ES2345036T3

ES2345036T3 - Sistema de clasificacion e inmovilizacion para acidos nucleicos utilizando sistemas de fijacion sinteticos.

Info

Publication number: ES2345036T3
Application number: ES02724166T
Authority: ES
Inventors: Markus Schweitzer; Richard Anderson; Michael Fiechtner; Jochen Muller-Ibeler; Stefan Raddatz; Christoph Brucher; Norbert Windhab; Jill Orwick; Eberhard Schneider; Marc Pignot; Stefan Kienle
Original assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Current assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2010-09-14
Anticipated expiration: 2022-02-14
Also published as: DE60236361D1; JP4388369B2; EP2298929A1; US20050208576A1; EP1412518A2; US6893822B2; EP1412518B1; AU2002254892A1; WO2003008638A2; WO2003008638A3; DK1412518T3; EP2218726A1; JP2004536317A; ATE467686T1; US20030175702A1

Abstract

Un método para modificar enzimáticamente un ácido nucleico diana, por reacción de ligación independiente del molde, o ligación de extremos romos o por PCR, en donde un conjugado que comprende un ácido nucleico (NA) constituido por 1 a 5 nucleótidos para reacciones de ligación independientes del molde, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son monocatenarios, o para reacciones de ligación con extremos romos, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son bicatenarios, y en donde el NA del conjugado se modifica por ligación de un término del NA a al menos un ácido nucleico adicional, o 10 a 40 nucleótidos para PCR y al menos una unidad sintética de fijación (SBU) seleccionada del grupo constituido por p-RNAs y p-DNAs, y en donde la SBU está enlazada covalentemente por su extremo 2' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 2' con el extremo 3' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 4' con el extremo 3' del ácido nucleico NA o por su extremo 4' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA), utilizando el ácido nucleico del conjugado como sustrato, comprendiendo el método: a)poner en contacto el conjugado con al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por una polimerasa, y una ligasa que utiliza los ácidos nucleicos existentes naturalmente como sustrato, y con otros reactivos necesarios para la acción de la enzima; y b)incubar la mezcla obtenida en a) en condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar la modificación del ácido nucleico.

Description

Sistema de clasificación e inmovilización para ácidos nucleicos utilizando sistemas de fijación sintéticos.

La presente invención se refiere al uso de conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos como sustratos para reacciones enzimáticas independientes del molde, o fijación de extremos romos o de cadena de polimerasa, que incluyen reacciones de amplificación de ácidos nucleicos.

Las químicas y los análisis de ácidos nucleicos han ascendido hasta un lugar de prominencia en áreas tan diversas como la investigación biológica, la medicina, la agricultura, e incluso la ciencia forense. Una necesidad fundamental en el uso de ácidos nucleicos en todas estas áreas es la posibilidad de manipular los mismos en una escala macroscópica por localización de especies (o grupos de especies) particulares de ácido nucleico en una localización conocida, por ejemplo en una red sobre un sustrato. Con objeto de inmovilizar los ácidos nucleicos sobre materiales soporte, se ha ideado una amplia gama de métodos, que pueden clasificarse en términos generales por la estabilidad del enlace. Una inmovilización covalente, es decir una inmovilización en la cual el ácido nucleico está enlazado a estructuras moleculares del material soporte por uniones covalentes, es típicamente irreversible sin riesgo de la degradación del ácido nucleico inmovilizado. En cambio, pueden utilizarse reacciones complejantes, o reacciones entre dos socios de un sistema de unión que se reconocen específicamente uno a otro. Estas reacciones pueden ser reversibles o, para propósitos prácticos, irreversibles a lo largo de la escala de tiempo de un experimento particular. Si un sistema de unión para inmovilización de ácidos nucleicos debe designarse reversible o irreversible depende finalmente de la posición del equilibrio entre los ácidos nucleicos fijados y libres. Un ejemplo de un sistema de fijación que debe considerarse como prácticamente irreversible es la complejación de biotina por avidina (o estreptavidina, o sus diversas proteínas equivalentes modificadas genéticamente), con una constante de fijación de K_{a} \approx 2,5 x 10^{13} (M^{-1}) (Chilkoti, A.; Stayton, P.A.; J. Am. Chem. Soc. 117, 10622-10628 (1995); Greene M.; Advances in Protein Chemistry; 85-132 (1975)). Este sistema ha sido ampliamente utilizado para inmovilización de ácidos nucleicos y otras biomoléculas sobre materiales soporte.

WO86/07387 describe un ejemplo diferente de unión reversible de ácidos nucleicos a superficies. Como se describe en este documento, las secuencias de fijación de ácido nucleico se inmovilizan sobre materiales soporte por medio de agentes complejantes, por ejemplo con ayuda de pares anticuerpo/antígeno.

Otro ejemplo de un sistema de apareamiento reversible que ha sido utilizado son juegos de oligómeros de nucleótidos naturales, que se hibridan específicamente para proporcionar "identificadores" de formación de dúplex para inmovilización. En contraste con biotina-estreptavidina, los oligómeros de ácido nucleico tienen una dimensionalidad informática en la formación de pares: existen una multiplicidad de juegos de fijación específicos que pueden idearse, caracterizados por la secuencia de monómeros (nucleótidos) que se aparean específicamente sólo con secuencias complementarias. Al contrario que los sistemas multi-hapteno-lectina, o los sistemas multi-anticuerpo-antígeno, tales juegos de identificadores de ácido nucleico tienen características químicas y termodinámicas aceptablemente uniformes, lo que facilita su uso en reacciones múltiples.

EP 0305145 describe, por ejemplo, el uso de colas de homopolinucleótidos y su apareamiento específico con oligómeros de homopolinucleótidos complementarios para inmovilización de oligonucleótidos específicos de diana. Por otra parte, JP 03151900 describe el uso de secuencias específicas de ácido nucleico para inmovilización de ácidos nucleicos específicos de diana. Es característico de tales sistemas que el oligonucleótido a inmovilizar se componga de dos partes: una parte oligómera complementaria al oligonucleótido inmovilizado en la superficie del soporte, y una segunda parte oligómera específica para interacción con componentes de la muestra (v.g., complementaria a un ácido nucleico muestra). Sistemas similares se describen también en WO93/13225, WO93/13223, WO93/25563, US 5 763 175, WO97/32999, WO00/58516 y en WO00/60124.

La desventaja de los métodos arriba descritos es que la secuencia utilizada para la inmovilización puede hibridarse potencialmente con la secuencia a inmovilizar, formando estructuras secundarias intramoleculares, puede hibridarse con otra secuencia a inmovilizar, formando estructuras secundarias intermoleculares, o puede hibridarse con los ácidos nucleicos de la muestra. El riesgo de una interacción indeseable o interferente de este tipo aumenta con la longitud del o de los ácidos nucleicos a inmovilizar y con la complejidad de una muestra (v.g., la posibilidad de ácidos nucleicos contaminantes de organismos desconocidos).

Otra desventaja del uso de ácidos nucleicos naturales para inmovilización es que la estabilidad de los dúplex de ácidos nucleicos naturales no aumenta linealmente en proporción a la longitud (número de nucleótidos en la secuencia) a lo largo de un intervalo amplio, sino que se aproxima más bien a un límite que depende únicamente del porcentaje relativo de pares de bases CG a AT ("contenido de CG"). Sistemas de fijación que tienen una estabilidad de dúplex que excede del límite natural no pueden prepararse utilizando ácidos nucleicos naturales. Esta limitación es también problemática cuando se aplican diversas condiciones de severidad al ácido nucleico en su localización inmovilizada: Los identificadores de ácido nucleico inmovilizantes se verán sometidos también a las mismas condiciones de severidad (es decir, agentes caotrópicos, condiciones térmicas, o fuerzas electrostáticas) y pueden disociarse. Véase G. Michael Blackbum y Michael J. Gait, eds. Nucieic Acids in Chemistry and Biology, 2ª edición, 1996, Oxford University Press, Nueva York.

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La consecución de una diferenciación fina en diferenciación de severidad entre interacciones de identificadores de inmovilización (que deben permanecer hibridadas) y las interacciones específicas de la diana (que a menudo se discriminan al nivel de desapareamiento de un solo par de bases) es a menudo difícil, especialmente en condiciones de tipo clínico cuando el método debe ser particularmente robusto y consistente.

Otra desventaja significativa económica y de tiempo del uso de ácidos nucleicos naturales como agentes de inmovilización es que se requiere una cierta longitud mínima de secuencia para alcanzar un nivel práctico de estabilidad y selectividad de la inmovilización. Es típico utilizar 20-meros a fin de conseguir una especificidad de fijación suficiente. Esto da como resultado que la cadena de ácido nucleico entera (compuesta de la secuencia para el reconocimiento de la muestra y la secuencia para inmovilización) resulte relativamente larga. El uso de secuencias muy largas puede ser desventajoso por varias razones. En primer lugar, el uso de secuencias largas de ácido nucleico aumenta la probabilidad de formación intramolecular de estructuras secundarias, y aumenta también la probabilidad de hibridación transitoria o estable entre cadenas múltiples en solución.

Se han descrito dispositivos de redes electrónicas activas para el transporte electroforético y la manipulación de ácidos nucleicos, véanse las Patentes U.S. núms. 6.245.508; 6.225.059; 6.051.380; y 6.017.696, el texto de cada una de las cuales se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Cuando se manipulan ácidos nucleicos en redes electrónicas activas, se prefiere el uso de secuencias más cortas. El direccionamiento electrocinético y el movimiento en la red de chips electrónicos funcionan particularmente bien con ácidos nucleicos relativamente cortos debido a la mejor movilidad electroforética de las moléculas más pequeñas. Así, las secuencias más cortas para uso como agentes de complejación con inmovilización tienen mayor utilidad en el contexto de las redes electrónicas
activas.

Otra desventaja de la utilización de sistemas naturales para la inmovilización de ácidos nucleicos es que tales sistemas pueden degradarse o destruirse fácilmente durante su uso. En particular, la degradación por componentes enzimáticos de la muestra, o incluso DNAsas y RNAsas contaminantes de las yemas de los dedos de los operarios del laboratorio, constituyen un problema. La degradación o fragmentación por hidrólisis de los ácidos nucleicos utilizados para inmovilización, en particular por enzimas tales como enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas, no es infrecuente cuando se deja que un oligómero de ácido nucleico permanezca en reposo a la temperatura ambiente durante varios días. Así pues, es deseable el uso de agentes complejantes para inmovilización que no estén sometidos a degradación o modificación por enzimas naturalmente existentes.

En el curso de las últimas décadas, se han desarrollado una pluralidad de tecnologías para aprovechar la ventaja de la gran diversidad natural de enzimas a fin de modificar ácidos nucleicos. Las reacciones con endonucleasas de restricción escinden específicamente los ácidos nucleicos en sitios definidos de la secuencia, y pueden utilizarse nucleasas u otras enzimas para degradar o modificar los ácidos nucleicos en cualquiera de sus términos. Adicionalmente, pueden utilizarse polimerasas y transferasas terminales para construir oligómeros de ácidos nucleicos a partir de nucleótidos. Pueden utilizarse también enzimas ligasa para conectar, o ligar unas a otras, cadenas de ácidos nucleicos diferentes, de manera dependiente de moldes monocatenarios, independientes de cadenas bicatenarias de extremos romos, o independientes de moldes monocatenarios. Estas herramientas enzimáticas se han convertido en un pilar de la bioquímica analítica, y son necesarias para prácticamente cualquier investigación de biología molecular en algún momento. Por ejemplo, las polimerasas se utilizan comúnmente para la realización de reacciones de amplificación de ácido nucleico y reacciones de secuenciación, que son ambas componentes necesarios de la producción de proteínas de interés en investigación.

En la mayoría de los casos, se requieren pasos de purificación o pasos de separación física para manipulación en cada etapa de las manipulaciones enzimáticas de los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se purifican usualmente por precipitación, separación electroforética, o pasos cromatográficos. Para propósitos de aislamiento e inmovilización, los ácidos nucleicos se modifican a menudo con un identificador de afinidad, como biotina. Estos ácidos nucleicos modificados con biotina pueden ligarse de manera estable e irreversible a fases sólidas por la vía de complejos macromoleculares biotina-estreptavidina (v.g. DE 4001154 y EP 0063879). El complejo muy grande obtenido puede separarse de nuevo únicamente por condiciones químicas muy severas. Aunque es un complejo utilizado comúnmente, esto proporciona sólo una herramienta de interacción con inmovilización: Las reacciones múltiples con localización específica de los productos no pueden realizarse con un sistema de afinidad biotina-estreptavidina sola. De modo alternativo, es posible incorporar modificaciones con polihistidina, o esteroides o haptenos, tales como digoxigenina, en un ácido nucleico a fin de hacer posible la separación por fijación a parejas de fijación correspondientes a las modificaciones. Sin embargo, estos sistemas sólo permiten la separación en diversas condiciones (cromatografía de níquel, frente a fijación con antimonio), y por tanto no resuelven las limitaciones de la interacción biotina-avidina para reacciones múltiples.

La conjugación química de un ácido nucleico a otro ácido nucleico en solución requiere que se proporcione un ácido nucleico con una modificación que puede reaccionar con la modificación del otro ácido nucleico formando una unión estable. A menudo, ácidos nucleicos acabados presintetizados se conjugan con otros ácidos nucleicos y análogos por utilización de la capacidad de los ácidos nucleicos para formar pares complementarios consigo mismos, o por el apareamiento de los ácidos nucleicos con un molde de ácido nucleico para fijación. El apareamiento conduce a una asociación o pre-organización de las partes a conjugar, lo que respalda o hace termodinámicamente favorable de cualquier otro modo la reacción de conjugación subsiguiente. Por ejemplo, Nucleic Acids Research 19(9), 3671-3691 (1988) describe la conjugación de ácidos nucleicos modificados con tiol. Esta opción permite, cuando se trata con oxígeno atmosférico, la formación a la vez de homodímeros y heterodímeros, y es por consiguiente sólo provisionalmente adecuada para enlazar uno a otro dos ácidos nucleicos diferentes. La conjugación, soportada por molde, de ácidos nucleicos modificados con aldehídos con ácidos nucleicos modificados con aminas se describe en J. Am. Chem. Soc. 114, 9197-9198 (1992). Otra conjugación fotoquímica soportada por molde se describe en Nucleic Acids Research, 26(13), 3300-3304 (1998). Una de las pocas reacciones descritas sin soporte por auto-fijación o fijación con molde es la reacción de fosforotioatos con \alpha-haloacetileno (Gryaznov SM, J. Am. Chem. Soc. 115, 3808-3809 (1993)). WO01/07657 describe el enlace de bloques de construcción de RNA en el extremo 3' de un oligonucleótido de RNA por oxidación con peryodato para dar el dialdehído y reacción subsiguiente con un nucleófilo nitrogenado para dar un producto cíclico. Los nucleófilos nitrogenados utilizados pueden ser aminas, hidracinas, hidracidas, semicarbacidas o tiosemicarbacidas. El producto formado inicialmente puede estabilizarse por reducción con
NaCNBH_{3}.

Dado que los sistemas de fijación sintéticos, tales como los sistemas de fijación piranosil-RNA (pRNA) o piranosil-DNA (pDNA), son, por diseño, estéricamente incapaces de aparearse con ácidos nucleicos, estos métodos previamente descritos no son aplicables a la conjugación de ácidos nucleicos con unidades sintéticas de fijación. Sin embargo, la síntesis tándem en fase sólida de conjugados unidad sintéticas de fijación/ácido nucleico por química de fosforamiditos no es deseable para circunstancias en las cuales un ácido nucleico está fácilmente disponible para la conjugación (v.g., una preparación de plásmido bacteriano). Análogamente, si el ácido nucleico a conjugar es más largo que aproximadamente 20 nucleótidos, el tamaño del conjugado (ácido nucleico + 6-15 residuos de pRNA) se aproxima a y eventualmente sobrepasa el límite eficiente de síntesis de la química en fase sólida. Existe por tanto necesidad de encontrar métodos y condiciones que hagan posible conjugar ácidos nucleicos acabados, pre-sintetizados con sistemas sintéticos de fijación.

Los conjugados preparados de acuerdo con los métodos de esta invención pueden ponerse en contacto con unidades sintéticas de direccionamiento (SAUs) para formar constructos supermoleculares sobre materiales soporte. Estos métodos pueden realizarse pasiva o activamente (v.g., por direccionamiento electrónico sobre un dispositivo activado de redes electrónicas). En estos métodos, los conjugados pueden ponerse en contacto con una muestra, preferiblemente una muestra biológica, sea antes o después del contacto con las SAUs unidas.

Los conjugados a utilizar en el método de esta invención pueden prepararse por métodos mejorados para la síntesis en fase sólida de conjugados enlazados por restos fosfato o fosforamidito. Estos métodos comprenden:

a): síntesis de los conjugados sobre una fase sólida de soporte utilizando unidades monómeras u oligómeras, en donde las unidades están protegidas con \beta-cianoetilo sobre un fósforo terminal de las unidades,

b): tratamiento del soporte con una solución de una alquilamina en un disolvente inerte,

c): tratamiento del soporte con hidracina para escindir y desproteger el conjugado.

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Preferiblemente, la alquilamina es una alquilamina secundaria, seleccionada más preferiblemente del grupo constituido por dimetilamina, dietilamina, dipropilamina, dibutilamina, dipentilamina, dihexilamina, di-N-octilamina, di-N-decilamina, didodecilamina, N-etilmetilamina, N-metil-N-propilamina, N-metilbutilamina, N-metilpentilamina, N-metilhexilamina, N-etilpropilamina, N-(N-butil)-N-propilamina, N-amil-N-butilamina, N,N'-di-N-butil-1,6-hexanodiamina, N,N'-dimetil-1,3-propanodiamina, N,N'-dimetil-1,6-hexanodiamina. Es muy preferida la utilización de dietilamina.

La presente invención proporciona métodos para utilizar la porción de ácido nucleico de un conjugado SBU-NA como sustrato en reacciones enzimáticas seleccionadas de acuerdo con la reivindicación 1. En estas reacciones, la porción de ácido nucleico de los conjugados se modifica enzimáticamente. En general, estos métodos compren-
den:

a): poner en contacto el conjugado con al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por una polimerasa y una ligasa, que utiliza ácidos nucleicos existentes naturalmente como sustrato, y con otros reactivos necesarios para la acción de la enzima; y

b): incubar la mezcla obtenida en a) en condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar la modificación del conjugado.

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En diversas realizaciones, pueden utilizarse diversos reactivos en el paso a), con inclusión de nucleósido-trifosfatos (v.g., ordinarios, marcados, modificados químicamente) y/o ácidos nucleicos molde o diana (v.g., ordinarios, marcados, modificados químicamente). En diversas realizaciones, puede emplearse más de una enzima en el paso a). En una realización preferida, la enzima es una enzima ligasa, y la porción de ácido nucleico del conjugado es independiente del molde o está ligada por extremos romos a un ácido nucleico diana. En otra realización preferida, la enzima es al menos una polimerasa, y una secuencia de ácido nucleico molde se amplifica por PCR utilizando el conjugado como iniciador. En una versión particularmente preferida de esta realización, la amplificación es una amplificación lineal o exponencial por ciclación térmica. En otra realización preferida, la enzima es una mezcla de enzimas que comprenden una actividad de endonucleasa de restricción y una actividad de polimerasa, y una secuencia de ácido nucleico molde se amplifica isotérmicamente utilizando un conjugado como
iniciador.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1: Una representación diagramática de algunas configuraciones preferidas para enlace de ácidos nucleicos (NA) a unidades sintéticas de fijación (SBU), y el modo en que pueden utilizarse tales conjugados para inmovilización sobre materiales soporte (SM) utilizando unidades sintéticas de direccionamiento (SAU). La Figura 1A muestra el enlace de un ácido nucleico por su extremo 3' al extremo de la SBU que apunta en dirección opuesta al soporte cuando está apareada con la SAU. La Figura 1B muestra el enlace de un ácido nucleico por su extremo 5' al extremo de la SBU que apunta en dirección opuesta al soporte. La Figura 1C muestra el enlace de un ácido nucleico por su extremo 5' al extremo de la unidad de fijación que apunta hacia el soporte. La Figura 1D muestra el enlace de un ácido nucleico por su extremo 5' a una posición en el centro de la unidad de fijación. Un ejemplo de este tipo de enlace sería la conjugación de un enlazador de base triptamina en un pRNA con un aldehído en el extremo de un ácido
nucleico.

Figura 2: Una ilustración de algunas disposiciones de enlaces preferidas y espaciadores para uso con ácidos nucleicos y unidades sintéticas de fijación de pRNA, R1 = H, OH, Ome, Me; R2 = H, OH, Ome; L = (CH_{2})_{n}; CH_{2}-CH_{2}-(-O-CH_{2}-CH_{2}-)_{m}-O-CH_{2}-CH_{2}. CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(-O-CH_{2} -CH_{2}-CH_{2}-)_{q}-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}; Ba = base heterocíclica (C, T, U, G, A, etc.) A: enlace del extremo 4' de un bloque de construcción piranosilo de una SBU al extremo 3' de un ácido nucleico directamente a través de un fosfato. B: enlace del extremo 4' de un bloque de construcción piranosilo de una SBU al extremo 5' de un ácido nucleico directamente a través de un fosfato. C: enlace del extremo 2' de un bloque de construcción piranosilo de una SBU al extremo 5' de un ácido nucleico directamente a través de un fosfato. D (no perteneciente a la invención): Enlace del extremo 4' de un bloque de construcción piranosilo de una SBU al extremo 3' de un ácido nucleico por un enlazador (L). E (no perteneciente a la invención): Enlace del extremo 4' de un bloque de construcción piranosilo de una SBU al extremo 5' de un ácido nucleico por un enlazador (L). F (no perteneciente a la invención): Enlace del extremo 2' de un bloque de construcción piranosilo de una SBU al extremo 5' de un ácido nucleico por un enlazador (L).

Figura 3 (no perteneciente a la invención): Una representación diagramática de la diferencia estructural tridimensional entre los ácidos nucleicos y los sistemas de fijación sintéticos preferidos. Fig. 3A muestra la forma helicoidal de dúplex de ácido nucleico sobre la base de una hélice B-DNA. Fig. 3B muestra la naturaleza no helicoidal de los sistemas de fijación sintéticos tales como pRNA, pDNA, y CNA. Fig. 3C muestra el ejemplo de una unidad de fijación (SBU) 102a y una unidad de direccionamiento (SAU) 102B. NA = ácido nucleico; SM = material soporte; en este ejemplo, la dirección 102B está inmovilizada y 102a está conjugada con el ácido nucleico (NA) por un enlazador. Las interacciones intercatenarias de apilamiento de bases (pilas) se muestran utilizando el ejemplo de interacciones de apilamiento de bases purina-purina (pila PU-PU) y de las interacciones de apilamiento de bases purina-pirimidina (pila PU-Py). La pila 0 significa la ausencia de una interacción de apilamiento de bases de este tipo. Las pilas pirimidina-purina posibles en principio no están presentes en este ejemplo específico.

Figura 4: Una ilustración que sirve como ejemplo de algunas realizaciones de direccionamientos y conjugados de fijación de pRNA. 4A muestra una unidad sintética de direccionamiento (SAU) que tiene un extremo 4' biotina (BIO) para inmovilización sobre materiales soporte revestidos con estreptavidina, 4B muestra una unidad sintética de direccionamiento (SAU) con un resto tetrahidracida (4HY) para inmovilización en superficies éster activas, y 4C muestra un conjugado de una unidad pRNA (SBU) y un DNA (NA) que puede utilizarse en los métodos de esta invención.

Figura 5 (no perteneciente a la invención): Una ilustración de la conjugación de un DNA que tiene un ribonucleótido terminal 3' (NA) con un diol vecinal, y un pRNA marcado con 2'Cy3 y modificado con 4'-monohidracida (L HY pRNA) para dar un conjugado CAN como se describe en el Ejemplo 1.4.

Figura 6 (no perteneciente a la invención): Una ilustración de la conjugación de un DNA modificado con 3'-glicerilo (Gly NA) por la vía del DNA aldehídico oxidado (OB NA) intermedio con un pRNA marcado con 2'Cy3 y modificado con 4'-monohidracida (L HY pRNA) para dar un CAN conjugado como se describe en el Ejemplo
1.5.

Figura 7 (no perteneciente a la invención): La Figura 7A ilustra la inmovilización de ácidos nucleicos (NA) que están enlazados por un sitio de ramificación (BS) a una pluralidad de unidades de fijación idénticas para la inmovilización sobre materiales soporte (SM). Fig. 7B muestra el uso de dos sistemas de fijación sintéticos diferentes (SAU1 y SBU1 así como SAU2 y SBU2) para la inmovilización de un ácido nucleico a través de una estructura de ramificación. Una ventaja de estas estructuras es la energía de fijación aditiva incrementada que inmoviliza el ácido nucleico.

Figura 8 (no perteneciente a la invención): Un conjugado ilustrativo en el cual un ácido nucleico (NA) está enlazado por un sitio de ramificación (BS), o un resto de ramificación (W), a una pluralidad de unidades de fijación idénticas (SBU).

Figura 9 (no perteneciente a la invención): Un diagrama de algunas realizaciones posibles de direccionamientos de fijación sintéticos marcados y unidades sintéticas de fijación o conjugados. 9A muestra un conjugado de un ácido nucleico (NA) y unidad sintéticas de fijación (SBU) con un marcador en el extremo de la unidad de fijación, como por el extremo fosfato (SM = material soporte). B representa la configuración para el grupo marcador (M) que está localizado en cualquier posición en el conjugado, por ejemplo por el uso de un resto de marcación de base. C muestra el uso de un direccionamiento de fijación sintético marcado. D muestra el uso juego de dos grupos marcadores (M1 y M2) que se han ajustado uno a otro y dan una señal en la forma de apagado ("quench") de fluorescencia o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) cuando un conjugado se fija al direccionamiento de fijación
sintético.

Figura 10 (no perteneciente a la invención): Una ilustración de una realización adicional en la cual una pluralidad de especies moleculares diferentes o ácidos nucleicos (NA1 y NA2) están inmovilizados próximos uno a otro en la misma posición de la red, o sitio de captura. Esto puede conseguirse, como se representa en 10A por fijación de dos SAU's diferentes a un sitio para formar dos sistemas de fijación diferentes (SBS) en una localización de la red (L). O bien, como se representa en B, puede conseguirse el mismo efecto utilizando el mismo sistema de fijación (SBS), y utilizando conjugados de ácidos nucleicos diferentes (NA1 y NA2) con la misma SBU.

Figura 11 (no perteneciente a la invención): Una ilustración del uso de direccionamientos de fijación sintéticos y conjugados de unidades sintéticas de fijación con ácidos nucleicos para la construcción de redes en materiales soporte (SM). La figura A muestra una realización en la cual diferentes ácidos nucleicos (NA1, NA2, NA3, ...) están inmovilizados en localizaciones diferentes (L) del material soporte utilizando unidades de fijación diferentes (SBU1, SBU2, SBU3, ...) y unidades de direccionamiento diferentes (SAU1, SAU2, SAU3, ...). Las SAUs de las localizaciones están, por ejemplo, simplemente punteadas sobre redes pasivas, o pueden estar direccionadas electrónicamente a sitios de captura por encima de los electrodos en el caso de redes electrónicas activas. Una característica de la realización es que cada localización de la red lleva un direccionamiento de fijación distintivo. Aunque esto se ilustra en esta memoria como una SAU separada para cada SP, los direccionamientos distintivos pueden estar formados fácilmente por mezclas de SAU's (v.g., SAU1 & 2 en L1, SAU3 & 4 en L2, etc.). La Figura 11B muestra que para inmovilizar un ácido nucleico (NA) sobre un material soporte (SM) SBU (en este caso pRNA) y SAU (en este caso CAN) no precisan pertenecer a una misma clase molecular. Cualesquiera moléculas estéricamente compatibles que formen una inmovilización estable y selectiva después de su reconocimiento son adecuadas para uso en estos
formatos.

Figura 12 (no perteneciente a la invención): Un diagrama que muestra una realización de método para utilizar unidades sintéticas de fijación y conjugados de unidades sintéticas de direccionamiento con ácidos nucleicos para construir redes sobre materiales soporte. Como se ilustra, las posiciones individuales de la red pueden direccionarse específica e independientemente unas de otras por utilización de superficies de red con localizaciones individualmente activables, tales como, por ejemplo, redes electrónicas activas. Inicialmente, se fijan N direccionamientos de fijación diferentes (a, b, c, ... N) a la superficie del material soporte. En este paso, se fijan unidades sintéticas de direccionamiento a grupos de un número M de sitios activos utilizando el mismo método de inmovilización (v.g., interacción biotina-estreptavidina, o química de ésteres activos con hidracida) en varios pasos (v.g. aplicación por puntos o direccionamiento electrónico). La inmovilización se lleva a cabo preferiblemente de tal manera que se depositan unidades sintéticas de fijación idénticas en filas o columnas, aunque pueden utilizarse otras geometrías (v.g., cuadrados, cruces, círculos, o incluso grupos de sitios elegidos aleatoriamente). Así, se obtiene una red de N direccionamientos de fijación diferentes, en la cual cada unidad aparece en una repetición de M veces (Fig. 12A). En los pasos siguientes, conjugados de ácidos nucleicos y unidades sintéticas de fijación se ponen en contacto con la red generada previamente. Aunque esto puede llevarse a cabo individualmente utilizando conjugados SBU/MA individuales, se utilizan ventajosamente juegos de conjugados SBU/NA diferentes para inmovilizar hasta N ácidos nucleicos diferentes codificados por SBU (sic) en un solo paso. Es portante que el método puede utilizarse sólo en aquellas redes en las cuales las posiciones individuales de la red pueden activarse específica e independientemente unas de otras, v.g. en redes electrónicas activas. Las posiciones activadas en cada paso crean una condición que es favorable para la fijación de las SBUs con las SAUs unidas. En la realización preferida, mezclas de N conjugados diferentes (o grupos de conjugados codificados por SBU) están direccionadas a N posiciones de la red, y este direccionamiento puede llevarse a cabo secuencialmente o en paralelo a todas las posiciones N. Estas juegos pueden contener N ácidos nucleicos diferentes (v, w, x, y, ... N) todos los cuales están conjugados con una unidad sintéticas de fijación individual (a', b', c', ... N). El reconocimiento específico de la unidad sintética de direccionamiento fijada por las unidades de fijación conduce sólo al tipo de ácido nucleico que se ha conjugado con la unidad sintética de fijación correspondiente complementaria a la unidad de fijación fijada, que está inmovilizada en cada posición de la red. Dicho de otro modo, el juego de conjugados se distribuye a localizaciones específicas. Así, en un solo paso de proceso se inmovilizan N conjugados diferentes (a'-v1, b'-w1, c'-x1, d'-y1, ... N). Aunque se muestra aquí un esquema de direccionamiento fila/columna, son posibles otras geometrías. Después de la fijación de cada juego de conjugados a cada juego de localizaciones activado, se retiran los conjugados no ligados. Este procedimiento puede repetirse luego utilizando un nuevo segundo juego de conjugados (a'-v2, b'-w2, c'-x2, d'-y2, ... N). En cada repetición, se inmovilizan de nuevo hasta N conjugados en paralelo. Así, después de M repeticiones, se inmovilizan en la red W conjugados diferentes, con
W = N x M.

Figura 13 (no perteneciente a la invención): muestra realizaciones adicionales para utilización de sistemas sintéticos de fijación para la inmovilización de ácidos nucleicos sobre un material soporte. Fig. 13A muestra un ejemplo de una red de N unidades de direccionamiento diferentes. En realizaciones adicionales, puede ser deseable unir unidades de direccionamiento individuales dos o más veces a posiciones diferentes de la red para direccionamiento duplicado en dichas posiciones. Esta realización es típica para redes pasivas, aunque puede utilizarse también en sistemas de redes de localización activos. Fig. 13B muestra, a modo de ejemplo, una realización para utilización de sistemas de fijación sintéticos para generar redes de ácidos nucleicos para los análisis de diferentes muestras de ácidos nucleicos, como puede aplicarse a estudios de expresión génica. En este caso, tiempos, etapas o poblaciones diferentes de ácidos nucleicos, por ejemplo secuencias sonda de genes particulares que se han hibridado a muestras diferentes, se comparan unos con otros en una red. En este caso, a modo de ejemplo, se representa la inmovilización de tres veces T1, T2, T3 de diversas secuencias de ácido nucleico (genes; S1, S2, S3, ...). Inicialmente, se prepara una red de unidades sintéticas de direccionamiento fijadas. Las veces a comparar pueden diferenciarse después de ello por juegos particulares de SBU's conjugado con el juego de secuencias de ácido nucleico a monitorizar. Las veces a comparar pueden dejarse asociar con las SAU's simultánea o secuencialmente. El reconocimiento específico de unidades sintéticas de direccionamiento por las unidades sintéticas de fijación inmoviliza en cada posición de la red únicamente el conjugado perteneciente específicamente a la posición, localizando así los ácidos nucleicos de la muestra hibridados de acuerdo con la SBU utilizada. Una ventaja del direccionamiento simultáneo de varias muestras de una vez, es que la variabilidad en las condiciones de hibridación causada por la incubación individual de las muestras con la red puede evitarse, permitiendo una comparación más rigurosa y cuantitativa de los resultados. Adicionalmente, la capacidad para ensayar muestras múltiples en un solo ciclo ahorra tiempo en comparación con el direccionamiento individual, o la hibridación con redes separadas.

Figura 14 (no perteneciente a la invención): Un gráfico del resultado de un experimento de resonancia de plasmones de superficie (SPR) en el cual 14 unidades sintéticas de direccionamiento están en contacto con 14 unidades sintéticas de fijación. La señal creciente desde la línea base hacia arriba indica fijación. Como sería de esperar, todas las unidades de direccionamiento se ligan a la unidad de fijación específica correspondiente en cada caso (v.g. 102a a 102b). Algunas unidades de direccionamiento y unidades de fijación, sin embargo, muestran cierto grado de asociación cruzada con unidades que no son exactamente complementarias (v.g. 105b con 110a). Series de unidades de fijación en los cuales dichas reacciones de asociación cruzada están reducidas sustancialmente, se dice que son "ortogonales". Aunque son adecuadas para algunos usos, las unidades no ortogonales no deberían utilizarse juntas en un juego de sistemas de fijación sintéticos cuando se desea una distribución estricta de acuerdo con las unidades de direcciona-
miento.

Figura 15 (no perteneciente a la invención): Una fotografía y gráfico de la asociación específica de unidades de fijación marcadas fluorescentemente a unidades sintéticas de direccionamiento unidas a la superficie de una red electrónica activa. Las señales de fluorescencia más fuertes se encuentran todas ellas en una diagonal con los pares SBU-SAU específicos, como era de esperar.

Figura 16 (no perteneciente a la invención): Un gráfico de la asociación de conjugados de ácidos nucleicos CNA y pRNA/SBUs con pRNA/SAU's unidas a la superficie del chip SPR, que demuestra también la fijación específica entre los pares coordinantes. 102b, 103b, 104b, y 105b, biotinilados en 4', preparados como en el Ejemplo 2.1, se inmovilizaron en los canales del Chip Sensor como se describe en el Ejemplo 8. Los conjugados IL4RP102a, IL4RP103a, e IL4RP104a, preparados como en el Ejemplo 1.1, se ensayaron luego secuencialmente respecto a fijación a las SAUs en los canales.

Figura 17 (no perteneciente a la invención): Un gráfico de la inmovilización de un conjugado IL4RP102a (Ejemplo 1.1) por la unidad sintética de direccionamiento biotinilada 102b (Ejemplo 2.1) en un chip SPR e hibridación subsiguiente de la parte de ácido nucleico del conjugado con tres fragmentos de DNA complementarios. IL4RP102C1 era una secuencia complementaria para la totalidad salvo los tres nucleótidos 5' de la porción NA de IL4RP102a, IL4RP102C2 era una secuencia totalmente complementaria, y IL4RP102C3 era una secuencia totalmente complementaria más tres nucleótidos. Este experimento ilustra también la posibilidad de que las SAUs unidas se utilicen repetidas veces por simple separación de los conjugados SBU ligados con una solución moderadamente básica (v.g. NaOH 10 mM).

Figura 18 (no perteneciente a la invención): Un diagrama de la disposición y fotografías negativas de los resultados del Ejemplo 5.2. Mezclas de conjugados de unidad sintéticas de fijación -ácido nucleico marcadas con cy3 y una sin marcar (SBU-NA) se direccionan a una red electrónica activa. Cada conjugado se inmoviliza a la posición con la unidad sintética de direccionamiento coincidente (SAU). La fluorescencia medida se presenta como un diagrama y una imagen de chips.

Figura 19 (no perteneciente a la invención): 19A: Un diagrama del uso de un CNA conjugado de una unidad sintéticas de fijación (SBU) y una sección de ácido nucleico (NA) como el sustrato (iniciador) para una polimerasa (E) que realiza una síntesis de ácido nucleico dependiente del molde, un primer paso en reacciones de amplificación. 19B: Un diagrama del uso de un CNA conjugado de una unidad sintética de fijación (SBU) y una sección de ácido nucleico (NA) como el sustrato de una ligasa monocatenaria (E) que enlaza el conjugado a un ácido nucleico. Aunque se muestra con una sección de NA relativamente larga en el conjugado, las reacciones de ligasas pueden utilizar conjugados con un solo residuo de ácido nucleico.

Figura 20A & B (no perteneciente a la invención): Diagramas del uso de un CNA conjugado de una unidad sintética de fijación (SBU) y una sección de ácido nucleico (NA) como sustratos para reacciones de nucleasas. A: El conjugado y un ácido nucleico diana se escinden en una reacción de endonucleasa de restricción (E). Esta reacción puede ser especialmente útil cuando se acopla con marcación por transferencia de energía fluorescente, como se muestra aquí. Las emisiones de un resto fluoróforo (F) pueden enmascararse situando un resto de apagado (Q) en el mismo conjugado. Después de la escisión, las emisiones del fluoróforo ya no son absorbidas por el resto de apagado, y se hacen visibles. El proceso de esta reacción puede cuantificarse dinámicamente (tiempo real), o después de haberse completado, a fin de cuantificar la cantidad de la diana en la muestra. B: El ácido nucleico diana es degradado selectivamente por una endonucleasa (E) cuando se híbrida a la porción del ácido nucleico conjugado. Esto puede ser especialmente útil para degradación de ácidos nucleicos diana RNA con RNAsas bicatenarias específicas, tales como la
RNAsaH.

Figura 21: Una ilustración de conjugados pRNA-DNA representativos que pueden obtenerse de acuerdo con los métodos de esta invención. A: Un conjugado NA/SBU de un pRNA (SBU) con 2'-Ome-RNA (NA) y 5'fosfato (P) (un sustrato adecuado para una reacción de ligasa); el conjugado lleva adicionalmente un tinte de fluorescencia en su extremo 3'. B: Un conjugado NA/SBU de una unidad pRNA (SBU) y un DNA (NA) con extremo 3' libre (un sustrato adecuado para una reacción de polimerasa o endonucleasa de restricción).

Figura 22: A: Una fotografía de un gel de agarosa que muestra la formación de productos específicos de amplificación en una reacción PCR utilizando conjugados pRNA-DNA como iniciadores de acuerdo con los métodos de esta invención. Para comparación, se aplicaron también mezclas que utilizaban iniciadores de DNA estándar (véase el Ejemplo 2). B: otra fotografía de un gel de agarosa que muestra el resultado de una reacción PCR en gran escala utilizando conjugados NA/SBU como iniciadores (véase el Ejemplo 3).

Figura 23: Una fotografía de un gel de poliacrilamida al 10% que muestra los productos de fijación de un conjugado marcado por fluorescencia de pRNA y 2'-Ome-RNA con un RNA diana formado de acuerdo con los métodos de esta invención, a la vez con sombreado UV y producción de imagen por fluorescencia. Debido a su corta longitud, el conjugado libre NA/SBU no ligado no se presenta en el gel (véase Ejemplo 4). Las pistas de los geles son como
sigue:

: Pista 1: RNA aceptor (control negativo)

: Pista 2: Mezcla de fijación con 100 pmol de RNA aceptor y 300 pmol de pRNA híbrido

: Pista 3: Mezcla de fijación con 100 pmol de RNA aceptor y 1000 pmol de pRNA híbrido

: Pista 4: Mezcla de fijación con 100 pmol de RNA aceptor y 300 pmol de pRNA híbrido

: Pista 5: Mezcla de fijación con 100 pmol de RNA aceptor y 1000 pmol de pRNA híbrido.

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Figura 24 (no perteneciente a la invención): Una ilustración que muestra, esquemáticamente, una red de SAU en localizaciones (L) a las cuales se han direccionado una juego de iniciadores SDA distintos por la interacción entre la SAU y SAU.

Figura 25 (no perteneciente a la invención): Una ilustración que muestra que dos iniciadores diferentes pueden direccionarse utilizando un solo SBS con empleo de un enlazador ramificado para unir los iniciadores a una
SBU.

Figura 26 (no perteneciente a la invención): Una ilustración que muestra la arquitectura general del constructo SDA anclado a SBU. Los iniciadores SDA contienen un molde de sitio de restricción y una región complementaria al DNA diana. Los iniciadores amortiguadores son secuencias complementarias a una región del DNA diana aguas arriba de donde se liga el iniciador SDA. Los iniciadores amortiguadores forman los sitios de iniciación para la polimerasa y conducen al desplazamiento inicial de la cadena del ácido nucleico diana desde el iniciador extendido.

Figuras 27A Y 27B (no perteneciente a la invención): Una ilustración de los pasos de iniciación para SDA anclado a SBU (fase 1): Copia de la secuencia diana en el iniciador SDA anclado a SBU, desplazamiento del DNA genómico por extensión desde el iniciador amortiguador 1, activación del sitio de restricción, y generación de cadenas F1 desplazadas.

Figura 27C (no perteneciente a la invención): Una ilustración de las reacciones de amplificación lineal de SDA anclado a SBU (fase 2): La generación de un amplicón anclado monocatenario para cada cadena desplazada en fase 1 capturada.

Figuras 27D Y 27E (no perteneciente a la invención): Una ilustración de las reacciones de amplificación exponenciales de SDA anclado a SBU (fase 3): activación de los sitios de restricción en ambos amplicones anclados. Generación de cadenas S1 y S2 desplazadas, y amplificación exponencial por puenteado y captura.

Figura 28 (no perteneciente a la invención): Una ilustración del experimento de direccionamiento específico descrito en el Ejemplo 5.3. Las dos primeras columnas de conjugados, ácido nucleico/SBU direccionados e inmovilizados y ácidos nucleicos hibridados marcados se ilustran por las cifras pequeñas bajo los encabezamientos "columna 1" y "columna 2". La señal fluorescente verde se muestra a la izquierda, y la señal fluorescente roja se muestra a la derecha, para cada una de las dos columnas. Obsérvese que este experimento demuestra que no existe hibridación significativa alguna de las secuencias complementarias a localizaciones no activadas dentro de la red, permitiendo el aislamiento eficaz de las reacciones de hibridación utilizando las mismas secuencias de muestras diferentes en localizaciones diferentes.

Los solicitantes han demostrado varias mejoras en la producción y uso de conjugados que comprenden al menos un ácido nucleico (NA) y al menos una unidad sintética de fijación (SBU), en donde la unidad sintética de fijación es capaz de reconocer específicamente una unidad de sintética de direccionamiento molecular (SAU) unida a una superficie. El reconocimiento específico de SBUs por SAUs puede conducir a constructos que incluyen un sistema de fijación sintético (SBS) compuesto de una unidad sintética de fijación y una unidad sintética de direccionamiento. A partir de esta idea básica para un sistema de inmovilización de ácido nucleico, pueden realizarse muchas variaciones de redes de ácido nucleico inmovilizado. Éstas incluyen redes ensambladas tanto pasiva como activamente de ácidos nucleicos inmovilizados que difieren en términos de secuencia, origen (v.g. de muestras diferentes), tipo (RNA, DNA, etc.), o en otros aspectos. Por utilización de los sistemas sintéticos de fijación descritos, pueden distribuirse mezclas relativamente complejas de ácidos nucleicos eficiente y específicamente a localizaciones predeterminadas sobre un soporte para análisis fácil o uso ulterior en ensayos biológicos basados en ácido
nucleico.

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Conjugados para uso en los métodos de la presente invención

Así pues, la base de la presente invención son conjugados que comprenden al menos un ácido nucleico (NA) y al menos una unidad sintética de fijación (SBU), de acuerdo con la reivindicación 1. De este modo es posible, por ejemplo, enlazar ácidos nucleicos, oligonucleótidos o polinucleótidos, a uno o más componentes pRNA y/o pDNA de tal modo que las moléculas formen una unidad estable, un conjugado, en las condiciones requeridas para utilización. En este contexto, la conjugación tiene que ser covalente.

El término "ácidos nucleicos", como se utiliza en esta memoria, incluye ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos y otras moléculas que son capaces de hibridarse específicamente a su complemento (o complemento parcial), y que están compuestas de nucleótidos naturales o modificados. Moléculas consideradas como ácidos nucleicos, oligonucleótidos o polinucleótidos son todos los oligómeros y polímeros que existen naturalmente o bien pueden prepararse por síntesis y que tienen la capacidad de hibridarse con oligómeros de ácidos nucleicos existentes naturalmente. Debe indicarse que, como se utiliza en esta memoria, los "ácidos nucleicos" pueden diferenciarse por secuencia de bases, por composición química (v.g., DNA frente a RNA), o simplemente por origen natural o diseñado arbitrariamente (v.g. una secuencia amplificada de dos muestras). Por ejemplo, NA_{1}, y NA_{2} pueden ser distintos debido a que son dos partes alícuotas que se han dispensado por separado de la misma amplificación PCR del mismo gen a partir de las mismas células muestra. Usualmente, sin embargo, los ácidos nucleicos se considerarán distintos sobre la base de secuencia u origen a partir de una muestra separada.

Los ácidos nucleicos tienen una estructura algo repetitiva químicamente constituida por unidades de bases heterocíclicas nitrogenadas de reconocimiento de monómeros enlazadas a través de una cadena principal, usualmente un azúcar furanosilo con puentes fosfodiéster en ácidos nucleicos existentes naturalmente. Los ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos tienen normalmente una estructura polímera lineal, pero se han ideado estructuras de ácido nucleico ramificadas utilizando modificaciones químicas y diversos restos de ramificación durante la síntesis química. Ejemplos de ácidos nucleicos existentes naturalmente son DNA y RNA, en los cuales los monómeros nucleosídicos comprenden 2-desoxi-D-ribosa y D-ribosa, respectivamente. En DNA y RNA, se encuentran ambos en forma de furanosa, y son por enlaces fosfodiéster (sic) para formar la cadena principal del polímero. Las bases heterocíclicas nitrogenadas unidas por enlaces N-glicosídicos forman la estructura de reconocimiento específica que permite que el DNA y el RNA se apareen específicamente basándose en la secuencia de las
bases.

Ejemplos de oligonucleótidos y polinucleótidos no naturales son los derivados químicamente modificados de DNA, y RNA tales como, por ejemplo, sus fosforotioatos, fosforoditioatos, metilfosfonatos, 2'-O-metil-RNA, 2'-fluoro-RNA. Adicionalmente, moléculas más diferentes estructuralmente que pueden aparearse con DNA y RNA se incluyen también dentro de la definición de ácidos nucleicos, como ácidos nucleicos inmovilizados (LNA) o ácidos nucleicos peptídicos (PNA) (Sanghivi, Y. S., Cook, D. P., Carbohydrate Modification in Antisense Research, American Chemical Society, Washington 1994; Uhlmann; Peyman; Chemical Abstracts 90(4), 543-584 (1990)). Una característica clave de todos los ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos, como se definen en esta memoria, es su capacidad para aparearse con o ligarse a los ácidos nucleicos existentes naturalmente.

Una categoría especial de ácidos nucleicos, como se definen en esta memoria, son los aptámeros, o aptazimas. Estas moléculas, que están compuestas de nucleótidos, que son funcionalmente (si no estructuralmente) distinguibles por su afinidad específica, o fijación a moléculas diana (sic). El conocimiento molecular de aptámeros y aptazimas está basado en la fijación que está mediada por la estructura espacial y dinámica y la presentación espacial de partes de la molécula, similar al principio de reconocimiento anticuerpo-antígeno. Los restos de bases nitrogenadas polares de los aptámeros de ácido nucleico, dispuestos en la secuencia de los nucleótidos, son por tanto capaces de formar una "mano" dispuesta espacialmente para agarrar la molécula diana. Además de sus propiedades específicas de reconocimiento, las aptazimas poseen una función catalítica. Por ejemplo, por "brings" (sic) un par de moléculas diana reaccionantes en proximidad en la relación espacial apropiada, la aptazima puede producir un ambiente termodinámico favorable para promover la reacción.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con esta definición incluyen también aquellas moléculas que contienen además de la secuencia de ácido nucleico requerida para apareamiento o reconocimiento molecular de moléculas diana potenciales, partes adicionales que sirven para otros propósitos tales como, por ejemplo, detección, conjugación con otras unidades moleculares, espaciamiento o ramificación. Las moléculas incluyen en particular los conjugados covalentes o no covalentes estables de ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos con tintes fluorescentes, péptidos, proteínas, anticuerpos, aptámeros, moléculas orgánicas e inorgánicas.

En particular, puede desearse marcar el ácido nucleico, o la SBU, de un conjugado con un resto de marcación detectable. A menudo, el resto de marcación está unido al conjugado en el extremo del NA o la SBU que está opuesto al sitio de conjugación, como se ilustra en la Figura 5. Los marcadores son útiles para varios propósitos en los sistemas de la invención, que incluyen el aseguramiento de que un ácido nucleico ha quedado inmovilizado en una localización particular por la SBS, y la cuantificación de un conjugado modificado enzimáticamente que ha incorporado, v.g., una base marcada, o había escindido un de apagado, como en la Figura 20. Restos de marcación preferidos para uso en la presente invención incluyen restos fluorescentes, restos de apagado, restos de tintes visibles, restos radiactivos, restos quimioluminiscentes, restos biotina, restos hapteno, restos de micropartículas (v.g., microesferas coloidales de oro visibles, microesferas fluorescentes, etc.), micropartículas (para)magnéticas, y restos de marcación enzimáticos. En particular, se prefieren restos fluorescentes debido a su fácil manipulación y seguridad. Restos fluorescentes adecuados para uso en la presente invención incluyen tintes BODIPY^{TM}, restos cianina, tintes Alexa^{TM}, tintes de fluoresceína, tintes de rodamina, tintes de ficoeritrina, tintes de cumarina, tintes Rojo Texas, Lissamina^{TM}, FAM, HEX, TET, TAMRA, ROX, EDANA, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianato-estilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, succinimidil-pireno-butirato, isotiocianato de acridina, Azul Cascada, Verde Oregón, Amarillo Lucifer-vinil-sulfona, e IR1446 (Tinte Láser Kodak^{TM}). Además de restos fluorescentes, puede ser deseable utilizar un resto de apagado para absorber longitudes de onda luminosas particulares. Restos de apagado adecuados para uso en la presente invención incluyen restos Black Hole Quencher^{TM}, DABCYL, Rojo Reactivo 4 (Cibacron Brilliant 3B-A), Verde Malaquita, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC), y ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico \Boxequenze (sic).

Las parejas de un sistema de fijación que se ligan específicamente uno a otro se designan por unidad de fijación y unidad de direccionamiento. La parte del sistema de fijación que se fija a los materiales soporte se conoce como unidad sintética de direccionamiento (SAU), mientras que la parte conjugada al ácido nucleico contiene la unidad sintética de fijación complementaria (SBU). Así pues, los ácidos nucleicos en los conjugados utilizados en la presente invención están enlazados a unidades sintéticas de fijación que son capaces de reconocer específicamente una unidad sintética de direccionamiento complementaria fijada a un material soporte. Las unidades sintéticas de fijación (SBUs) y las unidades sintéticas de direccionamiento (SAUs), utilizadas en esta invención son unidades moleculares que son capaces de un apareamiento molecular específico. Cuando la SBU y la SAU se reconocen y aparean, las dos forman un complejo supramolecular estable y específico, un sistema de fijación sintético (SBS). Aunque las SBU/SAUs que pueden utilizarse en la invención no están limitadas a una especie molecular particular (v.g., pRNA o pDNA), las mismas pueden describirse en términos de sus funciones y características clave.

Una característica de los sistemas de fijación es que la fijación de los componentes del sistema de fijación es normalmente reversible y que la posición del equilibrio entre los componentes libres y complejados del sistema de fijación puede verse influenciada por temperatura, pH, concentración y otras condiciones de la solución con objeto de promover el suceso de fijación, o de desprender las SBUs asociadas de sus SAUs correspondientes. Otras características primarias de los sistemas sintéticos de fijación son que los mismos tienen origen no natural, y no mimetizan la relación espacial de las estructuras de hibridación de los ácidos nucleicos. Así pues, las SBU/SAUs utilizadas se han preparado por síntesis, y tienen la ventaja de no interaccionar con los ácidos nucleicos naturales. Otra ventaja es la posibilidad de formar complejos más estables que los ácidos nucleicos de origen natural, en particular con respecto a procesos de degradación enzimáticos. Dado que los sistemas de fijación sintéticos no se aparean con, o se hibridan o ligan a ácidos nucleicos, oligonucleótidos o polinucleótidos, el uso de tales sistemas para distribución e inmovilización de los ácidos nucleicos no conduce a interacción indeseable o interferencia por el componente de inmovilización con los ácidos nucleicos (NA), otras biomoléculas u otros componentes de la
muestra.

Unidades monómeras que pueden utilizarse para la síntesis de sistemas de fijación sintéticos son pRNAs o pDNAs. Tales bloques de construcción se describen, por ejemplo, en WO98/25943, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161-2183, Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621-1635, Helv. Chim. Acta 1996, 79, 2316-2345, Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 1901-1951, WO99/15539 ("pRNA"), WO99/15509 ("CNA") y por Beier, M.; et al.; Science 283, 699-703 (1999). Las características útiles de estas moléculas son también aplicables generalmente a estructuras en gran parte análogas que tienen, v.g., un resto de eslabonamiento diferente además del fosfato entre los residuos azúcar de la cadena principal, u otras alteraciones menores. Es interesante indicar que SBUs y SAUs que utilizan estos tipos de unidades monómeras pueden estar constituidas por diferentes clases de monómeros, en tanto que se mantenga el reconocimiento específico. Sistemas de fijación heterólogos que se prefieren en este contexto son pRNA/pDNA, pRNA/CAN o pDNA/CAN. Sin embargo, es todavía más preferido que la SBU y la SAU utilicen la misma clase de monómeros.

pRNA o pDNA forman sistemas de fijación sintéticos (SBS) que se aparean de manera selectiva y estable. La estabilidad de la formación del par depende del número, composición y secuencia de los bloques de construcción monómeros en el sistema de fijación oligómero y del número de interacciones de apilamiento de bases entre las cadenas (apilamiento de bases intercatenario). Al contrario que los ácidos nucleicos existentes naturalmente, la fuerza de la interacción de SBS para pRNA y pDNA es inicialmente más fuerte que para un ácido nucleico que utilice la misma secuencia, y la fuerza de la interacción aumenta en un intervalo dinámico más amplio a medida que aumenta la longitud de la secuencia de apareamiento. Así, pueden idearse fácilmente SBSs con pRNA y pDNA que tienen una fuerza de fijación aumentada mayor que la de los ácidos nucleicos naturales, y que se mantendrán unidos en condiciones que son severas para las porciones de la secuencia de ácido nucleico de los conjugados. La región SBU o la región SAU que produce un reconocimiento específico comprende preferiblemente de 3 a 15, más preferiblemente de 6 a 10 monómeros. Secuencias específicamente útiles para uso en bibliotecas o juegos de conjugados se describen más adelante.

Los sistemas de fijación sintéticos (SBS) o componentes de los mismos (SBU y SAU) no pueden en sí mismos ser sintetizados, amplificados, modificados, procesados, ligados, fragmentados o hidrolizados por enzimas que son conocidas por la tecnología de los ácidos nucleicos, tales como polimerasas, ligasas, nucleasas, enzimas de restricción, etc., por ejemplo. Esta propiedad es particularmente ventajosa cuando se utilizan conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos, dado que la parte del asociado, que está relacionada con el sistema sintético de fijación, no es modificada, inmovilizada, separada o procesada por los pasos enzimáticos normalmente necesarios para procesamiento de la muestra o del ácido nucleico, tal como una amplificación precedente, por ejemplo. La propiedad es también ventajosa, debido a que el sistema de fijación sintético (SBS) o sus componentes (SAU/SBU) no están sometidos a degradación por las enzimas que pueden estar contenidas en la
muestra.

Como se ha mencionado arriba, los sistemas sintéticos de fijación (SBS) y/o las unidades sintéticas de fijación (SBU) y/o las unidades sintéticas de direccionamiento (SAU) pueden contener grupos moleculares adicionales que se utilizan para detección, conjugación con otras unidades moleculares, espaciamiento o ramificación. Los grupos moleculares incluyen en particular los conjugados covalentes o estables no covalentes de pRNA o pDNA con restos de marcación como se ha descrito arriba.

Ejemplos específicos de tales conjugados que utilizan pRNA y pDNA para el componente SBU han sido descritos previamente en WO99/15893 (USSN. 09/509.051, presentado en fecha 20 de marzo de 2000), WO99/15542 (USSN, 09/509.011, presentado en fecha 20 de marzo de 2000), WO99/15541 (USSN 09/509.039, presentado en fecha 20 de marzo de 2000), y WO99/15509 (USSN 09/509.040, presentado en fecha 20 de marzo de 2000).

Una opción para la preparación de conjugados con un extremo 3' libre en la porción de ácido nucleico consiste en iniciar la síntesis del sistema de fijación sobre el soporte CPG, y ensamblar luego el ácido nucleico detrás de la SBU. Si se utilizan bloques de construcción inversos para este propósito, es posible sintetizar el ácido nucleico en la dirección 5' \rightarrow 3'. El resultado es un eslabonamiento como se representa en Fig. 1B y Fig. 2B/2E. Siempre que no se requiera extremo libre 3' alguno en la parte del ácido nucleico, la síntesis del ácido nucleico puede llevarse a cabo con bloques de construcción estándar en la unidad de fijación. El resultado es un eslabonamiento como se representa en Fig. 1A y Fig. 2A/D (véase: DE 19741715 o WO99/15539: "Pentopyranosylnucleosid, seine Herstellung und Verwendung").

Los solicitantes han ideado recientemente métodos mejorados para la síntesis directa en fase sólida de pRNA, pDNA, u otros conjugados fosfato-cadena principal. Resultó sorprendente para los solicitantes encontrar que es posible preparar conjugados de sistemas de fijación sintéticos y ácidos nucleicos de modo particularmente fácil en una síntesis química en fase sólida, si se aplica una estrategia particular de grupos protectores. En el grupo protector alilo utilizado previamente, y su desprotección en el fosfoéster de pRNA utilizando catalizadores de paladio, conducía a fragmentación parcial del oligómera sintetizado durante la desprotección cuando se sintetizaban cadenas relativamente largas sobre el soporte. En contraste, la utilización de un grupo protector \beta-cianoetilo y el paso de desprotección estándar con hidracina conducen a rendimientos muy bajos del pRNA conjugado deseado. La eliminación del grupo \beta-cianoetilo por hidracina, y conversión deseada en un fosfodiéster que puede ser desprotegido por la hidracina, es más lenta que la reacción secundaria indeseable de escisión nucleófila de los enlaces fosfotriéster del conjugado por hidracina. Sorprendentemente, el tratamiento del conjugado pRNA-pDNA mientras está ligado al soporte CPG con una solución de una alquilamina en un disolvente inerte después de la culminación de la síntesis, evita este problema. Después del tratamiento, el grupo protector \beta-cianoetilo puede desprotegerse con hidracina sin escisión del conjugado pRNA-DNA. Preferiblemente, se utiliza una alquilamina secundaria en un disolvente inerte. Alquilaminas secundarias preferidas incluyen dimetilamina, dietilamina, dipropilamina, dibutilamina, dipentilamina, dihexilamina, di-N-octilamina, di-N-decilamina, didodecilamina, N-etilmetilamina, N-metil-N-propilamina, N-metilbutilamina, N-metilpentilamina, N-metilhexilamina, N-etilpropilamina, N-(N-butil)-N-propilamina, N-amil-N-butilamina, N,N-di-N-butil-1,6-hexanodiamina, N,N'-dimetil-1,3-propanodiamina, N,N'-dimetil-1,6-hexanodiamina. Es particularmente preferida la dietilamina. La alquilamina se encuentra preferiblemente en solución a una concentración de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 10%, de modo más preferible desde aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, y de modo más preferible a una concentración de aproximadamente 1,5%. Disolventes adecuados para uso incluyen diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano, tetrahidrofurano, tolueno, dietiléter, etanol, metanol, acetonitrilo, hexano, y heptano. Los solicitantes han encontrado que es particularmente adecuada una solución aproximadamente al 1,5% de dietilamina en diclorometano. El compuesto intermedio obtenido después del tratamiento puede desprotegerse fácilmente por hidracina y purificarse por cromatografía. Así pues, pueden fabricarse ahora fácilmente conjugados pRNA-DNA sintetizados directamente con rendimiento
satisfactorio.

A menudo es deseable enlazar sistemas de fijación pre-sintetizados a ácidos nucleicos acabados. Los ácidos nucleicos que se obtienen a partir de fuentes naturales o por reacciones enzimáticas tales como, v.g., transcripción in vitro (utilizada también frecuentemente para preparación de aptámeros y aptazimas) son más ventajosamente conjugados a SBSs con un enlazador funcional. Sin embargo, muchos métodos bioquímicos de conjugación descritos en la bibliografía (v.g. Hermanson, G.T.: Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996) han resultado químicamente inadecuados para los ácidos nucleicos y/o las unidades sintéticas de fijación. Varios métodos para enlace de ácidos nucleicos con ácidos nucleicos utilizan la hibridación de los ácidos nucleicos a fin de conseguir la unión y el posicionamiento iniciales, seguidos por enlace covalente de las cadenas (v.g. fotoquímicamente por la vía del psoraleno). Tales métodos no son útiles para conjugación SBU/NA, dado que las SBUs no se aparean con ácidos nucleicos.

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SAUs para uso con los conjugados de SBU preparados de acuerdo con la invención

Las SAUs son los pares de fijación específicos coordinantes de las SBUs de los conjugados, y por tanto comparten generalmente características similares con las SBUs. La diferencia principal es que las SAUs están unidas a un material soporte, en lugar de estar conjugadas a un ácido nucleico u otra biomolécula. Las SAUs pueden unirse a un soporte sólido único (como en una red rectangular plana) o a varios soportes distintos (como en un juego de cuentas, varillas de nivel, o los pocillos de una placa de microtitulación). Se da preferencia a la utilización de juegos de direccionamientos de fijación que no reaccionan cruzadamente en las condiciones de aplicación particulares (v.g., separados físicamente en una red plana, frente a la capacidad de interaccionar unos con otros en una juego de cuentas) y que reaccionan de manera similar a las condiciones de severidad tales como, por ejemplo, pH, fuerza iónica, temperatura, potencial eléctrico, agentes desnaturalizantes, etc., y que exhiben propiedades similares de estabilidad. Así pues, las SAUs pertenecen preferiblemente a una sola clase molecular (v.g., todas ellas pRNA, todas ellas CNA, etc.). Para realizaciones específicas, sin embargo, es también posible combinar SAUs con propiedades diferentes sobre el mismo
soporte.

Puede utilizarse cualquier material soporte adecuado como la superficie a la que se une la SAU. Por ejemplo, se pueden utilizar materiales sólidos insolubles en las condiciones de aplicación. Éstos incluyen silicio, dióxido de silicio, nitruro de silicio, vidrio de porosidad controlada, cerámicas, metales, preferiblemente metales preciosos, en particular oro o platino, o semiconductores, siliciuro metálico, plásticos y polímeros, con inclusión de polímeros conductores. Adicionalmente, pueden utilizarse como materiales soporte materiales porosos tales como sol-geles inorgánicos, e hidrogeles o biopolímeros. Éstos incluyen, por ejemplo, celulosa, agarosa-poliacrilamida, polimetacrilamida, e hidrogeles polímeros orgánicos. Las superficies de los materiales soporte pueden ser un solo material, o varios materiales en capas o revestimientos. Los revestimientos pueden encontrarse en la forma de capas monomoleculares, de un revestimiento que contiene una pluralidad de capas apiladas, o de un revestimiento que contiene capas desordenadas. La estructura de la capa de soporte dependerá de su propósito: por ejemplo, una superficie de cuentas de agarosa o pastillas de silicio puede servir simplemente como soporte sólido para localizar la SAU en una posición particular conocida. Redes de sensores, tales como los dispositivos SPR utilizados en los experimentos (sic), el soporte puede comprender una superficie metálica derivatizada para la unión directa de SAU al sensor. Inversamente, redes electrónicas activas, como las utilizadas en la construcción de redes supramoleculares activas más adelante, comprenden un electrodo en las localizaciones de la red por debajo de una capa de permeación (v.g., hidrogel de agarosa o
poliacrilamida).

Dado que los SBSs pueden utilizarse de modo particularmente ventajoso con redes electrónicas activas (como se describen los dispositivos en las patentes de referencia anteriores, incorporadas en esta memoria por referencia), esta realización particular se describirá con mayor detalle. Una característica particular de las capas de permeación utilizadas en redes electrónicas activas es que las mismas son porosas, permitiendo la penetración de conjugados, ácidos nucleicos o muestras profundamente en la capa, y proporcionando una gran área superficial para que ocurran interacciones. Estas capas de permeación separan también los ácidos nucleicos en las localizaciones activadas del ambiente electroquímico severo inmediatamente en el electrodo. Adicionalmente, las superficies de los materiales soporte o de polímeros aplicados a materiales soporte tienen frecuentemente grupos funcionales que permiten la unión covalente o estable no covalente o eslabonamiento de unidades de direccionamiento de los sistemas de fijación. Ejemplos de tales grupos funcionales son esteres activados, aldehídos, tioles, aminas, así como estreptavidina, avidina, y otras proteínas de fijación de biotina, etc.

Además de las redes electrónicas activas (como se describen en las patentes de referencia anteriores, y también en US 5.605.662, materiales soporte típicos incluyen también otros dispositivos, tales como chips sensores, chips con sistemas o canales de flujo continuo, sistemas de tipo fluido, cuentas, cuentas magnéticas, placas de microtitulación, fases cromatográficas estacionarias y otros materiales sólidos que pueden utilizarse en sistemas de ensayo hetero-
géneos.

Métodos Pasivos y Activos de Producción de Estructuras de Redes Supramoleculares

Como se ha descrito arriba, la formación de conjugados hace posible codificar los ácidos nucleicos individuales (NAs) con una o más unidades sintéticas de fijación. La codificación se define en esta memoria como la asignación inequívoca de una unidad sintéticas de fijación específicamente direccionable a un ácido nucleico de tal modo que subsiguientemente el ácido nucleico es específicamente susceptible de ser localizado espacialmente, inmovilizado, distribuido, y detectado por tanto sobre un material soporte por la interacción específica entre la unidad de direccionamiento y la unidad de fijación complementaria. De este modo, pueden prepararse juegos o bibliotecas de conjugados en las cuales diversos Nas son codificados por uno o un grupo de SBUs. Por ejemplo, puede producirse una biblioteca en la cual todos los NAs están codificados por una SBU diferente, o en la cual todos los NAs están codificados por un grupo conocido de SBUs. Inversamente, pueden producirse bibliotecas en las cuales todas las SBUs codifican un solo NA, o un grupo conocido de NAs. Si se produce una biblioteca en la cual todos los NAs están codificados por una SBU única exclusiva, resulta una biblioteca de conjugados 1:1 estricta.

Cuando se pone en contacto con la SAU coordinante en las condiciones apropiadas para fijación, la SBU de un conjugado se liga con la SAU para formar un ácido nucleico inmovilizado con SBS. La fijación específica de la unidad sintética de fijación (SBU) a la unidad sintética de direccionamiento (SAU) forma preferiblemente sistemas de fijación sintéticos (SBS) y constructos resueltos en posición, y esto conduce a la distribución y/o inmovilización de los conjugados en la superficie del soporte en localizaciones particulares en las que se unen las SAUs. Así pues, es ventajoso unir SAUs, o grupos definidos de SAUs, a localizaciones predeterminadas en el soporte, de tal modo que la identidad de los ácidos nucleicos inmovilizados pueda determinarse de una manera dependiente de la posición. Por ejemplo, las SAUs pueden unirse en una red de localizaciones (rectangular, circular, o cualquier otro patrón adecuado), a fin de producir una red de ácidos nucleicos inmovilizados en las localizaciones predeterminadas. Una mezcla de esta clase se prepara análogamente a los métodos utilizados en tecnología de chips de DNA (véase: Microarray Biochip technology; Schena, M. Eaton Publishing, Natick, 2000; DNA Microarrays, Schena, M., en Practical Approach Series, Oxford University Press, Oxford 1999). La unión de las unidades sintéticas de direccionamiento en el material soporte por un enlace covalente es particularmente ventajosa, aunque se han utilizado también sistemas de tipo biotina/estreptavidina con resultados satisfactorios. Sistemas ramificados en los cuales se proporciona una SAU con una pluralidad de hidracidas como grupos reactivos han resultado útiles, en particular con capas activas de permeación de éster en redes electrónicas activas. La provisión de una multiplicidad de grupos reactivos en una molécula conduce a una inmovilización más rápida y más estable en el material soporte (PCT/US 00/22205). (Véase Figura 4B). Si una localización comprende una mezcla de SAUs, entonces varios ácidos nucleicos con diferentes SBUs pueden inmovilizarse en la localización (véase Figura 10), o conjugados de ácidos nucleicos para SBUs múltiples diferentes pueden inmovilizarse en la localización (véase Figura 7).

Así pues, se utilizan conjugados en los cuales un ácido nucleico está conjugado con una pluralidad de unidades sintéticas de fijación (iguales o diferentes). Sistemas de esta clase son posibles utilizando bloques de construcción ramificados (Shchepinov, M. S.; Udalova, I. A.; Bridgman, A. J.; Southern, E. M; Nucleic Acids Res.; 25, 4447-4454 (1997)) en combinación con los métodos arriba descritos. Véase la Figura 7. La ventaja de una arquitectura molecular de este tipo es que, debido a los sistemas de fijación múltiples en un conjugado, la interacción del sistema de fijación móvil con la parte del sistema de fijación que está inmovilizada sobre el material soporte, se hace múltiple y cooperativa. Como resultado, es posible conseguir una inmovilización extremadamente estable de los conjugados sobre el material soporte para aplicaciones específicas, en tanto que se mantiene la selectividad del sistema de fijación. Como se ha expuesto anteriormente, estos sistemas permiten también el uso de SBUs más cortas para producir una mayor diversidad de pares de fijación específicos que la que es posible utilizando una sola SBU de la misma longitud. Sistemas de esta clase son nuevos y los solicitantes han podido obtenerlos por primera
vez.

La Figura 1 representa algunas de las posibles orientaciones de conjugados ligados a SAUs sobre la superficie de materiales soporte. Dependiendo de la aplicación, se prefieren realizaciones particulares. Para procesamiento enzimático de una parte de ácido nucleico de un conjugado como un iniciador para una reacción de polimerasa, el extremo 3' del ácido nucleico está preferiblemente libre. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por iniciación de la síntesis química sobre un soporte CPG con la parte de ácido nucleico seguido por la síntesis de la unidad de fijación sobre el ácido nucleico (Fig. 1C; Fig. 2C) (véase: DE 19741715 o WO99/15539: "Pentopyranosylnucleosid, seine Herstellung und Verwendung" [Pentopyranosyl nucleoside, and the preparation and use thereof']). Es posible aquí, en caso apropiado, como se representa en Fig. 2F, insertar segmentos como enlazadores o espaciadores por modificación del ácido nucleico o utilización de bloques de construcción modificados disponibles comercialmente, como se ha descrito arriba. Dicha separación de la unidad de fijación y el ácido nucleico es útil siempre que, en las condiciones de aplicación, la proximidad espacial de los sistemas conduzca a problemas estéricos, por ejemplo a una hibridación más deficiente del ácido nucleico con la muestra. Tales conjugados pueden obtenerse de modo particularmente eficaz por utilización del nuevo método de desprotección.

Los sistemas sintéticos de fijación, pRNA, pDNA y CNA forman pares sustancialmente más estables que los ácidos nucleicos existentes naturalmente, tales como DNA. Sorprendentemente, se ha encontrado que los oligonucleótidos de pRNA compuestos de ocho unidades monómeras (8-meros) alcanzan una estabilidad que es igualada en el caso del DNA únicamente por 25-meros. Adicionalmente, la estabilidad del pRNA está determinada por el número de interacciones de apilamiento de bases entre las cadenas en lugar de por el contenido de GC. Una interacción fuerte de apilamiento de bases de este tipo entre las cadenas por la vía de los sistemas de electrones \pi de las bases no es posible en la estructura helicoidal de DNA y RNA (véase Figura 3), en comparación con los efectos de energía de apilamiento de bases RNA/DNA normales. Como resultado, la estabilidad térmica aumenta continuamente con la longitud de la secuencia de dúplex o heterodúplex de pRNA, pDNA o CAN, y esto hace posible que los sistemas de fijación sintéticos toleren temperaturas de preparación y ensayo relativamente altas, que son más severas para los componentes de ácido nucleico de los conjugados.

Es ventajoso utilizar conjugados marcados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos para monitorización, control y aseguramiento de la calidad de la inmovilización sobre los materiales soporte (véase Figura 9). Marcadores adecuados son en este caso particularmente tintes fluorescentes, tintes ordinarios, radioisótopos y enzimas o micropartículas, como se ha descrito arriba. Éstos pueden detectarse por absorción o transmisión fluorescente, luminiscente (colorimétrica) del espectro visible, recuento por centelleo, u otros medios adecuados. Así, el conjugado de la unidad sintética de fijación y el ácido nucleico se proveen de un marcador que puede diferenciarse de un segundo marcador para detección de la interacción entre el ácido nucleico y los componentes de la muestra. Preferiblemente, los marcadores de "control de calidad" no interaccionan, interfieren o se solapan con el segundo marcador. La detección de la especie marcada en el conjugado o detección de la señal generada por la especie marcada indica si el conjugado ha sido inmovilizado como se desea. La unidad de direccionamiento de los sistemas de fijación sintéticos, que se ha inmovilizado sobre el material soporte, puede marcarse con una especie 1 que puede interaccionar específicamente con una especie marcada 2 que está conectada con el conjugado del sistema de fijación sintético y el ácido nucleico. Véase la Figura 9. Ejemplos típicos de tales interacciones son el apagado de la fluorescencia utilizando apagadores y la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Grupos preferidos para apagado de la fluorescencia son DABCYL y los restos Black Hole Quencher^{TM}. Los sistemas de esta clase indican ventajosamente por la interacción específica la inmovilización correcta de los conjugados. Dado que en el caso de la restricción de la fluorescencia la inmovilización correcta conduce a una disminución en la señal de fluorescencia, se obtienen conjugados inmovilizados sobre el material soporte, que pueden utilizarse para llevar a cabo una detección adicional por fluorescencia sin interferencia de la fluorescencia utilizada para detectar la inmovilización de los
conjugados.

De este modo pueden producirse constructos supramoleculares de ácidos nucleicos inmovilizados por fijación pasiva de los conjugados SBU/NA a una o más SAUs unidas a un soporte sólido. Sobre soportes de redes pasivas, controladas por difusión o convección, cada direccionamiento de fijación permite solamente la inmovilización de un conjugado particular provisto de la parte complementaria del direccionamiento de fijación. Esto es resultado del hecho de que las redes pueden exponerse en cada ciclo solamente a una mezcla de conjugados, que es idéntica a lo largo de toda la red. Así, es posible solamente un ciclo (M = 1), dado que la red entera está en contacto con todos los conjugados de una juego de conjugados C. En este caso, por consiguiente, el número N de direccionamientos de fijación determina al mismo tiempo el número de conjugados inmovilizados posibles diferentes de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos, que pueden inmovilizarse y distribuirse sobre el material soporte (véase Fig. 13).

El reconocimiento específico de los direccionamientos para auto-organización permite que el método descrito inmovilice en paralelo N conjugados y por consiguiente N ácidos nucleicos diferentes sobre materiales soporte en un solo ciclo. Análogamente, todas las posiciones de tales redes pueden ponerse en contacto en las condiciones de la aplicación únicamente con un tipo de muestra al mismo tiempo y en condiciones idénticas para todas las posiciones de la red. Una ventaja de la realización es que el usuario no necesita proporcionar ningún aparato o instrumento particular para generar una red de ácidos nucleicos. La red de unidades sintéticas de direccionamiento es universal y puede emplearse por tanto para generación de una multiplicidad de redes de ácido nucleico. El usuario requiere únicamente un juego o serie de ácidos nucleicos codificados individualmente con SBUs. Los ácidos nucleicos se organizan y preparan por sí mismos sobre el material soporte con SAUs fijadas por el reconocimiento molecular específico de SAUs y SBUs y proporcionan una inmovilización específica.

Otra ventaja, en comparación con la aplicación por puntos de ácidos nucleicos individuales, es que el usuario, dado que aplica juegos de ácidos nucleicos codificados al material soporte, es capaz de llevar a cabo todos los pasos de proceso necesarios sobre los conjugados como una juego entero después de la conjugación de los ácidos nucleicos con SBUs. Por ejemplo, en lugar de N pasos individuales de desalado, purificación o concentración, se requiere únicamente uno sólo de dichos pasos para el juego. Esto hace posible ahorrar material y pasos de proceso. Además, estos pasos propensos a error se llevan a cabo totalmente en un solo paso, por lo que no existe desviación alguna de ácido nucleico a ácido nucleico. Esto elimina la variabilidad causada por el tratamiento individual de los ácidos nucleicos, que podría distorsionar la calidad cuantitativa de los datos recogidos de un ensayo llevado a cabo sobre la
red.

En contraste con las técnicas de construcción de redes pasivas, la generación de una red sobre un dispositivo de localización activo permite la distribución selectiva de un juego múltiple de conjugados. En general, los dispositivos de redes de localización activas son dispositivos en los cuales las localizaciones individuales son activables para producir condiciones favorables para la formación de SBS específicamente en la localización. Así, las localizaciones "activables" se seleccionan individualmente de manera controlada. Dicha activación puede ser de naturaleza química (v.g., liberación controlada a distancia de un agente promotor de hibridación en la localización) o física (v.g., campo eléctrico o magnético, energía IR [calor] o fotónica, exposición mecánica [véase, v.g. el dispositivo producido por Clondiag, Alemania, descrito en WO01/02094] etc.). De uso y efectividad particulares en los métodos de construcción de redes de la invención son redes electrónicas activas, en las cuales las localizaciones individuales en la red pueden ser activadas por un electrodo asociado. Por ejemplo, véase Patente U.S. NO. 5.605.662 "Active Programmable Electronic Devices for Molecular Biological Analysis and Diagnostics". Dado que las redes electrónicas activas hacen posible controlar activamente el movimiento electrocinético y la concentración, o direccionamiento, de unidades sintéticas de direccionamiento (SAU), de conjugados SBU-NA, y de muestras a posiciones particulares de la red, es posible inmovilizar N x M conjugados diferentes sobre tales redes electrónicas activas con un número N de direccionamientos de fijación diferentes, por realización de M ciclos de direccionamiento en
sucesión.

Así, cuando se genera la red de unidades sintéticas de direccionamiento inmovilizadas para uso en la construcción activa de redes, se proporcionan inicialmente varias posiciones de la red (y, opcionalmente, de modo simultáneo) con direccionamientos de fijación idénticos. Las SAUs pueden aplicarse por puntos para fabricación de alta capacidad, o pueden direccionarse electrónicamente, como se representa en la Figura 12A. En los métodos de direccionamiento electrónicos, en cada uno de los N pasos se inmovilizan al menos M unidades sintéticas de direccionamiento (SAU) idénticas en paralelo de tal manera que, al final, se obtiene una red de chips de N unidades sintéticas de direccionamiento diferentes, estando cada SAU presente en al menos una repetición de M veces.

Las mezclas M (series) de hasta N conjugados de ácidos nucleicos (NA) y SBUs complementarias se direccionan luego a N posiciones de red. En realizaciones de construcción de redes 0 puras (sic), en las que todos los N conjugados están inmovilizados, cada unidad de fijación específica individual complementaria a una unidad de direccionamiento específica está presente como un conjugado con un ácido nucleico específico, y el grupo (serie) de las localizaciones activas contiene los direccionamientos de fijación individuales en cualesquiera localizaciones en las que se desee la inmovilización del ácido nucleico (NA) correspondiente. En algunas realizaciones de tipo ensayo, el usuario puede no conocer inicialmente si están presentes todos los N conjugados (v.g., si están presentes ciertos amplicones de una muestra). En estas realizaciones, los N conjugados presentes formarán SBSs con las SAUs de las localizaciones activadas, posicionando los ácidos nucleicos de la muestra.

Utilizando este sistema, puede obtenerse cualquier número de patrones para inmovilización. Usualmente, para inmovilización de ácidos nucleicos a fin de formar una red para uso posterior, el juego de las posiciones direccionadas en un ciclo contendrá cada direccionamiento de fijación solamente una vez. El direccionamiento de las mezclas se repite M veces, y el lavado entre los pasos garantiza que los conjugados no ligados de la primera juego se eliminen completamente antes de aplicar y direccionar un nuevo juego. Opcionalmente, las localizaciones activadas pueden lavarse electrónicamente por inversión breve de la polarización del electrodo en las localizaciones. Si la red electrónica activa forma parte de un sistema de preparación de muestras más complejo con electrodos de recogida, los conjugados lavados y no ligados pueden recogerse en el electrodo de carga opuesta para ser desechados ulteriormente. En caso deseado, SAUs, o más preferiblemente mezclas de todas las SAUs utilizadas o todas las SAUs posibles, pueden unirse al contraelectrodo a fin de actuar como un "disipador" de recogida para todos los conjugados lavados de las localizaciones por el paso de lavado electrónico.

Este procedimiento permite una reducción de tiempo y simplificación importantes del método de inmovilización de diferentes ácidos nucleicos en una red. Las ventajas se aprovechan óptimamente si el número N de los direccionamientos y el número M de los ciclos son las raíces cuadradas del número de posiciones de la red. El óptimo para una red de 100 posiciones son 10 direccionamientos de fijación diferentes empleados en 10 ciclos de inmovilización y 10 ciclos de direccionamiento. Así pues, para cargar la red con 100 ácidos nucleicos diferentes, se requieren 20 (= 10 + 10) pasos de proceso en lugar de 100 pasos de inmovilización individuales para los ácidos nucleicos individuales. Si cada paso requiere 3 minutos por ciclo, una red puede cargarse en 1 hora en comparación con 5
horas.

La ventaja para una red de 100 posiciones es la reducción por un factor de 5 en el tiempo gastado. Si el tiempo requerido para preparación de la red a partir de SAUs no se incluye en el cálculo, el tiempo se reduce por un factor de 10. Dado que la red de SAUs es universal, la red puede prepararse previamente. Debido a estos ahorros de tiempo, pueden generarse mega-redes de 10.000 ácidos nucleicos diferentes en 5 horas (2,5 con una red SAU prefabricada) y 100.000 en 16 horas (8). Para esta realización, carece de importancia que las unidades sintéticas de direccionamiento estén fijadas en filas y columnas, como se representa en la Figura 12, o en otros formatos adecuados.

Una persona con experiencia ordinaria apreciará que se producen nuevas estructuras de red por los métodos de construcción de redes activas, en comparación con las generadas utilizando técnicas de construcción de redes pasivas. En una red pasiva, el producto acabado es una juego de N ácidos nucleicos inmovilizados, que están inmovilizados por N SBSs distintos. En contraste, en una red producida por métodos de construcción activos, se inmovilizan al menos dos ácidos nucleicos diferentes por el mismo SBS, en localizaciones diferentes. En la práctica, grandes grupos de 10, 20, 100 o más ácidos nucleicos diferentes serán inmovilizados en localizaciones diferentes por el mismo
SBS.

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Uso de los Conjugados y Estructuras de Redes Supramoleculares en Ensayos Biológicos

Las redes pasivas y activas preparadas de acuerdo con el método pueden utilizarse de modo totalmente análogo a las redes generadas por métodos tradicionales, además de tener varios usos distintivos. Las redes pueden utilizarse, por ejemplo, para ensayos SNP o STR (repeticiones cortas en tándem), como ha sido descrito por Gilíes et al., WO00/58522, o por Sosnowski et al. US 6.207.373.

Una aplicación de la realización es el uso de ácidos nucleicos codificados con unidades sintéticas de fijación para inmovilización de oligonucleótidos estabilizadores de captura para ensayos SNP (Gilíes, P.N. et al., Nature Biotechnology, 17, 365-370 (1999)). En el ensayo SNP, oligonucleótidos estabilizadores de captura o ácidos nucleicos amplificados se inmovilizan sobre una red. Se prepara una red de 100 (W) oligonucleótidos estabilizados de captura diferentes con 10 (N) direccionamientos SBS, de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, por preparación de conjugados de SBU y NA. Los oligonucleótidos estabilizadores de captura utilizados pueden ser conjugados con un extremo libre 5' y 3' de ácido nucleico. Los oligonucleótidos estabilizadores de captura se combinan con juegos de 10 (N) conjugados, conjugándose cada SBU en el juego con un ácido nucleico específico y estando presente cada SBU en el juego una sola vez. Se preparan en total 10 (M) juegos. Se prepara una red que tiene 10 (N) SAUs diferentes, estando presente cada SAU con una repetición de 10 (M) veces, de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 5. El ejemplo utiliza una red de localización activa cuyas posiciones pueden ponerse en contacto individualmente (en M ciclos) con ácidos nucleicos, conjugados, y juegos, preferiblemente una red electrónica activa. Se aplica a la red un primer juego de oligonucleótidos estabilizadores de captura codificados con SBUs. Esta aplicación tiene lugar en condiciones de severidad que hacen posible la fijación específica y estable de SBU a SAU. El juego se pone en contacto con un grupo o juego de posiciones, en las cuales ocurre una SAU específica en cada caso una sola vez (o en tantas veces como se desee la inmovilización de un oligonucleótido estabilizador de captura específico). Para redes específicas activas, el contacto se lleva a cabo por direccionamiento electrónico activo de los juegos a las posiciones deseadas. El contacto puede tener lugar secuencialmente o en paralelo para todas las posiciones del juego. La fijación específica de SAU y SBU conduce a la clasificación e inmovilización de los conjugados en las posiciones de tal modo que en cada posición se inmoviliza un solo oligonucleótido estabilizador de captura específico.

La red se lava luego, eliminando todos los conjugados de la primera juego excepto los conjugados inmovilizados específicamente. A continuación se aplica un segundo juego de conjugados y se repiten los pasos arriba descritos. De este modo se obtiene una red después de 10 (M) ciclos, en la cual los 100 (W) oligonucleótidos estabilizadores de captura diferentes están inmovilizados, y la red puede ponerse luego en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra para llevar a cabo un ensayo de captura sándwich. Pueden utilizarse formatos de ensayo de hibridación electrónicos o pasivos, aunque los formatos de ensayo electrónicos se utilizan ventajosamente con muestras múltiples. Por ejemplo, si en los pasos de inmovilización de captura se crean 10 juegos de 100 capturas diferentes simultáneamente en un dispositivo de 1000 localizaciones, entonces pueden hibridarse electrónicamente 10 muestras diferentes de manera individual a cada juego de capturas, y analizarse luego de una vez en un paso final de hibridación de sondas informadoras. Esto es un ejemplo de un ensayo en el cual la red se construye antes que los conjugados SBU de la red se pongan en contacto con la muestra.

Para inmovilizar los ácidos nucleicos amplificados, se utilizan iniciadores codificados por SBU. Tales iniciadores permiten la incorporación de SBUs directamente en los productos de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos de una muestra. Después de realización de la amplificación, y combinación opcional de los productos de amplificación, los ácidos nucleicos amplificados codificados pueden distribuirse fácilmente en juegos de localizaciones activadas por sus SBUs, como se ha descrito arriba. En la amplificación, un solo juego de iniciadores codificados puede ser utilizado amplificación múltiple (sic), y los productos combinados para direccionamiento electrónico, o pueden utilizarse juegos múltiples de iniciadores codificados para amplificación paralela de ácidos nucleicos. En reacciones múltiples, el tratamiento (v.g. desalado, purificación, concentración) de los ácidos nucleicos amplificados codificados puede llevarse a cabo globalmente, conduciendo a una reducción en los pasos y material requeridos. Los juegos se inmovilizan luego en la red, como se ha descrito arriba, inmovilizándose de nuevo los ácidos nucleicos amplificados individuales en posiciones individuales. Los amplicones inmovilizados pueden analizarse y detectarse después por hibridación pasiva o electrónica de sondas informadoras/estabilizadoras, o por cualquier otro método apropiado. Éste es un ejemplo de un ensayo en el cual la red se construye después que los conjugados SBU se han puesto en contacto con una muestra.

Una "muestra", como se utiliza en esta memoria, es cualquier solución y/o mezcla de componentes de origen natural o artificial, que se pone en contacto con los componentes del sistema descrito en esta memoria. Se prefieren a menudo las muestras biológicas, dado que son la fuente usual de ácidos nucleicos de interés. Las muestras biológicas para uso en la invención se derivan preferiblemente de una muestra seleccionada del grupo constituido por materiales humanos, materiales de origen animal, materiales vegetales, materiales fúngicos, cultivos de células, cultivos virales, muestras de alimentos, y muestras de agua. En este contexto, "materiales" abarca todos los fluidos, secreciones, excreciones, tejidos blandos o duros, y otras materias asociadas a organismos que pueden contener ácidos nucleicos, con inclusión de ácidos nucleicos de organismos infecciosos. Las muestras pueden someterse a pasos de preparación, tales como purificación de ácidos nucleicos, amplificación, u otros tipos de procesamiento enzimático, antes de su utilización.

El contacto entre las moléculas diana potenciales de la muestra y los NAs de los conjugados puede tener lugar antes, después, u ocasionalmente durante la inmovilización de los conjugados NA/SBU en el material soporte por los direccionamientos SAU. La presencia y/o cantidad de dianas en la muestra que se liga específicamente a los conjugados (en el caso de ensayos de hibridación) y/o la presencia, cantidad o propiedades del ácido nucleico (NA) propiamente dicho (en el caso de conjugados amplificados o modificados enzimáticamente) puede detectarse luego por medios adecuados. En este contexto, las muestras incluyen todas las moléculas, biomoléculas, mezclas, y reactivos que están en contacto con los ácidos nucleicos (NA) inmovilizados sobre los materiales soporte con objeto de reducir información acerca del tipo y/o presencia o frecuencia de las moléculas diana en la muestra. Las muestras pueden contener así, en particular, sondas marcadas o sin marcar, sondas de hibridación, enzimas y mezclas para reacciones enzimáticas, u otros reactivos para un formato de ensayo particular. Los componentes de la muestra pueden procesarse o marcarse para adaptarlos al método de ensayo particular. Marcadores adecuados para uso en los ensayos de la invención incluyen los enumerados anteriormente para conjugados y SAUs.

Un aspecto adicional es la reutilizabilidad singular de los soportes direccionados a SAU. Los ácidos nucleicos inmovilizados de los conjugados pueden eliminarse de modo relativamente fácil, en contraste con los sistemas de inmovilización tradicionales (v.g., eslabones covalentes o biotina/estreptavidina). Las propiedades de fijación de los sistemas de fijación sintéticos pueden verse influidas por el establecimiento de condiciones de severidad particulares (pH, contenido de sales, temperatura, voltaje, agentes desnaturalízadores, etc.) a fin de eliminar todos los conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos del material soporte. Un método preferido es la adición de una solución básica (NaOH, KOH, NH_{4}OH, etc.) para disminuir el pH. Métodos alternativos incluyen el uso de agentes desnaturalizantes tales como dimetilformamida, formamida, dimetilsulfóxido. Si el eslabonamiento de la unidad sintética de direccionamiento del sistema de fijación sintético al material soporte es en sí mismo estable frente a las condiciones, entonces se retiene una red de unidades sintéticas de direccionamiento inmovilizadas (SAU) después de un tratamiento con dicha severidad. La red puede utilizarse luego nuevamente para la inmovilización de nuevos conjugados de unidades sintéticas de fijación (SBU) y ácidos nucleicos (NA), del mismo modo que una red de SAUs recién preparada. La reutilización del material soporte con las unidades sintéticas de direccionamiento inmovilizadas (SAU) ahorra material (material soporte y unidades de direccionamiento) y tiempo cuando se prepara la red de SAUs inmovilizadas. El uso de sistemas de fijación sintéticos (SBS) es por consiguiente ventajoso en comparación con el uso de sistemas irreversibles tales como biotina-estreptavidina, por ejemplo. Un ejemplo de regeneración de un material soporte se exhibe en el Ejemplo 8. Estas realizaciones de la invención son particularmente atractivas cuando se utilizan redes que comprenden elementos funcionales intrincados, tales como redes de sensores o dispositivos de redes electrónicas activas.

Como se describe brevemente en el ejemplo de SNP, los métodos proporcionan también vías de uso de los conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos a fin de distribuir y direccionar a los materiales soporte, en paralelo, ácidos nucleicos que son idénticos en cuanto a secuencia o composición, pero que se han obtenido de fuentes diferentes. Este aspecto es particularmente útil en redes pasivas, en las cuales las muestras no pueden distribuirse sobre soportes simplemente por activación de localizaciones particulares en la red. Para la determinación de los patrones de expresión génica, por ejemplo, la diferente expresión de genes idénticos puede compararse en diferentes etapas del desarrollo, momentos después de un estímulo, o en poblaciones diferentes, todos ellos en la misma red pasiva. Ventajosamente, la dimensionalidad de información de los sistemas de fijación sintéticos (SBS) se utiliza a fin de codificar cada gen estudiado en cada muestra con un direccionamiento individual (unidad de fijación, SBU) o por utilización de conjugados de SBU como iniciadores de la amplificación con una muestra de cDNA.

Después que los amplicones génicos de las muestras de origen diferente se han marcado de este modo, pueden combinarse los mismos y procesarse juntos ulteriormente. Esto evita la variabilidad en el tratamiento de las muestras individualmente, y permite el direccionamiento uniforme y coordinado de los ácidos nucleicos idénticos de fuentes diferentes en la misma red y precisamente en las mismas condiciones. Como resultado, puede alcanzarse una exactitud considerablemente mayor y menor variación (desviación estándar) de los datos. En contraste con la codificación comúnmente utilizada por tintes diferentes, la codificación por unidades sintéticas de fijación específicas (SBU) permite un número considerablemente mayor de códigos utilizables simultáneamente diferentes. Se evita también un solapamiento de señales del espectro visible, dado que la codificación sirve en este caso para separar espacialmente los ácidos nucleicos codificados. En contraste, los tintes no permiten una separación de esta clase, con el resultado de un solapamiento espectral frecuente de los tintes, lo que hace más difícil la separación de las señales.

Este tipo de realización se representa en Fig. 13B. En este caso, diferentes tiempos, etapas o poblaciones de especies particulares de ácidos nucleicos, por ejemplo genes particulares, en una red se comparan unos con otros. Para este propósito, puede utilizarse una red estándar de unidades sintéticas de direccionamiento unidas, en las cuales cada posición tiene un direccionamiento SAU distinto. Aunque cada gen en cada muestra está asignado a una SBU distinta en este ejemplo pasivo, una alternativa podría ser utilizar direccionamientos y conjugados SBU repetidos, con tal que los direccionamientos se manipulen en juegos separados utilizando una red de localización activa. Las veces a comparar de una especie están dirigidas a las posiciones sea como una mezcla simultáneamente, o secuencialmente. El reconocimiento específico de unidades sintéticas de direccionamiento por las unidades sintéticas de fijación inmoviliza en cada posición de la red únicamente el conjugado que se aparea específicamente con la SAU en dicha posición.

Los ácidos nucleicos diana en las muestras pueden ser detectados y/o cuantificados por medio de marcadores, como se ha descrito previamente para los marcadores de control de calidad, sea en las dianas propiamente dichas o en sondas hibridadas. En realizaciones alternativas, puede utilizarse también espectrometría de masas, tal como MALDI-TOF, con o sin técnicas de marcación de masas. Se han ideado diversos esquemas de detección para formatos de redes de ácido nucleico inmovilizados, y las personas con experiencia ordinaria apreciarán fácilmente su aplicación a ensayos que utilicen las redes.

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Reacciones de Fijación Enzimáticas y PCR que utilizan los Conjugados SBU-NA de acuerdo con la invención

Como se ha expuesto previamente, los conjugados pueden utilizarse en reacciones de polimerasa para la amplificación enzimática de los ácidos nucleicos diana en una muestra. Sorprendentemente, los solicitantes han encontrado que conjugados que comprenden al menos una unidad sintéticas de fijación (SBU) seleccionada y al menos una sección de ácido nucleico (NA) de acuerdo con la reivindicación 1 pueden servir como sustratos para reacciones de fijación enzimática y PCR que utilizan ácidos nucleicos como sustrato, y son por tanto compatibles con los procesos enzimáticos utilizados comúnmente de métodos de producción biotecnológicos. Para uso en los métodos enzimáticos de fijación y PCR de la invención, las unidades sintéticas de fijación de los conjugados incluyen secciones de pRNA, y/o pDNA, siendo estas secciones capaces de mediar la fijación específica y reversible por hibridación. La sección de ácido nucleico (NA) comprende al menos un nucleótido, o análogo de nucleótido compatible con ácido nucleico, como se define en la reivindicación 1.

Así pues, el método enzimático básico de fijación y PCR de la invención consiste simplemente en poner en contacto un conjugado con al menos una enzima seleccionada de ligasa o polimerasa que utiliza ácidos nucleicos existentes naturalmente como sustrato, y poner en contacto ulteriormente la mezcla con otros reactivos necesarios para la acción de la enzima. A continuación, se deja incubar la mezcla en condiciones adecuadas para la enzima durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar la modificación enzimática del conjugado. Tanto los reactivos necesarios como las condiciones variarán considerablemente de una enzima a otra y entre el proceso utilizado para efectos diferentes. Por ejemplo, los reactivos PCR incluyen un ácido nucleico molde o ácido nucleico diana adicional. Dependiendo del procedimiento, pueden añadirse sustancias auxiliares adicionales tales como, por ejemplo, tampones, ácidos, bases, coenzimas, inhibidores de nucleasas, etc. O bien, los reactivos podrían incluir nucleótidos para una polimerasa (sic). Análogamente, condiciones tales como la temperatura variarán entre enzimas "termoestables", tales como las derivadas de Thermus aquaticus y especies similares, y enzimas termolábiles derivadas de, v.g., Escherichia coli. Los solicitantes han encontrado, sin embargo, que los conjugados pueden utilizarse análogamente para regular sustratos de ácido nucleico. El uso de los conjugados en una reacción de ácido nucleico enzimática conocida particular requerirá, por tanto, un mínimo de experimentación. Adicionalmente, pueden utilizarse combinaciones de enzimas en procesos críticos que utilizan actividades enzimáticas concertadas, tales como TMA (RNA-polimerasa, y transcriptasa inversa).

Así pues, los conjugados NA/SBU descritos son modificados por las enzimas particulares, utilizando cualesquiera ácidos nucleicos molde requeridos, ácidos nucleicos diana y/o nucleósido-trifosfatos (NTPs), dependiendo del método usado. El término ácido nucleico molde abarca un ácido nucleico natural que se híbrida a la sección de ácido nucleico (NA) del sustrato conjugado NA/SBU y sirve como molde para el eslabonamiento o la síntesis del ácido nucleico diana. Debe entenderse que el ácido nucleico diana es un ácido nucleico natural que está enlazado enzimáticamente a la sección de ácido nucleico (NA) del conjugado NA/SBU, o es sintetizado enzimáticamente por la reacción después del contacto con el NA del conjugado. La sección de ácido nucleico (NA) está enlazada covalentemente al ácido nucleico diana.

El producto de la modificación enzimática del conjugado es un conjugado cuya parte de ácido nucleico ha sido procesada. El producto final dependerá por tanto del proceso enzimático empleado. La PCR (con inclusión de DNA-polimerasa, RNA-polimerasa, y reacciones de transcriptasa inversa) produce amplicones conjugados a SBUs. Las reacciones de fijación producen conjugados de SBU con secuencias de ácido nucleico adicionales unidas como apéndice.

Para una PCR, la sección de ácido nucleico de un conjugado NA/SBU tiene un extremo 3' libre. En contraste, las ligasas requieren un fosfato libre en el extremo 5' de un ácido nucleico para eslabonamiento al extremo 3' de un ácido nucleico. En algunas realizaciones de la invención, este es un eslabonamiento al extremo 3' de un RNA.

Enzimas ilustrativas incluyen las polimerasas utilizadas para amplificación de ácidos nucleicos, en particular DNA-polimerasas tales como, por ejemplo, polimerasa Taq, exopolimerasa Vent, enzima Klenow, DNA-polimerasa T7, Poli, DNA-polimerasa T4, polimerasa PFV1, polimerasa PWO o polimerasa Pfu, además de RNA-polimerasas tales como RNA-polimerasa T7, RNA-polimerasa T3, RNA-polimerasa SP6 y transcriptasa inversa. Éstas incluyen adicionalmente DNA- y RNA-ligasas tales como, por ejemplo DNA-ligasa T4, o RNA-ligasa T4. Las reacciones con RNA-ligasas y DNA-ligasas son muy útiles para producción de conjugados alargados.

En una realización preferida, los conjugados son polimerasas modificadas enzimáticamente con la adición de nucleósido-trifosfatos para producir amplicones con SBUs unidas. Para este propósito, los conjugados NA/SBU se utilizan como sustratos iniciadores en reacciones de polimerasa, hibridándose la sección de ácido nucleico del NA/SBU con un ácido nucleico molde. Con la adición de polimerasa y los monómeros de nucleósido-trifosfatos (NTPs), la polimerasa utilizaba la cadena de ácido nucleico molde para añadir nucleótidos complementarios al extremo 3' de la sección de ácido nucleico (NA), sintetizando así una cadena complementaria. Se prefiere PCR.

Para uso de los conjugados NA/SBU como iniciadores de ácido nucleico en reacciones enzimáticas de esta clase, los conjugados tienen que ser estables en las condiciones de reacción, en particular al calentamiento y enfriamiento repetidos de las reacciones PCR. En este caso, los conjugados de secciones de ácido nucleico (NA) con unidades sintéticas de fijación (SBU) que comprenden pRNA, y/o pDNA resultaron particularmente adecuados. Adicionalmente, la unidad sintética de fijación (SBU) del conjugado no tiene que ser un inhibidor ni un sustrato competidor para la enzima. Una reacción competitiva en inhibición de la enzima no es exhibida ventajosamente por los conjugados NA/SBU descritos.

En otra realización preferida de la invención, se ligan conjugados NA/SBU con un ácido nucleico diana. En este caso, la ligasa enlaza el extremo 5' libre del sustrato de DNA conjugado con el extremo 3' de un ácido nucleico diana. Se conocen varias ligasas monocatenarias que no requieren ventajosamente ninguna cadena de ácido nucleico molde adicional a fin de ligar los dos ácidos nucleicos. En particular, las RNA-ligasas, en contraste con las DNA-ligasas, enlazan ácidos nucleicos con eficiencia suficiente sin un molde (véase, England, T.E.; Nature, 275, 560-561 (1978) o England, T.E.; Bruce, A.G.; Uhlenbeck, O.C. METHODS IN ENZYMOLOGY 65(1), 65-74 (1980) o Romaniuk, Paul J.; Uhlenbeck, Olke C. Methods Enzymol. 100, 52-9 (1983)). Así, una RNA-ligasa puede utilizar un conjugado de una unidad sintética de fijación (SBU) y una sección de ácido nucleico (NA) modificada corta (tan corta como un solo nucleótido), y enlazar el conjugado con el extremo 3' de un RNA. Esta reacción se prefiere para proporcionar conjugados procesados enzimáticamente para las aplicaciones arriba descritas y utilizar un ácido nucleico molde.

Para las reacciones de fijación, las longitudes de sección de ácido nucleico son de 1 a 5 ácidos nucleicos para fijación. Las longitudes de ácido nucleico son de 10 a 40 nucleótidos, más preferiblemente de 7 a 30 nucleótidos, para PCR, que requieren una secuencia específicamente hibridada. Sorprendentemente, los solicitantes han encontrado que la actividad enzimática puede existir tan cerca como a menos de 30, 20, 15, 10, 7, 5, ó 2 nucleótidos, o incluso 1 nucleótido del punto de conjugación entre el NA y la SBU.

La reacción enzimática puede tener lugar en este caso utilizando conjugados NA/SBU en solución, o conjugados NA/SBU inmovilizados (v.g., como en el caso de la información enzimática por extensión de iniciadores). Los conjugados NA/SBU modificados enzimáticamente en solución pueden inmovilizarse luego sobre tales superficies por distribución SAU después de la culminación de la reacción enzimática. Los conjugados obtenidos enzimáticamente así producidos e inmovilizados pueden utilizarse ahora para investigar muestras en diversos formatos de ensayo como se ha descrito arriba, o puede utilizarse el proceso enzimático en sí mismo como parte del ensayo.

Las unidades sintéticas de fijación (SBU) propiamente dichas no pueden ser sintetizadas, amplificadas, modificadas, procesadas, ligadas, fragmentadas o hidrolizadas por las enzimas que se conocen por la tecnología del ácido nucleico, tales como polimerasas, ligases, nucleasas, y enzimas de restricción. Esta propiedad es particularmente ventajosa cuando se utilizan conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos en procesos enzimáticos como se describen en esta memoria, dado que la SBU no es modificada, inmovilizada, eliminada o procesada por los pasos enzimáticos necesarios normalmente para procesar la muestra o el ácido nucleico.

Así pues, el uso de conjugados NA/SBU es ventajoso por tanto para la producción de conjugados amplificados análogamente a los procesos descritos en JP 03151900 y WO 93/25563.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis de Conjugados de Ácidos Nucleicos y Sistemas de Fijación Sintéticos

Ácidos nucleicos, oligonucleótidos, sistemas de fijación sintéticos y/o conjugados NA/SBU pueden prepararse de acuerdo con el método de fase sólida en un sintetizador automático Expedite 8905 de Applied Biosystems. Como se utiliza en los Ejemplos que siguen, los ácidos nucleicos u oligonucleótidos o la parte de ácido nucleico correspondiente de los conjugados se sintetizan utilizando fosforamiditos disponibles comercialmente con inclusión de los fosforamiditos inversos para síntesis 5'-3' (Cruachem). Para la síntesis sólida de ácidos nucleicos, se utilizaron los ciclos y condiciones de síntesis sugeridos por el fabricante del equipo y/o el suministrador de amidito. Lo mismo puede decirse para el uso de bloques de construcción de enlaces, enlazadores, modificadores o amiditos de ramificación (como están disponibles de Glenn Research o Chemgenes).

Para los sistemas de fijación sintéticos de pRNA, se utilizan las condiciones y monómeros descritos en las referencias apropiadas. Aunque el método básico para la síntesis en fase sólida de los sistemas de fijación sintéticos de pRNA es el mismo, diferencias importantes comparadas con la síntesis estándar de DNA son el uso de ciclos de síntesis adaptados con tiempo de acoplamiento más largo, el uso de ácido dicloroacético al 6% para destritilación y el uso de hidrocloruro de piridinio como activador. Para los conjugados, se da preferencia a la utilización del grupo protector \beta-cianoetilo en el fosforamidito en asociación con el protocolo de desprotección especial descrito más adelante en esta memoria. Los monómeros se secan previamente a vacío sobre hidróxido de potasio y se emplean como solución 0,1M en acetonitrilo seco. Como alternativa al pRNA o pDNA sintetizado por química de fosforamidito, el CNA con su cadena principal amídica puede sintetizarse de acuerdo con los métodos descritos en WO 99/15509, y utilizarse con la modificación apropiada del grupo funcional en las reacciones de acoplamiento que se indican más adelante.

La purificación cromatográfica de los ácidos nucleicos, sistemas de fijación sintéticos y conjugados se lleva a cabo por RT-HPLC. Columna: Merck LiChrospher RP 18 o Phenomex Luna Phenyl-Hexyl, 10 pM, analítica: 4 x 250 mm, caudal = 1,0 ml/min, semi-preparativa: 10 x 250, caudal = 3,0 ml/min; tampón: A: acetato de trietilamonio (TEAA) 0,1 M pH = 7,0 en agua, TEAA 0,1 M, pH = 7,0 en acetonitrilo/agua (95:5); gradiente 0% B a 100% B en 100 min para separaciones analíticas y preparativas).

Los espectros de masas por electropulverización (ESI-MS) se registraron en un aparato Finnigan LCQ en modo de ionización negativo. Los espectros de masas MALDI se registraron en un Applied Biosystems Voyager DEPro.

Sorprendentemente, los solicitantes han encontrado que se obtienen sistemas de fijación sintéticos y conjugados con rendimientos particularmente satisfactorios y con una pureza particularmente satisfactoria si se lleva a cabo un tratamiento con una alquilamina, tal como dietilamina en diclorometano antes de la desprotección y eliminación del soporte de síntesis.

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Protocolo general para desprotección de cianoetilo de los sistemas de fijación sintéticos y conjugados

Después de la síntesis en fase sólida de acuerdo con el método del fosforamidito, el soporte se mezcla inicialmente con una solución al 1,5% (p/v) de dietilamina en diclorometano y se agita mediante sacudidas a la temperatura ambiente, en la oscuridad, durante una noche (15 h). Es posible también lavar el soporte de síntesis con la solución de reactivos continuamente en lugar de utilizar un proceso por lotes. La solución se desecha y el soporte se lava con tres porciones de cada uno de los disolventes siguientes: diclorometano/acetona/agua. Durante este tratamiento, las moléculas diana se mantienen inmovilizadas en el soporte. Las mismas se retiran y se desprotegen únicamente en el paso siguiente.

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Protocolo general para la desprotección y eliminación del soporte de síntesis de los sistemas de fijación sintéticos y conjugados (hidracinólisis)

El soporte de CPG húmedo procedente del protocolo anterior se mezcla con hidrato de hidracina acuoso al 24% y se agita mediante sacudidas a 4ºC durante 18 h. Se separa la hidracina por extracción en fase sólida utilizando cartuchos Sep-Pak C18 0,5 g Waters, NO. 20515. Para este propósito, el cartucho se activa por lavado con 10 ml de acetonitrilo. La solución de hidracina, diluida con 5 veces su volumen de tampón de bicarbonato de trietilamonio (TEAB) de pH 7,0, se carga luego en la columna y se liga el producto. La hidracina se separa por lavado con TEAB. El producto se diluye luego con TEAB/acetonitrilo (1:2). Alternativamente, la hidracina puede eliminarse por RP-HPLC si se utiliza una columna resistente a la hidracina. En este caso, ha resultado útil Poros R3 (Applied Biosystems). Las condiciones de elución corresponden a las arriba descritas. Las fracciones que contienen el producto se combinan y se evaporan a sequedad a vacío. El análisis y la purificación preparativa se llevan a cabo por RP-HPLC como se ha descrito arriba. Para pDNA y conjugados del mismo, es también posible utilizar amoniaco acuoso para la desprotección en las condiciones comunes en la química de la síntesis del DNA (solución al 25%, 55ºC, durante una
noche).

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Ejemplo 1.1

Conjugados de ^{4'}pRNA^{2'}-^{5'}DNA^{3'} (Fig. 1C. Fig. 2C: Fig. 2F)

La síntesis se inició con una síntesis estándar en fase sólida de DNA en la dirección 3'-5' para producir la secuencia de DNA deseada. En caso de desearse un grupo enlazador o grupo de ramificación, los bloques de construcción de síntesis apropiados se acoplaron al extremo 5' del producto en las condiciones indicadas por el fabricante. Si el DNA se enlazaba directamente a pRNA a través de un fosfato, (Fig. 2C), no se utilizó fosforamidito enlazador alguno. A continuación, los bloques de construcción monómeros de pRNA se acoplaron en las condiciones especiales arriba descritas de tal modo que se obtuvo un direccionamiento de fijación de SBU de la longitud y secuencia deseadas. Si se deseaba un conjugado marcado, se acoplaron fosforamiditos marcadores al conjugado en un último paso opcional, o se utilizaron como un reactivo acoplado inicial en la síntesis. En este caso, resultaron útiles los fosforamiditos de tinte fluorescente Cy3 y Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech) eran útiles, pero es también posible utilizar cualesquiera otros tintes de fosforamidito adecuados derivados conocidos de la síntesis del DNA. El conjugado se acabó, se desprotegió, se aisló y se purificó como se ha descrito arriba. Análogamente, es posible preparar conjugados de pRNA y ácidos nucleicos modificados (v.g. 2'-O-metil-RNA). Para ello, se acoplan 2'-O-metilfosforamiditos después del RNA. El ácido nucleico se fosforiló también ocasionalmente en su extremo 5', como se muestra más adelante. Para este propósito, se utilizaron bloques de construcción conocidos por el operario experto para la introducción de
fosfatos.

La aplicación del protocolo general condujo a los conjugados siguientes (negrilla = pRNA; cursiva = DNA):

: IL4RP102a: ^{4'}TCCTGCATTC^{2'}-^{5'}GGA TAG AGG CAG AAT AAC AGG^{3'} [SEQ ID NO. 77]

: tiempo de retención: 23,7 min; M calc.: 9697; M obs.: 9696

: IL4RP103a: ^{4'}CTCTACGTCT^{2'5'}GCA TAG AGG CAG AAT AAC AGG^{3'} [SEQ ID NO. 78]

: tiempo de retención: 22,2 min; M calc.: 9697; M obs.: 9696

: IL4RP104a: ^{4'}CCTCGTACTT^{2'5'}GGA TAG AGG CAG AAT AAC AGG^{3'}[SEQ ID NO. 79]

: tiempo de retención: 21,7 min; M calc.: 9697; M obs.: 9696

: Feto1-102a: ^{4'}TCCTGCATTC^{2'5'} AGA AAT CTC ACA TGG ACA TCT TCA^{3'} [SEQ ID NO. 80]

: tiempo de retención: 22,2 min; M calc.: 10770; M obs.: 10771

: Feto2-102a: ^{4'}TCCTGCATTC^{2'5'} CCT GGG CTT TGC AGC ACT TCT C^{3'} [SEQ ID NO. 81]

: tiempo de retención: 22,3 min; M calc.: 9830; M obs.: 9822.

Ejemplo 1.2

Conjugados de ^{5'}DNA^{3'}-^{4'}pRNA^{2'} (Fig. 1A; Fig. 2A; Fig. 2D)

La síntesis se inició con una síntesis de pRNA como se ha descrito arriba, produciendo la pRNA-SBU deseada sobre el soporte de síntesis. Si se deseaba un grupo enlazador o grupo de ramificación, los bloques de construcción de síntesis apropiados se acoplaron al producto utilizando las condiciones indicadas por el fabricante. Como anteriormente, cuando el pRNA estaba enlazado directamente a DNA por un fosfato (Fig. 2A), no se añadió enlazador adicional alguno. Los fosforamiditos estándar de DNA y los ciclos de síntesis se utilizaron luego a fin de sintetizar la secuencia de DNA deseada. Si se deseaba un conjugado marcado, se acoplaron fosforamiditos marcadores al conjugado como se ha descrito anteriormente. El conjugado se acabó, se desprotegió, se aisló y se purificó como se ha descrito arriba. Análogamente, se obtuvieron también conjugados de 2'O-metil-RNA y pRNA utilizando 2'-O-metilfosforamiditos en lugar de DNA-fosforamiditos.

La aplicación del protocolo general condujo a los conjugados siguientes (negrilla = pRNA; cursiva = DNA); cursiva, subrayado = 2'-O-metil-RNA):

: IL4 CS-102a: ^{5'}CCC CAG TGC TGG^{3'4}TCCTGCATTC^{2'} [SEQ ID NO. 82]

: tiempo de retención: - min; M calc.: 6800; M obs.: 6801

: IL6 CS-103a ^{5'}ATGCTAAAGGACGTCATTGCACAATCTTAA^{3'4}CTCTACGTCT^{2'} [SEQ ID NO. 83]

: tiempo de retención: 27 min; M calc.: 12391; M obs.: -

: IL4R CS-104a:^{5'}GG AGT TTG TAC ATG CGG TGG AGC^{3'4}CCTCGTACTT^{2'} [SEQ ID NO. 84]

: tiempo de retención: 27 min; M calc.: 10354; M obs.: 10353

: P-OMeC-TAGGATT: fosfato-^{5'} C ^{3'4}TAGGATT^{2} [SEQ ID NO. 85]

: tiempo de retención: 39' min; M calc.: 3154; M obs.: 3153.

Ejemplo 1.3

Conjugados de ^{3'}DNA^{5'}-^{4'}pRNA^{2'} (Fig. 1B; Fig. 2B; Fig. 2E)

Esta realización preferida se llevó a cabo análogamente al protocolo descrito en el Ejemplo 1.2. La única diferencia fue la utilización para la síntesis del DNA de fosforamiditos parcialmente inversos (Cruachem) que permiten el ensamblaje de la cadena de DNA en la dirección 5'-3'. Como en el Ejemplo 1.2, esto condujo también a un conjugado que llevaba un extremo 3' libre. Si se necesita el extremo 3' por ejemplo, para una reacción enzimática de alargamiento (PCR), no debe unirse un marcador a este fosfato. Es posible preparar conjugados marcados con un fosfato 3' libre iniciando la síntesis con un tinte ligado a un soporte, o utilizando amiditos marcados que permiten la continuación de la síntesis de la molécula al comienzo de la síntesis en fase sólida. Un amidito de este tipo es Cy3-fosforamidito (Amersham Pharmacia Biotech).

La aplicación del protocolo general condujo a los conjugados siguientes (negrilla = pRNA; cursiva = DNA):

: IL4RP104aCy3: ^{3'}GGA CAA TAA GAC GGA GAT ACG^{5'4}CCTCGTACTT^{2'}[SEQ ID NO. 86]

: tiempo de retención: 25 min; M calc.: 10221; M obs.: 10220.

Ejemplo 1.4

Conjugado pRNA-DNA como Ejemplo de Conjugación de un Sistema de Fijación Sintético Preformado con Ácido Nucleico

El oligonucleótido de DNA modificado IL4CsrU, 5'-d(CCC CAG TGC TGG)-rU-3' [SEQ ID NO. 87] (Fig. 5) se obtuvo por síntesis estándar de DNA sobre un soporte de ribo-U CPG obtenido de un suministrador comercial de oligo-DNA (BioSpring, Frankfurt am Main). Se disolvió una parte alícuota de este ácido nucleico en una cantidad apropiada de agua desionizada para obtener una solución 5 mM. Se introdujeron 20 \mul (100 nmol) se la solución en un vaso de microreacción Eppendorf de 1,5 ml. Se añadió 1 \mul de una solución acuosa 0,1 M de peryodato de sodio. El vaso se dejó en reposo a la temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora. Se retiró luego el exceso de peryodato por adición de 1 \mul de una solución 0,5M de sulfito de sodio. Después de 15 minutos, se añadieron 10 \mul de un tampón de fosfato de sodio 1M de pH 7,4 y la solución resultante se transfirió a un vaso de microreacción Eppendorf de 1,5 ml en el cual se habían evaporado a sequedad previamente 8,4 nmoles de un oligonucleótido de pRNA marcado con tinte modificado con hidracida, 4'-hidracida-TTACGGAT-Cy3 2' [SEQ ID NO. 88], Después de mezclar, la solución se dejó en reposo en la oscuridad durante 1 hora. Elaboración: el producto se purificó por medio de RP-HPLC. De acuerdo con HPLC, el rendimiento es 84% basado en el oligonucleótido de hidracida-pRNA utilizado. Se aislaron 4,1 nmoles de conjugado, lo que corresponde a un rendimiento aislado de conjugado de 49%. El conjugado se caracterizó por medio de MALDI-TOF MS: M calc.: 7.210; N obs.: 7.180 (señal amplia); tiempo de retención: DNA: 20,4 min; hidracida-pRNA: 41,2 min; conjugado: 38,2 min.

Todos los ácidos nucleicos que contienen un cis-diol cíclico terminal (v.g., RNA, aptámeros y aptazimas) pueden conjugarse por este método. Alternativamente, puede compararse un ribonucleósido en un DNA, PNA, u otro término de ácido nucleico, o una SBU (v.g., pRNA) para uso como resto de acoplamiento.

Ejemplo 1.5

Conjugado pRNA-DNA como un Ejemplo de Conjugación de un Sistema de Fijación Sintético Preformado con un Ácido Nucleico

Para este método, el DNA debería contener un cis-diol, que puede ser proporcionado por síntesis del ácido nucleico sobre soportes de glicerilo, v.g.: Glen Research Corp., Sterling, Virginia, EE.UU.; NO. de catálogo 20-2933-41 (Fig. 6). El oligonucleótido de DNA modificado (v.g.. IL4CSGly, 5'-CCC CAG TGC TGG-Gly-3') [SEQ ID NO. 89] se disolvió en agua y se hizo reaccionar con peryodato de sodio en un vaso de microrreacción Eppendorf de 1,5 ml. Se eliminó el exceso de peryodato de sodio por adición de solución de sulfito de sodio. Se añadió tampón de fosfato de sodio de pH 7,4 y la solución resultante se mezcla con un oligonucleótido de pRNA modificado con hidracida (v.g.: 4'-hidracida-TAGGCATT-Cy3 2') [SEQ ID NO. 90] y cianoborohidruro de sodio. Después de mezclar, se dejó la solución en reposo en la oscuridad. La mezcla se acabó por HPLC y el producto se caracterizó por MALDI-TOF MS.

Ejemplo 1.6

Conjugación de un Ácido Nucleico con una Pluralidad de Unidades sintéticas de fijación

Bloques de construcción ramificados para uso en la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida se conocen por la bibliografía (Shchepinov, M. S.; Udalova, I. A.; Bridgman, A. J.; Southern, E. M; Nucleic Acids Res.; 25, 4447-4454 (1997)). El acoplamiento de un bloque de construcción triplemente ramificado (Trebler Phosphoramidite, Glen Research, NO. de catálogo 10-1922-90) y el acoplamiento subsiguiente de un fosforamidito de hidracida al extremo 5' de un oligonucleótido de DNA ligado a un soporte en reposo con la secuencia 5'-CCC CAG TGC TGG-3' [SEQ ID NO. 91] condujo a un ácido nucleico que contenía 3 grupos extremos reactivos precursores de hidracida. El bloque de construcción se desprotegió y se acabó por métodos estándar, como se describe en el Ejemplo 2.2. El oligonucleótido de DNA producido se hizo reaccionar, análogamente al método del Ejemplo 1.4, con una unidad sintética de fijación de pRNA que llevaba un bloque de construcción de ribonucleótido en un extremo. El pRNA se obtuvo por síntesis de la SBU sobre un soporte de ribo-U, y desprotección subsiguiente. La realización de la reacción de conjugación de acuerdo con el protocolo arriba mencionado proporcionó el producto deseado (Fig. 8).

Ejemplo 2.1

Producción de 4'-Biotin-pRNA como ejemplo de síntesis de unidades sintéticas de direccionamiento (Fig. 4A)

Una unidad de direccionamiento de pRNA 10-mero sintetizada de acuerdo con los métodos descritos se desprotegió primeramente sobre el soporte CPG por eliminación del subgrupo protector tritilo mediante ácido dicloroacético. Después de activación y acoplamiento de un fosforamidito de biotina (Cruachem) con DCI y oxidación subsiguiente, se introdujo así un derivado de biotina por medio de un enlace fosfodiéster en el extremo 4' de la dirección del pRNA. La purificación cromatográfica y caracterización analítica se llevan a cabo por los protocolos descritos.

Ejemplos

: Bio-102b Bio-GAATGCAGGA: [SEQ ID NO. 92]

: tiempo de retención: 25,4 min; M calc.: 3753; M obs.: 3754

: Bio-103b Bio-AGACGTAGAG: [SEQ ID NO. 93]

: tiempo de retención: 26,2 min; M calc.: 3753; M obs.: 3754

: Bio-104b Bio-AAGTACGAGG: [SEO ID NO. 94]

: tiempo de retención: 26,1 min; M calc.: 3753; M obs.: 3754.

Otras SAUs de pRNA marcadas con biotina utilizan, por ejemplo, en los experimentos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) descritos en el Ejemplo 8, más adelante, se prepararon análogamente a los mostrados anteriormente.

Ejemplo 2.2

Producción de 4'-Tetrahidracida-pRNA como Ejemplo de Síntesis de Unidades sintéticas de direccionamiento (Fig. 4B)

Una unidad de direccionamiento 10-mera preparada de acuerdo con el protocolo de síntesis de pRNA anterior se desprotegió primeramente sobre el soporte CPG por eliminación de su grupo protector trifilo mediante ácido dicloroacético. Después de la activación y acoplamiento de un fosforamidito ramificado simétrico (ChemGenes) con hidrocloruro de piridinio y oxidación subsiguiente, se introdujo un diol ramificado por medio de un enlace fosfodiéster en el extremo 4' del pRNA. A continuación se acopló doblemente un diéster de fosforamidito para producir un direccionamiento de fijación de tetraéster ramificado que, después de desprotección de cianoetilo e hidracinólisis subsiguiente, se hizo reaccionar directamente para dar la tetrahidracida.

Protocolo para preparar el fosforamidito-diéster dietil-5-[[[[bis(1-metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfino]oxi]metil]-1,3-bencenodicarboxilato: Se disolvieron 1,29 g (5 mmoles) de 5-(hidroximetil)isoftalato de dietilo [252,27] (98%, Aldrich; CAS 181425-91-2) en 20 ml de diclorometano seco a la temperatura ambiente y se mezclaron con 2,59 g (40 mmoles, 4 eq.) de N-etiltiisopropilamina [129,25] y 1,3 g (11 mmoles, 1,1 eq) de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidito [236,68] (Aldrich; CAS 89992-70-1). Después de 15 min a la temperatura ambiente, la cromatografía en capa delgada (acetato de etilo/n-heptano (1:4)) indicó la terminación de la reacción. La mezcla se concentró y se mezcló con 30 ml de acetato de etilo/n-heptano (2:3). El hidrocloruro precipitado se eliminó por filtración. El filtrado se concentró y se aplicó directamente a una columna de cromatografía. La elución con acetato de etilo/n-heptano (1:4) dio 1,6 g (70%) de 5-[[[[bis(1-metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfino]oxi]metil]-1,3-bencenodicarboxilato de dietilo como un aceite incoloro. C_{22}H_{33}N_{2}O_{6}P; ^{1}H NMR 8,59 (m, 1H, arom.), 8,21 (m, 2 H, arom,), 4,87-4,75 (m, 2 H, CH_{2} cianoetilo), 4,41 (q, J = 6,98 Hz, 4 H, CH_{2} etilo), 3,95-3,80 (m, 2 H, 2x CH i-Pr), 3,74-3,61 (m, 2 H, CH_{2} cianoetilo), 2,66 (t, J (P,H) = 6,45 Hz, 2 H, O-CH_{2}-arom), 1,41 (t, J = 6 H, 2x CH_{3} etilo), 1,23-1,20 (m, 12 H, CH_{3}, i-Pr); ^{31}P-NMR (CDCl_{3}): \delta = 149,94; ^{13}C-NMR (CDCl_{3}): \delta = 165,8 (C=O), 140,2 (C-CH_{2}-O-P), 132,1 (2x C arom), 131,1 (2xC-H arom), 129,7 (C H arom), 117,6 (CN), 64,7 (P-O-CH_{2}-arom), 61,4 (2x CH_{2} etilo), 58,6 (O-CH_{2}-CH_{2}-CN), 43,4 (2x C-H i-Pr), 24,7 (4x CH_{3} i-Pr), 20,5 (O-CH_{2}-CH_{2}-CN), 14,4 (CH_{3} etilo); HRMS 453,2156 ([M+H]+ C_{22}H_{34}N_{2}O_{6}P calculado: 453,21545). La purificación cromatográfica y la caracterización analítica se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos arriba descritos.

Ejemplos

: 4HY-102b 4HY-GAATGCAGGA: [SEQ ID NO. 95]

: tiempo de retención: 20,7 min; M calc.: 3985; M: obs.: 3986

: 4HY-103b 4HY-AGACGTAGAG: [SEQ ID NO. 96]

: tiempo de retención: 20,8 min; M calc.: 3985; M: obs.: 3986

: 4HY-104b 4HY-AAGTACGAGG: [SEO ID NO. 97]

: tiempo de retención: 20,8 min; M calc.: 3985; M: obs.: 3986.

Ejemplo 3.1

Inmovilización de SAUs modificadas con Hidracida sobre Redes Electrónicas Activas

Los experimentos se realizaron en una Terminal de Trabajo de Biología Molecular NanoChip^{TM} (Nanogen Inc. San Diego, EE.UU.). La inmovilización de las SAUs modificadas con hidracida utiliza redes que llevan una modificación química que puede reaccionar con la hidracida. Una modificación de red para dicho uso es una red con capa de permeación modificada con éster activado como se describe en (PCT/US00/22205). En este caso, la superficie del material soporte se recubrió con poliacrilamida en la cual se han copolimerizado ésteres de N-hidroxisuccinimida activados. La eficiencia de inmovilización se mejoró utilizando SAUs que llevaban en un extremo varias hidracidas (v.g. cuatro) (véase el Ejemplo 2.2). Las SAUs modificadas con hidracida se disolvieron en tampón de histidina 50 mM a una concentración de 500 nM y se direccionaron electrónicamente a las localizaciones deseadas en el dispositivo a 2,2 V durante 3 minutos. Las mismas se fijaron luego en las localizaciones por la vía de reacción de las hidracidas con los ésteres activados para formar enlaces covalentes.

Las redes obtenidas de esta manera se utilizaron para la inmovilización de conjugados de la misma manera que las redes que tenían SAUs fijadas por una interacción no covalente biotina/estreptavidina.

Ejemplo 3.2

Inmovilización de Unidades sintéticas de direccionamiento Biotiniladas sobre Redes Electrónicas Activas

Los experimentos se llevaron a cabo en una Terminal de Trabajo de Biología Molecular NanoChip^{TM} y cartuchos NanoChip^{TM} (NanoGen Inc. San Diego, EE.UU.). La inmovilización de las unidades sintéticas de direccionamiento en la red utilizó protocolos electrónicos estándar de direccionamiento como los establecidos por el fabricante para DNA. Resumidamente, se disolvieron unidades biotiniladas de direccionamiento de pRNA en \beta-histidina 50 mM a una concentración de 500 nM. Esta solución se aplicó al chip y las unidades de direccionamiento se direccionaron electrónicamente a las localizaciones deseadas. Para este propósito, las localizaciones deseadas de la red están polarizadas a un potencial eléctrico que conduce a la concentración de las SAUs. Para las unidades sintéticas de direccionamiento cargadas negativamente, v.g., pRNAs, las posiciones se polarizaron en sentido positivo. Un procedimiento de direccionamiento satisfactorio para pRNA y pDNA era direccionamiento con +2,0 V durante 1 minuto, en la experiencia de los solicitantes.

La red de unidades sintéticas de direccionamiento obtenida de este modo, o por el método de unión de hidracida anterior, puede utilizarse universalmente. Dependiendo del juego de conjugados aplicado, una red de este tipo se convierte en una red basada en aplicaciones especiales.

Ejemplo 4

Inmovilización Selectiva de 10 Conjugados Diferentes sobre Redes Electrónicas Activas

A partir de los sistemas sintéticos de fijación descritos en el Ejemplo 8, se seleccionaron 10 sistemas (N = 10) que eran sustancialmente ortogonales, y no interaccionan significativamente unos con otros (102a,b; 103a,b; 104a,b; 106a,b; 109a,b; 110a,b; 117a,b; 119a,b; 120a,b; 122a,b). El programa de inmovilización y el programa de direccionamiento se representan en la tabla siguiente.

Las unidades sintéticas de direccionamiento se unieron a localizaciones en un NanoChip^{TM}, como en el Ejemplo 3.2, por medio de biotina-estreptavidina. Las 10 unidades de direccionamiento diferentes (serie "b") se cargaron fila a fila de tal modo que se fijaron unidades de direccionamiento idénticas a cada una de las 10 localizaciones en una fila. Con objeto de asegurar que cada una de las 10 unidades de direccionamiento está cargada solamente en una fila, se llevaron a cabo los 10 pasos de unión activa de SAU sucesivamente, con lavados entre los pasos.

1

Las unidades de fijación complementarias usadas eran las 10 secuencias de pRNA (serie "a") complementarias a las 10 unidades de direccionamiento. Para detección en la red, las unidades de fijación se marcaron en el extremo 2' con un resto de tinte (Cy3). Las afinidades de los sistemas de fijación sintéticos se comprobaron utilizando un voltaje de +2,0 V en 180 s. La concentración de las unidades de fijación individuales era en todos los casos 100 nM en tampón de histidina 50 mM. Cada unidad de fijación complementaria se direccionó activamente columna por columna de tal modo que era posible estudiar la fijación de una sola unidad de fijación a la totalidad de las 10 unidades de direccionamiento con una sola activación eléctrica. Utilizando sucesivamente 10 pasos de direccionamiento activos (M = 10), fue así posible testar 10 unidades sintéticas de fijación respecto a sus propiedades de apareamiento con las 10 unidades de direccionamiento. El tiempo para este ensayo paralelo fue 2 horas, mientras que el ensayo de 10 pares en el sistema de resonancia de plasmones de superficie (Ejemplo 8) requería 50 horas. En este caso, la ventaja de tiempo de la codificación realizada por la posible paralelización de pasos de trabajo resulta inmediatamente evidente. Después de dirigir activamente los direccionamientos de fijación complementarias, el chip se lavó con 40 ml de tampón NaCl HBS 50 mM y fue leído luego por el lector de la terminal de trabajo NanoGen. La fluorografía obtenida se muestra en Fig. 15. Únicamente los apareamientos deseados exhiben fluorescencia intensa. Los campos con el borde denso en la tabla de Fig. 15 representan aquellas posiciones del chip NanoGen en las cuales los sistemas de fijación sintéticos están localizados en los que las SAUs unidas y las SBUs direccionadas se corresponden unas a
otras.

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Ejemplo 5

Inmovilización de Oligonucleótidos de Captura/Estabilizadores sobre Redes Electrónicas Activas por Sistemas de Fijación Sintéticos

Se inmovilizan 100 oligonucleótidos captura/estabilizador diferentes sobre una red electrónica activa como sigue: en primer lugar se genera una red de SAUs fijadas utilizando 10 SAUs diferentes (N = 10). Se proporcionan en cada caso 10 localizaciones de red en columnas (véase Fig. 12) con SAUs idénticas. La preparación de una red de este tipo se describe en el Ejemplo 3.1 y en el Ejemplo 3.2.

A continuación, se preparan los conjugados de oligonucleótidos captura/estabilizador y SBUs, como se describe en el Ejemplo 1. Cada oligonucleótido lleva una dirección de SBU específica. Los conjugados se combinan a juegos de 10 conjugados cada uno (en total 10 juegos, M = 10), teniendo cada SBU un NA particular conjugado a ella en cada juego. Los juegos se disuelven en tampón de histidina 50 mM a una concentración de 10 nM (por conjugado) y se direccionan electrónicamente a un primer juego de 10 posiciones. En este caso se tiene cuidado a fin de cada SAU aparezca una sola vez en el juego de localizaciones direccionadas. Un método fácil de asegurarse de esto es, como se representa en Fig. 12, por unión de las SAUs en columnas y direccionamiento de los juegos de conjugados en filas. El direccionamiento electrónico tiene lugar a +2,1 V durante 120 segundos. Los juegos pueden direccionarse a las posiciones sea secuencialmente, parcialmente en paralelo, o simultáneamente para todas las posiciones del juego. El reconocimiento específico de SAU y SBU inmoviliza únicamente el conjugado con la secuencia de reconocimiento coincidente en cada localización individual: dicho de otro modo, el juego se distribuye en conjugados individuales y los conjugados individuales se inmovilizan en localizaciones específicas de la red. A continuación, la red se lava con tampón de histidina 50 mM y se aplica el juego siguiente de conjugados. De nuevo, se lleva a cabo el direccionamiento a 10 posiciones y lavado. Después de 10 ciclos (M = 10), las 100 posiciones son ocupadas por diferentes oligonucleótidos de captura/estabilizadores, y la red puede utilizarse para hibridación u otros ensayos. Comparado con la carga secuencial de una red con 100 ácidos nucleicos individuales, que requiere 100 ciclos, el número de ciclos se reduce en un 90%.

Utilizando la red de ácido nucleico obtenida de este modo, es posible realizar todos los experimentos y ensayos que pueden llevarse a cabo utilizando una red preparada por inmovilización directa de ácidos nucleicos sobre las posiciones de la red, tales como ensayos de expresión génica, SNP, y STR.

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Ejemplo 5.2

Inmovilización Paralela de Mezclas de Conjugados pRNA-DNA: Selectividad de Inmovilización

En una red electrónica activa se unieron 5 SAUs de pRNA (serie "b", secuencias 102b, 103b, 104b, 106b, 109B) en filas utilizando interacciones biotina/estreptavidina como se ha descrito previamente (Ejemplo 2.1). Se utiliza un cartucho estándar estreptavidina/agarosa NanoChip. Condiciones de unión: histidina 50 mM, SAU 500 mM, 2,0 V, 60 s.

Se prepararon 5 mezclas diferentes de 10 conjugados pRNA-DNA por mezcladura de conjugados sintetizados individualmente (Ejemplo 1.2) a 50 nM cada uno. Dentro de cada mezcla se marcaron nueve conjugados con Cy3 y se dejó uno sin marcar. Cada mezcla se direccionó simultáneamente a una columna de localizaciones con 5 direccionamientos de pRNA diferentes. Las condiciones de direccionamiento eran histidina 50 mM, 50 nM para cada conjugado, 2,0 V, 180 s.

\newpage

: Mezcla 1: DTD-102a; EH1-103a-Cy3; CYP19-104a-Cy3; 178850-106a-Cy3; 192610-109a-Cy3; 195088-110a-Cy3; EPHX2-117a-Cy3; NAT12-119a-Cy3; GSTA1-120a-Cy3; NAT1B-122a-Cy3

: Mezcla 2: DTD-102a-Cy3; EH1-103a; CYP19-104a-Cy3; 178850-106a-Cy3; 192610-109a-Cy3; 195088-110a-Cy3; EPHX2-117a-Cy3; NAT12-119a-Cy3; GSTA1-120a-Cy3; NAT1B-122a-Cy3

: Mezcla 3: DTD-102a-Cy3; EH1-103a-Cy3; CYP19-104a; 178850-106a-Cy3; 192610-109a-Cy3; 195088-110a-Cy3; EPHX2-117a-Cy3; NAT12-119a-Cy3; GSTA1-120a-Cy3; NAT1B-122a-Cy3

: Mezcla 4: DTD-102a-Cy3; EH1-103a-Cy3; CYP19-104a-Cy3; 178850-106a; 192610-109a-Cy3; 195088-110a-Cy3; EPHX2-117a-Cy3; NAT12-119a-Cy3; GSTA1-120a-Cy3; NAT1B-122aCy3

: Mezcla 5: DTD-102a-Cy3; EH1-103a-Cy3; CYP19-104a-Cy3; 178850-106a-Cy3; 192610-109a; 195088-110a-Cy3; EPHX2-117a-Cy3; NAT12-119a-Cy3; GSTA1-120a-Cy3; NAT1B-122aCy3.

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El material sin fijar se lavó y se obtiene la imagen de la fluorescencia de Cy3 de la red en una Terminal de Trabajo de Biología Molecular NanoChip. Los resultados se enumeran en la Tabla siguiente. Véase Fig. 18. La un bloque por columna (sic) que corresponde a la SAU/SBU de conjugado sin marcar dentro de la mezcla exhibía fluorescencia baja: esto demostró que había poca fijación inespecífica de los otros 9 conjugados para estas posiciones.

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2

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Nota: un valor de fluorescencia de 1048,6 indica fluorescencia saturada. El valor real es entonces mayor.

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Como segundo paso, una mezcla de cadenas de DNA marcadas con Cy5 complementarias a la parte de DNA de los conjugados (Cy5-DTD-Comp, Cy5-EH1-Comp; Cy5-CYP19-Comp; Cy5-178850-Comp; Cy5-192610-Comp.) se direccionó simultáneamente a las columnas de conjugados inmovilizados (25 mM por DNA, 2,0 V, 180 s). De nuevo se eliminó por lavado el material sin fijar y se obtuvo la imagen de la fluorescencia de Cy5. Las señales de fluorescencia en todas las posiciones demostraban que los conjugados capturan DNA complementario. Los bloques conjugados sin marcar capturaban también complementos de DNA, demostrando que los marcadores no tenían efecto alguno sobre la eficiencia de hibridación.

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3

4

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Secuencias

5

6

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Ejemplo 5.3

Inmovilización Paralela de Mezclas de Conjugados p-RN-DNA: Selectividad de Inmovilización con 10 SAU/SBU

Paso 1

Construcción de una red de unidades sintéticas de direccionamiento (SAU) de p-RNA

En una red electrónica activa se unieron 10 SAU's de p-RNA (serie "b", secuencias 102b, 103b, 104b, 106b, 109b, 110b, 117b, 119b, 120b, 122b) en filas por unión biotina/estreptavidina (Ejemplo 2.1). Se utilizó un cartucho estándar estreptavidina/agarosa NanoChip. Condiciones de unión: Histidina 50 mM, SAU 250 nM, 2,0 V, 60 s. Se obtuvo una red con 10 direccionamientos idénticos de p-RNA en cada fila, teniendo cada fila un direccionamiento de pRNA distinto.

Paso 2

Construcción de una red de DNA

Se preparó una mezcla de 10 conjugados p-RNA-DNA mezclando conjugados sintetizados individualmente (Ejemplo 1.2) a 40 nM cada uno. Dentro de la mezcla de conjugados, cada secuencia de DNA estaba codificada por una SBU de p-RNA específica SBU (DTD-102a, EH1-103a, CYP19-104a, 178850-106a, 192610-109a, 195088-110a, EPHX2-117a, NAT12-119a, GSTA1-120a, NAT1B-122a). La mezcla de conjugados se direccionó activamente de modo simultáneo a la totalidad de los 10 bloques de una columna, con un juego de 10 localizaciones con 10 direccionamientos de p-RNA diferentes. Se direccionaron secuencialmente 10 columnas con la misma mezcla de conjugados. Observación: utilizando 10 mezclas diferentes de conjugados DNA-p-RNA (en donde dentro de cada mezcla cada DNA es codificado por una SBU de p-RNA diferente pero en las diferentes mezclas se codifican diferentes DNA's con SBU's de pRNA repetitivas) en lugar de una sola mezcla de conjugados, es posible construir una red de 100 secuencias de DNA diferentes con el mismo número de pasos de direccionamiento y dentro del mismo tiempo que en este experimento. Las condiciones de direccionamiento eran histidina 50 mM, 40 nM para cada conjugado, 2,0 V, 180 s). La mezcla de conjugados se calentó a 95ºC durante 5 min y se enfrió rápidamente en un baño de hielo, inmediatamente antes de direccionarla a fin de romper las estructuras secundarias y las interacciones DNA-DNA supuestas. Las secuencias de los conjugados en la mezcla eran como sigue:

8

: (Negrilla: p-RNA; cursiva: DNA)

Se obtuvo una red de capturas de DNA inmovilizadas en un chip electrónico activo Nanogen. Dentro de cada fila del chip, estaba inmovilizada la misma secuencia de captura de DNA.

Paso 3

Sondado

Para demostrar la selectividad de la inmovilización de las secuencias de captura de DNA se sondó el chip con 10 mezclas de secuencias informadoras de DNA sin marcar, marcadas con Cy3 y marcadas con Cy5, complementarias a las secuencias de captura de DNA inmovilizadas por las SBSs.

Las mezclas eran como sigue:

a): Dentro de cada mezcla se dejó un informador de DNA sin marcar (mezcla NO. 1: informador NO. 1; mezcla NO. 2: informador NO. 2; ...; mezcla NO. 10: informador NO. 10)

b): Dentro de cada mezcla cada segunda secuencia informadora se marcó con el mismo tipo de tinte fluorescente, y los informadores adyacentes tienen tintes diferentes, dentro de las mezclas.

9

: Mezcla 1: comp, EH1comp-Cy3, CYP19comp-Cy5, 178850comp-Cy3, 192610comp-Cy5,195088comp-Cy3, EPHX2comp-Cy5, NAT12comp-Cy3, GSTA1 comp-Cy5,NAT1Bcomp-Cy3

: Mezcla 2: DTDcomp-Cy3, EHIcomp, CYP19comp-Cy3, 178850comp-Cy5, 192610comp-Cy3, 195088comp-Cy5, EPHX2comp-Cy3, NAT12comp-Cy5, GSTA1 comp-Cy3, NAT1Bcomp-Cy5

: Mezcla 3: DTDcomp-Cy5, EH1comp-Cy3, CYP19comp, 178850comp-Cy3, 192610comp-Cy5, 195088comp-Cy3, EPHX2comp-Cy5, NAT12comp-Cy3, GSTA1 comp-Cy5, NAT1Bcomp-Cy3

: Mezcla 4: DTDcomp-Cy3, EH1comp-Cy5, CYP19comp-Cy3, 178850comp, 192610comp-Cy3, 195088comp-Cy5, EPHX2comp-Cy3, NAT12comp-Cy5, GSTA1 comp-Cy3,NAT1Bcomp-Cy5

: Mezcla 5: DTDcomp-Cy5, EH1comp-Cy3, CYP19comp-Cy5, 178850comp-Cy3, 192610comp, 195088comp-Cy3, EPHX2comp-Cy5, NAT12comp-Cy3, GSTA1 comp-Cy5, NAT1Bcomp-Cy3

: Mezcla 6: DTDcomp-Cy3, EHIcomp-Cy5, CYP19comp-Cy3, 178850comp-Cy5, 192610comp-Cy3, 195088 comp, EPHX2comp-Cy3, NATI 2comp-Cy5, GSTA1 comp-Cy3, NAT1Bcomp-Cy5

: Mezcla 7: DTDcomp-Cy5, EH1comp-Cy3, CYP19comp-Cy5, 178850comp-Cy3, 192610comp-Cy5, 195088 comp-Cy3, EPHX2comp, NATI 2comp-Cy3, GSTA1comp-Cy5, NAT1Bcomp-Cy3

: Mezcla 8: DTDcomp-Cy3, EHIcomp-Cy5, CYP19comp-Cy3, 178850comp-Cy5, 192610comp-Cy3, 195088 comp-Cy5, EPHX2comp-Cy3, NAT12comp, GSTA1 comp-Cy3, NAT1Bcomp-Cy5

: Mezcla 9:DTDcomp-Cy5, EHIcomp-Cy3, CYP19comp-Cy5, 178850comp-Cy3, 192610comp-Cy5, 195088 comp-Cy3, EPHX2comp-Cy5, NAT12comp-Cy3, GSTAIcomp, NAT1Bcomp-Cy3

: Mezcla 10: DTDcomp-Cy3, EH1comp-Cy5, CYP19comp-Cy3, 178850comp-Cy5, 192610comp-Cy3, 195088 comp-Cy5, EPHX2comp-Cy3, NATI 2comp-Cy5, GSTA1 comp-Cy3, NAT1Bcomp.

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Las mezclas informadoras se direccionaron activamente. Los 10 bloques de una columna que representaba un juego de 10 capturas de DNA diferentes se direccionaron en paralelo con una sola mezcla informadora. Se direccionaron secuencialmente 10 columnas, cada una de ellas con una mezcla informadora diferente. Las condiciones de direccionamiento eran histidina 50 mM, 25 nM para cada conjugado, 2,0 V, 180 s. La mezcla informadora se calentó a 95ºC durante 5 min y se enfrió rápidamente en un baño de hielo inmediatamente antes del direccionamiento a fin de romper las estructuras secundarias y las instalaciones DNA-DNA supuestas. Las secuencias de los informadores en la mezcla eran como se indica en la tabla anterior. El chip se lavó con tampón con alto contenido de sal (fosfato 50 mM, NaCl 500 mM; pH 7,0; 20 pasos a 75 \mul/s durante 3 s cada uno) a fin de separar los oligonucleótidos informadores no ligados.

De este modo, se produjo una red de oligonucleótidos informadores ligados en donde los informadores adyacentes están marcados con tintes fluorescentes diferentes. En las posiciones de la diagonal (1,1; 2,2; ...; 10,10) el informador se dejó sin marcar.

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Paso 4

Lectura Fluorescente

La imagen del chip se obtiene con ganancia baja (128 \mus) en ambos canales Cy3 (rojo) y Cy5 (verde):

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Marco 1: VERDE (Canal Cy3)

10

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Nota: La posición 6-2 es el electrodo de referencia y no se utiliza para direccionamiento.

Marco 1: ROJO (canal Cy5)

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11

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El patrón fluorescente coincide con la localización esperada de la fluorescencia en la red, dados los patrones de direccionamiento utilizados. Esto demuestra que:

1.): aunque las mezclas de conjugados se direccionan en paralelo, cada una de las secuencias de captura de DNA está inmovilizada en un bloque específico (localización) en la red como se define por su reconocimiento de p-RNA SBU/SAU

2.): aunque se direccionan en paralelo, cada oligonucleótido informador de DNA está ligado específicamente por su captura de DNA coincidente.

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Ejemplo 5.4

Uso de Ácidos Nucleicos Inmovilizados en una Determinación de SNP

Como demostración de la aplicación práctica de los ácidos nucleicos inmovilizados por el sistema de fijación sintético a diversos formatos de ensayo, se llevó a cabo un solo experimento de tipo polimorfismo de nucleótidos (SNP) utilizando conjugados inmovilizados pRNA-DNA en un dispositivo NanoChip^{TM}. El formato del ensayo de discriminación SNP es estándar en el dispositivo, y esta variante particular utiliza sondas de apilamiento de bases para distinguir mejor entre ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes. En lugar de amplicones PCR se utilizaron como dianas oligonucleótidos sintéticos.

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12

1200

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Un direccionamiento de fijación sintético de p-RNA (H4-102b del Ejemplo 2.2) se fijó en 4 posiciones de un cartucho Nanochip como se describe en el experimento 3.1. Un conjugado DNA-p-RNA estabilizador de captura se direccionó a las 4 posiciones. El conjugado se ligó a la superficie por la interacción específica de p-RNA que conducía a un estabilizador de captura de DNA monocatenario inmovilizado en la superficie del chip. Las condiciones de direccionamiento para la captura fueron: Conjugado 50 nM; histidina 50 mM; 2,0 V, 120 s. Se direccionó una secuencia diana de tipo salvaje a la posición #1 del chip (DNA 40 nM, histidina 50 mM; 2,0 V, 120 s). Después de lavado del material no ligado con tampón de histidina, una diana de SNP mutante con una sola mutación de base se direccionó a la posición #2 del chip en las mismas condiciones. Se direccionó a la posición #3 una mezcla 1:1 de diana de tipo salvaje y mutante. Se direccionó a la posición #4 una mezcla 1:4 de diana de tipo salvaje y
mutante.

El informe se realiza hibridando pasivamente una mezcla del informador de tipo salvaje marcado con Cy3 y el informador mutante marcado con Cy5 a todas las posiciones del chip (en el informador 500 nM, fosfato 50 mM de pH 7,5, NaCl 50 mM). Después de lavado con tampón rico en sal (fosfato 50 mM de pH 7,5, NaCl 500 mM) se mide la fluorescencia de las 4 posiciones del chip en el canal Cy3 y C5. La fluorescencia de Cy3 se normaliza (100% para el tipo salvaje en la posición #1) y la señal de Cy5 de la diana de SNP mutante se normaliza (100% en la posición
#2).

Se miden las señales siguientes:

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Ejemplo 6

Inmovilización de ácidos nucleicos amplificados

Se inmovilizan ácidos nucleicos amplificados por utilización de conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos amplificados. Un método de obtención de tales conjugados consiste en la utilización de conjugados de SBUs y ácidos nucleicos como iniciadores para reacciones de amplificación enzimáticas, como se describe más adelante. Las reacciones de amplificación típicas para ácidos nucleicos son la reacción en cadena de polimerasa (PCR), o métodos isotérmicos como han sido descritos por Westin et al. (J. Clinical Microbiol 39(3) 1097-1104 (2001)). Si el iniciador utilizado en tales métodos es un conjugado, se obtiene un conjugado en el cual los ácidos nucleicos amplificados están enlazados a una SBU.

Los conjugados de esta clase se inmovilizan sobre materiales soporte utilizando los conjugados en los protocolos de direccionamiento descritos arriba para conjugados de captura/estabilizadores: después de la reacción de amplificación, los conjugados se combinan, en caso deseado, para formar juegos en los cuales cada SBU aparece una sola vez. Los conjugados se desalan (columnas BioRad Bio-Spin) y se diluyen con tampón de histidina 50 mM hasta una concentración final de 2,5 a 10 nM. Los conjugados se dirigen a las localizaciones deseadas en un instrumento NanoGen de acuerdo con los protocolos del fabricante (+2,0 V; 3 minutos). El reconocimiento y la fijación específicos de SBU y SAU inmovilizan los conjugados de tal manera que, como resultado, se obtiene una red de ácidos nucleicos amplificados. Utilizando esta red, es posible llevar a cabo todos los experimentos y ensayos que pueden realizarse utilizando una red preparada por inmovilización directa de amplicones de ácidos nucleicos en las posiciones de la red, tales como ensayos de expresión génica y SNP.

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Ejemplo 7

Inmovilización de Ácidos Nucleicos Amplificados para Estudios de Expresión Génica

La cuestión de la frecuencia relativa de ácidos nucleicos particulares, el mRNA de los genes, es fundamental para los estudios de expresión génica. Para este propósito, se aíslan mRNAs de tejidos o células, y se amplifican secciones específicas de los mismos. El mRNA se aísla de tejidos, como se describe en DNA Microarrays - A Practical Approach (Schena, M; Oxford University Press, Oxford, 1999), y se amplifican secuencias particulares de ácidos nucleicos (genes) con iniciadores biotinilados específicos. Si los conjugados de ácidos nucleicos y SBUs se utilizan en su lugar como iniciadores, se obtiene un producto de amplificación codificado para la especie apropiada. La reacción de amplificación se lleva a cabo individualmente para cada vez, etapa o población de acuerdo con el protocolo indicado. Secuencias idénticas de genes pero de tiempos, etapas o poblaciones diferentes, se codifican con SBUs diferentes. Cuando se examina una pluralidad de secuencias al mismo tiempo, los ácidos nucleicos pueden amplificarse simultáneamente de acuerdo con una reacción de amplificación múltiple. Después de la amplificación, los conjugados se combinan en juegos de tal modo que

a): todas las veces, etapas o poblaciones de una especie, que van a compararse, se reúnen en un juego (con una SBU diferente en cada caso) y que

b): cada SBU aparece una sola vez en cada uno de los juegos.

Una red de unidades sintéticas de direccionamiento unidas (SAU) se prepara de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 3.1 y 3.2 (véase Fig. 13B). En esta red, los juegos se dirigen a las localizaciones de las SAUs complementarias a las SBUs contenidas en un juego por aplicación de un voltaje (+2,0 V durante 3 min). En este contexto, al menos aquellas localizaciones que llevan SAUs complementarias a las SBUs de un gen se direccionan simultáneamente. Como resultado, los tiempos, etapas o poblaciones de un gen, que van a compararse, pueden inmovilizarse en condiciones idénticas. Los amplicones fijados a las posiciones de la red se detectan luego por hibridación con un ácido nucleico marcado complementario al amplicón del gen.

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Ejemplo 8

Detección de la Estabilidad y Selectividad de la Fijación de los Sistemas Sintéticos de Fijación en un Experimento Múltiple de SPR con 14 Pares Unidad de Direccionamiento/Unidad de Fijación de pRNA Diferentes

Todos los experimentos de SPR (resonancia de plasmones de superficie) descritos se llevaron a cabo en un instrumento BIAcore 2000 de BIAcore (Uppsala, Suecia), con software BIAcore Control 3.1. Los sensogramas registrados se evaluaron y procesaron utilizando el software 3.1 de BIAevaluation. Las unidades de direccionamiento de pRNA biotiniladas se fijaron a la superficie de chips BIAcore "Sensor Chip SA". Cada chip comprende 4 "canales" (conductos de tipo fluido con la superficie del sensor) que están disponibles tanto para inmovilización como para detección. El sistema tampón utilizado era el tampón estándar HBS-EP de BIAcore. Cada chip sensor utilizado se sometió a un proceso de limpieza previamente a la fijación de las unidades de direccionamiento de tal modo que se obtuvo subsiguientemente una línea basa constante en los cuatro canales.

Con objeto de limpiar el Sensor Chip para uso óptimo en los experimentos, se desarrolló un protocolo que comprendía los pasos siguientes:

1.: 10 min de lavado con tampón HBS-EP (5 \mul/min)

2.: 1 min de inyección de NaOH 10 mM (5 \mul/min)

3.: 5 min de lavado con tampón HBS-EP (5 \mul/min)

4.: Repetición de los pasos 1-3 dos veces.

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Inmovilización de las unidades sintéticas de direccionamiento de pRNA

Unidades de direccionamiento de pRNA biotiniladas con secuencias "b" con una biotina 4' (producida como en el Ejemplo 2.1) se fijaron a la superficie del SensorChip utilizando protocolos proporcionados por el fabricante del instrumento. Cada canal (posición en el chip Biacore) está provisto por tanto de una unidad de direccionamiento definida. Con objeto de asegurar esto, el paso de fijación tuvo que llevarse a cabo sucesivamente para los cuatro canales. La eficiencia de fijación de la superficie se mejoró por disolución de las unidades de direccionamiento por separado en NaCl 500 mM HBS-EP (en lugar del tampón estándar Biacore NaCl 150 mM HBS-EP). La concentración de las unidades sintéticas de direccionamiento era siempre 100 nM.

Cada canal se preparó a 295 K durante 2 minutos a un caudal de 5 \mul/min de tal modo que después de la inmovilización se ligaron aproximadamente 700-800 RU (unidades de resonancia) de sustancia. Después de la fijación, cada canal se lavó con tampón estándar BHS-EP durante 10 min más. Así, fue posible ligar cuatro unidades de direccionamiento diferentes por chip. Con objeto de ensayar 14 unidades de direccionamiento diferentes, tuvieron que usarse por tanto cuatro chips (3 chips con 4 unidades de direccionamiento y un chip con dos unidades de direccionamiento. Cada chip se trató en todos los casos con protocolos y soluciones tampón idénticos.

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Fijación de unidades de fijación complementarias a las superficies

Se inyectó una unidad de fijación sintética complementaria en los cuatro canales de un sensor chip de tal modo que fue posible, utilizando una sola inyección de sustrato, testar directamente cuatro unidades sintéticas de direccionamiento en cuanto a sus afinidades con la unidad de fijación. La fijación de las unidades de fijación complementarias se estudió en tampón NaCl 150 mM HBS-EP a un caudal de 30 \mul/min a 295 K y con un tiempo de inyección de 2 min. La concentración de las 14 unidades de fijación complementarias era siempre 300 nM: las soluciones se prepararon por separado. Después de cada inyección, siguió un paso de lavado de 20 min a fin de poder estimar la fuerza de fijación/afinidad de los direccionamientos de fijación. Después de testar la fijación de los conjugados individuales, los conjugados se separaron por disrupción de la interacción SAU/SBU con NaOH 15 mM. Subsiguientemente, el chip estaba listo para otra inyección, es decir la superficie del material soporte se regeneraba y estaba disponible para ensayos ulteriores. El protocolo se llevó a cabo 14 veces sobre un chip a fin de estudiar cada unidad sintética de direccionamiento en cuanto a afinidad para las unidades sintéticas de fijación. Por consiguiente, para los cuatro chips el protocolo tuvo que llevarse a cabo 64 veces.

Protocolo de fijación de un SensorChip en 4 canales:

1.: 2 min de inyección de la unidad de fijación complementaria x (30 \mul/min)*

2.: 20 min de lavado con tampón HBS-EP (30 \mul/min)

3.: 1 min de inyección de NOH 10 mM (5 \mul/min)

4.: 5 min de lavado con tampón HBS-EP (5 \mul/min)

5.: 1 min de inyección de NaOH 10 mM (5 \mul/min)

6.: 20 min de lavado con tampón HBS-EP (30 \mul/min)

7.: Repetición 13 x pasos 1-6.

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Los nombres de la unidad de fijación sintética y las unidades sintéticas de direccionamiento estudiados respecto a su afinidad y especificidad se indican en Fig. 14. El número designa el nombre de los sistemas de fijación; en este experimento, "b" era la unidad sintética de direccionamiento fijada a la superficie del SensorChip; en este experimento, "a" era la unidad de fijación sintética cuya fijación a la unidad de direccionamiento se presentaba. Las unidades sintéticas de direccionamiento se sintetizaron y purificaron como pRNA de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 2.1.

El resultado del estudio de fijación de SPR se representa en Fig. 14. La diagonal indica claramente la fijación específica de los sistemas de fijación sintéticos. Obsérvese que fuera de la diagonal, la mayoría de las SBUs no interaccionan con las SAUs no correspondientes, o lo hacen en una proporción que es mucho menor que su interacción con su SAU correspondiente. Estas secuencias son "ortogonales" unas con respecto a otras. Fuera de la diagonal, aparecen interacciones indeseables en varias posiciones, por ejemplo los pares 118 y 119. Estas dos secuencias SBS son ligeramente ortogonales una respecto a otra. Las combinaciones de unidades sintéticas de direccionamiento y unidades sintéticas de fijación que exhiben tales reacciones cruzadas pueden evitarse si se requiere para un experimento particular o para la construcción de una red particular.

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Ejemplo 9

Uso de Conjugados pRNA-DNA como Iniciadores en una Reacción PCR

Para la reacción PCR, se utilizó un juego de dos conjugados pRNA-DNA diferentes (juego 1 y juego 2) que sirven como iniciadores durante la reacción de amplificación. La preparación de los iniciadores por síntesis en fase sólida se describe en el Ejemplo 1.1. Con la ayuda de estos nuevos iniciadores, se amplificó y aisló una sección de secuencia definida del gen de la \alpha-fetoproteína de Mus musculus. El cDNA del gen se utilizó en este caso para amplificación. Los constructos iniciadores tenían las secuencias siguientes:

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La secuencia del cDNA del gen de \alpha-fetoproteína, a partir de la cual se amplificaron las secuencias, es:

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El fragmento del gen amplificado que era de esperar utilizando el juego de iniciadores 1 está subrayado en la secuencia.

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Protocolo de amplificación

Para la amplificación, se añadieron 4 \mul de una mezcla de dNTP (2,5 mM; Promega), 2,5 \mul de Feto1-102a (inverso) (10 \muM), 2,5 \mul de Fetol (directo) (10 \muM), 1 \mul de polimerasa taq (5 U/\mul; Promega) y 2 \mul de cDNA aislado de Mus musculus a 30 \mul de agua DEPC (Ambion) 5 \mul de 10 x politampón de DNA termófilo (Promega), 3 \mul de MgCl_{2} (25 mM; Promega). Para la reacción PCR, la mezcla de 50 \mul se sometió al ciclo de amplificación siguiente: pre-incubación a 95ºC durante 2 min; 35 ciclos de PCR a 94ºC (15 s), 55ºC (30 s), 72ºC (30 s) y finalmente 72ºC (7 min). Una vez completada la amplificación, la mezcla de reacción se retiró y se guardó a 4ºC. La amplificación se llevó a cabo durante etapas de expresión diferentes del gen de \alpha-fetoproteína utilizando los juegos de iniciadores 1 y 2. Así, se determinó la expresión del gen de \alpha-fetoproteína murina en hígado murino fetal para las etapas de desarrollo de 8 días 8 y 14 días utilizando los nuevos iniciadores. Como control, se realizó una reacción en paralelo utilizando iniciadores estándar de DNA, y se analizó en un gel de agarosa (véase Fig. 22) para comparación. Para análisis de la expresión génica, se apartó una muestra (20 \mul) de la mezcla PCR, se mezcló con 2 \mul de 6 x tampón de carga (Sigma) y se separaron las bandas en un gel de agarosa al 1,7%.

Como se muestra en Fig. 22, en Feto1 y Feto2 se forman productos de amplificación específicos del gen utilizando los iniciadores conjugados siempre que los productos se obtengan también con iniciadores de DNA. Inversamente, los iniciadores conjugados no producen producto alguno cuando los iniciadores de DNA no producen producto alguno (v.g., Feto2 d8), lo que demuestra que no tiene lugar amplificación inespecífica. La serie de diluciones de Ceto1-102a (inversa), en la cual el iniciador conjugado se utilizó a concentraciones decrecientes, demuestra que no aparecen iniciadores dímeros si se utilizan cantidades relativamente bajas del iniciador.

Adicionalmente, los productos conjugados de SBU de la región PCR podían ser inmovilizados por SBUs en un NanoChip^{TM}, en un procedimiento análogo al del Ejemplo 4.

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Ejemplo 10

Uso de los Conjugados pRNA-DNA en PCR de Escala Midi (reacción de 500 \mul)

Para aplicaciones particulares se requieren mayores cantidades de ácidos nucleicos amplificados codificados. El ejemplo siguiente describe el uso del conjugado pRNA-DNA para amplificación con iniciadores de un fragmento del gen de \alpha-fetoproteína murina a partir de una biblioteca de cDNA en una mezcla de PCR relativamente grande (500 \mul). Utilizando juegos de iniciadores idénticos, como se describe en el Ejemplo 9, se aplicó el protocolo de amplificación siguiente.

Para la amplificación, se añadieron 4 \mul de una mezcla de dNTP (2,5 mM; Promega), 25 \mul de Feto1-102a (inv.) (10 \muM), 25 \mul de Fetol (dir.)(10 \muM), 10 \mul de polimerasa taq (5 U/\mul; Promega) y 20 \mul de una biblioteca de cDNA de Mus musculus a 336 \mul de agua DEPC (Ambion) 50 \mul de 10x politampón termófilo de DNA (Promega), 30 \mul de MgCl_{2} (25 mM; Promega). Para la reacción PCR, la mezcla de 500 \mul se sometió al ciclo de amplificación siguiente: pre-incubación a 95ºC durante 2 min; PCR de 35 ciclos a 94ºC (15 s), 55ºC (30 s), 72ºC (30 s) y finalmente 72ºC (7 min). Después de terminada la amplificación, se retiró la mezcla de reacción y se guardó a 4ºC.

Análogamente al Ejemplo 9, se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa para el fraccionamiento. El resultado se representa en Fig. 22B. Los fragmentos de gen obtenidos se purificaron con ayuda del kit de purificación Qiagen y se secuenciaron subsiguientemente. Se confirmó la amplificación de la secuencia deseada.

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Ejemplo 11

Fijación de un Conjugado con un Ácido Nucleico por Medio de RNA-Ligasa T4

El acoplamiento enzimático entre moléculas híbridas 5'-fosfato-(3'-O-metil-RNA)-pRNA (donante) y RNA (aceptor) por medio de RNA-ligasa T4 se describe a continuación. Para antecedentes sobre reacciones de fijación, véase Engiand, T.E.; Nature, 275, 560-561 (1978) o Engiand, T.E.; Bruce, A.G.; Uhlenbeck, O.C. Methods in Enzymology 65(1), 65-74 (1980) o Romaniuk, Paul J.; Uhlenbeck, Olke C. Methods Enzymol. 100, 52-9 (1983)). En esta reacción, se forma un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5' de la molécula híbrida RNA-pRNA y el grupo 3'OH de un RNA aceptor. El RNA aceptor utilizado se preparó por transcripción in vitro de acuerdo con un molde de DNA, utilizando un promotor 5' T7 y una RNA-polimerasa T7.

Preparación de un molde de transcripción in vitro (para generación de un RNA aceptor) por PCR utilizando los iniciadores siguientes

Oligonucleótido #1, Iniciador directo:: 5-TAATACGACTCACTATAGGG-3'[SEO ID NO. 177]

Oligonucleótido #2, iniciador inverso:: 5-TGGGGCTAAGCGGGATCG-3'[SEQ ID NO. 178]

Oligonucleótido #3, molde:

Se utilizó una mezcla de reacción PCR constituida por iniciador directo 1 \muM (oligonucleótido #1), iniciador inverso 1 \muM (oligonucleótido #2), molde 0,2 \muM (oligonucleótido #3), MgCl_{2} 2 mM, KCl 50 mM, Tris/HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), 0,1% (v/v) de Tritón X-100, dNTP 0,2 mM, 0,05 U/\mul de polimerasa Taq (Promega) para una amplificación PCR a lo largo de 20 ciclos de acuerdo con el programa de temperatura siguiente:

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Se preparó luego el RNA aceptor por transcripción in vitro a partir del molde. El producto PCR sin purificar se utilizó como molde de DNA para un kit de transcripción in vitro (sistema de producción de RNA en gran escala Promega Ribomax^{TM}, T7). La mezcla de transcripción in vitro se incubó a 37ºC durante 2-6 h. Subsiguientemente, los productos de transcripción se purificaron por un gel preparativo de urea o por medio de una columna de purificación RNeasy^{TM} (Qiagen). El éxito de la reacción de transcripción se monitorizó por fraccionamiento de los productos de transcripción en un gel de poliacrilamida-urea al 10%.

Enlace enzimático entre moléculas híbridas RNA-pRNA y RNA aceptor por medio de RNA-ligasa T4

Para fijación de una molécula híbrida 5'-fosfato-(3'-O-metil-RNA)-pRNA (donante) con el RNA aceptor, se incubaron 100 pmoles de RNA aceptor purificado junto con 300 pmoles o 1000 pmoles de una molécula híbrida 5'-fosfato-(3'-O-metil-RNA)-pRNA (descrita en el Ejemplo 1.2) y 10 U de RNA-ligasa T4 (MBI Fermentas), HEPES/NaOH 50 mM (pH 8,0 a 25ºC), MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, 20 \mug/ml de BSA y 10% (v/v) de DMSO en un volumen de reacción final de 15 \mul a 16ºC durante 30 min.

Para comprobar el éxito de la ligación, se añadió un volumen igual de un tampón de carga (urea 8,3M, EDTA 50 mM) a las mezclas que, después de desnaturalización térmica (5 min a 80ºC), se fraccionaron sobre un gel de poliacrilamida-urea al 10% (40 mA durante aprox. 20 min). Los ácidos nucleicos se visualizaron luego en el gel por sombreado UV (Fig. 23A). Adicionalmente, fue posible detectar el producto de fijación particular en el gel por medio de escaneo de fluorescencia, debido a la marcación de la mitad (3'-O-metil-RNA)-pRNA de la molécula con el tinte de fluorescencia Cy3 (Fig. 23B). Dado que el RNA aceptor no contiene tinte alguno, el RNA no es detectable en la imagen de fluorescencia. Debido a su corta longitud,

\hbox{el conjugado de pRNA libre no aparece tampoco en la
imagen de fluorescencia.}

Ejemplo 12

Uso de los Conjugados SBU-NA como Iniciadores en Reacciones SDA Ancladas

Los iniciadores SDA directo e inverso (cada uno de los cuales contiene una secuencia de reconocimiento de endonucleasa BsoBI 5' de una secuencia que es específica para un ácido nucleico diana) pueden unirse a SBUs por los métodos descritos en el Ejemplo 1. Éstos se direccionan luego electrónicamente a localizaciones individuales en la red de microchips. Pueden emplearse pares SAU/SBU simples o múltiples en una cualquiera de las localizaciones, para la amplificación de un solo producto, o amplificación múltiple. Una diana ilustrativa para amplificación podría ser la \alpha-fetoproteína de Mus musculus arriba descrita, para la cual pueden utilizarse las secuencias de iniciadores anteriores, con la adición de una secuencia del sitio de reconocimiento BsoBI (C/YCGRG). El DNA molde de una muestra se direcciona luego electrónicamente y se híbrida a los iniciadores inmovilizados.

La reacción de amplificación se inicia por la adición de enzimas e iniciadores amortiguadores (que se hibridan 5' a los iniciadores SDA en cada cadena del ácido nucleico diana). El chip se calienta a 60ºC durante 5 min. Se introducen en el chip 10 \mul de una mezcla SDA precalentada (ácido morfolinopropano-sulfónico [MOPS] 6 mM, pH 7,8; dGTP, dTTP, dATP 1,7 mM [cada uno], y dCTP tiolado; KCl 85 mM, MgCl_{2} 18 mM; NaCl 23 mM; Tris-HCl 3,5 mM, pH 7,9; ditiotreitol 35 \muM; 1,5 U de BsoBI; 0,8 U de Bstl polimerasa; y 25 nM de cada iniciador amortiguador). Después de incubación durante 30 min a 60ºC, se interrumpe la reacción de amplificación por lavado del chip 5 veces con NaCl 37,5 mM, citrato de sodio 3,75 mM, pH 7,2. Los amplicones anclados se desnaturalizan con solución alcalina (NaCl 75 mM, citrato de sodio 7 mM, pH 12,5) durante 4 min y se lavan 5 veces con NaCl 37,5 mM, citrato de sodio 3,75 mM, pH 7,2, para separar los amplicones complementarios no anclados. Los amplicones anclados se detectan subsiguientemente por hibridación con la sonda informadora apropiada.

Ejemplo 13

Ensayo del Factor V Leiden codificado por p-RNA

Este ejemplo está enfocado a la detección de una mutación de un solo punto (G \rightarrow A) en la posición 1691 del gen del Factor V Leiden humano. Muestras de origen individual se codifican con p-RNA y se inmovilizan así en posiciones específicas de un chip activo. Las muestras se direccionan en 10 juegos, comprendiendo cada juego 4 muestras amplificadas por PCR y codificadas individualmente. La mutación está tipificada por un ensayo de apilamiento de bases como ha sido descrito por Gilíes, P.N., Wu, D.J., Foster, C.B. Dillon, P.J., Chanock, S.J.; Nature Biotechnology, 17, 365-370 (1999).

Preparación de la Muestra

La amplificación del DNA muestra de Factor V purificado en reacciones PCR paralelas pero separadas utilizando un iniciador codificado por p-RNA (directo) [SEQ ID NO. 186] e iniciador inverso [SEQ ID NO. 185], Cada reacción PCR contiene un iniciador codificado por p-RNA diferente específico (secuencia del código de p-RNA: SEQ ID Nos. 49, 51, 53, 57) y el iniciador inverso por utilización de concentraciones y condiciones de iniciadores PCR estándar.

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Preparación Detallada de la Muestra

Se prepararon las mezclas de reacción xPCR siguientes (x = 1, 2, 3, 4), cada una en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (suficiente para 10 reacciones):

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18

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Se transfirieron 23 \mul de la mezcla de reacción PCR 1 (x = 1) a los pocillos en la fila 1 (A1, A2, A3, A4, ... A10) de la placa de pocillos PCR, 23 \mul de la mezcla de reacción PCR 5 2 (x = 2) en los pocillos de la fila 2 (B1, B2, B3, B4, ... B10) de la placa de pocillos PCR ..., 23 \mul de la mezcla de reacción PCR 4 (x = 4) en los pocillos de la fila 4 (D1, D2, D3, D4, ... D10) de la placa de pocillos PCR.

Se añadieron 2 \mul de una muestra de DNA Factor V a uno de los pocillos PCR y se mezclaron con la mezcla de reacción PCR. Este paso se repitió con todas las 39 muestras restantes en la placa de pocillos.

A continuación se llevaron a cabo las reacciones PCR en la placa de pocillos, y se amplificaron por el protocolo siguiente en un termociclador:

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19

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Las placas de pocillos PCR se retiraron del ciclador térmico. Los productos PCR en la columna A de la placa de pocillos se combinaron con una mezcla de amplicones 1 por transferencia de los amplicones que contenían los productos: PCR A1, B1, C1, D1 en un solo pocillo de una placa de desalado Millipore Multiscreen PCR.

Los productos PCR en la columna 2 de la placa de pocillos se combinaron con una mezcla de amplicones 2 por transferencia de los amplicones que contenían los productos PCR A2, B2, C2, D2 en un solo pocillo de una placa de desalado Millipore Multiscreen PCR, y así sucesivamente.

Por último, los productos PCR de la columna 10 se combinaron con una mezcla de amplicones 10 por transferencia de los amplicones que contenían los productos PCR A10, B10, C10, D10, en un solo pocillo de una placa de desalado Millipore Multiscreen PCR.

Se añadieron 50 \mul de dH_{2}O a cada pocillo de la placa de desalado que contenía una mezcla de amplicones, se dispuso la placa de desalado en un distribuidor de vacío Millipore y se secó con una bomba de vacío a 500 mbar. Se añadieron luego 100 \mul de dH_{2}O a cada pocillo que contenía una mezcla de amplicones. Este paso se repitió dos veces. Se añadieron luego 100 \mul de tampón de histidina 50 mM a cada pocillo que contenía una mezcla de amplicones.

La placa de desalado se dispuso en un girador orbital durante 5 minutos, ajustando la potencia al ajuste de velocidad máximo.

\newpage

Cada mezcla de amplicones se transfirió a continuación a una placa de pocillos y se calentó durante 5 minutos hasta 95ºC para separar los dúplex de amplicones (proceso de desnaturalización), sacudir las mezclas e introducir el material inmediatamente en hielo (guardado a 0ºC).

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Operaciones de Carga de Chips en una Terminal de Trabajo de Biología Molecular Nano-Chip^{TM} a) Operaciones de Cargador de Direccionamiento de p-RNA

Se transfirieron 60 \mul de los direccionamientos de p-RNA (SAU) (200 nM cada uno en tampón His 50 mM) (secuencias de los direccionamientos de p-RNA: SEQ ID Nos. 50, 52, 54, 58) a pocillos diferentes de una placa de pocillos Nunc. La inmovilización de los direccionamientos de p-RNA se realizó por filas (se direccionarán 10 bloques por cada dirección específico de p-RNA, tiempo de activación: 60 s, voltaje: 2,0 V) con un cajón de cargador. Para las operaciones de carga se utilizó un chip electrónico activo de 100 sitios. Las operaciones de carga se realizaron como se describe en el protocolo siguiente.

Para la inmovilización de los direccionamientos de p-RNA (direccionamiento 1 de pRNA, direccionamiento 2 de p-RNA, ... , direccionamiento 4 de p-RNA) se retiraron del frigorífico y se dejaron descongelar a la temperatura ambiente.

Se transfirieron 60 \mul de cada uno de los direccionamientos de p-RNA a una placa de pocillos Nunc, utilizando un pocillo separado para cada direccionamiento de p-RNA. La placa de pocillos Nunc se cubrió utilizando la cinta especificada de marca Scotch.

El cartucho de Chips y la placa de pocillos se transfirieron al cargador y se ejecutó el archivo del cargador.

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b) Operaciones del Cargador de Amplicones

60 \mul de las mezclas de amplicones (guardadas a 0ºC) diluidos en 100 \mul de tampón de Histidina 50 mM se transfirieron a los pocillos de una placa de pocillos Nunc. Cada una de las mezclas de amplicones aplicadas se hibridará activamente por columnas (4 bloques simultáneamente) 180 s a 2,0 V con un cajón de cargadores en el chip precargado preparado en la primera operación de carga (a).

Para el direccionamiento de las muestras, las mezclas de amplicones 1, 2, 3, ..., 10, cada una de las cuales contiene cuatro productos PCR codificados de p-RNA diferentes, se dejaron descongelar a la temperatura ambiente y se creó un archivo de mapas de cargador. Se transfirieron 60 \mul de las soluciones mezcla de amplicones a un pocillo en la placa de pocillos, utilizando un pocillo separado para cada solución de mezcla. La placa de pocillos se cubrió utilizando la cinta de marca Scotch especificada. El cartucho, precargado con los direccionamientos de p-RNA (véase la inmovilización de direccionamientos de p-RNA) se insertó en el cargador y se ejecutó el archivo del cargador.

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Operaciones del Lector de Chips, Detección de la Muestra

La lectura del Ensayo del Factor V puede hacerse utilizando el ensayo de apilamiento como se describe en Gilies, P.N., Wu, D.J., Foster, C.B. Dillon, P.J., Chanock, S.J.; Nature Biotechnology, 17, 365-370 (1999). Se añadieron 20 \mul de Informador de Tipo Salvaje (50 \muM) [SEQ ID NO. 188], 20 \mul de Informador de Mutación (50 \mum) [SEQ ID NO. 189] y 40 \mul de un Estabilizador (50 \muM) [SEQ ID NO. 187], La detección de la señal de fluorescencia Cy3 o Cy5 se llevó a cabo una temperatura de discriminación de 31ºC. Los datos se analizan con el instrumento de análisis SNA proporcionado con la Terminal de Trabajo de Biología Molecular NanoChip^{TM}.

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20

21

Umbrales de Designación de las Sondas

Heterocigoto < 1:2 < Sin Designación < 1:5 < Homocigoto

Relación señal a ruido para Exclusión del Bloque o Sin Designación: 5:1.

<110> Nanogen Recognomics GmbH

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<120> SISTEMA DE CLASIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN PARA ÁCIDOS NUCLEICOS UTILIZANDO SISTEMAS DE FIJACIÓN SINTÉTICOS

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<130> 201at18.wo

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<150> US 09/910,469

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<151> 2001-07-19

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<160> 189

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 8

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)..(8)

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<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip0,8cm

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 8

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)..(8)

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<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\hskip0,8cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

<22i> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pirannsil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranoxil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

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\hskip0,8cm

78

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pirannsil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

82

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

84

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

86

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

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<223> Piranosil RNA

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<400> 66

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\hskip0,8cm

87

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<211> 10

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

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<400> 67

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\hskip0,8cm

88

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

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<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

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\hskip0,8cm

89

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

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\hskip0,8cm

90

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pirannsosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 2'-O-metil-RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DMA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto glicerilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Grupo funcional hidracida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto tetra-hidracida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto tetra-hidracida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto tetra-hidracida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

<2225 (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto biotina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26).. (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

132

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)..(42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

136

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

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<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

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\hskip0,8cm

137

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

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\hskip0,8cm

138

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

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\hskip0,8cm

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<210> 120

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)

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<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (28)..(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

141

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<210> 121

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (38)

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<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(38)

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<223> Piranosil RNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

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\hskip0,8cm

142

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<211> 42

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sistema de fijación sintético

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (42)

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<223> Tinte Cy3

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (33)..(42)

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<223> Piranosil RNA

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\hskip0,8cm

143

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26).. (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)..(42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1166

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1167

\newpage

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<210> 148

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<400> 148

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<210> 149

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<400> 149

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\hskip0,8cm

1169

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\hskip0,8cm

170

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<400> 151

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171

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<400> 152

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\hskip0,8cm

172

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<212> DNA

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (25)

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<223> Tinte Cy3

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip0,8cm

173

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<210> 154

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (30)

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<223> Tinte Cy3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

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\hskip0,8cm

174

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<210> 155

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Base modificada

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<222> (25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip0,8cm

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (28)

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<223> Tinte Cy3

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\hskip0,8cm

176

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<212> DNA

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (25)

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<223> Tinte Cy3

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\hskip0,8cm

177

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<210> 158

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (25)

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<223> Tinte Cy3

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\hskip0,8cm

178

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<210> 159

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

179

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<210> 160

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<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (28)

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<223> Tinte Cy3

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<400> 160

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\hskip0,8cm

180

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<210> 161

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<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (32)

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<223> Tinte Cy3

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182

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (25)

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<223> Tinte Cy3

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)

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<223> Tinte Cy5

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)

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<223> Tinte Cy5

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186

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<210> 167

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)

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<223> Tinte Cy5

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<400> 167

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187

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

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<222> (1)

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<223> Tinte Cy5

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

188

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\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 169

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de test de ácido nucleico

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<220>

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<221> Base modificada

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<222> (1)

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<223> Tinte Cy5

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2009

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2009)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Alfa-fetoproteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico tipo salvaje

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Piranosil RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico tipo salvaje comunicada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de test de ácido nucleico mutante comunicada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tinte Cy5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sistema de fijación sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Estabilizador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Informador tipo salvaje

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Informador mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

209

Claims

1. Un método para modificar enzimáticamente un ácido nucleico diana, por reacción de ligación independiente del molde, o ligación de extremos romos o por PCR, en donde un conjugado que comprende un ácido nucleico (NA) constituido por 1 a 5 nucleótidos para reacciones de ligación independientes del molde, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son monocatenarios, o para reacciones de ligación con extremos romos, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son bicatenarios, y en donde el NA del conjugado se modifica por ligación de un término del NA a al menos un ácido nucleico adicional, o 10 a 40 nucleótidos para PCR y al menos una unidad sintética de fijación (SBU) seleccionada del grupo constituido por p-RNAs y p-DNAs, y en donde la SBU está enlazada covalentemente por su extremo 2' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 2' con el extremo 3' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 4' con el extremo 3' del ácido nucleico NA o por su extremo 4' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA), utilizando el ácido nucleico del conjugado como sustrato, comprendiendo el método:

a): poner en contacto el conjugado con al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por una polimerasa, y una ligasa que utiliza los ácidos nucleicos existentes naturalmente como sustrato, y con otros reactivos necesarios para la acción de la enzima; y

b): incubar la mezcla obtenida en a) en condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar la modificación del ácido nucleico.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El método de la reivindicación 1, en donde la ligasa utilizada es una RNA-ligasa T4.

3. El método de la reivindicación 1 en donde la enzima es una polimerasa, en donde el NA del conjugado tiene un extremo 3' no bloqueado, en donde los otros reactivos comprenden un ácido nucleico molde al cual se hibrida el término 3' no bloqueado del NA, y en donde el NA se modifica por la adición de al menos un nucleósido complementario al ácido nucleico molde al término 3' del NA.

4. El método de la reivindicación 3 en donde se añade un didesoxinucleótido al NA del conjugado.

5. El método de la reivindicación 3 ó 4 en donde se añade un nucleótido marcado al NA del conjugado.

6. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el ácido nucleico molde se deriva de una muestra biológica.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la muestra biológica se deriva de una muestra seleccionada del grupo constituido por materiales humanos, materiales animales, materiales de plantas, materiales fúngicos, cultivos de células, cultivos de virus, muestras de alimentos, y muestras de agua.

8. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 7, en donde la polimerasa es al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por DNA-polimerasas, RNA-polimerasas, y transcriptasas inversas.

9. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 8, en donde se amplifica al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico molde.

10. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 9 en donde la polimerasa es una polimerasa termoestable, y en donde las condiciones de b) comprenden someter a termociclación la mezcla de a) para alternativamente i) disociar los productos de extensión del ácido nucleico molde y ii) permitir la hibridación del NA conjugado al molde y la extensión enzimática del NA del conjugado, en donde se amplifica al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico molde.

11. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 10, en donde la polimerasa es una mezcla de una RNA-polimerasa y una transcriptasa inversa, que comprende adicionalmente poner en contacto el conjugado con una actividad de RNAsa H en la mezcla de a), en donde se amplifica al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico molde por amplificación mediada por transcripción.

12. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el ácido nucleico (NA) se selecciona del grupo constituido por ácidos desoxirribonucleicos, ácidos ribonucleicos, ácidos nucleicos químicamente modificados, ácidos nucleicos de fosforotioato, ácidos nucleicos de fosforoditioato, ácidos nucleicos de metilfosfonato, 2'-O-metil-RNA, 2'-fluoro-RNA, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos inmovilizados (LNA), un aptámero y una aptazima.

13. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el conjugado comprende adicionalmente al menos un resto de marcación.

\newpage

14. El método de la reivindicación 13, en donde el resto de marcación se selecciona del grupo constituido por restos fluorescentes, restos de extinción, restos de tinte visibles, restos radiactivos, restos quimioluminiscentes, restos de biotina, restos de hapteno, micropartículas, micropartículas paramagnéticas, y restos enzimáticos de marcación.

15. El método de la reivindicación 13, en donde el resto de marcación es un resto de tinte fluorescente seleccionado del grupo constituido por: tintes BODIPY^{TM}, tintes de cianina, tintes Alexa^{TM}, tintes de fluoresceína, tintes de rodamina, tintes de ficoeritrina, tintes de cumarina, tintes Rojo Texas, Lissamine^{TM}, FAM, HEX, TET, TAMRA, ROX, EDANA, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianato-estilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, pireno-butirato de succinimidilo, isotiocianato de acridina, Azul Cascada, Verde Oregón, Amarillo Lucifer-vinilsulfona, e IR1446 (Tinte Láser Kodak^{TM}).

16. El método de la reivindicación 13, en donde el resto de marcación es un resto de extinción seleccionado del grupo constituido por restos Black Hole Quencher^{TM}, DABCYL, Rojo Reactivo 4 (Rojo Brillante Cibacron 3B-A), Verde Malaquita, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC), y restos de ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico.