ES2308999T3 - Procedimientos para la determinacion multiplexada de especies diana usando compuestos de biblioteca de marcadores, composiciones y kits. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar una pluralidad de proteínas diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de: proporcionar un compuesto de unión para cada una de las proteínas diana de la pluralidad, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos al mismo por una unión escindible, distinguiéndose el indicador o indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas; combinar con la muestra un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas de modo que en presencia de una proteína diana se forme un complejo entre cada proteína diana y el compuesto de unión específico para la misma; liberar los indicadores eTag en dichos complejos por escisión de las uniones escindibles; y separar e identificar los indicadores eTag liberados por una o más características físicas para determinar la pluralidad de proteínas diana.

Description

Procedimientos para la determinación multiplexada de especies diana usando compuestos de biblioteca de marcadores, composiciones y kits.

El campo de esta invención es la detección por ensayo multiplexado de especies diana tales como proteínas en una muestra.

Cuando se elucide el genoma humano, habrá numerosas oportunidades para llevar a cabo ensayos para determinar la presencia de secuencias específicas, distinguir entre alelos en homocigotos y heterocigotos, determinar la presencia de mutaciones, evaluar los patrones de expresión celular, etc. En muchos de estos casos se deseará determinar en una sola reacción una serie de características diferentes de la misma muestra. También habrá interés en la determinación de la presencia de uno o más patógenos, sus genes de resistencia a antibióticos, subtipo genético y similares.

En muchos ensayos, habrá interés en la determinación de la presencia de secuencias específicas sean genómicas, sintéticas o de ADNc. Estas secuencias pueden estar asociadas en particular con genes, secuencias reguladoras, repeticiones, regiones multímeras, patrones de expresión y similares.

Hay y seguirá habiendo comparaciones de secuencias de individuos diferentes. Se cree que habrá aproximadamente un polimorfismo por cada 1.000 bases, de modo que se puede prever que habrá un gran número de diferencias entre individuos. Por polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) se entiende que habrá un nucleótido prevalente en el sitio, estando presentes una o más de las bases restantes en un porcentaje sustancialmente menor de la población.

En su mayor parte, los SNP estarán en regiones no codificantes, principalmente entre genes, pero también estarán presentes en exones e intrones. Además, la gran proporción de SNP no afectará al fenotipo del individuo, pero afectará claramente al genotipo. El SNP tiene una serie de propiedades interesantes. Puesto que el SNP será heredado, el SNP individual y/o los patrones de SNP estarán relacionados con defectos genéticos, tales como delecciones, inserciones y mutaciones que implican una o más bases en genes. En lugar de aislar y secuenciar el gen diana, será suficiente identificar el SNP implicado.

Además, el SNP se puede usar en medicina forense para identificar individuos. Aunque hay otros marcadores genéticos disponibles, el gran número de SNP y su extensa distribución en los cromosomas hacen que los SNP sean un objetivo atractivo. Además, mediante la determinación de una pluralidad de SNP asociados con un fenotipo específico se puede usar el patrón de SNP como indicación del fenotipo, en lugar de requerir la determinación de los genes asociados con el fenotipo.

La necesidad de determinar muchos analitos o secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, patógenos múltiples o genes múltiples o variantes genéticas múltiples) en la sangre u otros fluidos biológicos se ha hecho cada vez más evidente en muchas ramas de la medicina. Es claramente evidente la necesidad de estudiar la expresión diferencial de genes múltiples para determinar los resultados toxicológicos relevantes o la necesidad de cribar contaminantes víricos de sangre transfundida con una alta sensibilidad.

Así pues, la mayoría de los ensayos o ensayos de multianalitos que detectan secuencias de ácidos nucleicos múltiples implican múltiples pasos, tienen poca sensibilidad y un intervalo dinámico pequeño (se determinan diferencias de 2 a 100 veces en concentración de los analitos) y algunos requieren instrumentación sofisticada.

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Algunos de los procedimientos clásicos conocidos para ensayos de multianalitos incluyen los siguientes:

a. El uso de dos marcadores radioisótopos distintos para distinguir dos analitos diferentes.

b. El uso de dos o más marcadores fluorescentes diferentes para distinguir dos o más analitos.

c. El uso de quelatos de lantánidos en los que se usan tanto la vida útil como la longitud de onda para distinguir entre dos o más analitos

d. El uso de marcadores fluorescentes y quimioluminiscentes para distinguir dos o más analitos.

e. El uso de dos enzimas diferentes para distinguir dos o más analitos.

f. El uso de enzima y ésteres de acridinio para distinguir dos o más analitos.

g. La resolución espacial de diferentes analitos, por ejemplo, en matrices para identificar y cuantificar analitos múltiples.

h. El uso de marcadores de ésteres de acridinio en los que se usa la vida útil o la formación de dioxetano para cuantificar dos dianas víricas diferentes.

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Por lo tanto, un ensayo que tuviera mayor sensibilidad, amplio intervalo dinámico (diferencias de 10^{3} a 10^{4} veces en niveles objetivo), mayor grado de multiplexado, y menos reactivos y más estables, aumentaría la simplicidad y fiabilidad de los ensayos de multianalitos.

La necesidad de identificar y cuantificar un gran número de bases o secuencias distribuidas potencialmente a lo largo de centimorgans de ADN ofrece un desafío importante. Cualquier procedimiento debe ser preciso, razonablemente económico al limitar la cantidad de reactivos necesarios y proporcionando un solo ensayo, y que permita la diferenciación de los diferentes SNP o diferenciación y cuantificación de genes múltiples.

Finalmente, aunque las secuencias de ácidos nucleicos proporcionan una diversidad extrema para situaciones que pueden tener interés biológico o de otro tipo, hay otros tipos de compuestos, tales como proteínas en proteómica que también pueden ofrecer oportunidades en las determinaciones multiplexadas.

Holland (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:7276) describe la actividad de exonucleasa de la enzima termoestable ADN polimerasa de Thermus aquaticus en la amplificación por PCR para generar señal detectable específica de forma concomitante con la amplificación.

Lee en Nucleic Acid Research (1993) 21:16 3761) describe el ensayo TaqMan.

White (Trends Biotechnology (1996) 14(12):478-483) discute los problemas del multiplexado en el ensayo
TaqMan®.

Marino, Electrophoresis (1996) 17:1499 describe PCR específica de secuencia de baja restricción (LSSP-PCR). Una secuencia amplificada por PCR se somete a amplificación con un solo cebador en condiciones de baja restricción para producir una variedad de amplicones de diferentes longitudes. Se obtienen diferentes patrones cuando hay diferencias en la secuencia. Los patrones son únicos para un individuo y tienen posible valor para ensayos de identidad.

El polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) da resultados similares. En este procedimiento, el ADN amplificado por la PCR se desnaturaliza y se detectan las conformaciones dependientes de secuencia de las cadenas sencillas por sus diferentes velocidades de migración durante la electroforesis en gel. Como con la LSSP-PCR anterior, se obtienen diferentes patrones que señalan diferencias en la secuencia. Sin embargo, ni la LSSP-PCR ni el SSCP dan información de secuencias específicas y ambos dependen de la suposición cuestionable de que cualquier base que se cambie en una secuencia dará lugar a un cambio conformacional que se puede detectar. Pastinen, Clin. Chem. (1996) 42:1391, amplifica el ADN diana e inmoviliza los amplicones. Después se permite que cebadores múltiples hibriden con los sitios 3' y contiguos a un sitio SNP ("polimorfismo de un solo nucleótido") de interés. Cada cebador tiene un tamaño diferente que sirve como un código. Los cebadores hibridados son expandidos por una base usando trifosfato de didesoxinucleótido marcado con fluorescencia. El tamaño de cada uno de los productos fluorescentes producidos, determinado por electroforesis en gel, indica la secuencia, y por lo tanto, la localización del SNP. La identidad de la base en el sitio de SNP se define por el trifosfato usado. Haff, Nucleic Acids Res. (1997) 25:3749 toma un procedimiento similar, excepto que la determinación del tamaño se lleva a cabo por espectroscopía de masas y por lo tanto evita la necesidad de un marcador. Sin embargo, ambos procedimientos tienen la seria limitación de que el cribado de un gran número de sitios requerirá cebadores largos y muy puros que pueden tener estructuras secundarias difíciles y muy caras de sintetizar.

Hacia, Nat. Genet. (1996) 14:441, usa una matriz de oligonucleótidos de alta densidad. Se deja que las muestras de ADN marcadas se unan a 96.600 oligonucleótidos de 20 bases y se comparan los patrones de unión producidos procedentes de diferentes individuos. El procedimiento es atractivo en cuanto que se pueden identificar directamente los SNP, pero el coste de las matrices es alto y la hibridación no específica puede confundir la precisión de la información genética.

Fan (1997, 6-8 octubre, IBC, Annapolis MD) ha publicado resultados de un cribado a gran escala de sitios humanos con la secuencia marcada. La precisión del cribado del polimorfismo de un solo nucleótido se determinó por la resecuenciación convencional ABI.

Ross en Anal. Chem. (1997) 69:4197 ha discutido la hibridación de oligonucleótido específico de alelo junto con la espectroscopía de masas.

Holland, y col., PNAS USA (1991) 88, 7276-7280, describe el uso de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa para detectar los productos de la PCR.

La patente de EE.UU. nº 5.807.682 describe composiciones sonda para detectar una pluralidad de dianas de ácido nucleico.

El documento WO 99/42838 describe procedimientos, composiciones y kits para determinar la presencia de cantidades relativas de dos o más componentes en un medio usando un reactivo marcador para cada uno de dichos componente, que comprende una composición quimioluminiscente.

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Se proporcionan procedimientos para determinaciones multiplexadas que proporcionan una separación conveniente de marcadores identificadores liberados basados en las propiedades físicas de los marcadores. Los procedimientos se pueden llevar a cabo en un solo recipiente y pueden implicar una pluralidad de reactivos añadidos de forma simultánea o consecutiva. En un grupo de realizaciones, estará implicada la masa en la característica que permite la separación. Un grupo de marcadores identificadores para análisis electrocinético se caracteriza por tener regiones que sirven como (1) una región de unión escindible; (2) una región modificadora de la masa; (3) una región modificadora de la carga; y (4) una región detectable, dependiendo el número de regiones diferentes en parte del procedimiento de separación e identificación. Los compuestos que tienen estas regiones características son útiles junto con otros compuestos, donde las regiones se combinan en el mismo resto. Es particularmente interesante el uso de bloques estructurales para formar los compuestos, en los que la síntesis se realiza de forma repetitiva usando la misma química de unión en una pluralidad de etapas. Los compuestos objeto se unen a compuestos de unión para la identificación, para proporcionar reactivos identificadores, en los que la unión de una diana reactiva identificadora en un sistema de ensayo da como resultado la liberación del marcador identificador (en lo sucesivo denominado un "indicador eTag^{TM}") donde se pueden diferenciar los indicadores eTag. Se puede proporcionar un gran número de indicadores eTag en kits que comprenden un grupo funcional de conexión para unirse a los compuestos de unión o se pueden proporcionar kits de bloques estructurales para sintetizar indicadores eTag in situ junto con la síntesis del compuesto de unión. Tiene un interés particular el uso de los indicadores eTag objeto en la identificación de ácidos nucleicos y proteínas.

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Por lo tanto, la presente invención proporciona en una realización un procedimiento para detectar una pluralidad de proteínas diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión para cada una de las proteínas diana en una pluralidad, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos a los mismos mediante una unión escindible, distinguiéndose el indicador o indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas;

combinar con la muestra un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas de modo que en presencia de una proteína diana se forme un complejo entre cada proteína diana y el compuesto de unión específico para la misma;

liberar los indicadores eTag en dichos complejos mediante escisión de las uniones escindibles; y

separar e identificar los indicadores eTag liberados por dichas una o más características físicas para determinar la pluralidad de proteínas diana.

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En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar una pluralidad de especies diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión para cada una de una pluralidad de especies diana, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos al mismo mediante una unión escindible, distinguiéndose dichos uno o más indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas;

proporcionar un segundo compuesto de unión para cada una de la pluralidad de especies diana, teniendo cada segundo compuesto de unión un sensibilizador para generar una especie activa;

combinar con la muestra un compuesto de unión y un segundo compuesto de unión para cada una de la pluralidad de especies diana de modo que en presencia de una especie diana se forme un complejo entre la especie diana y el compuesto de unión y el segundo compuesto de unión específico para la misma, y de modo que el sensibilizador del segundo compuesto de unión produzca la generación de una especie activa y la escisión de una o más uniones escindibles para liberar uno o más indicadores eTag; y

separar e identificar los indicadores eTag liberados por dichas una o más características físicas para determinar las especies diana en la muestra.

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En otra realización más, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar poblaciones de cada una de una pluralidad de proteínas de superficie de membrana en una muestra celular, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas de superficie de membrana, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos al mismo mediante una unión escindible, distinguiéndose el indicador o indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas;

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combinar con la muestra celular un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas, de modo que en presencia de una proteína de superficie de membrana se forme un complejo entre cada proteína de superficie de membrana y el compuesto de unión específico para la misma;

escindir la unión escindible de cada compuesto de unión que forma dicho complejo de modo que se liberen los indicadores eTag; y

separar e identificar los indicadores eTag liberados por dichas uno o más características físicas para determinar las poblaciones de la pluralidad de proteínas de superficie de membrana.

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la fig. 1 es un esquema que ilustra configuraciones de alto voltaje de ejemplo usadas en el dispositivo CE^{2} LabCard^{TM} durante un ensayo enzimático;

la fig. 2 son dos electroferogramas que demuestran un análisis de indicadores eTag usando un CE^{2} LabCard^{TM}. La figura muestra la separación de aminodextrano marcado purificado con y sin perlas sensibilizadoras. La adición de perlas sensibilizadoras conduce a la liberación del indicador eTag del aminodextrano usando oxígeno singlete producido por el sensibilizador tras la irradiación a 680 nm. Condiciones experimentales: tampón de separación HEPES 20,0 mM pH 7,4, y PEO al 0,5%; configuraciones de voltaje como se muestran en la figura 1; la mezcla de ensayo tenía perlas sensibilizadoras recubiertas con estreptavidina 29 \mug/ml y se irradió durante 1 min a 680 nm usando un filtro de 680 \pm 10 nm y una lámpara de 150 W;

la fig. 3 son múltiples electroferogramas que demuestran un análisis de indicadores eTag usando un CE^{2} LabCard^{TM}. La figura muestra la separación de aminodextrano marcado purificado que se ha irradiado durante diferentes periodos de tiempo. Condiciones experimentales: tampón de separación HEPES 20,0 mM pH 7,4, y PEO al 0,5%; configuraciones de voltaje como se muestran en la figura 1; la mezcla de ensayo tenía perlas sensibilizadoras recubiertas con estreptavidina 27 \mug/ml y se irradió a 680 nm usando un filtro de 680 \pm 10 nm y una lámpara de 150 W;

la fig. 4 son múltiples electroferogramas que demuestran un análisis de indicadores eTag usando un CE^{2} LabCard^{TM}. La figura muestra la separación de aminodextrano marcado purificado usando diferentes concentraciones de perlas sensibilizadoras. La mayor concentración de perlas sensibilizadoras conduce a la mayor liberación de indicadores eTag del aminodextrano marcado. Condiciones experimentales: tampón de separación HEPES 20,0 mM pH 7,4, y PEO al 0,5%; configuraciones de voltaje como se muestran en la figura 1; la mezcla de ensayo se irradió durante 1 min a 680 nm usando un filtro de 680 \pm 10 nm y una lámpara de 150 W;

la fig. 5 representa la curva de calibración lineal para la liberación de indicadores eTag como función de la concentración de perlas sensibilizadoras. Los resultados se obtuvieron usando un CE^{2} LabCard. Condiciones experimentales: tampón de separación HEPES 20,0 mM pH 7,4, y PEO al 0,5%; configuraciones de voltaje como se muestran en la figura 1; la mezcla de ensayo se irradió durante 1 min a 680 nm usando un filtro de 680 \pm 10 nm y una lámpara de 150 W;

la fig. 6 es una curva de datos que muestra el efecto de la concentración de aminodextrano marcado en la liberación de indicador eTag. En esta figura se demuestra que una menor concentración de aminodextrano marcado para una concentración dada de perlas sensibilizadoras conduce a la liberación más eficaz de indicador eTag (o una mayor proporción de indicador eTag liberado a cantidad de aminodextrano marcado). Los resultados se obtuvieron usando un CE^{2} LabCard. Condiciones experimentales: tampón de separación HEPES 20,0 mM pH 7,4, y PEO al 0,5%; configuraciones de voltaje como se muestran en la figura 1; la mezcla de ensayo tenía perlas sensibilizadoras 29 \mug/ml y se irradió durante 1 min a 680 nm usando un filtro de 680 \pm 10 nm y una lámpara de 150 W;

la fig. 7 son electroferogramas múltiples que muestran la separación de indicadores eTag individuales. La figura ilustra la resolución que se puede obtener de los indicadores que son identificados por sus números ACLA;

la fig. 8 son electroferogramas múltiples que muestran una separación en un analizador 310 que se ha producido después de una reacción de amplificación, en presencia de sonda y cebador sin la adición de avidina;

la fig. 9 son electroferogramas múltiples que muestran una separación en un analizador 310 que se ha producido después de una reacción de amplificación, en presencia de sonda y cebador con la adición de avidina.

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Se proporcionan procedimientos y compuestos para determinaciones multipexadas, en las que los compuestos se pueden unir a compuestos de unión para detectar los compuestos de unión recíprocos en una muestra. Los procedimientos se distinguen por tener una pluralidad de sucesos de unión en un solo recipiente usando una mezcla de compuestos de unión conjugados de forma diferente con receptores eTag, la liberación de los receptores eTag identificadores de estos compuestos de unión unidos a sus compuestos diana en el mismo recipiente, y la detección de los marcadores identificadores liberados por separación de los marcadores en un solo experimento. Los receptores eTag se distinguen por tener una o más características físicas que permiten separarlos y detectarlos.

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El procedimiento usa una mezcla de compuestos de unión unidos a indicadores eTag, en los que cada indicador eTag tiene una característica que permite que sea detectado de forma única en un solo experimento de separación. El procedimiento implica combinar el compuesto de unión conjugado con el indicador eTag con una muestra para determinar la presencia de una pluralidad de dianas en condiciones en las que los compuestos de unión se unen a cualesquiera parejas de unión recíprocas para formar un complejo de unión. Después de suficiente tiempo para que se produzca la unión, los indicadores eTag se pueden liberar de los complejos de unión en el mismo recipiente. Se usan diferentes técnicas dependiendo de la naturaleza de los compuestos de unión para liberar los indicadores eTag al complejo. Después, los indicadores eTag liberados se separan e identifican por sus características diferenciables sin la interferencia de los indicadores eTag todavía unidos al compuesto de unión. Las técnicas para diferenciar entre los indicadores eTag unidos a un complejo y no unidos a un complejo incluyen reacciones enzimáticas que requieren que exista el complejo para que se produzca la escisión, modificación que usa la unión ligando/receptor, en la que el ligando es parte del compuesto de unión de modo que después de la escisión el receptor eTag todavía unido al compuesto de unión es modificado, unión doble a la diana dando como resultado la liberación del receptor eTag, donde opcionalmente el receptor eTag unido al compuesto de unión es modificado, y similares.

Un conjunto de receptores eTag se distingue por diferencias que incluyen la masa como una característica. Estos indicadores eTag no se basan en la diferenciación basada en oligonucleótidos de 2 o más, normalmente 3 o más nucleótidos, sino en bloques estructurales químicos orgánicos que se combinan convenientemente entre sí para proporcionar gran cantidad de compuestos diferenciables. Por lo tanto, aunque el indicador eTag original o indicador eTag conjugado con el compuesto de unión puede tener 2 o más nucleótidos, cuando es liberado del compuesto de unión, el indicador eTag liberado ya no tendrá más de 3, normalmente más de 2 nucleótidos. Tienen un interés particular los indicadores eTag que se caracterizan por diferencias en su relación masa/carga. Estos compuestos se distinguen por tener diferencias de movilidad y se caracterizan por tener regiones que sirven como (1) una región de unión escindible; (2) una región modificadora de la masa; (3) una región modificadora de la carga; y (4) una región detectable, en los que las regiones se pueden separar y distinguir o combinar, habiendo al menos dos regiones distintas que proporcionan la diferenciación. Estos indicadores eTag pueden combinarse en kits y ensayos con compuestos que tienen todas las regiones en una sola región para aumentar más el número de compuestos diferentes usados como indicadores eTag en una determinación multiplexada. Estos compuestos son útiles con otros compuestos en los que las diferentes regiones están presentes en el mismo resto, por ejemplo una a dos regiones, en las que la región modificadora de carga también puede ser la región detectable o la región modificadora de masa. Al tener una pluralidad de compuestos que pueden servir como moléculas identificadoras, se pueden ensayar mezclas de compuestos diana en un solo recipiente. Mediante el uso de protocolos que dan como resultado la liberación de indicadores eTag^{TM} del compuesto de unión, que son identificables debido a diferencias en movilidad, el análisis se simplifica mucho, puesto que los indicadores eTag no tendrán sustancialmente materiales que interfieran y sus diferencias de movilidad permitirán una detección y cuantificación precisas.

Los indicadores eTag variarán dependiendo del procedimiento de detección. En las determinaciones se usarán grupos de al menos 10 indicadores eTag unidos a 10 compuestos de unión diferentes. Los indicadores eTag se caracterizarán por ser escindibles del compuesto de unión en el mismo recipiente por el mismo mecanismo de escisión, tener una característica compartida que permite la separación y detección individuales, ser compatible con el procedimiento de determinación y tener un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 30 a 3000 dal, normalmente en el intervalo de peso molecular de aproximadamente 35 a 1500 dal. La variación puede ser de masa usando un espectrómetro de masa, en el que se usa un campo magnético para la separación, relación masa/carga que usa electroquinesis, en la que se usa un campo eléctrico para la separación, que también puede incluir polímeros de cribado y/o adsorción, adsorción, usando cromatografía, p. ej., cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta presión, en la que se usan interacciones polares y de van der Waals para la separación, etc.

Para los indicadores eTag que se basan en la masa como característica, la diferencia de unidades de masa en cada indicador eTag cuando se usa la espectrometría de masas para el análisis solo necesita ser de uno, preferiblemente al menos aproximadamente 2. Para la electroforesis, normalmente se tendrá una diferencia de al menos 3, normalmente 5 unidades como relación masa/carga, preferiblemente al menos aproximadamente 7, y si se desean usar distancias más cortas para la separación, 10 o más. Estas diferencias de unidades están dirigidas a moléculas de estructura similar, ya que como se discutirá más adelante, las estructuras pueden afectar a la movilidad sin cambiar la relación de masa/carga.

Para la mayoría, los indicadores eTag que tienen regiones independientes tendrán la siguiente fórmula:

100

en la que:

L es una región de unión terminal;

M es la región modificadora de masa;

C es la región modificadora de carga;

D es la región detectable, que está presente cuando se detecta el indicador eTag usando mediciones espectrofotométricas, y no está presente cuando el indicador eTag se detecta usando mediciones de espectrometría de masas;

n es 0 ó 1, siendo 1 para la medición espectrofotométrica y 0 para la medición espectrométrica de masas; y

el * indica que M, C y D pueden estar unidos a cualquiera de los otros grupos en cualquier sitio, y cuando no lo están son independientes y distintas regiones,

cualesquiera de M, C y D pueden combinarse entre sí para proporcionar funciones múltiples en una sola región y las regiones se pueden unir directamente entre sí o intercalar con grupos o regiones conectoras. Es decir, partes de una región pueden estar separadas por otra región entera o partes. También, como se ha indicado antes, las regiones diferentes no tendrán regiones que comprendan oligonucleótidos de 3 o más nucleótidos, normalmente no tendrán regiones que comprendan oligonucleótidos de 2 o más nucleótidos.

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Cuando el indicador eTag está unido al compuesto de unión, el indicador eTag tendrá la siguiente fórmula:

101

en la que:

B es el compuesto de unión unido a L';

L' es un grupo conector modificado como resultado de la unión a B; y el resto de los símbolos son como se han definido previamente.

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Los indicadores eTag liberados tendrán la siguiente fórmula:

102

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en la que:

L'' es el resto de la región conectora, que puede incluir más o menos que el grupo conector original, e incluye una parte del compuesto de unión o retiene solo una parte de la región de unión, por escisión en un sitio distinto del enlace hecho por unión de la región conectora y el compuesto de unión; y

el resto de los símbolos son como se han definido previamente.

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Cada una de las regiones puede unirse en una variedad de formas usando grupos funcionales y protocolos sintéticos diferentes, en los que la forma de unión puede servir como una de las regiones, por ejemplo, al tener uniones fosfato que dan como resultado uniones con carga negativa.

La región conectora funciona como conexión entre el resto del indicador eTag y el compuesto de unión. L tiene tres aspectos: un grupo funcional reactivo, sea inherente o hecho haciéndolo reaccionar con un resto activante; una unión escindible, que puede ser la conexión formada por la unión con el compuesto de unión, y un grupo(s) para unirse a una o más de las otras regiones. Para unirse al compuesto de unión, se pueden usar diferentes grupos funcionales, dependiendo de la naturaleza del compuesto de unión.

Cuando el compuesto de unión es un oligonucleótido, es decir ADN, ARN, se usarán normalmente combinaciones y análogos de los mismos, p. ej., análogos de tipo tio, grupos que reaccionan con alcoholes. Los grupos reactivos incluyen fosforamiditos, p. ej., fosforamiditos de dialquilo, en los que el alquilo tiene 1-6 átomos de carbono; fosforamiditos de alquilcianoetilo en los que el alquilo tiene 1-6 átomos de carbono, etc.; fosfitos o fosfatos de trialquilo, en los que el alquilo tiene 1-6 átomos de carbono; ácidos carboxílicos o derivados de los mismos, tales como haluros de acilo, anhídridos y ésteres activos, p. ej., éster de dinitrofenilo; haluros activos, tales como \alpha-halógenometiloxo y no oxo, en los que el halógeno tendrá un número atómico 17-53, cloro, bromo y yodo; y similares. Los productos serán ésteres, ésteres de ácido tanto inorgánico como orgánico, y éteres. Alternativamente, en algunos casos, pueden usarse otros compuestos distintos de los derivados de fosfato como unidades conectoras, usando en su lugar aminoácidos, tales como glicina y glicinas sustituidas. En este caso, las unidades del indicador eTag usarán una química análoga para sintetizar el indicador eTag in situ. Los conectores de ejemplo son solo ilustrativos y no se pretende que sean exhaustivos.

Para la mayor parte de los oligonucleótidos, la escisión será en un enlace fosfato entre dos nucleósidos, escindido por una enzima que tiene actividad de nucleasa, p. ej., actividad de 5'-3' nucleasa. Por lo tanto, la región conectora normalmente incluirá un derivado de ácido fosfórico para el acoplamiento al hidroxi terminal de un oligonucleótido que tenga una base adecuada, tal como adenina, citosina, guanosina, timidina y uracilo. Como se discutirá posteriormente, otros grupos hidroxilo del azúcar, ribosa o desoxirribosa, pueden estar sustituidos con una de las otras regiones. Cuando se usan otros procedimientos distintos de la actividad de nucleasa para liberar el indicador eTag, entonces no se puede usar ninguno de los otros grupos funcionales para la unión al oligonucleótido. Entonces la región conectora incluirá una entidad funcional que permita la escisión específica.

No es necesario usar oligonucleótidos para detectar secuencias de ácidos nucleicos específicas. Mediante el uso de compuestos de unión que reconocen una secuencia particular, como ADNss o ADNds, se puede unir un indicador eTag diferente a cada uno de los diferentes compuestos de unión. La combinación de la muestra de ácidos nucleicos con lo compuestos de unión marcados con indicador eTag da como resultado la unión de los compuestos de unión a secuencias que están presentes en la muestra. Se pueden usar diferentes protocolos dependiendo de la naturaleza del compuesto de unión. Por ejemplo, se pueden usar oligómeros de compuestos heterocíclicos, en particular compuestos de azol, p. ej. pirrol, imidazol, hidroxiimidazol, unidos por cadenas de dos átomos, en particular que tengan grupos -NH-, y aminoácidos, p. ej., glicina, alanina, \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico, etc. Los azoles normalmente están conectados por un puente de dos átomos que contiene un grupo -NH-, convenientemente de la posición 2 a la posición 4 ó 5. Estos compuestos forman horquillas que se unen al surco menor del ADNds con alta afinidad y especificidad de secuencia. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.090.947 y 5.998.140, que se incorporan específicamente en el presente documento por referencia para la descripción de las secuencias de unión.

Mediante la adición de los oligómeros adecuados a una muestra de ADNds, que puede incluir ADNds intacto o fragmentado, la separación entre oligómeros unidos y los oligómeros no unidos y liberación de los indicadores eTag unidos al ADNds, se puede determinar rápidamente la presencia de secuencias de ADNds en la muestra. La separación se puede hacer con proteínas que se unen a ADNds, al tener ligandos unidos al ADNds, p. ej. usando la PCR con cebadores que llevan un ligando, etc. Alternativamente, con una biotina u otro ligando unido al indicador eTag conjugado con el compuesto de unión que es retenido con el compuesto de unión cuando se libera el indicador eTag, se puede añadir el receptor del ligando que tiene una carga opuesta al indicador eTag liberado, de modo que en la electroforesis el indicador eTag migraría en la dirección opuesta. Los procedimientos pueden ser particularmente útiles cuando la sensibilidad del sistema es adecuada para evitar la amplificación y determinar directamente la presencia de una secuencia sin desnaturalización. Este procedimiento puede ser útil en la detección de organismos infecciosos, p. ej., bacterias, virus y protistas, identificación de quiasmas específicos, identificación de genomas, y similares.

Hay un gran número de entidades funcionales diferentes que son estables en las condiciones usadas en el proceso de unión con el compuesto de unión y después pueden ser escindidas sin afectar de forma adversa al indicador eTag. Las entidades funcionales pueden escindirse por procedimientos químicos o físicos que implican oxidación, reducción, solvolisis, p. ej. hidrólisis, fotolisis, termólisis, electrolisis, sustitución química, etc. Las entidades funcionales específicas incluyen tioéteres que pueden escindirse con oxígeno singlete, disulfuro que puede escindirse con un tiol, dicetonas que pueden escindirse con permanganato o tetraóxido de osmio, \beta-sulfonas, tetraalquilamonio, trialquilsulfonio, tetraalquilfosfonio, etc. en los que el carbono \alpha está activado con carbonilo, nitro, etc., que se puede escindir con base, quinonas en las que la eliminación se produce con reducción, éteres de bencilo sustituidos que pueden escindirse por vía fotolítica, carbonatos que pueden escindirse por vía térmica, quelatos de metales, en los que los ligandos pueden desplazarse con una mayor afinidad de ligando, así como muchas otras entidades funcionales que se conocen en la bibliografía. Los protocolos de escisión se describen en las patentes de EE.UU. nº 5.789.172, 6.001.579, y referencias citadas en las mismas.

Los indicadores eTag son útiles en determinaciones que implican una pluralidad de entidades diana. Normalmente, se estará interesado en al menos aproximadamente 3 unidades diana, más normalmente al menos 5, con frecuencia al menos aproximadamente 10 o más, y se puede estar interesado en al menos aproximadamente 20 o más, incluso aproximadamente 100 o más. El número de indicadores eTag normalmente será igual al número de entidades diana, aunque en algunas situaciones se puede usar el mismo indicador eTag para identificar una pluralidad de entidades diana relacionadas y después se pueden desplegar los resultados como entidades diana individuales. Los indicadores eTag unidos a los miembros de unión se pueden añadir individualmente o combinados con la muestra y después procesar para determinar la presencia de entidades diana.

Es interesante tener dos indicadores eTag que tengan una movilidad muy similar, normalmente con movilidad más similar en entre sí que con indicadores eTag no relacionados. Cuando hay que analizar situaciones emparejadas, tales como alelos, antígenos MHC, polimorfismos de uno solo nucleótidos, etc., al tener los indicadores eTag próximos en el electroferograma, en particular cuando tienen regiones detectables distinguibles, p. ej., agentes de fluorescencia que fluorescen a diferentes longitudes de onda, se obtiene una determinación rápida de si están presentes en la muestra ninguno, uno o ambos de la pareja.

Los análisis genéticos pueden tener muchas formas e implican determinaciones de diferente información. Los análisis genéticos implican secuenciación, detección de secuencias específicas relacionadas con la presencia de genes específicos o secuencias reguladoras, identificación de organismos, identificación de sucesos de transcripción relacionados con células diferentes, diferentes etapas celulares y estímulos externos, identificación de polimorfismos de un solo nucleótidos, alelos, secuencias repetidas, ADN de plastos, ADN mitocondrial, etc., medicina forense, y similares. En cada caso, hay que ensayar una muestra compleja, en la que se está interesado en numerosos sucesos de unión. Al proporcionar un indicador eTag único para cada suceso, se puede realizar simultáneamente una serie de ensayos en el mismo matraz y con una sola muestra o algunas partes alícuotas de la muestra. Por ejemplo, cuando un ensayo implica un solo nucleótido en cada recipiente, se usarán cuatro recipientes, uno para cada nucleótido. En la mayoría de los casos, los indicadores eTag se pueden separar de otros componentes de la mezcla de ensayo para reducir sustancialmente la interferencia de estos otros componentes cuando se ensayan los indicadores eTag.

Hay una serie de análisis genéticos que implican la escisión de un enlace fosfato de una secuencia de ácido nucleico como resultado de hibridación. Para la mayoría, la etapa inicial será en solución, aunque se pueden tener uno o más reactivos unidos a un soporte sólido en la primera y sucesivas etapas de la determinación. Se describe una técnica en las patentes de EE.UU. nº 5.876.930 y 5.723.591, en la que un cebador y una sonda están unidos a una secuencia diana y mediante extensión del cebador con la ADN polimerasa que tiene actividad de 5'-3' nucleasa, se escinden los nucleótidos terminales a medida que la polimerasa avanza a lo largo del ADN diana. Al tener un indicador eTag unido al o a los nucleótidos terminales y/o internos, el indicador eTag se liberará cuando esté presente el ácido nucleico diana. Otra técnica usa una enzima denominada Cleavasa, que reconoce un complejo de tres miembros del ácido nucleico diana, un cebador y una sonda. Véase, la patente de EE.UU. nº 5.719.028. Unido al extremo de la sonda hay un indicador eTag que es liberado por la Cleavasa, cuando se ha formado el complejo de tres miembros.

Para detectar los polimorfismos de un solo nucleótido ("SNP"), se pueden usar diferentes técnicas de complejidad variable. En una técnica, se usa un cebador que termina en el nucleótido que precede inmediatamente al SNP. Se puede tener el indicador eTag unido al cebador y un ligando unido al nucleótido recíproco al SNP. Se pueden tener 4 recipientes, cada uno con un nucleótido marcado diferente o un recipiente con cada uno de los nucleótidos marcados que tiene un marcador diferente. Se pueden usar diferentes polimerasas que tienen edición 3'-5' para asegurar que los emparejamientos erróneos son raros. Después se pueden capturar los cebadores extendidos, por ejemplo, al tener un ligando, p. ej. biotina, y poner en contacto la mezcla de extensión con el receptor recíproco. p. ej. estreptavidina, unido a un soporte, y liberar y analizar el indicador eTag. Mediante el agrupamiento de dianas de interés que tienen el mismo nucleótido para el SNP, el ensayo se puede multiplexar para una pluralidad de dianas. Otras técnicas incluyen tener sondas en las que el SNP está emparejado erróneamente. El nucleótido emparejado erróneamente está marcado con el indicador eTag. Cuando el SNP está presente, el nucleótido marcado con el indicador eTag será liberado para la detección. Véase la patente de EE.UU. nº 5.811.239.

En otra variación, se pueden ligar un cebador y una sonda, en el que uno es 3' del otro cuando hibrida con un ácido nucleico diana. Al tener uno de la pareja del cebador y la sonda con un indicador eTag con una unión escindible y el otro de la pareja con un agente que puede producir la escisión de la unión escindible en conjunto con otro agente, el cebador y la sonda pueden estar ligados entre sí cuando están unidos a la diana. Se puede liberar la pareja ligada de la diana, p. ej. con calor, y reciclarla enfriando la mezcla para permitir la hibridación del cebador y la sonda, ligando el cebador y la sonda unidos a la diana y después desnaturalizando para liberar el cebador y la sonda ligados, amplificando el número de cebadores y sondas ligados. Una vez que se ha logrado el grado de amplificación, se puede proporcionar el reactivo adicional que da como resultado la liberación de los indicadores eTag.

Cuando se usa la PCR u otra reacción de amplificación que implica un cebador, el cebador se puede marcar con un ligando que permite la separación del ADN amplificado, y después se puede separar el ADN mediante un receptor recíproco del ligando, cuyo receptor está unido a un soporte y añadir sondas marcadas con indicadores eTag específicos para la secuencia de la sonda. Después de hibridación y lavado para eliminar el ácido nucleico unido de forma no específica y el no unido, se liberan y analizan los indicadores eTag.

En lugar de los ensayos de ácidos nucleicos, se puede tener interés en ensayos de proteínas. Para determinar una mezcla de proteínas, se pueden usar células intactas, virus intactos, células infectadas por virus, lisatos, plastos, mitocondrias u otros orgánulos, muestras fraccionadas, u otros agregados de proteínas por si mismos o en conjunto con otros compuestos. Se puede usar cualquier fuente de una mezcla de proteínas, cuando haya interés en la identificación de una pluralidad de proteínas.

La proteómica ha destacado cuando lo que interesa es la expresión celular durante el metabolismo, mitosis, meiosis, en respuesta a un estímulo externo, p. ej. fármaco, virus, cambio en las condiciones físicas o químicas, que implica un exceso o una deficiencia de nutrientes y cofactores, estrés, envejecimiento, presencia de tensiones particulares de un organismo, y la identificación del organismo y cepa, resistencia múltiple a fármacos, y similares. Es necesario tener un medio para identificar un gran número de proteínas en una sola muestra, así como para proporcionar alguna cuantificación de las diferentes proteínas que se van a detectar. En un ensayo, se pueden usar proteínas de unión específicas para las proteínas diana. Un grupo de proteínas de unión se unen a un soporte, tal como un recipiente o pared de canal, partículas magnéticas o no magnéticas, p. ej., partículas de látex, dextrosa, sefarosa, celulosa, etc., donde el soporte permite separar las proteínas diana en el soporte. Más habitualmente, se usarán anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales en lugar de antisuero, aunque este último también puede ser útil. En otras situaciones pueden ser útiles otros receptores, tales como lectinas, enzimas, proteínas de superficie de membrana, etc., y en algunas situaciones se pueden usar ligandos para las proteínas. Los miembros de unión recíprocos, receptores y ligandos pueden estar unidos al soporte por enlace covalente o no covalente. Las superficies activadas son útiles cuando la superficie tiene un grupo funcional activo que reaccionará con el miembro de unión recíproco para proporcionar la unión estable a la superficie, p. ej., vidrio modificado con cloruro de sililo, polisacáridos modificados con bromuro de cianógeno, etc. Las proteínas se unen fuertemente a algunas superficies plásticas, de modo que no es necesario enlace covalente. Los ligandos tienen o pueden estar provistos de grupos funcionales activos para formar enlace con la superficie. Si se desea, la unión a la superficie puede realizarse en dos etapas por enlace de un ligando al miembro de unión recíproco y unión de un miembro de unión a ligando al soporte, por ejemplo, biotina como el ligando y estreptavidina como el miembro de unión al ligando, o se puede tener unión anti-Ig unido a la superficie para unirse a anticuerpos unidos a la proteína diana. Además, cuando se localiza un cambio en el entorno, se puede tener una concentración alta de un agente que contrarreste, p. ej. una gran cantidad de un tampón a pH 7, por ejemplo, fosfato 200 mM, en el que se produce amoniaco que crea un entorno básico localizado.

La muestra se combina con un miembro de unión recíproco, que puede estar unido al soporte o se puede unir posteriormente al soporte. Después de quitar mediante lavado los otros componentes de la mezcla, se añade el receptor para la proteína diana marcada con moléculas indicadoras eTag específicas para el receptor particular, a la proteína diana unida, de modo que quede unida al soporte por la proteína diana. Se unirán una o más moléculas indicadoras eTag al receptor, normalmente no más de aproximadamente 20, con frecuencia no más de aproximadamente 10. El número estará limitado por el grado de pérdida de la afinidad de unión cuando aumenta el número de moléculas indicadoras eTag. Normalmente, el receptor unido al soporte y el receptor marcado con indicador eTag se unirán a diferentes epítopos de la proteína diana, aunque en algunas situaciones en las que la diana tiene una pluralidad de epítopos iguales, los receptores pueden ser específicos para el mismo epítopo. Después de quitar por lavado todos los receptores marcados con el indicador eTag que no están unidos específicamente a la(s) proteína(s) diana, se liberan y ensayan las moléculas indicadoras eTag.

Cuando la diana permite la unión de dos miembros de unión recíprocos o cuando se proporciona un reactivo adicional que permite este suceso, se pueden usar determinaciones que implican "canalización" o transferencia de energía. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.843.666 y 5.573.906. En la bibliografía hay numerosas metodologías que implican canalización, en las que para la mayor parte la canalización está implicada en la producción de una señal directamente detectable, normalmente un cambio en la absorción o emisión de luz. La canalización implica tener dos reactivos, en el que el primer reactivo, cuando está cerca del segundo reactivo produce una señal detectable. Para el indicador eTag, la señal detectable es la liberación del indicador eTag del componente de unión. La liberación normalmente será función de la producción de una entidad de vida corta, tal como una especie química o una especie excitada fotoactivada, pero puede ser el resultado de cambiar el entorno local comparado con la solución a granel. Como especies químicas, las especies de ejemplo incluyen oxígeno singlete, peróxido de hidrógeno, NADH y radicales hidroxilo. Se usan dos entidades que tienen miembros de unión recíprocos que se unen al mismo resto diana. Una de las entidades genera una especie activa. La otra entidad tiene un grupo funcional susceptible que interacciona con la especie activa dando como resultado la liberación del indicador eTag o responde al entorno local cambiado para liberar el indicador eTag. Cualquiera de las especies activas es de vida corta, de modo que no creará un ruido de fondo significativo porque fuera de su proximidad la especie activa se hace inactiva, o se usa un depurador para que depure eficazmente la especie activa, de forma que ya no esté disponible para reaccionar con el grupo funcional susceptible que no está unido a la diana.

Los generadores de especies activas incluyen enzimas, tales como oxidasas, tales como glucosa oxidasa, xantano oxidasa, D-aminoácido oxidasa, NADH-FMN oxidorreductasa, galactosa oxidasa, gliceril-fosfato oxidasa, sarcosina oxidasa, colina oxidasa y alcohol oxidasa que produce peróxido de hidrógeno, peroxidasa de rábano picante que produce radical hidroxilo, varias deshidrogenasas que producen NADH o NADPH, ureasa que produce amoniaco para crear un pH local alto. Una unión escindible puede basarse en la oxidación de azufre o selenio cuando hay presente un tioéter, sulfóxido o sus análogos de selenio en la posición \alpha o \beta con respecto a un grupo activante, que proporciona carácter ácido al hidrógeno \alpha del grupo activante y le permite ser eliminado por una base para liberar así el grupo funcional oxidado al que está unido el indicador eTag o ser sometido a oxidación con liberación del indicador eTag. Alternativamente, se pueden usar quelatos de metales que son estables en un estado de oxidación e inestables en otro estado de oxidación. Otros compuestos incluyen metilquinonas sustituidas en \alpha, que tienen un indicador eTag unido por un grupo saliente, tal como sulfonilo, oxi, amino, etc.

Usando un sistema heterogéneo, se puede unir un primer agente para producir la escisión a una superficie para proporcionar un entorno para la liberación del indicador eTag cuando está unido a la superficie. Cuando se requiere un segundo agente para producir la liberación del indicador eTag, el segundo agente se añade después de suficiente tiempo para que el compuesto de unión conjugado con el indicador eTag quede unido a la superficie. Cuando la diana es un ácido nucleico, el ácido nucleico puede unirse a la superficie que contiene el primer agente, teniendo proteínas de unión de ADNss unidas a la superficie, o con otros procedimientos convenientes conocidos en la técnica. Una vez que la diana está unida a la superficie, se añaden los oligonucleótidos conjugados con el indicador eTag homólogos a las secuencias de ácidos nucleicos diana, seguido del segundo agente. Con ligandos y proteínas se pueden tener receptores que se unen en un sitio en la superficie y compuestos que unen el indicador eTag que se une en un sitio diferente formando lo que se denomina en la técnica un "sándwich".

Para el oxígeno singlete se pueden usar diferentes sensibilizadores, tales como derivados de escuarato. Véase, por ejemplo, Ullman, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426-5430 (1994). Se pueden encontrar ejemplos de combinaciones que son útiles en esta invención en las patentes de EE.UU. nº 5.536.498; 5.536.834; referencias citadas en las mismas; H.H. Wasserman y R.W. Murray. Singlet Oxygen. Academic Press, New York (1979); A.L. Baumstark. Singlet Oxygen, Vol. 2. CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1983. Se pueden encontrar otros mecanismos de escisión en los documentos WO99/64519; WO99/13108; WO98/01533 y WO97/28275.

El oxígeno singlete reacciona con una amplia variedad de dobles enlaces, con escisión del doble enlace en un grupo oxo con separación del indicador eTag. Las olefinas ilustrativas incluyen sulfuros de vinilo, éteres vinílicos, enaminas, iminas sustituidas en los átomos de carbono con un \alpha-metino (CH, un átomo de carbono que tiene al menos un átomo de hidrógeno), en las que el grupo vinilo puede estar en un anillo, el heteroátomo puede estar en un anillo, o sustituido en el átomo de carbono olefínico cíclico, y habrá al menos uno y hasta cuatro heteroátomos unidos a los átomos de carbono olefínicos. El dioxetano resultante puede descomponerse espontáneamente, por calentamiento por encima de la temperatura ambiente, normalmente por debajo de aproximadamente 75ºC, reacción con ácido o base, o fotolíticamente en ausencia o presencia de un sensibilizador. Numerosos artículos describen una variedad de compuestos que pueden descomponerse con oxígeno singlete, donde los artículos con frecuencia están interesados en la emisión de luz, de modo que los compuestos tienen estructuras más complicadas que son necesarias para los propósitos en cuestión, donde solo es necesaria la escisión para la liberación del indicador eTag del compuesto de unión. Por lo tanto, para la mayor parte, la conveniencia sintética, estabilidad en las condiciones de la unión al compuesto de unión y las condiciones de la unión, y la eficacia de la liberación, serán los factores principales en la selección de una estructura particular.

Los artículos de interés que son ilustrativos de una bibliografía mucho mayor, incluyen: Adam and Liu, J. Amer. Chem. Soc. 94, 1206-1209, 1972, Ando, y col., J.C.S. Chem. Comm. 1972, 477-8, Ando, y col., Tetrahedron 29, 1507-13, 1973, Ando, y col., J. Amer. Chem. Soc. 96, 6766-8, 1974, Ando and Migita, ibídem 97, 5028-9, 1975, Wasserman and Terao, Tetra. Lett. 21, 1735-38, 1975, Ando and Watanabe, ibídem 47, 4127-30, 1975. Zaklika, y col., Photochemistsry and Photobiology 30, 35-44, 1979, y Adam, y col., Tetra. Lett. 36, 7853-4, 1995. Véase también la patente de EE.UU. nº 5.756.726.

La formación de dioxetanos se obtiene por reacción de oxígeno singlete con una olefina activada sustituida con un indicador eTag en un átomo de carbono y el compuesto de unión en el otro átomo de carbono de la olefina. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.807.675.

Estos compuestos se pueden representar por la siguiente fórmula:

(indicador eTag - W)(X)_{n}C_{\alpha} = C_{\beta}(Y)(Z)

en la que:

W puede ser un enlace, un heteroátomo, p. ej., O, S, N, P, M (que representa un metal que forma un enlace covalente estable), o un grupo funcional, tal como carbonilo, imino, etc., y puede estar unido a X o C_{\alpha};

al menos un X será alifático, aromático, acíclico o heterocíclico y estará unido a C_{\alpha} por un heteroátomo, p. ej., N, O ó S, y el otro X puede ser igual o diferente, y puede ser además hidrógeno, alifático, aromático, alicíclico o heterocíclico, siendo normalmente aromático o heterocíclico aromático en el que un X puede considerarse junto con Y para formar un anillo, normalmente un anillo heterocíclico, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, normalmente cuando son distintos de hidrógeno, y tiene de aproximadamente 1 a 20, normalmente 1 a 12, más normalmente 1 a 8 átomos de carbono, y un X tendrá de 0 a 6, normalmente de 0 a 4 heteroátomos, mientras que el otro X tendrá al menos un heteroátomo y hasta 6 heteroátomos, normalmente 1 a 4 heteroátomos;

Y entrará en la definición de X, y normalmente está unido a C_{\beta} por un heteroátomo y como se ha indicado puede considerarse junto con X para formar un anillo heterocíclico;

Z normalmente será aromático, incluyendo heterocíclico aromático, de aproximadamente 4 a 12, normalmente 4 a 10 átomos de carbono y 0 a 4 heteroátomos, como se ha descrito antes, y está unido directamente a C_{\beta} o por un heteroátomo, como se ha descrito antes;

n es 1 ó 2, dependiendo de si el indicador eTag está unido a C_{\alpha} o a X;

en la que uno de Y y Z tendrá un grupo funcional para unirse al miembro de unión o estar unido al miembro de unión.

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Aunque no se representa en la fórmula, se puede tener una pluralidad de indicadores eTag en una sola molécula, teniendo uno o más indicadores eTag unidos a una o ambas X.

Los compuestos ilustrativos incluyen ácido S-(indicador eTag)-3-tiolacrílico, ácido N-(indicador eTag)-N-metil-4-amino-4-butenoico, O-(indicador eTag)-3-hidroxiacroleína, N-(4-carboxifenil)-2-(indicador eTag)-imidazol, oxazol y tiazol.

También tienen interés los derivados de N-alquil-acridinilo, sustituidos en la posición 9 con un grupo divalente de fórmula:

-(CO)X^{1}(A)-

en la que;

X^{1} es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, N y Se, normalmente uno de los tres primeros; y

A es una cadena de al menos 2 átomos de carbono y normalmente no más de 6 átomos de carbono sustituida con un indicador eTag, en la que preferiblemente las otras valencias de A están satisfechas con hidrógeno, aunque la cadena puede estar sustituida con otros grupos, tales como grupos alquilo, arilo, heterocíclicos, y en general A no tiene más de 10 átomos de carbono.

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También tienen interés los compuestos heterocíclicos tales como diheterociclopentadienos, ilustrados por imidazoles, tiazoles, oxazoles sustituidos, etc., en los que los anillos normalmente estarán sustituidos con al menos un grupo aromático y en algunos casos será necesaria la hidrólisis para liberar el indicador eTag.

También tienen interés los derivados de telurio (Te), en los que el Te está unido a un grupo etileno que tiene un átomo de hidrógeno \beta respecto al átomo de Te, en los que el grupo etileno es parte de un anillo alicíclico o heterocíclico, que puede tener un grupo oxo, preferiblemente condensado con un anillo aromático y la otra valencia del Te está unida al indicador eTag. Los anillos pueden ser cumarina, benzoxazina, tetralina, etc.

La región modificadora de masa, cuando no incluye la región modificadora de carga o el marcador detectable, normalmente será un grupo orgánico neutro, alifático, alicíclico, aromático o heterocíclico, en la que los heteroátomos serán neutros en las condiciones usadas para el protocolo de ensayo. Los heteroátomos pueden ser oxígeno como oxi, no-oxo u oxo-carbonilo, azufre como tio o tiono, halógeno, nitrógeno como amida, nitro o ciano, fósforo como fosfito o triéster fosfato. De forma conveniente, la región puede ser metileno, incluyendo polimetileno, alquilenoxi, incluyendo polialquilenoxi, en particular alquileno de 2-3 átomos de carbono, arilo o arilo sustituido, tal como fenileno, difenileno, cianofenileno, nitrofenileno, tiofenileno, clorofenileno, furanileno, aminoácidos, tales como N-acil-glicinamida y poligicinamida, incluyendo glicinamidas sustituidas, ciclopentileno, bis-fenileno-E, en el que E es carbonilo, oxo, tio, ureido, metileno, isopropileno, y similares; etc. La región modificadora de masa en general tendrá de aproximadamente 1 a 100, más normalmente de 1 a 60 átomos distintos de hidrógeno, y en general tiene al menos un átomo de carbono y hasta 60 átomos de carbono y de aproximadamente 0 a 40 heteroátomos, normalmente aproximadamente de 0 a 30 heteroátomos.

La región modificadora de carga variará dependiendo de los otros grupos presentes y de si se desea reducir el número de cargas no neutralizadas en la molécula o aumentar el número de cargas no neutralizadas. Las cargas en la molécula pueden proceder de otro distinto del grupo modificador de carga, tal como el marcador, se pueden incluir grupos conectores incluidos entre regiones en la región modificadora de carga, la región conectora, y cualquier resto del compuesto de unión que es retenido con el indicador eTag. Para la mayor parte, el indicador eTag tendrá una carga negativa global, aunque en algunos casos puede haber una carga positiva total, en particular si los indicadores eTag positivos y negativos se van a determinar en la misma separación electroforética. Las cargas negativas pueden proporcionarse con fosfato, incluyendo fosfonato, fosfinato, tiofosfato, etc., borato, carboxilato, sulfonato, enolato, fenóxido, etc. Las cargas positivas pueden proporcionarse con aminas y aminas sustituidas, p. ej., amonio, sulfonio, hidrazina, imina, amidina, iones metálicos, en particular como quelatos y metalocenos, etc. La región modificadora de carga puede tener de 1 a 60 átomos distintos de hidrógeno, normalmente de aproximadamente 1 a 30 átomos, en la que habrá al menos un heteroátomo, que puede ser oxígeno, nitrógeno, azufre, boro, fósforo, ion metálico, etc.

Se pueden combinar las funciones modificadora de masa y modificadora de carga en una sola región de una forma conveniente, usando poliaminoácidos, en la que el aspartato y glutamato naturales pueden servir para proporcionar cargas negativas y la lisina, arginina e histidina naturales pueden servir para proporcionar cargas positivas. Sin embargo, puede desearse usar aminoácidos no naturales, tales como aminoácidos sustituidos con ácido sulfónico, fosfónico y borónico. Mediante la elección apropiada junto con las otras regiones, se pueden lograr un gran número de movilidades diferentes. Cuando se usan combinados con regiones modificadoras de masa, el número de indicadores eTag que tienen diferentes movilidades aumenta mucho.

Se pueden usar combinaciones de dioles o diaminas y ácidos dibásicos sustituidos, en los que los sustituyentes están cargados, para formar diésteres y diamidas. Son ilustrativas de dichos oligómeros la combinación de dioles o diamino, tal como ácido 2,3-dihidroxipropiónico, ácido 2,3-dihidroxisuccínico, ácido 2,3-diaminosuccínico, ácido 2,4-dihidroxiglutárico, etc. Los compuestos dioles o diamino pueden estar unidos por ácidos dibásicos, cuyos ácidos dibásicos incluyen los ácidos dibásicos inorgánicos indicados antes, así como ácidos dibásicos tales como ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido tartárico, etc. Alternativamente, se pueden unir los hidroxilos o aminas con grupos alquileno o arileno, dicarbonilos, compuestos dihalogenados activados, etc. Otras combinaciones incluyen ditioles sustituidos, que pueden copolimerizar con dienos, compuestos dihalogenados activados, etc. Por lo tanto, mediante la selección adecuada de diferentes monómeros, se pueden producir oligómeros de orden bajo que después se pueden separar por peso molecular.

La región de detección puede incluir cualquier marcador que pueda ser detectado por espectrofotometría y/o electroquímica. Se encuentra disponible una gran variedad de marcadores para la detección en un dispositivo electroforético. Los agentes fluorescentes usados habitualmente incluyen fluoresceína y derivados de fluoresceína, colorantes lantánidos, rodamina y derivados de rodamina, Cy-5, Cy-3, HEX, TET, escuaratos y colorantes de cianina. Los colorantes pueden estar cargados o no cargados, de modo que aumenten o disminuyan la carga total de la molécula. También son útiles los marcadores electroquímicos, tales como ferroceno y complejos de rutenio.

Por razones económicas y de trabajo, en general es conveniente usar tan pocos láseres para excitación como sea posible. Por lo tanto, será conveniente usar combinaciones de absorbentes/transmisores de energía, con frecuencia un agente fluorescente, y receptores/emisores de energía, normalmente un agente fluorescente, manteniendo el absorbente de energía constante para la excitación donde el intercambio de energía entre las dos entidades permite la variación en la longitud de onda de emisión debido a cambios en el desplazamiento de Stokes. Las combinaciones de colorantes incluyen fluoresceína y HEX, (ex_{488 \ nm}, em_{560 \ nm}) y ftalocianina (ex_{488 \ nm}, em_{690 \ nm}). Se pueden proporcionar diferentes combinaciones de agentes fluorescentes para unir con una proximidad adecuada para la transferencia de energía. Un grupo ribosilo en la región de unión o la región modificadora de masa proporciona un grupo hidroxilo para la unión de un miembro de una pareja de transferencia de energía y dos hidroxilos para la inserción en la cadena, mientras que la desoxirribosa sustituida con dos agentes fluorescentes puede reaccionar con un grupo hidroxilo como una cadena lateral. La unidad particular usada a la cual se unen los miembros de la pareja de transferencia de energía se puede seleccionar para proporcionar modificación de la masa y/o modificación de la carga.

La movilidad del indicador eTag no dependerá solo de la relación masa/carga de acuerdo con la fórmula (M/z)^{2/3}, sino que dependerá también de la estructura. Las entidades en el indicador eTag que son rígidas y alargan la molécula potencian el arrastre y por lo tanto reducen la movilidad. Por lo tanto, mediante el uso de grupos rígidos, tales como heterociclos aromáticos de 5 y 6 miembros, p. ej. tetrahidrofurano, polienos y poliacetilenos, se pueden potenciar las diferencias de movilidad, aunque la relación de masa a carga no sea significativamente diferente.

La síntesis de nucleótidos que comprenden eTag se puede lograr de forma fácil y eficaz por acoplamiento sobre un soporte de fase sólida durante la síntesis de la sonda usando los procedimientos químicos de fosforamidito estándar. Los indicadores eTag se acoplan en el extremo 5' de las sondas después del acoplamiento de un resto nucleósido final, que forma parte del indicador eTag durante el ensayo. Se puede tener un trifosfato de nucleótido unido a uno de los extremos de los bloques estructurales del indicador eTag. En un procedimiento, el indicador eTag se construye secuencialmente a partir de uno o varios bloques estructurales de fosforamidito monoméricos (uno contiene una región detectable, p. ej. colorante), que se eligen para generar indicadores eTag con movilidades electroforéticas únicas basadas en su relación de masa a carga. Por lo tanto, el indicador eTag está compuesto de unidades monoméricas con relaciones carga a masa variables, unidas por conectores fosfato (Figura A). Se ha demostrado la separación de indicadores eTag que difieren en 9 unidades de masa (Tabla 1). Los fosforamiditos nucleosídicos usados para la síntesis del indicador eTag son restos modificados inicialmente o naturales. La fluoresceína ha sido el colorante inicial usado, pero también se pueden usar otros colorantes, tal como

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Figura A. Diseño y síntesis de indicadores eTag en soporte en fase sólida usando el procedimiento químico de acoplamiento de fosforamidito descrito previamente. Algunas de las combinaciones de bloques estructuras de fosforamidito con sus tiempos de elución previstos se presentan en la tabla 2. Como se muestra en la Figura B, los indicadores eTag se sintetizan para generar un espectro continuo de señales, eluyendo una después de otra y no coeluye ninguna de ellas (Figura B)

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Figura B. Separación de indicadores eTag diseñada para tener relaciones carga a masa únicas.

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TABLA 1 Indicadores eTag que se han separado en un LabCard. (Véase la sección experimental para una descripción) (detección: 4,7 cm; 200 V/cm)

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TABLA 2 Tiempos de elución previstos y experimentales (*) de indicadores eTag. C_{3}, C_{6}, C_{9}, C_{18} son espaciadores de fosforamidito disponibles en el comercio de Glen Research, Sterling VA. Las unidades son derivados de N,N-diisopropil-O-cianoetil-fosforamidito, que se indica por "Q". C_{3} es DMT (dimetoxitritil)oxipropil-Q; C_{6} es DMToxihexil-Q; C_{9} es DMToxi(trietilenoxi)-Q; C_{12} es DMToxidodecil-Q; C_{18} es DMToxi(hexaetilenoxi)-Q

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Todos los indicadores eTag anteriores funcionan bien y se pueden separar y eluir fácilmente después de 40 minutos. Para generar indicadores eTag que eluyan más rápido, son necesarios indicadores eTag de bajo peso molecular y carga alta. Varios tipos de monómeros de fosforamidito permiten sintetizar indicadores eTag con carga alta con tiempos de elución más cortos. El uso de dicarboxilato-fosforamiditos (Figura C) permite la adición de 3 cargas negativas por acoplamiento de monómero. Los fosforamiditos polihidroxilados (Figura D) combinados con un reactivo de fosforilación común permiten la síntesis de indicadores eTag muy fosforilados. Las combinaciones de estos reactivos con otros fosforamiditos conectores modificadores de masa permiten la síntesis de indicadores eTag con tiempos de elución más cortos.

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Figura C. Fosforamiditos modificadores de carga (EC o CE es cianoetilo)

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Figura D. Fosforamiditos polihidroxilados modificadores de carga.

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Los conjugados de marcadores anteriormente mencionados con diferentes movilidades electroforéticas permiten una amplificación y detección multiplexada de múltiples dianas, p. ej. ácidos nucleicos diana. Los conjugados de marcadores se unen a oligonucleótidos de una forma similar a la de los marcadores en general, mediante uniones que son enzimáticamente escindibles. Por supuesto, está en el campo de la presente invención preparar cualquier número de conjugados de marcadores para llevar a cabo determinaciones multiplexadas. Por consiguiente, por ejemplo, con 40 a 50 conjugados de marcadores diferentes separados en un solo canal de separación y 96 reacciones de amplificación diferentes con 96 canales de separación en un solo chip microfluido, se pueden detectar de 4000 a 5000 polimorfismos de un solo nucleótido.

Se ha demostrado la separación de indicadores eTag, que difieren en 9 unidades de masa (Tabla 1) como se muestra en la figura 7. El penúltimo acoplamiento durante la síntesis de la sonda se lleva a cabo inicialmente usando fosforamiditos modificados (y no modificados) disponibles en el comercio (Tabla 2). Este resto puede formar enlaces de hidrógeno con su pareja en la cadena diana y se considera un modificador de masa, pero podría ser potencialmente un modificador de carga. El puente fosfato formado durante este acoplamiento es la unión cortada durante un ensayo de 5'-nucleasa. El acoplamiento final se hace usando un análogo de fosforamidito de un colorante. Se usa la fluoresceína de forma conveniente, pero también se pueden usar otros colorantes.

En el esquema 1 se resume un procedimiento sintético. Partiendo de la 6-carboxifluoresceína disponible en el comercio, se protegen los grupos hidroxilo fenólicos usando un anhídrido. Se usó anhídrido isobutírico en piridina, pero otras variantes son igualmente adecuadas. Es importante indicar la importancia de seleccionar un grupo funcional éster como el grupo protector. Esta especie permanece intacta durante la síntesis del monómero de fosforamidito así como durante la construcción del oligonucleótido. Estos grupos no se eliminan hasta que el oligómero sintetizado se desprotege usando amoniaco. Después de la protección, el material bruto se activa entonces in situ por formación de un éster de N-hidroxi-succinimida (NHS-éster) usando DCC como agente de acoplamiento. El subproducto DCU se separa por filtración y se añade un aminoalcohol. Hay muchos aminoalcoholes disponibles en el comercio, algunos de los cuales derivan de la reducción de aminoácidos. Sólo la amina es suficientemente reactiva para desplazar la N-hidroxisuccinimida.

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Esquema 1

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Tras tratamiento de extracción estándar se obtiene un 95% de rendimiento del producto. Este material se fosfitila para generar un monómero de fosforamidito (Esquema 1). Para la síntesis de indicadores eTag adicionales se usa un conector bisaminoalcohol simétrico como aminoalcohol (Esquema 2). De esta forma, la segunda amina se acopla después con una multitud de derivados de ácidos carboxílicos (Tabla 1) antes de la reacción de fosfitilación. Usando esta metodología se pueden acoplar fácilmente cientos incluso miles de indicadores eTag con diferentes relaciones de carga a masa durante la síntesis en un sintetizador de ADN usando procedimientos químicos estándar.

Esquema 2

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Se accede a los indicadores eTag adicionales por una estrategia alternativa que usa la 5-aminofluoresceína como material de partida (Esquema 3). La adición de la 5-aminofluoresceína en un gran exceso respecto al dicloruro de diácido, en un volumen grande de disolvente, permite la formación predominante del producto monoacilado frente a la formación del dímero. Los grupos fenólicos no son reactivos en estas condiciones. El tratamiento acuoso convierte el cloruro de ácido terminal en un ácido carboxílico. Este producto es análogo a la 6-carboxi-fluoresceína y usando la misma serie de etapas se convierte en su monómero de fosforamidito protegido (Esquema 3). En el comercio hay disponibles muchos dicloruros de diácidos y diácidos que se pueden convertir en cloruros de diácido usando SOCl_{2} o cloruro de acetilo. Esta metodología es muy atractiva en cuanto que se usa un segundo modificador de masa. De este modo, si se tiene acceso a 10 fosforamiditos modificados comerciales y 10 dicloruros de diácidos y 10 aminoalcoholes, hay un potencial de 1000 indicadores eTag diferentes. Hay muchos dicloruros de diácidos y aminoalcoholes comerciales (Tabla 3). Estos procedimientos sintéticos son perfectamente adecuados para la química combinatoria.

TABLA 3 Modificadores de masa y carga que se pueden usar para la conversión de colorantes amino en monómeros de fosforamidito indicadores eTag

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Esquema 3

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Los grupos arilo sustituidos pueden servir como regiones modificadoras tanto de masa como de carga (Tabla 4). Puede haber diferentes grupos funcionales sustituyentes en el grupo aromático, p. ej. fenilo, para proporcionar la masa así como las cargas al indicador eTag. El grupo arilo puede ser un grupo terminal, en el que sólo es necesario un grupo funcional conector, de modo que un grupo hidroxilo libre puede acilarse, puede unirse como cadena lateral a un hidroxilo presente en la cadena del indicador eTag, o puede tener dos grupos funcionales, p. ej. hidroxilos fenólicos, que pueden servir para la formación del éster de fosfito y otros sustituyentes, tales como halógeno, halógenoalquilo, nitro, ciano, alcoxicarbonilo, alquiltio, etc., en el que los grupos pueden estar cargados o no cargados.

TABLA 4 Derivados de ácido benzoico como modificadores de masa y carga. (La masa está escrita debajo de cada modificador)

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También se ha sintetizado una variedad de indicadores eTag derivatizados con maleimida. Estos compuestos posteriormente se bioconjugaron con secuencias de ADN con 5'-tiol y se sometieron al ensayo de 5'-nucleasa. Las especies formadas tras la escisión se representan en la Tabla 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Indicadores eTag derivados de precursores unidos a malimida

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El indicador eTag se puede acoplar al tener un grupo funcional adecuado en un extremo para la unión con el compuesto de unión. Así pues, para oligonucleótidos se tendría un fosforamidito o éster fosfato en el sitio de unión para enlazar con una cadena de oligonucleótido, 5' ó 3', en particular después de haber sintetizado el oligonucleótido, mientras todavía está en el soporte sólido y antes de haber eliminado los grupos bloqueadores. Aunque existen otras técnicas para la unión del oligonucleótido al indicador eTag, tales como tener un grupo funcional en el extremo del oligonucleótido que reaccione específicamente con un grupo funcional en el indicador eTag, tal como maleimida y tiol, o amino y carboxi, o amino y ceto en condiciones de aminación reductora, se prefiere la adición de fosforamidito. Para un compuesto de unión a péptido, se puede usar una variedad de grupos funcionales, al igual que con el grupo funcional del oligonucleótido, ya que el procedimiento químico del fosforamidito puede ser adecuado sólo ocasionalmente. Por lo tanto, los grupos funcionales presentes normalmente en un péptido, tales como carboxi, amino, hidroxi y tiol pueden ser las dianas de un grupo funcional reactivo para formar un enlace covalente.

Tiene un interés particular en la preparación de los compuestos de unión de ácido nucleico marcado con indicador eTag el uso del procedimiento químico del fosforamidito en soporte sólido para construir el indicador eTag como parte de la síntesis del oligonucleótido. Al usar este procedimiento, se une el siguiente fosfato sucesivo en la posición 5' ó 3', normalmente la posición 5' de la cadena de oligonucleótido. El fosforamidito añadido puede tener un nucleótido natural o nucleótido no natural. En lugar de la química del fosforamidito, se pueden usar otros tipos de conectores, tales como análogos tio, análogos aminoácidos, etc. También se pueden usar nucleótidos sustituidos, en los que la región modificadora de masa y/o la región modificadora de carga pueden estar unidas al nucleótido, o un ligando puede estar unido al nucleótido. De esta forma, se añaden las uniones fosforamidito que comprenden las regiones del indicador eTag, de modo que cuando se ha completado la síntesis de la cadena de oligonucleótido, se continúa la adición de las regiones del indicador eTag para completar la molécula. De forma conveniente, se podría proporcionar cada uno de los bloques estructurales de las diferentes regiones con un fosforamidito o éster fosfato en un extremo y un grupo funcional bloqueado, en el que el grupo funcional libre puede reaccionar con un fosforamidito, principalmente un hidroxilo. Usando moléculas para las diferentes regiones que tienen un fosforamidito en un lado y un hidroxilo protegido en el otro lado, se puede construir el indicador eTag hasta la región terminal, que no requiere el hidroxilo protegido.

Sería ilustrativo de la síntesis el empleo de un diol, tal como un alquilendiol, polialquilendiol, con alquileno de 2 a 3 átomos de carbono, alquilenamina o polialquilenamina, en los que los alquilenos tienen de 2 a 3 átomos de carbonos y los nitrógenos están sustituidos, por ejemplo con grupos bloqueadores o grupos alquilo de 1-6 átomos de carbono, en los que un diol está bloqueado con un grupo protector convencional, tal como un grupo dimetiltritilo. Este grupo puede servir como la región modificadora de masa y con los grupos amino también como región modificadora de carga. Si se desea, el modificador de masa se puede acoplar usando bloques estructurales que se unen por el procedimiento químico del fosforamidito. De esta forma el modificador de carga se puede intercalar entre el modificador de masa. Por ejemplo, se podría preparar una serie de moléculas de poli(óxido de etileno) que tengan 1, 2, 3, n unidades. Cuando se desea introducir una serie de cargas negativas, se podría usar una unidad de poli(óxido de etileno) pequeña y construir la región modificadora de masa y carga con una pluralidad de unidades de poli(óxido de etileno) unidas por unidades fosfato. Alternativamente, usando un espaciador grande, habrá menos grupos fosfato presentes, por lo tanto sin diferencias de masa grandes, y se tendrán diferencias grandes en las relaciones de masa a carga.

La química usada es la química convencional usada en la síntesis de oligonucleótidos, en la que se usan bloques estructurales distintos de nucleótidos, pero la reacción es el procedimiento químico del fosforamidito convencional y el grupo de bloqueo es el grupo dimetoxiltritilo convencional. Por supuesto, también se pueden usar otros procedimientos químicos compatibles con sintetizadores automáticos, pero no hay razón para añadir una complejidad adicional al procedimiento.

Para los péptidos, los indicadores eTag se unirán de acuerdo con la química del grupo de unión y la disponibilidad de grupos funcionales en el compuesto de unión peptídico. Por ejemplo, con fragmentos Fab específicos para un compuesto diana, habrá un grupo tiol disponible para usar una olefina activa, p. ej., maleimida, para la formación de tioéter. Cuando hay lisinas disponibles, se pueden usar ésteres activados capaces de reaccionar en agua, tales como ésteres de nitrofenilo o ésteres de pentafluorofenilo, o anhídridos mixtos como con carbodiimida y semiéster de ácido carbónico. En la bibliografía hay muchos procedimientos químicos para la conjugación, de modo que para cada situación específica hay precedentes amplios en la bibliografía para la conjugación.

Una vez que se ha preparado el compuesto de unión conjugado con el indicador eTag, puede ser útil en una serie de ensayos diferentes, muchos de los cuales ya se han discutido. Las muestras pueden procesarse usando disolución mediante lisinas, separación de ácidos nucleicos de proteínas y lípidos y viceversa, y enriquecimiento de diferentes fracciones. Para las determinaciones relacionadas con ácidos nucleicos, la fuente de ADN puede ser cualquier organismo, células procariotas o eucariotas, tejido, muestras medioambientales, etc. El ADN o ARN pueden aislarse por medios convencionales, se puede hacer la transcripción inversa del ARN, se puede amplificar el ADN, tal como por PCR, se pueden usar cebadores con ligandos para usar en el posterior procesamiento, el ADN puede fragmentarse usando enzimas de restricción, se pueden concentrar secuencias específicas o eliminar usando secuencias homólogas unidas a un soporte, o similares. Las proteínas se pueden aislar usando precipitación, extracción y cromatografía. Las proteínas pueden estar presentes como proteínas individuales o combinadas en diferentes agregados, tales como orgánulos, células, virus etc. Una vez que se han tratado preliminarmente los componentes diana, después la muestra se puede combinar con las proteínas de unión marcadas con el indicador eTag.

Para una muestra de ácido nucleico, después del procesamiento, la mezcla de la sonda de indicadores eTag para las secuencias diana se combinará con la muestra en condiciones de hibridación, junto con otros reactivos, según sea necesario. Cuando la reacción es heterogénea, la secuencia diana tendrá un ligando para la unión a un miembro de unión recíproco para separar híbridos a los que se ha unido el indicador eTag. En este caso, se separará toda muestra de ADN que lleve el ligando, tanto con como sin la sonda marcada con el indicador eTag. Después de separar la muestra y eliminar la sonda marcada con indicador eTag de unión no específica en unas condiciones restrictivas predeterminadas basadas en la secuencia de la sonda, usando lavado a una temperatura elevada, concentración de sal, disolvente orgánico, etc., el indicador eTag es liberado en la solución de tampón electroforético para el análisis.

Para un ensayo homogéneo, se combinan la mezcla de la sonda marcada con indicador eTag y reactivos auxiliares en una mezcla de reacción que soporta la escisión de la región de conexión. La mezcla puede procesarse para separar los indicadores eTag de los otros componentes de la mezcla. La mezcla, con o sin enriquecimiento del indicador eTag, después puede transferirse a un dispositivo electroforético, normalmente un dispositivo de electroforesis capilar o microfluida y modificarse el medio según sea necesario para la separación electroforética. Cuando se desea eliminar del canal de separación las moléculas de indicador eTag intactas, se une un ligando al indicador eTag que no es liberado cuando se libera el indicador eTag. Alternativamente, por adición de un miembro de unión recíproco que tiene la carga opuesta al indicador eTag, de modo que la carga global es la opuesta a la carga del indicador eTag, estas moléculas migrarán hacia el electrodo opuesto del de las moléculas de indicador eTag liberadas. Por ejemplo, se podría usar biotina y estreptavidina, donde la estreptavidina lleva una carga positiva. En el caso de un oligonucleótido, el marcador indicador eTag se uniría a al menos dos nucleótidos, y la escisión se produce entre los dos nucleótidos con liberación del indicador eTag, con el nucleótido terminal del dinucleótido marcado con una biotina (el indicador eTag sería liberado sin el nucleótido biotinilado). En el caso de un analito peptídico, se podría tener la escisión en un sitio en el que el ligando permanece con el analito peptídico. Por ejemplo, se podría tener el indicador eTag sustituido en el grupo metilo de metionina. Usando la pirazolona de la metionina modificada, se podría unir a una lisina disponible. El grupo amino de la pirazolona se sustituiría con biotina. Después la escisión se lograría con bromuro de cianógeno, liberando el indicador eTag, pero la biotina permanecería con el péptido y cualquier indicador eTag que no se liberara del miembro de unión. Se usa entonces la avidina para cambiar la polaridad o separar el indicador eTag conjugado con el compuesto de unión.

La separación de los indicadores eTag por electroforesis se puede llevar a cabo de forma convencional. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.750.015; 5.866.345; 5.935.401; 6.103.199 y 6.110.343 y WO98/5269, y las referencias citadas en las mismas. La muestra también se puede preparar para la espectrometría de masas de forma convencional. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.965.363; 6.043.031; 6.057.543 y 6.111.251.

Por conveniencia, pueden proporcionarse kits que comprendan bloques estructurales para preparar indicadores eTag in situ o que tengan acoplados indicadores eTag para la unión directa del compuesto de unión. Para preparar el indicador eTag in situ durante la síntesis de oligonucleótidos, se proporcionarían fosforamiditos o fosfatos, en los que los ésteres incluirían grupos alquilo, en particular de 1 a 3 átomos de carbono y grupos cianoetilo, mientras que para el fosforamidito, dialquilamino, en el que los grupos alquilo tienen 1-4 átomos de carbono, mientras que el otro grupo sería un hidroxi protegido, en el que el grupo protector sería común en la síntesis de oligonucleótidos, p. ej., dimetoxitritilo. Para un gran número de indicadores eTag, es decir, 20 o más, un kit suministraría al menos 3 de cada una de las regiones modificadoras de masa y regiones modificadoras de carga, cada una con al menos el grupo de conexión fosfato y un hidroxilo protegido. Los dos grupos funcionales pueden estar separados por 2 o más átomos, normalmente no más de aproximadamente 60 átomos, y pueden ser vecinales (\alpha,\beta a \alpha,\omega). La naturaleza de los compuestos se ha discutido previamente. En el caso más sencillo, el derivado de ácido fosforoso serviría como región modificadora de carga, de modo que la región modificadora de masa y la región modificadora de carga se añadirían como un solo grupo. Además, se podrían tener al menos 2 regiones detectables, que serían un agente fluorescente que tiene el conector fosfato y otros grupos funcionales protegidos para los propósitos de la síntesis. Alternativamente, en lugar de tener la región de detección la región terminal, donde la región detectable permite la presencia de dos grupos funcionales que se pueden usar para la unión, una de las otras regiones puede servir como la región terminal. Además, una de las regiones puede unirse de forma conveniente a un mono o dinucleótido para la unión directa a la cadena de oligonucleótido, en la que la escisión se produce en la posición 3' del nucleótido unido al indicador eTag. Usando grupos tri o tetrasustituidos se puede proporcionar una región detectable que proporciona la pareja para la transferencia de energía. Sólo es necesario tener uno o dos agentes de transferencia de energía, mientras que se tiene una pluralidad de agentes de emisión para expandir mucho el número de indicadores eTag diferentes.

Otros reactivos que son útiles incluyen un nucleótido modificado con ligando y su receptor. Los ligandos y receptores incluyen biotina y estrept./avidina, ligando y antiligando, p. ej., digoxina o un derivado de la misma y antidigoxina, etc. Al tener un ligando conjugado con el oligonucleótido, se puede aislar la sonda de oligonucleótido conjugado con eTag y su diana con el receptor, separar el oligonucleótido conjugado con indicador eTag sin hibridar, y después liberar los indicadores eTag unidos o unir un receptor de carga opuesta, de modo que el complejo de ligando-receptor con el indicador eTag migra en la dirección opuesta.

Cuando se prepara el indicador eTag habrá la región de unión adicional, que en la descripción anterior viene dada por el derivado de ácido fosforoso o la unidad de mono o dinucleótido derivado de ácido fosforoso. Para estos indicadores eTag, no es necesario restringirse a las uniones fosfato, sino que se pueden usar otros procedimientos químicos convenientes, en particular procedimientos químicos que sean automáticos. Por lo tanto, en lugar de ácido fosforoso y alcohol protegido, se puede usar carboxi y alcohol o amino, olefina activada y tiol, amino y oxo-carbonilo, en particular con aminación reductora, un hidroxi con un haluro activo u otro hidroxi para formar un éter y similares. Se pueden usar compuestos que son difuncionales con los mismos o diferentes grupos funcionales, en los que se podría tener un diácido y un diol o un hidroxiácido o éster cíclico para producir el indicador eTag. Ya se han descrito muchos ejemplos de estos tipos de compuestos y son bien conocidos en la bibliografía. Mediante la selección adecuada de los monómeros y las condiciones se puede seleccionar un orden de reacción particular, es decir el número de monómeros que reaccionan, o se puede separar la mezcla por las diferentes movilidades.

Para las separaciones basadas en sorción, adsorción y/o absorción, la naturaleza de los indicadores eTag para proporcionar la diferenciación puede ser relativamente sencilla. Usando diferencias de composición, tales como compuestos alifáticos, compuestos aromáticos y derivados halogenados de los mismos, se pueden hacer las determinaciones por cromatografía de gases, con captura de electrones o espectrometría de masas de iones negativos, cuando hay presentes átomos electronegativos. De esta forma se pueden usar hidrocarburos o hidrocarburos sustituidos con halógeno como los indicadores eTag unidos a un conector que se puede liberar. Véanse las patentes de EE.UU. nº 5.565.324 y 6.001.579, que se incorporan específicamente por referencia en lo que se refiere a la descripción relevante de grupos escindibles y grupos detectables.

Los kits incluirán al menos dos regiones detectables y suficientes reactivos para tener al menos 10, normalmente al menos 20 y con frecuencia al menos 50 o más indicadores eTag diferentes que se pueden separar por su movilidad.

Para 20 indicadores eTag diferentes, sólo se requieren 5 regiones modificadoras de masa diferentes, una conexión fosfato y cuatro regiones detectables diferentes. Para 120 indicadores eTag, sólo se necesita tener 10 regiones modificadoras de masa diferentes, 3 regiones modificadoras de carga diferentes y 4 regiones detectables diferentes. Para 500 indicadores eTag diferentes, sólo se necesita tener 25 regiones modificadoras de masa diferentes, 5 regiones modificadoras de carga diferentes y 4 regiones detectables diferentes.

Se proporciona la siguiente tabla para una lista inclusiva pero no exclusiva de las diferentes formas en las que se puede usar el objeto de la invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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El suceso de reconocimiento conduce a la generación o modificación de los indicadores eTag

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Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no como limitación.

Parte experimental Preparación sintética de fluoresceína-fosforamiditos modificadas

Carboxifluoresceína protegida con pivaloilo: En un matraz de fondo redondo de 50 ml se puso 5(6)-carboxifluoresceína (0,94 g, 2,5 mmol), carbonato potásico (1,0 g, 7,5 mmol) y 20 ml de DMF seca. La reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 10 min, después de lo cual se añadió mediante jeringuilla anhídrido trimetilacético (1,1 ml, 5,5 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente, y después se filtró para separar el carbonato potásico en exceso y finalmente se vertió en 50 ml de HCl al 10%. Precipitó de la solución un sólido amarillo pegajoso. La solución acuosa se decantó y el sólido residual se disolvió en 10 ml de metanol. La adición gota a gota a esta solución de HCl al 10% dio un fino precipitado amarillo, que se filtró y se secó al aire para dar un sólido blanquecino (0,88 g, 62%). TLC (Hxn, EtOAc, MeOH 45:45:10).

Éster de NHS de pivaloil-carboxifluoresceína. En un matraz de fondo redondo de 200 ml se puso la carboxifluoresceína protegida (2,77 g, 5,1 mmol) y 50 ml de diclorometano. Se añadieron N-hidroxisuccinimida (0,88 g, 7,6 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (1,57 g, 7,6 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después la reacción se filtró para separar el subproducto de diciclohexilurea precipitado y se redujo a aproximadamente 10 ml de disolvente a vacío. La adición gota a gota de hexanos con enfriamiento produjo un sólido coloreado amarillo-naranja, que se trituró con hexanos, se filtró y se secó al aire para dar 3,17 g (95%) de producto. TLC (Hxn, EtOAc, MeOH 45:45:10).

Alcohol. En un matraz de fondo redondo de 100 ml se pusieron el éster de NHS (0,86 g, 1,34 mmol) y 25 ml de diclorometano. La solución se agitó en atmósfera de nitrógeno después de lo cual se añadió con jeringuilla aminoetanol (81 \mul, 1 eq). La reacción se controló por TLC (Hxn,EtOAc,MeOH 45:45:10) y se encontró que se había completado después de 10 min. Después, el diclorometano se separó a vacío y el residuo se disolvió en EtOAc, se filtró y se absorbió sobre 1 g de gel de sílice. Esta se puso en capas sobre una columna de 50 g de sílice y se eluyó con Hxn:EtOAc:MeOH (9:9:1) para dar 125 mg (20%) de producto limpio.

Fosforamidito. En un matraz de fondo redondo de 10 ml que contenía 125 mg del alcohol se añadieron 5 ml de diclorometano. Se añadió mediante jeringuilla diisopropiletilamina (139 \mul, 0,8 mmol). La solución incolora se volvió amarillo brillante. Se añadió mediante jeringuilla 2-cianoetil-diisopropilclorofosforamidito (81 \mul, 0,34 mmol) y la solución se volvió incolora inmediatamente. Después de 1 h la TLC (Hxn:EtOAc:TEA 45:45:10) mostró que la reacción se había completado con la formación de dos isómeros que eluían próximos. El material se purificó en una columna de sílice (Hxn:EtOAc:TEA 45:45:10) aislando ambos isómeros juntos y dando 130 mg (85%).

Ácido carboxílico. En un vial de 4 ml se puso ácido 12-aminododecanoico (0,1 g, 0,5 mmol) y 2 ml de piridina. A esta suspensión se añadió mediante jeringuilla clorotrimetilsilano (69 \mul, 1,1 eq). Después de disolverse todo el material (10 min) se añadió éster de NHS (210 mg, 0,66 eq). La reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche y después se vertió en agua para precipitar un sólido amarillo, el cual se filtró, se lavó con agua y se secó al aire. La TLC (Hxn:EtOAc:MeOH 45:45:10) muestra una mezcla de dos isómeros.

Procedimiento general para el resto de las síntesis. El ácido carboxílico formado descrito antes se activa por formación del éster de NHS con 1,5 eq. de cada uno de N-hidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida en diclorometano. Después de filtrar la diciclohexilurea resultante, el tratamiento con 1 eq. de diferentes aminoalcoholes dará lugar a la formación del enlace amida y como resultado un alcohol terminal. La fosfitilación usando las condiciones estándar descritas antes proporcionará el fosforamidito.

Síntesis de fluoresceína-fosforamiditos

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Síntesis de 2'-desoxicitosina-fosforamidito biotinilado

Esquema 1

Síntesis de 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-2'-desoxiuridina (1)

Se disolvieron 2'-desoxiuridina (4 g, 17,5 mmol) e imidazol (3,47 g, 52,5 mmol) en 30 ml de DMF seca y se añadió cloruro de t-butildimetil-sililo (7,87 g, 52,5 mmol) a la solución con agitación a temperatura ambiente. Después de 3 h, la TLC en gel de sílice (MeOH 10% + CH_{2}Cl_{2} 90%) mostró que todo el material de partida se había convertido en un nuevo compuesto con mayor R_{f}. La solución se concentró hasta un volumen pequeño, y después se añadieron aproximadamente 200 ml de éter y se lavó tres veces con solución acuosa saturada de NaCl. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, y el filtrado se evaporó para dar un material gomoso incoloro que se convirtió en un producto sólido blanco (8 g, 100%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-N^{4}-(1,2,4-triazolo)-2'-desoxicitidina (2)

Se suspendió 1,2,4-triazol (19,45 g, 282 mmol) en 300 ml de CH_{3}CN anhidro a 0ºC, se añadieron lentamente en 5 min 8 ml de POCl_{3}, y después 50 ml de trietilamina. Después de una hora, se disolvió 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-2'-desoxiuridina (1) (9 g, 19,7 mmol) en 200 ml de CH_{3}CN seco y se añadió a la reacción a lo largo de 20 min. Después de agitar la reacción durante 16 horas a T.a., la TLC (éter al 100%) mostró que todo el material de partida se había convertido en un compuesto nuevo con R_{f} inferior. La mezcla de reacción se filtró, se redujo el volumen de CH_{3}CN, se diluyó con acetato de etilo y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, y después dos veces con solución acuosa saturada de NaCl. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y el disolvente se evaporó, se coevaporó con tolueno para dar un producto sólido amarillo (10 g, 100%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-N^{4}-(4,7,10-trioxa-1-tridecanamino)-2'-desoxicitidina (3)

Se disolvió 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (10,44 g, 47,4 mmol) en 100 ml de dioxano, después se disolvió 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-4-(1,2,4-triazolo)-2'-desoxicitidina (2) (8,03 g, 15,8 mmol) en 200 ml de dioxano (calentado a aproximadamente 50ºC y vuelto a enfriar a T.a.) y se añadió gota a gota en 10 min a la solución de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina con agitación vigorosa a T.a. Después de 5 h, la TLC en gel de sílice mostró que todo el material de partida se había convertido en un producto nuevo con R_{f} inferior, y la mezcla resultante se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano y se lavó dos veces con solución de bicarbonato sódico al 5% y solución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a sequedad para dar un producto gomoso amarillo (7,87 g). El producto se purificó en una columna de gel de sílice eluída con un gradiente de metanol en diclorometano de 0 a 10% con trietilamina al 1%. El producto se obtuvo en forma de una goma amarillenta (5,66 g, 54%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (4)

Se disolvieron 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanamino)-2'-desoxicitidina (3) (2,657 g, 4,43 mmol) y Biotina-éster de NHS (1,814 g, 5,316 mmol) en 20 ml de DMF seca y se añadió aproximadamente 1 ml de trietilamina. Después de agitar la mezcla de reacción durante 4 h a T.a., la reacción se paró por evaporación de toda la DMF para dar un material gomoso amarillo (4,36 g). Este material se disolvió en diclorometano y se lavó tres veces con solución saturada de NaCl, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. La TLC en gel de sílice (MeOH 5% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 94%) indicó la formación de un nuevo producto que tenía R_{f} mayor. Este producto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice usando (CH_{2}Cl_{2} 99% + TEA 1%) a (MeOH 1% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 98%) para dar un producto espumoso amarillo (2,13 g, 60%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de 4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (5)

Se disolvió 3',5'-O-di-t-butildimetilsilil-4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (4) (1,6 g, 1,8 mmol) en 50 ml de THF seco, después se añadieron aproximadamente 5,5 ml de fluoruro de tetrabutilamonio en THF en 2 min, mientras se agitaba a T.a. Después de 3 h, la TLC en gel de sílice (MeOH 10% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 89%) mostró que se había formado un nuevo producto con R_{f} inferior. El disolvente se evaporó para dar un producto aceitoso amarillo. La cromatografía en gel de sílice eluida con (CH_{2}Cl_{2} 99% + TEA 1%) a (MeOH 7% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 92%) permitió la purificación del producto en forma de un producto gomoso incoloro (1,14 g, 97%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

t-Butilbenzoilación de la biotina de la 4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (6)

Se disolvió 4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (5) (14,14 g, 21,5 mmol) en 100 ml de piridina seca. Se añadió clorotrimetilsilano (11,62 g, 107,6 mmol) y la mezcla se agitó durante otras 2 h a t.a. Se añadió cloruro de 4-t-butilbenzoilo (5,07 g, 25,8 mmol) y la mezcla se agitó durante otras 2 h a T.a. La mezcla de reacción se enfrió con un baño de hielo y la reacción se paró por adición de 50 ml de agua y 50 ml de solución acuosa de amoniaco al 28%. La solución se mantuvo con agitación a T.a. durante 20 min, después se evaporó a sequedad con alto vacío y finalmente se evaporó dos veces con tolueno. El material se disolvió en diclorometano y se extrajo dos veces con solución acuosa de bicarbonato sódico al 5%. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se evaporó a sequedad, se volvió a disolver en diclorometano y se aplicó a una columna de gel de sílice. La columna se eluyó con gradiente de metanol en diclorometano de 0 a 10%, y se obtuvo un producto en forma de una espuma blanca (9,4 g, 53,5%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de 5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (7)

El compuesto (6) (10,82 g, 13,3 mmol) se coevaporó dos veces con piridina seca, después se disolvió en piridina (100 ml) y se añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (DMT-Cl) (6,76 g, 19,95 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 3 h. La TLC (MeOH 10% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 89%) mostró la formación de un producto nuevo con R_{f} superior, y algo de producto de partida que quedaba sin reaccionar, después se añadió otra cantidad de DMTCl (2 g) y se mantuvo con agitación durante 2 h. La reacción se paró por adición de etanol y la mezcla se agitó durante 15 min. Después de evaporar a sequedad y evaporar conjuntamente con tolueno, el material se disolvió en diclorometano. La fase orgánica se lavó dos veces con solución acuosa de bicarbonato sódico al 5%, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. El producto se purificó en una columna de sílice usando un gradiente de metanol en diclorometano/TEA al 1% de 0 a 5%. El producto se obtuvo en forma de una espuma blanca (4,55 g, 31%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de 3'-O-[(diisopropilamina)(2-cianoetoxi)fosfino)]-5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-4-N-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-2'-desoxicitidina (8)

Se disolvió 5'-DMT-Biotin-dC (7) (507 mg, 0,453 mmol) en acetonitrilo seco (30 ml) y diclorometano (5 ml), y después se añadieron diisopropilamina (73 mg, 0,56 mmol), tetrazol (1,15 ml, 0,52 mmol) y 2-cianoetil-N,N,N'N'-tetraisopropilfosfano 214 mg, 234 \mul, 0,7 mmol) y la mezcla se agitó en atmósfera de nitrógeno a T.a. Después de 2 h, la TLC en gel de sílice (acetato de etilo/diclorometano/trietilamina/metanol: 45%/45%/5%/5%) mostró que se había formado sólo aproximadamente 30% de producto y había aproximadamente 70% de material de partida sin reaccionar. Se añadieron más reactivos hasta que la mayor parte del material de partida se había convertido, quedando sólo aproximadamente 5% sin reaccionar. El disolvente se evaporó a sequedad, se disolvió en diclorometano seco, se lavó con solución de bicarbonato sódico (5%), solución de salmuera saturada, y después la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna en gel de sílice usando de (acetato de etilo/diclorometano/trietilamina: 48%/48%/4%:) a (acetato de etilo/diclorometano/trietilamina/metanol: 47%/47%/5%/1%). El producto deseado se obtuvo en forma de un producto gomoso incoloro (406 mg, 70%). Este material se coevaporó tres veces con una mezcla de benceno seco y diclorometano, después se mantuvo en un desecador que contenía P_{2}O_{5} y perlas de NaOH a vacío durante 26 h antes de usarlo en la síntesis de ADN.

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Síntesis de 2'-desoxiadenosina-fosforamidito biotinilado

Esquema 2

Síntesis de 8-Bromo-2'-desoxiadenosina

Se disolvió 2'-desoxiadenosina (7 g, 25,9 mmol) en tampón de acetato sódico (150, 1 M, pH 5,0) calentándolo a aproximadamente 50ºC, después se enfrió a 30ºC, y después se añadieron gota a gota a la reacción 3 ml de bromo en 100 ml del mismo tampón a T.a., durante 15 min. Después de 6 h la TLC en gel de sílice (MeOH en CH_{2}Cl_{2} al 20%) mostró que todo el material de partida se había convertido en un nuevo producto. La reacción se decoloró por adición de algo de metabisulfito sódico (Na_{2}S_{2}O_{5}) mientras se agitaba, el color cambió a una solución blanca, el pH de la reacción se neutralizó por adición de NaOH (solución 1 M). La mezcla de reacción se mantuvo a 4ºC (frigorífico) durante 16 h. Al día siguiente se filtró el material sólido, se lavó con agua fría y después acetona para dar un producto sólido en polvo amarillo (5,75 g, 64%). La estructura de este producto se confirmó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de N^{6}-benzoil-8-bromo-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (1)

Se secó la 8-bromo-2'-desoxiadenosina (7,7 g, 22,17 mmol) por evaporación conjunta con piridina seca y el sólido se suspendió en 200 ml de piridina seca seguido de la adición de cloruro de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo (DMT-Cl) (9 g, 26,6 mmol). Después de agitar durante 4 h a T.a., la TLC en gel de sílice mostró que se había formado un producto nuevo y había algo de material de partida sin reaccionar. Se añadió otra cantidad de DMT-Cl (3 g) y se agitó a T.a. durante 2 h. Cuando la TLC mostró que todo el material de partida se había convertido en un producto nuevo con R_{f} superior, la mezcla de reacción se enfrió a 0ºC y se añadió gota a gota trimetilclorosilano (12,042 g, 14 ml, 110,85 mmol) mientras se enfriaba y después de 40 min, mientras se agitaba se añadió de forma similar cloruro de benzoilo (15,58 g, 12,88 ml, 110,85 mmol). La reacción se dejó reaccionar a T.a. durante 2 h. La reacción se inactivó por adición lenta de agua fría (50 ml), seguido de la adición de amoniaco concentrado (30%, 50 ml). Después de 30 min, la mezcla de reacción se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en agua y la solución se extrajo con acetato de etilo tres veces, la fase orgánica se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico y después salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. El producto se purificó por cromatografía en columna de sílice, para dar un producto sólido amarillento (6,79 g, 41,6%). La estructura de este producto se confirmó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de N^{6}-benzoil-8-bromo-3'-O-t-butildimetilsilil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina

Se disolvieron 6N-benzoil-8-bromo-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (1) (14 g, 19 mmol) e imidazol (1,94 g, 28,5 mmol) en 100 ml de DMF seca y se añadió cloruro de t-butildimetil-sililo (4,3 g, 28,5 mmol) a la solución agitada a temperatura ambiente. Después de 4 h, la TLC en gel de sílice (MeOH en CH_{2}Cl_{2} al 2,5%) mostró que todo el material de partida se había convertido en un producto nuevo con R_{f} superior. La solución se concentró en un volumen pequeño, después se añadieron aproximadamente 400 ml de éter y se lavó tres veces con solución acuosa saturada de NaCl. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y el filtrado se evaporó para dar un producto espumoso blanquecino (16,18 g, 100%). Por H-RMN y EM-ES se confirmó la estructura.

Síntesis de N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanamino)-3'-O-t-butidimetilsilil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (2)

Se disolvió N^{6}-benzoil-8-bromo-3'-O-t-butildimetilsilil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (8,31 g, 9,7 mmol) en 200 ml de etanol y después se añadió 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (6,75 g, 6,7 ml, 30 mmol) en una vez y se mantuvo con agitación a 50ºC. Después de 16 h la TLC mostró que todo el material de partida se había convertido en un producto mayoritario con R_{f} inferior y otros productos minoritarios. El disolvente se evaporó a sequedad, se disolvió en diclorometano, se lavó tres veces con solución de salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporó para dar un material gomoso amarillo. La cromatografía en columna de (TEA 1% + CH_{2}Cl_{2}) a (TEA 1%+ MeOH 5%+ CH_{2}Cl_{2}) permitió la purificación del producto mayoritario en forma de un material gomoso blanquecino (4,53 g, 47%). Este producto se identificó por H-RMN y EM-ES.

Síntesis de N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-3'-O-t-butildimetilsilil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina

Se disolvieron N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanamino)-3'-O-t-butildimetilsilil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (4,53 g, 4,57 mmol) y biotina-éster de NHS (3,12 g, 9,13 mmol) y se añadieron 75 ml de DMF y unas gotas de TEA y la reacción se agitó a T.a. Después de 2 h la TLC en gel de sílice (MeOH 5% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 94%) mostró la formación de un producto mayoritario menos polar que el material de partida y otra mancha minoritaria que tenía R_{f} inferior. Se evaporó el disolvente a sequedad, después se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se lavó tres veces con una solución saturada de NaCl, se secó la fase orgánica, se evaporó a sequedad para dar un material gomoso amarillo. Este material se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice usando de (TEA 1% + CH_{2}Cl_{2}) a (TEA 1% + MeOH 2,5% + CH_{2}Cl_{2}) como eluyente. Después, la evaporación de las fracciones que contenían el producto dio un material sólido amarillento (3,16 g, 78%). Por H-RMN y EM-ES se confirmó la estructura.

Síntesis de N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (3)

Se disolvió N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-3'-O-t-butildimetilsilil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (3,16 g, 2,6 mmol) en 100 ml de THF seco, y después se añadieron aproximadamente (3,25 ml, 3,25 mmol) de fluoruro de tetrabutilamonio en THF en 5 min, mientras se agitaba a T.a. Después de 8 h, la TLC en gel de sílice (MeOH 10% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 89%) mostró un producto nuevo formado con R_{f} inferior. El disolvente se evaporó para dar un material aceitoso amarillo. La cromatografía en columna en gel de sílice eluída con (CH_{2}Cl_{2} 99% + TEA 1%) a (MeOH 5% + TEA 1% + CH_{2}Cl_{2} 94%) permitió la purificación del producto en forma de un producto espumoso blanco (2,86 g, 100%). Por H-RMN y EM-ES se confirmó la estructura.

Síntesis de N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-3'-O-[(diisopropilamina)(2-cianoetoxi)fosfino)]-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (4)

Se disolvió N^{6}-benzoil-8-(4,7,10-trioxa-1-tridecanaminobiotin)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
(0,959 g, 0,86 mmol) en una mezcla de acetonitrilo seco (200 ml) y diclorometano (50 ml), y diisopropilamina (224 \mul, 1,29 mmol) seguido de la adición de 2-cianoetil-N,N,N,N'-tetraisopropilfosfano (404 \mul, 1,29 mmol) y tetrazol (2,6 ml, 1,2 mmol, solución 0,45 M en acetonitrilo seco). La adición y posterior reacción se llevan a cabo en atmósfera de argón mientras se agita a T.a. Después de 1,5 h la TLC en gel de sílice (MeOH 5% + TEA 5% + EA 45% + CH_{2}Cl_{2} 45%) mostró que sólo se había convertido aproximadamente 50% del material de partida (MP) en un producto nuevo. Se añadieron las mismas cantidades de reactivos a la reacción y se mantuvo agitando durante otras 2 horas a T.a. La TLC mostró que aproximadamente el 95% del MP se había convertido en un producto nuevo con R_{f} superior. El disolvente se evaporó a sequedad y después se disolvió en diclorometano, se extrajo una vez con solución de bicarbonato al 5%, seguido de solución saturada de salmuera y después se secó sobre sulfato sódico anhidro y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna en gel de sílice se eluye primero con (TEA 10% + EA 45% + CH_{2}Cl_{2} 45%) y después (TEA 5% + MeOH 5% + EA 45% + CH_{2}Cl_{2} 45%). Después, la evaporación de las fracciones que contenían el producto dio un material gomoso amarillo (774 mg). Este material se coevaporó tres veces con una mezcla de benceno seco y diclorometano, y después se mantuvo en un desecador que contenía P_{2}O_{5} y perlas de NaOH a vacío durante 24 h antes de usarlo en la síntesis de ADN.

Síntesis de oligonucleótidos que contienen biotina-dC y biotina dA

La síntesis de oligonucleótidos que contienen biotina-dC y biotina-dA, situados específicamente en el sitio, se llevó a cabo en un soporte de CPG usando un sintetizador de ADN completamente automatizado y los desoxinucleósidos-fosforamiditos completamente protegidos disponibles en el comercio. Las síntesis de todos estos oligonucleótidos se llevó a cabo en una escala de 1,0 y 0,4 \mumol. El tiempo de acoplamiento para la biotina-dC y dA se prolongó a 900 segundos. Se encontró que la eficacia del acoplamiento de los fosforamiditos de la biotina-dC y dA era mayor que 96%. Después del acoplamiento de los fosforamiditos biotinilados, se añadieron los restos que quedaban que comprendían el indicador eTag de interés. Tras completar la síntesis de los oligonucleótidos, se desprotegieron con amoniaco a 65ºC durante 1 hora. Estos oligonucleótidos se purificaron por HPLC de fase inversa y se desalaron por columna de OPC, y después se usaron como estaban.

Preparación sintética de ACLA1 en un sintetizador de ADN ABI 394

El 6-carboxifluoresceína(6-FAM)-fosforamidito se prepara por adición de 2,96 ml de acetonitrilo anhidro a una botella de 0,25 g de fluoresceína-fosforamidito, para dar una solución 0,1 M. Después la botella se carga en el sintetizador de ADN ABI 394 en posición 8 usando el protocolo de cambio de botella estándar. Los otros monómeros naturales de fosforamidito (dA^{bz} (0,1 M: 0,25 g/2,91 ml de acetonitrilo anhidro), dC^{Ac} (0,1 M: 0,25 g/3,24 ml de acetonitrilo anhidro), dT (0,1 M: 0,25 g/3,36 ml de acetonitrilo anhidro), dG^{dmf} (0,1 M: 0,25 g/2,81 ml de acetonitrilo anhidro) se cargan de una forma similar en los puertos 1-4. Se carga acetonitrilo en el puerto lateral 18, el activador tetrazol estándar se carga en el puerto 9. El reactivo CAP A se carga en el puerto 11, el reactivo CAP B se carga en el puerto 12, el oxidante se carga en el puerto 15, y la solución de desbloqueo se carga en el puerto 14, usando todos protocolos de cambio de botella estándar.

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Reactivos estándar usados para la síntesis de ADN

Oxidante: yodo 0,02 M (0,015 para sondas MGB)

Desbloqueante: ácido tricloroacético al 3% en diclorometano

Activador: 1H-tetrazol en acetonitrilo anhidro

Acetonitrilo de calidad para HPLC (agua al 0,002%)

Reactivo Cap A: anhídrido acético

Reactivo Cap B: N-metil-imidazol

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Después se introduce la secuencia diana de interés con un acoplamiento terminal desde el puerto 8 a ACLA1 unido al extremo 5' de la secuencia. Después se elige un ciclo modificado, de modo que se sintetice la escala de ADN (0,2 mol, 1,0 mol...etc.) deseada. El ciclo modificado contiene una etapa de espera adicional de 800 segundos después de cualquier adición de 6-FAM. Después se carga una columna de síntesis de ADN estándar, que contiene el soporte al que se acoplará el ADN, en una de las cuatro posiciones del sintetizador de ADN. Los indicadores eTag que contienen ADN se han sintetizado en diferentes soportes estándar 500 \ring{A} CPG (Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG, dT-CPG) así como en soportes especiales que contienen conector 3'-biotina, 3'-amino y especies de unión al surco menor.

Tras completar la síntesis, la columna se retira del sintetizador y se seca a vacío o por soplado de aire o nitrógeno a través de la columna para eliminar el acetonitrilo residual. Después, la columna se abre y se saca el CPG y se pone en un vial de 3,6 g. Se añade amoniaco concentrado (2,0 ml) y el vial se cierra y se pone en un bloque calefactor ajustado a 65ºC durante un mínimo de dos horas. Después de dos horas se deja enfriar el vial a temperatura ambiente, después de lo cual se separa la solución de amoniaco usando una pipeta Pasteur y se pone en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución se concentra a vacío y se lleva a la purificación por HPLC.

Preparación sintética de ACLA2 en un sintetizador de ADN ABI 394

El 6-carboxifluoresceína(6-FAM)-fosforamidito se prepara por adición de 2,96 ml de acetonitrilo anhidro a una botella de 0,25 g de fluoresceína-fosforamidito, para dar una solución 0,1 M. Después la botella se carga en el sintetizador de ADN ABI 394 en posición 8 usando el protocolo de cambio de botella estándar. Los otros monómeros naturales de fosforamidito (dA^{bz} (0,1 M: 0,25 g/2,91 ml de acetonitrilo anhidro), dC^{Ac} (0,1 M: 0,25 g/3,24 ml de acetonitrilo anhidro), dT (0,1 M: 0,25 g/3,36 ml de acetonitrilo anhidro), dG^{dmf} (0,1 M: 0,25 g/2,81 ml de acetonitrilo anhidro) se cargan de una forma similar en los puertos 1-4. Se carga acetonitrilo en el puerto lateral 18, el activador tetrazol estándar se carga en el puerto 9, el reactivo CAP A se carga en el puerto 11, el reactivo CAP B se carga en el puerto 12, el oxidante se carga en el puerto 15, y la solución de desbloqueo se carga en el puerto 14, usando todos protocolos de cambio de botella estándar. Después se introduce la secuencia diana de interés con un acoplamiento terminal desde el puerto 8 y un penúltimo acoplamiento de timidina al extremo 5' de la secuencia para acoplar ACLA2. Después se elige un ciclo modificado, de modo que se sintetice la escala de ADN (0,2 \mumol, 1,0 \mumol...etc.) deseada. El ciclo modificado contiene una etapa de espera adicional de 800 segundos después de cualquier adición de 6-FAM. Después se carga una columna de síntesis de ADN estándar, que contiene el soporte al que se acoplará el ADN, en una de las cuatro posiciones del sintetizador de ADN. Los indicadores eTag que contienen ADN se han sintetizado en diferentes soportes estándar 500 \ring{A} CPG (Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG, dT-CPG) así como en soportes especiales que contienen conector 3'-biotina, 3'-amino y especies de unión al surco menor.

Tras completar la síntesis, la columna se retira del sintetizador y se seca a vacío o por soplado de aire o nitrógeno a través de la columna para eliminar el acetonitrilo residual. Después, la columna se abre y se saca el CPG y se pone en un vial de 3,6 g. Se añade amoniaco concentrado (2,0 ml) y el vial se cierra y se pone en un bloque calefactor ajustado a 65ºC durante un mínimo de dos horas. Después de dos horas se deja enfriar el vial a temperatura ambiente, después de lo cual se separa la solución de amoniaco usando una pipeta Pasteur y se pone en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución se concentra a vacío y se lleva a la purificación por HPLC.

Preparación sintética de ACLA3 en un sintetizador de ADN ABI 394

El 6-carboxifluoresceína(6-FAM)-fosforamidito se prepara por adición de 2,96 ml de acetonitrilo anhidro a una botella de 0,25 g de fluoresceína-fosforamidito, para dar una solución 0,1 M. Después la botella se carga en el sintetizador de ADN ABI 394 en posición 8 usando el protocolo de cambio de botella estándar. Los otros monómeros naturales de fosforamidito (dA^{bz} (0,1 M: 0,25 g/2,91 ml de acetonitrilo anhidro), dC^{Ac} (0,1 M: 0,25 g/3,24 ml de acetonitrilo anhidro), dT (0,1 M: 0,25 g/3,36 ml de acetonitrilo anhidro), dG^{dmf} (0,1 M: 0,25 g/2,81 ml de acetonitrilo anhidro) se cargan de una forma similar en los puertos 1-4. Se carga acetonitrilo en el puerto lateral 18, el activador tetrazol estándar se carga en el puerto 9, el reactivo CAP A se carga en el puerto 11, el reactivo CAP B se carga en el puerto 12, el oxidante se carga en el puerto 15, y la solución de desbloqueo se carga en el puerto 14, usando todos protocolos de cambio de botella estándar. Después se introduce la secuencia diana de interés con un acoplamiento terminal desde el puerto 8 y dos acoplamientos penúltimos de timidina al extremo 5' de la secuencia para acoplar ACLA3. Después se elige un ciclo modificado, de modo que se sintetice la escala de ADN (0,2 \mumol, 1,0 \mumol...etc.) deseada. El ciclo modificado contiene una etapa de espera adicional de 800 segundos después de cualquier adición de 6-FAM. Después se carga una columna de síntesis de ADN estándar, que contiene el soporte al que se acoplará el ADN, en una de las cuatro posiciones del sintetizador de ADN. Los indicadores eTag que contienen ADN se han sintetizado en diferentes soportes estándar 500 \ring{A} CPG (Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG, dT-CPG) así como en soportes especiales que contienen conector 3'-biotina, 3'-amino y especies de unión al surco menor.

Tras completar la síntesis, la columna se retira del sintetizador y se seca a vacío o por soplado de aire o nitrógeno a través de la columna para eliminar el acetonitrilo residual. Después, la columna se abre y se saca el CPG y se pone en un vial de 3,6 g. Se añade amoniaco concentrado (2,0 ml) y el vial se cierra y se pone en un bloque calefactor ajustado a 65ºC durante un mínimo de dos horas. Después de dos horas se deja enfriar el vial a temperatura ambiente, después de lo cual se separa la solución de amoniaco usando una pipeta Pasteur y se pone en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución se concentra a vacío y se lleva a la purificación por HPLC.

Preparación sintética de ACLA16 en un sintetizador de ADN ABI 394

El 6-carboxifluoresceína(6-FAM)-fosforamidito se prepara por adición de 2,96 ml de acetonitrilo anhidro a una botella de 0,25 g de fluoresceína-fosforamidito, para dar una solución 0,1 M. Después la botella se carga en el sintetizador de ADN ABI 394 en posición 8 usando el protocolo de cambio de botella estándar. El fosforamidito espaciador C3 (0,25 g) se disuelve en 5,0 ml de acetonitrilo anhidro y se carga en la posición 5 del sintetizador. Los otros monómeros naturales de fosforamidito (dA^{bz} (0,1 M: 0,25 g/2,91 ml de acetonitrilo anhidro), dC^{Ac} (0,1 M: 0,25 g/3,24 ml de acetonitrilo anhidro), dT (0,1 M: 0,25 g/3,36 ml de acetonitrilo anhidro), dG^{dmf} (0,1 M: 0,25 g/2,81 ml de acetonitrilo anhidro) se cargan de una forma similar en los puertos 1-4. Se carga acetonitrilo en el puerto lateral 18, el activador tetrazol estándar se carga en el puerto 9, el reactivo CAP A se carga en el puerto 11, el reactivo CAP B se carga en el puerto 12, el oxidante se carga en el puerto 15, y la solución de desbloqueo se carga en el puerto 14, usando todos protocolos de cambio de botella estándar. Después se introduce la secuencia diana de interés con un acoplamiento terminal desde el puerto 8 y un penúltimo acoplamiento del espaciador C3 desde el puerto 5 para acoplar ACLA16. Después se elige un ciclo modificado, de modo que se sintetice la escala de ADN (0,2 \mumol, 1,0 \mumol...etc.) deseada. El ciclo modificado contiene una etapa de espera adicional de 800 segundos después de cualquier adición de 6-FAM. Después se carga una columna de síntesis de ADN estándar, que contiene el soporte al que se acoplará el ADN, en una de las cuatro posiciones del sintetizador de ADN. Los indicadores eTag que contienen ADN se han sintetizado en diferentes soportes estándar 500 \ring{A} CPG (Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG, dT-CPG) así como en soportes especiales que contienen conector 3'-biotina, 3'-amino y especies de unión al surco menor.

Tras completar la síntesis, la columna se retira del sintetizador y se seca a vacío o por soplado de aire o nitrógeno a través de la columna para eliminar el acetonitrilo residual. Después, la columna se abre y se saca el CPG y se pone en un vial de 3,6 g. Se añade amoniaco concentrado (2,0 ml) y el vial se cierra y se pone en un bloque calefactor ajustado a 65ºC durante un mínimo de dos horas. Después de dos horas se deja enfriar el vial a temperatura ambiente, después de lo cual se separa la solución de amoniaco usando una pipeta Pasteur y se pone en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución se concentra a vacío y se lleva a la purificación por HPLC.

Todos los demás indicadores eTag se sintetizan de una forma similar a la descrita antes.

La siguiente tabla 6 proporciona una lista de diferentes indicadores eTag con sus estructuras, en las que los símbolos son como se definen en la tabla 2 y se repiten aquí por conveniencia. C_{3}, C_{6}, C_{9} y C_{18} son espaciadores de fosforamidito disponibles en el comercio de Glen Research, Sterling VA. Las unidades son derivados de N,N-diisopropil-O-cianoetil-fosforamidito, que se indica por Q. Los subíndices indican el número de átomos en la cadena, que comprende unidades de etilenoxi que terminan en Q con el otro extremo protegido con DMT. Las letras sin subíndices A, T, C y G indican los nucleótidos convencionales, mientras que T^{NH2} indica aminotimidina y C^{Br} indica bromocitidina. En la figura 7, los números indican el indicador eTag como se numeran en la siguiente Tabla 6:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Indicadores eTag

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Digestión de las sondas de indicadores eTag mediante la S1 nucleasa

En un tubo de 1,5 ml, se añaden 10 \mul de sonda de indicador eTag con una concentración 10 \muM, se añaden 1,5 \mul de tampón de reacción de S1 nucleasa 10x, se añaden 0,5 \mul de S1 nucleasa (Promega, cat. nº M5761, 20-100 unidades/\mul), y se añaden 3 \mul de tampón de Tris-EDTA para llevar el volumen final a 15 \mul. La reacción se incuba a 37ºC durante 20 min seguido de 25 min a 96ºC para inactivar la nucleasa.

TABLA 7

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Ensayos de 5' nucleasa para el seguimiento de la expresión de ARNm específico en lisatos de células

Se cultivaron células THP-1 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) en presencia o ausencia de 12-miristato-13-acetato de forbol 10 nM (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO) en medio RPM1 1640 con suero bovino fetal al 10% (v/v), L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Veinticuatro horas después de la inducción, se recogieron las células y se lavaron dos veces con PBS antes de la lisis con tampón de lisis (Tris 20 mM pH 7,5, Nonidet P-40 al 0,5%, MgCl_{2} 5 mM, tRNA 20 ng/\mul) a 25ºC, durante 5 min. El lisato se calentó a 75ºC durante 15 min antes de probarlo en el ensayo de 5' nucleasa.

Se combinaron 10 \mul de lisato celular con un oligómero con ADN invasor monocatenario corriente aguas arriba (5'CTC-TCA-GTT-CT), un oligómero de ADN señal biotinilado monocatenario corriente aguas abajo (marcado con eTag), y 5' nucleasa 2 ng/\mul (Cleavase IX) en 20 \mul de tampón (MOPS 10 mM pH 7,5, Tween-20 al 0,05% y Nonidet P-40 al 0,05%, MgCl_{2} 12,5 mM, ATP 100 \muM, inhibidor de Rnasa 2 U/\mul). Las reacciones se llevaron a cabo a 60ºC durante 4 horas antes del análisis por electroforesis capilar. Para eliminar la señal de fondo debida a la actividad no específica de la enzima, se añadió 1 \mul de avidina 1 mg/ml a las reacciones para separar todos los oligómeros no escindidos marcados con eTag, u oligómeros escindidos de forma no específica marcados con eTag. Las figuras 8 y 9 muestran separaciones que se llevaron a cabo tanto con como sin adición de avidina.

Amplificación por PCR con actividad 5' nucleasa usando indicadores eTag

Los indicadores eTag se describen en la Tabla 6. Los indicadores eTag que se prepararon se cribaron para proporcionar 20 candidatos que proporcionaban separaciones definidas. Se generaron 31 indicadores eTag con dianas sintéticas usando reactivos TaqMan en las condiciones mostradas en el siguiente formato de tabla. Hubo 62 reacciones con las dianas sintéticas (1 reacción y un control negativo por indicador eTag). La mezcla madre implica preparar una solución de mezcla madre de TaqMan, cebador (tanto inverso como directo) y agua. Después la mezcla se divide en partes alícuotas en tubos de PCR individuales seguido de la adición de sonda y molde.

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Después se llevaron todas las reacciones individuales a un ABI 3100 usando POP4 como matriz de separación. Las muestras se diluyeron 1:20 en tampón TaqMan 0,5X y se añadió 1 \mul de avidina (10 mg/ml) para la unión a cualquier sonda intacta. Las muestras se diluyeron más 1:2 con formamida antes de inyectar la muestra en los capilares de ABI 3100. A continuación están las condiciones usadas con el ABI 3100 para la separación.

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La posterior separación de múltiples indicadores eTag en un solo experimento se llevó a cabo como se muestra en la Figura 7, cuyas estructuras se identifican en la tabla 6 anterior.

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Ensayo análogo proteómico de indicador eTag 1 - Marcaje de aminodextrano (PM \sim 500.000) con indicador eTag y biotina

Se usó aminodextrano como un modelo para demostrar la liberación de indicador eTag en relación con una molécula de alto peso molecular, que también sirve como modelo para proteínas. El número de grupos amino para 10 mg de aminodextrano se calculó como 2 x 10^{-8} moles. Para una relación de biotina a indicador eTag 1:4, el número de moles de biotina-éster de NHS usado era 1,85x10^{-6} y el número de moles de maleimida-éster de NHS era 7,4x10^{-6}. Se disolvieron 10,9 mg de aminodextrano en 6 ml de tampón de PBS al 0,1%. Después, se disolvieron juntos 10 mg de biotina-x-x-éster de NHS y 23,7 mg de EMCS en 1 ml de DMF. Esta solución en DMF se añadió en porciones de 50 \mul (intervalos de 30 min) a la solución de aminodextrano mientras se agitaba y se mantenía fuera de la luz. Después de la adición final de la solución de DMF, la mezcla se mantuvo toda la noche (mientras se agitaba y fuera de la luz). Después, la mezcla se dializó usando membrana con corte de exclusión de peso molecular de 10.000. La membrana se sumergió en un vaso de precipitados que contenía 2 litros de agua mientras se agitaba. Este agua se cambió cuatro veces (intervalos de 2 h). La membrana se mantuvo en el agua durante la noche (mientras se agitaba y se mantenía fuera de la luz). Después la solución se liofilizó y el polvo liofilizado se usó para marcar con indicador eTag.

2 - Reacción del aminodextrano marcado con biotina y maleimida con el indicador eTag, SAMSA

Se usó como indicador eTag SAMSA [5-((2-(y-3)-S-acetilmercapto)succinoil)amino)fluoresceína] para reaccionar con maleimida en la molécula de aminodextrano. Para este propósito se disolvieron 0,3 mg (\sim5,3x10^{9} moles) de biotina y EMCS marcado con aminodextrano en 10 \mul de agua y después se hicieron reaccionar con 10 veces la relación molar de SAMSA, para la conversión completa de la maleimida en el indicador eTag. Por lo tanto, se disuelven 1,1 mg de SAMSA (\sim1,2x10^{-6} moles) en 120 \mul de NaOH 0,1 M y se incuban a temperatura ambiente durante 15 min (para la activación del grupo tiol). Después el exceso de NaOH se neutralizó por la adición de 2 \mul de HCl 6 M, y el pH de la solución se ajustó a 7,0 por la adición de 30 \mul de tampón de fosfato (200 mM, pH = 7,0). La solución de SAMSA activada se añadió a los 10 \mul de solución de aminodextrano marcado y se incubó durante 1 h. El aminodextrano marcado con indicador eTag se purificó con filtración en gel usando Sephadex G-25 (Amersham) y se recogieron muestras purificadas.

3 - Liberación de eTag del aminodextrano marcado

Se añadieron con cuidado 2 \mul de perlas sensibilizadoras recubiertas de estreptavidina (100 \mug/ml) en la oscuridad a 5 \mul de aminodextrano marcado purificado y se incubaron en la oscuridad durante 15 min. Después, la solución se irradió durante 1 min a 680 nm. Se examinó la liberación del indicador eTag por CE usando un dispositivo CE^{2}LabCard^{TM}. Como se muestra en la figura 1, el CE^{2}LabCard^{TM} consiste en dos partes, control de evaporación e inyección/separación. El control de evaporación incorpora un canal (450 \mum de ancho y 50 \mum de profundidad) con dos depósitos de tampones (2 mm de diámetro) y el pocillo de control de evaporación (1 mm de diámetro) en el centro del canal. El volumen de los pocillos laterales (pocillos de rellenado) es 4,7 \mul, mientras que el volumen del pocillo medio es sólo 1,2 \mul y el volumen del canal bajo el pocillo medio es aproximadamente 40 nl. La segunda parte del dispositivo CE^{2} que es la parte de inyección/separación, consiste en canales de inyección y separación con dimensiones de 120 \mum de ancho y 50 \mum de profundidad. El canal de inyección está conectado directamente al pocillo de control de evaporación. Los canales se cierran mediante laminado con una película (MT40) en el LabCard^{TM}.

Después de llenar el dispositivo CE^{2}LabCard^{TM} con tampón de separación (HEPES 20 mM, pH = 7,4) y PEO al 0,5%), se añadieron 300 nl de la mezcla de ensayo en el pocillo medio (pocillo de muestra) y se separó por CE como se muestra en la figura 1.

La figura 2 muestra los electroferogramas de aminodextrano marcado purificado con y sin perlas sensibilizadoras. Como se muestra, la adición de perlas sensibilizadoras conduce a la liberación del indicador eTag del aminodextrano usando oxígeno singlete producido por el sensibilizador tras la irradiación a 680 nm. Con el fin de optimizar el tiempo de irradiación, se irradiaron diferentes tubos que contenían la misma mezcla de perlas y sensibilizador para diferentes periodos de tiempo en el intervalo de 1 a 10 min. No hay un aumento significativo en la liberación del indicador eTag para la irradiación más larga de 1 min. La figura 4 muestra el efecto de la concentración de perlas sensibilizadoras en la liberación del indicador eTag. Como se representa en la figura 4, la concentración más alta de perlas sensibilizadoras conduce a la mayor liberación de indicadores eTag del aminodextrano marcado. La figura 5, representa la curva de calibración lineal para la liberación de indicadores eTag como función de la concentración de perlas sensibilizadoras. Además, también se examinó el efecto de la concentración de aminodextrano marcado en la liberación de indicador eTag y el resultado se muestra en la figura 6. Como puede verse, la menor concentración de aminodextrano marcado para una concentración dada de perlas sensibilizadoras conduce a una liberación de indicador eTag más eficaz (o mayor relación de indicador eTag liberado a cantidad de aminodextrano marcado).

Es evidente a partir de los resultados anteriores que la presente invención proporciona formas muy eficaces de preparar composiciones para usar en determinaciones multiplexadas y para llevar a cabo determinaciones multiplexadas. Los procedimientos proporcionan protocolos homogéneos y heterogéneos, tanto con ácidos nucleicos como proteínas, como ejemplo de otras clases de compuestos. En las determinaciones de ácidos nucleicos, las determinaciones de SNP se simplifican mucho cuando el protocolo se puede llevar a cabo solo en uno a cuatro recipientes y se puede determinar un gran número de SNP fácilmente en un periodo de tiempo corto con gran eficacia y precisión. Para otras secuencias, se pueden investigar genomas tanto de procariotas como de eucariotas, incluyendo para los procariotas resistencia a fármacos, especie, cepa, etc., y para los eucariotas especie, tipo de célula, respuesta a estímulos externos, p. ej., fármacos, cambios físicos en el entorno, etc., mutaciones, quiasmas, etc. Con proteínas, se puede determinar la respuesta de la célula huésped, orgánulos o similares a cambios en el entorno químico y físico, en relación con una pluralidad de rutas, cambios en la población de proteínas de superficie, cambios debido al envejecimiento, neoplasia, activación y otros fenómenos naturales, en los que se puede cuantificar la cantidad de proteína.

En particular, como determinaciones de ácidos nucleicos, los presentes indicadores eTag se pueden sintetizar de forma conveniente junto con la síntesis de oligonucleótidos usados como sondas, cebadores, etc., en los que el indicador eTag es liberado en presencia de la secuencia diana homóloga. Se proporcionan kits de bloques estructurales o indicadores eTag para usar en diferentes determinaciones.

Claims (29)

1. Un procedimiento para detectar una pluralidad de proteínas diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión para cada una de las proteínas diana de la pluralidad, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos al mismo por una unión escindible, distinguiéndose el indicador o indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas;

combinar con la muestra un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas de modo que en presencia de una proteína diana se forme un complejo entre cada proteína diana y el compuesto de unión específico para la misma;

liberar los indicadores eTag en dichos complejos por escisión de las uniones escindibles; y

separar e identificar los indicadores eTag liberados por una o más características físicas para determinar la pluralidad de proteínas diana.

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2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además incluye una etapa previa a dicha etapa de escisión, etapa que comprende separar dichos complejos de dichos compuestos de unión no unidos.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha etapa de escisión incluye tratar dicha unión escindible con una enzima para liberar dichos indicadores eTag.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que cada uno de dichos indicadores eTag tiene un marcador fluorescente o un marcador electroquímico y en el que dicha pluralidad de dichas proteínas diana es una pluralidad de 3 a 10 proteínas diana.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha pluralidad de dichas proteínas diana está en el intervalo de 3 a 20, en el que dichas una o más características físicas comprenden movilidad electroforética y fluorescencia, y en el que dicho compuesto de unión es un compuesto de unión a anticuerpo.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dichos indicadores eTag liberados tienen una carga opuesta a la de dichos complejos y dichos compuestos de unión, en el que dicha unión escindible se escinde por oxidación, y en el que dicha etapa de escisión incluye proporcionar una especie activa para oxidar dicha unión escindible.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha unión escindible se escinde por oxidación y en el que dicha etapa de escisión incluye proporcionar una especie activa para oxidar dicha unión escindible.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha especie activa es peróxido de hidrógeno u oxígeno singlete.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha etapa de escisión incluye además proporcionar para cada una de dicha pluralidad de proteínas diana un segundo compuesto de unión específico para las mismas, teniendo dicho segundo compuesto de unión un sensibilizador para generar dicha especie activa para oxidar dicha unión escindible.

10. El procedimiento según la reivindicación 6, 7, 8 o 9, en el que dicha especie activa es oxígeno singlete, en el que dicho segundo compuesto de unión es un compuesto de unión de anticuerpo, y en el que dicha unión escindible es una olefina, un tioéter, un sulfóxido o un análogo de selenio del tioéter o sulfóxido.

11. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que dicho compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión son cada uno anticuerpos.

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12. Un procedimiento para detectar una pluralidad de especies diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión para cada una de una pluralidad de especies diana, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos al mismo por una unión escindible, distinguiéndose el indicador o indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas;

proporcionar un segundo compuesto de unión para cada una de la pluralidad de especies diana, teniendo cada segundo compuesto de unión un sensibilizador para generar una especie activa;

combinar con la muestra un compuesto de unión y un segundo compuesto de unión para cada una de la pluralidad de especies diana, de modo que en presencia de una especie diana se forma un complejo entre la especie diana y el compuesto de unión y el segundo compuesto de unión específico para la misma, y de modo que el sensibilizador del segundo compuesto de unión produce la generación de una especie activa y la escisión de una o más uniones escindibles para liberar uno o más indicadores eTag; y

separar e identificar los indicadores eTag liberados por una o más características físicas para determinar las especies diana en la muestra.

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13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dichos uno o más indicadores eTag de cada compuesto de unión diferente tienen diferentes relaciones carga/masa, de modo que los indicadores eTag de cada compuesto de unión diferente forman picos diferentes tras la separación electroforética, y en el que dicha etapa de separación incluye la separación electroforética de dichos indicadores eTag.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha unión escindible se escinde por oxidación y en el que dicha especie activa es oxígeno singlete.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha unión escindible es una olefina, un tioéter, un sulfóxido, o un análogo de selenio del tioéter o sulfóxido.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión son cada uno compuestos de unión a anticuerpos.

17. El procedimiento según la reivindicación 12, 13, 14, 15 ó 16, en el que dicha pluralidad de dichas especies diana es una pluralidad de 3 a 20 especies diana.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión son cada uno anticuerpos.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha pluralidad de dichas proteínas de superficie de membrana es una pluralidad de 3 a 10 especies diana.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho sensibilizador genera dicho oxígeno singlete tras fotoactivación.

21. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha etapa de separación electroforética de dichos indicadores eTag incluye proporcionar dichos indicadores eTag, cada uno con una carga de polaridad opuesta a la de los materiales interferentes.

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22. Un procedimiento para determinar poblaciones de cada una de una pluralidad de proteínas de superficie de membrana en una muestra celular, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas de superficie de membrana, teniendo cada compuesto de unión uno o más indicadores eTag unidos al mismo por una unión escindible, distinguiéndose el indicador o indicadores eTag de cada compuesto de unión de los de los otros compuestos de unión por una o más características físicas;

combinar con la muestra celular un compuesto de unión para cada una de la pluralidad de proteínas de modo que en presencia de una proteína de superficie de membrana se forme un complejo entre cada proteína de superficie de membrana y el compuesto de unión específico para la misma;

escindir la unión escindible de cada compuesto de unión que forma dicho complejo de modo que se liberen los indicadores eTag; y

separar e identificar los indicadores eTag liberados por una o más características físicas para determinar las poblaciones de la pluralidad de proteínas de superficie de membrana.

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23. El procedimiento de la reivindicación 22, que además incluye, previa a dicha etapa de escisión, separar dichos complejos de dichos compuestos de unión no unidos.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que cada uno de dichos indicadores eTag tiene un marcador fluorescente o un marcador electroquímico y en el que dicha pluralidad de dichas proteínas de superficie de membrana es una pluralidad de 3 a 10 proteínas de superficie de membrana.

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25. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha pluralidad de dichas proteínas de superficie de membrana está en el intervalo de 3 a 10, en el que dichas una o más características físicas comprenden movilidad electroforética y fluorescencia, y en el que dicho compuesto de unión es un compuesto de unión a anticuerpo.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicha unión escindible se escinde por oxidación y en el que dicha etapa de escisión incluye proporcionar una especie activa para oxidar dicha unión escindible.

27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que dicha especie activa es peróxido de hidrógeno u oxígeno singlete.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha etapa de escisión incluye además proporcionar para cada una de dicha pluralidad de dichas proteínas de superficie de membrana un segundo compuesto de unión específico para las mismas, teniendo el segundo compuesto de unión un sensibilizador para generar dicha especie activa para oxidar dicha unión escindible.

29. El procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicha especie activa es oxígeno singlete, en el que dicho segundo compuesto de unión es un compuesto de unión de anticuerpo, y en el que dicha unión escindible es una olefina, un tioéter, un sulfóxido o un análogo de selenio del tioéter o sulfóxido.