaza-adenosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 7 de la base,y
- los derivados de
2'-desoxy-7-desaza-guanosin-5'-trifosfato
o de
7-desaza-guanosin-5'-trifosfato
funcionalizados en posición 7 de la base.
5. Conjugado según la reivindicación 1,
caracterizado porque es un conjugado fluorescente de
nucleósido en el cual el ribo- o
desoxirribo-nucleósido se elige entre A, G, C, U,
T, los desoxi- o didesoxinucleósidos correspondientes, y sus
análogos químicamente modificados.
6. Conjugado según la reivindicación 5,
caracterizado porque el desoxirribonucleósido se elige entre
la
3'-azido-3'-desoxitimidina
y sus derivados; y los análogos 2', 3'-didesoxi de
A, T, C, G, U, I.
7. Conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el marcador
fluorescente está enlazado a un grupo funcional introducido o
generado en la base o en la unidad pentofuranósica del ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido, bien
directamente o bien por medio de un brazo espaciador.
8. Conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el marcador
fluorescente es un criptato de terbio, de europio, de samario o de
disprosio.
9. Conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el marcador
fluorescente es un criptato de tierras raras que consta de al menos
una sal de tierras raras complejada por un compuesto
macropolicíclico de fórmula
en la cual Z es un átomo que tiene 3 ó 4
valencias, R es nada o representa hidrógeno, el grupo hidroxi, un
grupo amino o un radical hidrocarbonado, los radicales bivalentes
\code{A}, \code{B} y \code{C} son, independientemente entre
sí, cadenas hidrocarbonadas que contienen opcionalmente uno o más
heteroátomos y están opcionalmente interrumpidos por un
heteromacrociclo, conteniendo también, al menos uno de los radicales
\code{A}, \code{B} y \code{C}, al menos un resto molecular, o
constando esencialmente de un resto molecular, poseyendo dicho
resto molecular una energía de triplete superior a la del nivel
emisor del ion de tierras raras
complejado.
10. Conjugado según la reivindicación 9,
caracterizado porque el marcador fluorescente es un criptato
de tierras raras que consta de al menos una sal de tierras raras
complejada por un compuesto macropolicíclico de fórmula (I) según la
reivindicación 9, en la cual el resto molecular se elige entre
fenantrolina, antraceno, benceno, naftaleno, los bi- y
ter-fenilo, azobenceno, azopiridina, piridina,
bipiridinas, bisquinoleínas y los compuestos de las fórmulas
siguientes:
- C_{2}H_{4} - X_{1} - C_{6}H_{4} -
X_{2} - C_{2}H_{4} -
- C_{2}H_{4} - X_{1} - CH_{2} -
C_{6}H_{4} - CH_{2} - X_{2} - C_{2}H_{4} -
X_{1} y X_{2}, que pueden ser iguales o
diferentes, representan oxígeno, nitrógeno o azufre,
siendo X oxígeno o
hidrógeno.
11. Conjugado según la reivindicación 9 ó 10,
caracterizado porque el marcador fluorescente es un criptato
de tierras raras que consta del ion terbio o europio complejado por
uno de los compuestos macrocíclicos siguientes:
(22)fenantrolina;
(22)fenantrolina-amida; (22)antraceno;
(22)antracen-amida;
(22)bi-isoquinoleína;
(22)bifenil-bis-piridina;
(22)bipiridina; (22)bipiridin-amida;
los macropoliciclos tris-bipiridina,
tris-fenantrolina,
fenantrolina-bis-bipiridina,
bi-isoquinolein-bis-piridina,
bis-bipiridin-difenilbipiridina.
12. Conjugado según la reivindicación 11,
caracterizado porque el marcador fluorescente es el criptato
de europio Eu trisbipiridina.
13. Conjugado según una de las reivindicaciones 1
a 8, caracterizado porque el marcador fluorescente es un
criptato de tierras raras que consta de al menos una sal de tierras
raras complejada por un compuesto macropolicíclico que comprende un
resto molecular elegido entre bipirazinas, bipirimidinas y
heterociclos de nitrógeno que contienen grupos N-óxido.
14. Conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el marcador
fluorescente es un criptato de tierras raras que consta de al menos
una sal de tierras raras complejada por un compuesto
macropolicíclico que responde a una de las fórmulas II o III
siguientes:
en las
cuales:
-el ciclo de fórmula
es uno de los ciclos
siguientes:
- Y es un grupo o un brazo espaciador que está
constituido por un radical orgánico bivalente, elegido entre los
grupos alquileno lineales o ramificados de C_{1} a C_{20} que
contienen opcionalmente uno o más dobles enlaces y/o que contienen
opcionalmente uno o más heteroátomos tales como oxígeno, nitrógeno,
azufre o fósforo, o uno o más grupos carbamoilo o carboxamido;
entre los grupos cicloalquileno de C_{5} a C_{8}; o entre los
grupos arileno de C_{6} a C_{14}; estando dichos grupos
alquileno, cicloalquileno o arileno opcionalmente sustituidos con
grupos alquilo, arilo o sulfonato;
- Z es un grupo funcional capaz de enlazarse de
manera covalente con una sustancia biológica;
- R es un grupo metilo o representa el grupo
-Y-Z;
- R' es hidrógeno o un grupo -COOR'', en el cual
R'' es un grupo alquilo de C_{1} a C_{10} y representa
preferentemente el grupo metilo, etilo o
terc-butilo, o bien R' es un grupo
-CO-NH-Y-Z.
15. Conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el marcador
fluorescente está enlazado al ribo- o al
desoxirribo-nucleósido o nucleótido por medio de un
brazo espaciador que consta de un radical orgánico bivalente,
elegido entre los grupos alquileno lineales o ramificados de
C_{1}-C_{20}, que contienen opcionalmente uno o
más dobles enlaces o triples enlaces y/o que contienen
opcionalmente uno o más heteroátomos, tales como oxígeno, nitrógeno,
azufre, fósforo o uno o más grupos carbamoilo o carboxamido; los
grupos cicloalquileno de C_{5}-C_{8} y los
grupos arileno de C_{6}-C_{14}; estando dichos
grupos alquileno, cicloalquileno o arileno opcionalmente
sustituidos con grupos alquilo, arilo o sulfonato.
16. Conjugado según la reivindicación 15,
caracterizado porque el brazo espaciador se elige entre los
grupos:
y
17. Conjugado según una de las reivindicaciones 1
a 15, caracterizado porque el desoxirribonucleótido es la
desoxiuridina, el marcador fluorescente es el criptato de europio
Eu trisbipiridina, y el brazo espaciador es un grupo
3-aminoalilo.
18. Procedimiento de preparación de los
conjugados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17,
caracterizado porque se hace reaccionar un ribo- o
desoxirribo-nucleósido o nucleótido nativo o
químicamente modificado o conjugado a una o más moléculas
marcadoras, en el que al menos un átomo de carbono del anillo o un
átomo de nitrógeno exocíclico del anillo purínico o pirimidínico, o
también un átomo de carbono de la unidad pentafuranósica, es
susceptible de estar implicado en un enlace con un marcador
fluorescente, con al menos un marcador fluorescente enlazado a dicho
o dichos átomos que constan de un criptato de tierras raras.
19. Uso de un conjugado según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 17, como marcador.
20. Uso de un conjugado según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 y 6 a 16, como nucleótido constituyente
en una reacción de síntesis de ácido nucleico.
21. Uso de un conjugado según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 y 7 a 16, para detectar y/o para
localizar compuestos que contienen al menos una secuencia de ácido
nucleico.
22. Uso según la reivindicación 20 en un
procedimiento de medida de la actividad enzimática de una enzima
implicada en una reacción de síntesis de ácido nucleico,
caracterizado porque se mide la fluorescencia emitida directa
o indirectamente por dicho conjugado, correlacionándose dicha
emisión de fluorescencia con el porcentaje de incorporación de dicho
conjugado en el polinucleótido de ácido nucleico sintetizado.
23. Uso según la reivindicación 22,
caracterizado porque la actividad enzimática es una
actividad de ADN o de ARN polimerasa, transcriptasa inversa,
transferasa o ligasa.
24. Uso según la reivindicación 20 en un
procedimiento de medida de la actividad enzimática que tiene por
sustrato un ácido nucleico.
25. Polinucleótido que comprende un número
superior a 1 de conjugados según una de las reivindicaciones 9 a
16.
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