JP4388369B2 - 合成結合システムを用いる核酸のための選別および固定化システム - Google Patents

合成結合システムを用いる核酸のための選別および固定化システム Download PDF

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Description

本発明は、合成結合ユニットおよび核酸の共役体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）に関する。本発明はまた、当該合成結合システムによって仲介される核酸の特異的分子アドレッシング（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ，場所決め）により、そうした共役体を用いて支持材料（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）上に核酸を選別そして固定化するための方法に関する。特に、本発明はまた、当該共役体から新規のアレイ構築体を産生するために能動的電子アレイシステム中に、合成結合ユニットおよび核酸の共役体を利用する新規方法、およびさまざまな核酸アッセイフォーマットでのそうした構築体の使用、に関する。加えて、本発明は、そうした共役体のさまざまな新規形態、固相合成共役体をつくる改良法、および合成前の合成結合ユニットおよび核酸を共役させる改良法、に関する。本発明はまた、核酸増幅反応を含む、さまざまな酵素反応のための基質として、合成結合ユニットおよび核酸の共役体の使用に関する。
従来の技術
核酸の化学および分析は、生物学研究、医学、農学、そしてさらには法医学のような多様な分野で目立つようになっている。これらの分野のすべてで核酸の使用が特に必要なのは、基質上のアレイ中のような、既知の場所に特定の核酸分子種（または分子種の群）を局在させることにより、巨視的な規模でそれらを操作するための能力である。支持材料上に核酸を固定化するために、広範な方法が考案されてきたが、それらは結合の安定性により大まかに分類できる。共有結合固定化、すなわち核酸が共有結合により支持材料の分子構造に連結される固定化は、当該固定化核酸の分解の危険なしには、典型的には不可逆性である。対照的に、錯体形成反応（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、すなわち、相互に特異的に認識する結合システムの２つのパートナー間の反応、を使うことも可能である。これらの反応は、可逆的であっても、あるいは実用的な目的で、特定の実験の時間尺度で不可逆であってもよい。核酸を固定化するための結合システムが、可逆的または不可逆的であるとされるかどうかは、結局は、結合核酸と遊離核酸との間の平衡の位置に依存する。事実上不可逆的と見なされる結合システムの例は、アビジン（またはストレプトアビジン、またはそれらのさまざまな工作された、相当タンパク質）によるビオチンの錯体形成で、Ｋa≒２．５ｘ１０13（Ｍ-1）の結合定数をもつ（Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，Ａ．；Ｓｔａｙｔｏｎ，Ｐ．Ａ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，１０６２２−１０６２８（１９９５）；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｍ．；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；８５−１３２（１９７５））。本システムは、支持材料上に核酸および他の生体分子を固定化するために、広く使われてきた。
ＷＯ８６／０７３８７は、表面への核酸の可逆的結合の別の例を記載している。ここに記載されている核酸結合配列は、例えば抗体／抗原ペアの助けを借りて、錯化剤により支持材料上に固定化される。
使用されてきた可逆的ペアリング（ｐａｉｒｉｎｇ，対合形成）システムのもう１つの例は、固定化のための二重鎖形成“標識”を与えるように特異的にハイブリッド形成する、天然ヌクレオチドオリゴマーのセットである。ビオチン・ストレプトアビジンとは違って、核酸オリゴマーは対合形成に情報次元性をもつ：すなわち、考案することが可能な、相補的配列とのみ特異的に対合する単量体（ヌクレオチド）の配列により特徴づけられる、複数の特定の結合セットがある。マルチ・ハプテン・レクチンシステムまたはマルチ・抗体・抗原システムと異なり、核酸標識のそのようなセットは、かなり均質な化学的および熱力学的特性をもち、それが多重反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）におけるそれらの使用を容易にしている。
ＥＰ０３０５１４５は、例えば、ホモポリヌクレオチド尾部の使用と、および標的特異的オリゴヌクレオチドを固定化するための、相補的ホモポリヌクレオチドオリゴマーとのそれらの特異的ペアリングとを、記載している。他方、ＪＰ０３１５１９００は、標的特異的核酸を固定化するための、特異的核酸配列の使用を記載している。固定化されるオリゴヌクレオチドは２つの部分から成るのが、その種のシステムに特徴的である：すなわち、支持体の表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドに対して相補的な１つのオリゴマー部分、および試料の成分との相互作用に特異的な（例えば、試料の核酸に対して相補的な）第２のオリゴマー部分である。同様なシステムは、ＷＯ９３／１３２２５，ＷＯ９３／１３２２３，ＷＯ９３／２５５６３，ＵＳ５７６３１７５，ＷＯ９７／３２９９９，ＷＯ００／５８５１６およびＷＯ００／６０１２４にも記載されている。
上記の方法の欠点は、固定化に使用された配列が、固定化される予定の配列とハイブリッド形成して、分子内二次構造を形成する可能性があること、固定化される予定のもう１つの配列とハイブリッド形成して、分子間二次構造を形成することがありえること、あるいは試料からの核酸とハイブリッド形成することもありえること、である。そうした好ましくない、あるいは妨害性の相互作用の危険は、固定化される予定の核酸（類）の長さ、ならびに試料の複雑性（例えば、未確認の生物からの汚染核酸の可能性）とともに、増加する。
固定化に天然核酸を使用するもう１つの欠点は、天然核酸の二重鎖の安定性が、広範囲にわたって、長さ（配列中のヌクレオチドの数）に比例して直線的に増加せずに、むしろＡＴ対ＣＧ塩基対の相対的百分率（“ＣＧ含量”）だけに依存する限界に近づくことである。その自然限界を超える二重鎖安定性をもつ結合システムは、天然核酸を用いては調製できない。この制約は、さまざまな厳しい条件をその固定化場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）で核酸に対して課す場合にも、問題になる：すなわち固定化核酸標識も同じ厳しい条件（すなわち、カオトロピック試薬、熱条件、または静電力）を受けるであろうし、そして解離することもありえる。Ｇ．Ｍｉｃｈａｅｌ ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＭｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｇａｉｔ編，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、１９９６，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照されたい。
固定化標識相互作用（それらはハイブリッド形成されたままでなければならない）と標的特異的相互作用（それらは単一塩基対ミスマッチレベルで識別されることが多い）との間のストリンジェントな区別での細かい区別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を達成することは、当該方法が特に頑丈かつ終始一貫していなければならない場合の臨床型条件下ではなおさら、難しいことが多い。
固定化剤として天然核酸を使用することの、もう１つのかなりの経済的および時間的短所は、固定化の実用レベルの安定性および選択性に到達するには、ある最小配列長が必要なことである。十分な結合特異性を達成するためには、２０マー（ｍｅｒｓ，単量体単位）を使うことが、典型的である。その結果として、全核酸鎖（試料を認識するための配列および固定化のための配列より成る）は、比較的長くなる。非常に長い配列の使用は、いくつかの理由で不利なことがある。まず、長い核酸配列の使用は、分子内的に二次構造形成の可能性を増し、そしてまた、溶液中で複数の鎖間での一時的あるいは安定なハイブリッド形成の可能性を増す。
能動的電子アレイデバイスが、核酸の電気泳動輸送および操作のために、記載されており、それぞれの本文は全部が参考文献により本明細書に援用されている、米国特許第６２４５５０８号、第６２２５０５９号、第６０５１３８０号および第６０１７６９６号を参照されたい。能動的電子アレイ上で核酸を操作する場合、より短い配列の使用が好ましい。電子チップアレイ上での界面動電アドレッシング(Electro-kinetic addressing)および移動は、小さい分子ほど電気泳動移動性が優れているので、比較的短い核酸で特にうまく行く。したがって、固定化錯化剤として、より短い配列を使用することが、能動的電子アレイの環境下での有用性を増加した。
核酸の固定化のために天然システムを使うことのもう１つの欠点は、その種のシステムが、それらの使用中に容易に分解または破壊されることがあり得る、ことである。特に、試料の酵素的成分、または研究室の実験者の指先からの汚染ＤＮＡアーゼおよびＲＮＡアーゼでさえも、それらによる分解が問題である。固定化に使われる核酸の加水分解による、特に制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼのような酵素による、分解または断片化は、核酸オリゴマーを室温で数日間放置した場合には、めずらしくない。それゆえ、天然に存在する酵素類による分解または修飾を受けない、固定化用の錯化剤の使用が望ましい。
過去数十年の間に、核酸を修飾するために、多様な天然種の酵素を利用するための多数の技術が開発されてきた。制限エンドヌクレアーゼ反応は、特定の配列部位で核酸を特異的に切断し、そしてヌクレアーゼまたは他の酵素は、いずれかの末端で核酸を分解または修飾するために利用可能である。加えて、ポリメラーゼおよび末端トランスフェラーゼは、ヌクレオチドから核酸オリゴマーを構築するのに利用可能である。リガーゼ酵素も、一本鎖鋳型依存的に、平滑断端二本鎖的に、または一本鎖鋳型非依存的に、異なる核酸鎖を相互に接続または結合するために、利用可能である。これらの酵素的手段は、分析生化学の大黒柱になっており、そしてほとんどすべての分子生物学研究にとっていずれかの時点で必要である。例えば、ポリメラーゼは、核酸の増幅反応および配列決定反応を行うために普通に用いられ、それらの反応はいずれも、研究上興味のあるタンパク質の産生に必要な要素である。
ほとんどの場合、精製工程または物理的分離工程は、核酸の酵素的操作の各段階での処理のために、必要である。核酸は、沈澱、電気泳動的分離、またはクロマトグラフィー工程により、通常、精製される。単離および固定化の目的のために、核酸は、ビオチンのようなアフィニティー標識でしばしば修飾される。これらのビオチン修飾核酸は、高分子性ビオチン・ストレプトアビジン複合体を介して、固相に安定かつ不可逆的に結合させることが可能である（例えば、ＤＥ４００１１５４およびＥＰ００６３８７９）。得られた非常に大きな複合体は、かなり苛酷な化学的条件によってのみ、再び分離が可能である。普通に使われる複合体ではあるが、これは１つの固定化相互作用手段を提供するに過ぎない：すなわち産物の特定局在化を伴う多重反応は、ビオチン・ストレプトアビジン・アフィニティーシステム単独では行うことができない。別に、当該修飾に対応する結合パートナーに固定することにより、分離を可能にするために、ポリヒスチジン修飾またはジゴキシゲニンのようなステロイドまたはハプテンを、核酸中へ精巧に組入れることも可能である。しかし、これらのシステムは、別種の条件下（抗体結合に対するニッケルクロマトグラフィー）で分離が可能なだけで、したがって多重反応に対するビオチン・アビジン相互作用の制約を克服しない。
溶液中での１つの核酸のもう１つの核酸への化学的共役には、一方の核酸が、他方の核酸の修飾と、安定な結合を形成することにより、反応できる修飾を施されていることが必要である。しばしば、仕上げられ、前合成された核酸が、自身と相補的ペアを形成する核酸の能力を利用することにより、または当該核酸とライゲーション用の核酸鋳型とのペアリングにより、他の核酸およびアナログと共役される。そのペアリングは、共役される部分の会合または前編成をもたらし、それが、引続く共役反応を助けるか、さもなければ熱力学的に適切にする。例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（９），３６７１−３６９１（１９８８）は、チオ修飾核酸の共役を記載している。この選択は、大気中の酸素で処理した場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方の形成を可能にし、そのため２つの異なる核酸を連結するのには、間に合わせ的に適しているに過ぎない。アミン修飾核酸とのアルデヒド修飾核酸の鋳型支持共役は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，９１９７−９１９８（１９９２）に記載されている。もう１つの鋳型支持光化学共役は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６（１３），３３００−３３０４（１９８８）に記載されている。自己結合または鋳型結合による支持なしで記載されている少数の反応の１つは、α−ハロアセチレンとのホスホロチオエートの反応である（Ｇｒｙａｚｎｏｖ ＳＭ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，３８０８−３８０９（１９９３））。ＷＯ０１／０７６５７は、ジアルデヒドをつくるための過ヨウ素酸塩による酸化、および環状生成物をつくるための窒素求核試薬によるその後の反応によって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端でのＲＮＡビルディングブロックの連結（ｌｉｎｋａｇｅ）を記載している。使われる窒素求核試薬は、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、またはチオセミカルバジドが可能である。当初形成される生成物は、ＮａＣＮＢＨ3による還元によって安定化が可能である。
ピラノシルＲＮＡ（ｐＲＮＡ）またはピラノシルＤＮＡ（ｐＤＮＡ）結合システムのような合成結合システムは、デザイン上、核酸とのペアリングが立体的にできないので、これら前記の方法は、核酸を合成結合ユニットに共役させることに、適用できない。しかし、ホスホルアミデート化学による合成結合ユニット／核酸共役体の固相縦列合成は、核酸が共役に容易に利用できる環境（例えば、細菌プラスミド調製物）については、望ましくない。同様に、もし共役される核酸が約２０ヌクレオチドより長いならば、当該共役体（核酸 ＋ ６−１５ｐＲＮＡ残基）のサイズは、固相化学の有効合成限界に近づき、そしてついには超えてしまう。それゆえ、仕上げられ、前合成された核酸を合成結合システムと共役させることのできる方法および条件を、見つける必要がある。
課題解決手段
第１の側面において、本発明は、能動的アレイデバイスを利用する固定化核酸のアレイの能動的構築のための新規な方法を提供する。本発明では、固定化核酸のアレイを、支持材料上に複数の活性化可能な場所を含む能動的場所アレイデバイス上に、つくるが、それは下記による：
ａ） 活性化された場所の少なくともいくつかが、当該場所に付着された、予め決められた合成アドレッシングユニット（ＳＡＵ）または合成アドレッシングユニットのセットを、含む、または、そこに付着しており、および当該場所の活性化が、ＳＡＵｓのＳＢＵｓへの結合に有利な条件を作出する、能動的アレイデバイス上の場所の第１セットＬ1を活性化すること；
ｂ） 共役体の当該セット中のＳＢＵｓの少なくともいくつかが、活性化された場所に付着されたＳＡＵｓの少なくともいくつかに、特異的に結合できる、合成結合ユニット（ＳＢＵ）・核酸（ＮＡ）共役体の第１セットＣ1に場所の活性化されたセットを接触させること；
ｃ） 非結合共役体を除去すること；そして
ｄ） Ｍ≧１である、工程（ａ）から（ｃ）をＭ回繰返すこと、場所のセットＬM+1を活性化すること、そしてそれらを共役体のセットＣM+1に接触させること。
第１側面の実施態様では、能動的デバイスの場所に少なくとも、同じＳＡＵが付着されることが、好ましい。好ましい態様はまた、矩形にアレイされた場所を利用する。特に好ましい態様は、オプションで電子洗浄を備えた、能動的電子アレイデバイスを使用することが可能である。本明細書のいたるところに記載されているさまざまな特定のＳＡＵｓおよびＳＢＵｓは、さまざまな特定の共役体構造がそうであるように、本第１側面で有用である。同様に、本明細書のいたるところに記載されているさまざまなライブラリーは、本発明の本側面でセットＣとして使用することが可能である。本発明の第１側面のさまざまな態様で、ＳＡＵｓは、能動的アドレッシング手段により、またはもっと伝統的なスポッティング手段により受動的に、アレイの場所に付着されてもよい。
本発明の第１側面のさまざまな態様で、少なくとも１０の、少なくとも１００の、少なくとも１０００の、または１００００あるいはそれ以上もの個別の核酸が、能動的場所アレイ上に固定化されてもよい。同様に、本発明では、各サイクルで少なくとも５の、少なくとも１０の、少なくとも２０の、あるいは１００もの、共役体の群のような、各セットＣ中でのさまざまな数の共役体が、各サイクルＭで固定化されてもよい。これは数サイクル行われてもよいが、好ましくはそこでは、能動的場所アレイのサイズ、および各セットＣ中での共役体の望ましい数次第で、Ｍは、１および１００の間、好ましくは１および２０の間、あるいはまた好ましくは１および１０の間である。
本第１側面のさらなる態様で、アレイ上の固定化用の共役体は、固体支持体と接触される前に、試料、好ましくは生物学的試料とまず接触される。好ましい態様では、共役体は、試料と接触中に、増幅反応に利用されることも可能である。別のさらなる態様では、構築されたアレイは、その後、試料、好ましくは生物学的試料と接触される。選択的には、当該アレイは検出工程にかけることも可能であるが、そこでは、固定化された共役体、または固定化された共役体にハイブリッド形成された標的核酸が検出される。
本発明の第１側面のさらなる態様で、共役体がＳＢＵ／ＳＡＵ相互作用を分断することによりアレイから除かれ、それによって付着されたＳＡＵｓをもつ支持体をさらなる使用に再生する、さらなる工程に当該アレイを従わせることも可能である。
本発明の第２の側面は、能動的アレイ構築法を用いてつくられる、新規アレイ構築体である。これらの新規超分子構築体は下記を含む：
ａ） 支持材料上の少なくとも２つの予め決められた場所に同じＳＡＵが付着されている、別々の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）場所のアレイを含む支持材料に付着された、少なくとも１つの合成アドレスユニット（ＳＡＵ）（単一ＳＡＵまたはＳＡＵｓの混合体のいずれか）、そして
ｂ） 共役体の少なくとも２つが同じＳＢＵおよび異なるＮＡｓをもつ、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および核酸（ＮＡ）を含む少なくとも２つの共役体、
ｃ） そこでは、当該共役体のＳＢＵが、前記２つの予め決められた場所でＳＡＵと合成結合システムユニット（ＳＢＳ）を形成し、そして２つの異なるＮＡのそれぞれを異なる場所で固定化する。
本出願の各所に記載されているＳＡＵｓおよびＳＢＵ共役体は、本発明の第２側面のさまざまな態様で利用が可能である。加えて、下記のさまざまなタイプの支持材料も利用が可能である。第２側面の好ましい態様は、超分子構築体用の支持体として活性電子アレイを利用する。当該超分子構築体は、同じ合成結合システムにより固定化された少なくとも５の、少なくとも１０の、または１００またはそれより多い異なる共役体を、含んでもよい。当該構築体はまた、少なくとも１０の、少なくとも１００の、少なくとも１０００の、または１００００またはそれ以上もの、異なる固定化核酸を含んでもよい。第２側面の好ましい態様では、超分子構築体は、支持材料上の異なる場所に付着された２つまたはそれ以上の異なるＳＡＵｓを含み、そこではＳＡＵｓが直交性である。
第３の側面で、本発明は、支持材料上で核酸を選別して、そして固定化するのに使うことが可能な、いくつかの新規共役体を提示する。本発明の本側面の共役体は、一般式（ＮＡ）（ＳＢＵ）をもち、ここで：
ＮＡは核酸であり、
ＳＢＵは合成結合ユニットであり、
ここで各ＮＡは、リンカーＸにより少なくとも１つのＳＢＵに連結され、ここでＸは下記より成る群から選択される：
ここで
Ｙ1，Ｙ2は 相互に独立してＯＨ，ＳＨ，ＮＨ2またはＣＨ3であり、
Ｇは ＯまたはＳであり、
Ｌ1，Ｌ2は 下記より成る群から独立に選択されるリンカーであり：
共有結合；および飽和または不飽和の、分枝または非分枝の、置換または非置換の、１−６０炭素原子および、Ｎ，Ｏ，およびＳより成る群から選択された０−４０ヘテロ原子の鎖、を含むリンカー鎖成分（ｍｏｉｅｔｙ）；
Ｖ1，Ｖ2は 下記より成る群から独立に選択される
−［−ＣＨ2−］−，および
Ｒ1，Ｒ2は 相互に独立してＨまたはＯＨであり、そしてここで
Ｂａは 窒素ヘテロ環成分である。
本発明の本側面のさまざまな態様で、リンカーＸは、一般式（ｉ）−（ｖ）のいずれをもってもよく、そしていずれの方向に向けられてもよい。本発明のさまざまな態様で、Ｌは下記を含むリンカー類でよく：
−［−（ＣＨ2）n−］−
または−［−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）m］−
または−［−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ2）q］−
または−［−（ＣＨ2）v−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）z−］−
または−［−（ＣＨ2）v−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ2）z−］−
なお、ｎ，ｍ，ｑ，ｖ，ｚは、いずれの場合も相互に独立に１および２０の間の整数で、そしてさらに好ましくは、ｎは２および１２の間であり，ｍは１および５の間であり，ｑは１および４の間であり，そしてｖおよびｚは独立に２および６の間である。
第4の側面で、本発明は、一般式（ＮＡ）n（ＳＢＵ）Mをもつ、新規の分枝または直鎖の共役体を提示するが、ここで：
ＮＡは核酸であり、
ＳＢＵは合成結合ユニットであり、
ここで各ＮＡは少なくとも１つのＳＢＵに連結され、ｎは１から６までの整数であり、ｍは１から６までの整数であり、そしてここでｎ＋ｍ＞２である。本発明の第4側面の好ましい態様で、共役体は、（Ｉ），（ＩＩ），または（ＩＩＩ）より成る群から選択された一般式の構造をもつ：
（ＮＡ）−Ｘ1−（ＳＢＵ）−Ｘ2−（ＮＡ） （式（Ｉ））
（ＳＢＵ）−Ｘ1−（ＮＡ）−Ｘ2−（ＳＢＵ） （式（ＩＩ））
（ＮＡ）−Ｗ−（−（ＳＢＵ））u （式（ＩＩＩ））
ここでｕは２および６の間の整数である。
本発明の第4側面のさまざまな態様で、ＮＡは、リンカー成分Ｘまたは分枝成分Ｗを介して少なくとも１つのＳＢＵに共有結合で連結されるが、ここでＸは、各リンカーユニットついて独立に、下記より成る群から選択される：
ここで
Ｙ1，Ｙ2は 相互に独立してＯＨ，ＳＨ，ＮＨ2またはＣＨ3であり、
Ｇは ＯまたはＳであり、
Ｌ1，Ｌ2は 下記より成る群から独立に選択されるリンカーであり：
共有結合；および飽和または不飽和の、分枝または非分枝の、置換または非置換の、１−６０炭素原子および、Ｎ，Ｏ，およびＳより成る群から選択された０−４０ヘテロ原子の鎖、を含むリンカー鎖成分；
Ｖ1，Ｖ2は 下記より成る群から独立に選択される
−［−ＣＨ2−］−，および
Ｒ1，Ｒ2は 相互に独立してＨまたはＯＨであり、そして
Ｂａは 窒素ヘテロ環成分である；
そしてここでＷは下記の一般式をもつ：
ここでＹ1はＯＨ，ＳＨ，ＮＨ2またはＣＨ3であり；
ここでＤ1，Ｄ2，Ｄ3，およびＤ4は、独立に、共有結合、または飽和または不飽和の、分枝または非分枝の、置換または非置換の、１から１０炭素原子および、Ｏ，ＳおよびＮより成る群から選択される０から４ヘテロ原子の鎖、を含むリンカー鎖成分であり；
ここでＪは炭素または窒素であり；
ここでｚは０または１、さらにここでＪが窒素であれば、ｚは０であり；そして
ここでＸ1，Ｘ2，およびＸ3は、上記のように独立にＸである。
本発明の第4側面の好ましい態様で、Ｗは次の一般構造の１つをもつ：
本発明の第３および第4側面での使用のためのＳＢＵｓおよびＮＡｓは、本明細書に記載されているもののどれでもよい。好ましいＳＢＵｓは、ｐＲＮＡ、ｐＤＮＡおよびＣＮＡを含む。好ましいＮＡｓはＤＮＡ，ＲＮＡおよびそれらの化学的に修飾された誘導体を含む。標識された態様も好まれる。
第５側面において、本発明は、単量体ユニットのオリゴマーを含む、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および合成アドレッシングユニット（ＳＡＵ）より成る群から選択される合成結合システムのユニットを提示するが、
ここで当該単量体ユニットは下記の一般式をもち
ここでＢbは単量体ユニットをオリゴマーに接続するバックボーン成分で、そしてここでＲsは窒素ヘテロ環成分を含む特定認識成分であり、ここで当該単量体ユニットは式（ＩＸ）または（Ｘ）に従って直線的に配列され、
Ｂs1−（Ｊ）−Ｂs2 （式（ＩＸ））
Ｂs1−（Ｊ）−Ｂs2−（J’）−Ｂs3 （式（Ｘ））
ここでｓ１，ｓ２およびｓ３は独立に０および１０の間の整数で、そしてＢは合成結合ユニット（ＳＢＵ）を合成するために使われるような任意の単量体性ビルディングブロックであり、そしてＪは認識成分（Ｒs）の配列で、ここでＪはＪ’と同じでもあるいは異なってもよく、そしてここで配列ＪおよびＪ’は独立に、配列ＪおよびＪ’が同じ群から選択される場合には、SEQ ID NO. ３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、および７５より成る群Ａから選択され、または、SEQ ID NO. ４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、および７６より成る群Ｂから選択される。
本発明の第５側面の好ましい態様では、ＪおよびＪ’の配列は独立に、配列ＪおよびＪ’が同じ群から選択される場合には、SEQ ID NO. ３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７より成る群Ａ’から選択され、または、SEQ ID NO. ４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８より成る群Ｂ’から選択される。本発明の第５側面の別の好ましい態様では、ＪおよびＪ’の配列は独立に、配列ＪおよびＪ’が同じ群から選択される場合には、SEQ ID NO. ４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、および７５より成る群Ａ”から選択され、または、SEQ ID NO. ５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、および７６より成る群Ｂ”から選択される。本発明の第５側面のさらに好ましい態様では、ＪおよびＪ’は独立に、配列ＪおよびＪ’が同じ群から選択される場合には、SEQ ID NO. ４９、５１、５３、５７、５９、６１、６５、６９、７１、および７５より成る群Ａ”’から選択され、または、SEQ ID NO. ５０、５２、５４、５８、６０、６２、６６、７０、７２、および７６より成る群Ｂ”’から選択される。
好ましい態様では、ＳＡＵｓまたはＳＢＵｓは、ｐＲＮＡ、ｐＤＮＡまたはＣＮＡである。さまざまな態様で、本発明の第５側面は、開示された配列をもつＳＡＵｓまたはＳＢＵｓを含むセット、ライブラリー、またはキットでもよく、好ましくはそこで、セット、ライブラリー、またはキット中のＳＡＵｓまたはＳＢＵｓは、相互に直交性である。例えば、キット態様は、修飾されていないか、または支持材料への付着のための官能基で修正されているかのいずれかである、２つまたはそれより多い、より好ましくは少なくとも５の、または少なくとも１０の、または少なくとも２０の、ＳＡＵｓを含むことも可能である。さらに、ＳＡＵキット態様は、支持材料へ予め付着されたＳＡＵｓを含んでもよい。これらの態様では、好ましくは１および１００の間の、または２および２０の間の、または２および１０の間のＳＡＵｓが、既知の場所で支持体上に付着される。または、キット態様は、修飾されていないか、またはＮＡｓへの付着のための官能基で修正されているかのいずれかである、２つまたはそれより多い、より好ましくは少なくとも５の、または少なくとも１０の、または少なくとも２０の、ＳＢＵｓを含むことも可能である。加えて、本発明の第５側面のＳＢＵｓは、本明細書に開示された共役体構造のいずれにも利用可能である。
本発明の第３、第4側面、および共役体第５側面のさまざまな態様において、ライブラリーはいくつかの共役体から構築も可能である。ライブラリーのＳＢＵメンバーは、好ましくは直交性である。ライブラリーは、当該ライブラリーの目的次第で、少なくとも２の、好ましくは少なくとも５の、少なくとも１０の、少なくとも２０の、または少なくとも１００の、共役体を含む（例えば、遺伝子座のセットを増幅するための共役体プライマーのライブラリーは２０の共役体をもつことが可能であるが、一方ではＳＮＰまたはＳＴＲアッセイアレイを生産するためのライブラリーは、１００以上もの共役体をもつことも可能である）。ライブラリーでは、各ＮＡは特定のＳＢＵに共役可能であり、各ＳＢＵは特定のＮＡまたは両者に共役可能である。あるいは、各ＮＡはＳＢＵｓのセットに共役可能であり、または各ＳＢＵはＮＡｓのセットに共役可能である。
本発明の第３、第4側面、および共役体第５側面のさまざまな態様において、アレイ中の固定化核酸の超分子構築体は、１つまたは１つ以上の共役体から構築されてもよい。これらは、本明細書に記載された支持材料のいずれかの上で、本明細書に記載されたＳＡＵｓのいずれでも、使用可能である。好ましい超分子構築体は、少なくとも５の、より好ましくは少なくとも１０の、より好ましくは少なくとも１００のまたは少なくとも１０００の共役体を含む。
本発明のこれらの側面のさらなる態様では、共役体は、支持材料上に超分子構築体を形成するために、付着されたＳＡＵｓに接触させる。これらの方法は、受動的にまたは能動的に行われてもよい（例えば、好ましい態様では能動的電子アレイデバイス上に電子アドレッシングによる）。これらの方法・態様では、共役体は、付着ＳＡＵｓに接触させる前か後に、試料、好ましくは生物学的試料と接触させることが可能である。
本発明の第６側面では、キットが、本発明の第３および第4側面の共役体をつくるために、提供される。これらのキットは、本発明の第３または第4側面の共役体をつくるために、修飾または非修飾の核酸との反応用の官能基で修飾された、１つまたは１つ以上のＳＢＵｓ、より好ましくは少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも２０を含む。
第７の側面で、本発明は、リン酸またはホスホルアミデート成分連結共役体の固相合成の改良法を提示する。これらの方法は下記を含む：
ａ） ユニットが当該ユニットの末端リン上でβ−シアノエチル保護されている、モノマーまたはオリゴマーユニットを用いて固体支持相上に共役体を合成すること、
ｂ） 当該支持体を不活性溶媒中でアルキルアミンの溶液で処理すること、
ｃ） 当該共役体を切離し、そして脱保護するために、当該支持体をヒドラジンデ処理すること。
好ましい態様では、アルキルアミンは第二級アルキルアミンで、より好ましくは、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、ジ−Ｎ−オクチルアミン、ジ−Ｎ−デシルアミン、ジドデシルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルアミン、Ｎ−メチルブチルアミン、Ｎ−メチルペンチルアミン、Ｎ−メチルヘキシルアミン、Ｎ−エチルプロピルアミン、Ｎ−（Ｎ−ブチル）−Ｎ−プロピルアミン、Ｎ−アミル−Ｎ−ブチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｎ−ブチル−１，６−ヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミンより成る群から選択される。使用に最も好ましいのはジエチルアミンである。
第８側面で、本発明は、本明細書に開示された構造のいずれかのような、ＳＢＵ−ＮＡ共役体の核酸部分を、酵素反応における基質として、利用するための方法を提示する。実施態様の１つの群では、共役体の核酸部分は酵素的に修飾される。一般に、これらの方法は下記を含む：
ａ） 基質として天然に存在する核酸を利用する少なくとも１つの酵素と、および当該酵素の作用に必要な他の試薬とに、共役体を接触させること；および
ｂ） 当該共役体の修飾を行うのに十分な時間の間、当該酵素が機能するのに適した条件下で、ａ）で得られた混合物をインキュベートすること。
さまざまな態様で、ヌクレオシド三リン酸（例えば、普通の、標識された、化学的に修飾された）および／または鋳型または標的核酸（例えば、普通の、標識された、化学的に修飾された）を含む、さまざまな試薬を、工程ａ）で利用することが可能である。さまざまな態様で、１つ以上の酵素を工程ａ）で使用することが可能である。１つの好ましい態様では、酵素はリガーゼ酵素で、そして共役体の核酸部分は標的核酸に結合される。もう１つの好ましい態様では、酵素は少なくとも１つのポリメラーゼで、そして鋳型核酸配列は、プライマーとして当該共役体を用いて増幅される。本態様の特に好ましいバージョンでは、増幅は、直線的または指数関数的熱サイクリング増幅である。もう１つの好ましい態様では、酵素は、制限エンドヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性を含む酵素の混合物で、そして鋳型核酸配列は、プライマーとして共役体を利用して等温的に増幅される。本態様の特に好ましいバージョンでは、共役体は固定化され、そして増幅はアンカーＳＤＡ反応である。
本発明の第８側面の別の態様では、共役体は、共役体へハイブリッド形成された核酸が、酵素により修飾される標的核酸にハイブリッド形成された基質として利用される。好ましい態様は、共役体へハイブリッド形成されたままでのＲＮＡアーゼＨによる標的ＲＮＡ鎖の分解、および共役体へハイブリッド形成されたままでの制限エンドヌクレアーゼによる標的核酸鎖の切断を含む。

出願人は、表面に付着された合成分子アドレスユニット（ＳＡＵ）を、合成結合ユニットが特異的に認識できる、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）および少なくとも１つの合成結合ユニット（ＳＢＵ）を含む共役体の産生および使用に、多くの改良を明らかにしてきた。ＳＡＵｓによるＳＢＵｓの特異的認識は、合成結合ユニットおよび合成アドレスユニットから成る合成結合システム（ＳＢＳ）を含む構築体をもたらすことが可能である。核酸固定化システムについてのこの基本的考えから、固定化核酸アレイの多くのバリエーションが実現可能である。これらは、配列、起源（例えば、異なる試料から）、タイプ（ＲＮＡ，ＤＮＡ，など）に関して、あるいは別の仕方で、相違する固定化核酸の、受動的および能動的の両方で組立てられたアレイを、含む。開示された合成結合システムを利用することにより、核酸の比較的複雑な混合物を、手軽な分析または核酸ベースの生物学的アッセイにおけるさらなる使用のために、支持体上の予め決められた場所に能率的にそして特異的に選別することが可能である。

本発明において使用するための共役体：
それゆえに、本発明の根拠は、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）および少なくとも１つの合成結合ユニット（ＳＢＵ）を含む共役体で、式（ＮＡ）n（ＳＢＵ）mにより一般的に表され、ここでｎ≧１、およびｍ≧１である。それゆえ、本発明の、および本発明の方法での使用のための共役体は、核酸および合成結合ユニット構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）の数および配置により、それらの核酸構成要素の選択により、そしてそれらの合成結合ユニット構成要素のそれらの選択により、変わることが可能である。それゆえ、例えば、核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、他の超巨大分子複合体または重合体を、１つまたは１つ以上のｐＲＮＡ，ｐＤＮＡおよび／またはＣＡＮ構成要素に連結することが可能で、その結果、当該分子は、それらの使用に必要な条件下で、安定なユニット、共役体を形成する。これに関連して、その共役は、必ずしも共有結合である必要はなく、ファンデルワールス相互作用、双極相互作用、特に水素結合、錯体型結合またはイオン相互作用のような超巨大分子力を経由して行われてもよい。
本明細書で使われる用語“核酸”は、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドおよび、それらの補体（または部分的補体）に特異的にハイブリッド形成可能であり、そして天然のまたは修飾されたヌクレオチドから構成される、他の分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとみなされる分子は、天然に存在するか、さもなければ合成的に調製可能であり、そして天然に存在する核酸のオリゴマーとハイブリッド形成する能力をもつ、すべてのオリゴマーおよびポリマーである。注目すべきは、本明細書で使われる場合、“核酸”は、塩基の配列により、化学組成（例えば、ＤＮＡ対ＲＮＡ）により、または単に、天然のまたは暫定的に命名された起源（例えば、２つの試料から増幅された配列）により、区別できることもあり得る。例えば、ＮＡ1およびＮＡ2は、同じ試料細胞からの同じ遺伝子の同じＰＣＲ増幅から別々に分配された２つのアリコートなので、異なっているとすることもある。しかし通常、核酸は、配列または別々の試料からの起源に基づき、相違すると考えられる。
核酸は、天然に存在する核酸中では、通常、ホスホジエステル架橋をもつフラノシル糖のバックボーンを通じて連結された単量体性認識窒素ヘテロ環塩基ユニットからできている、ある程度化学的に反復性の構造をもつ。核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、普通、直線状の重合体構造をもつが、分枝核酸構造も、化学修飾および、化学合成の際の各種分枝成分を用いて、考案されてきた。天然に存在する核酸の例は、ＤＮＡおよびＲＮＡで、そのヌクレオシド単量体はそれぞれ２−デオキシ−Ｄ−リボースおよびＤ−リボースを含んでいる。ＤＮＡおよびＲＮＡでは、糖はいずれもフラノース型で、ホスホジエステル結合を経由して当該ポリマーのバックボーンを形成する。Ｎ−グリコシド型で連結された窒素ヘテロ環塩基は、ＤＮＡおよびＲＮＡが当該塩基の配列に基づき特異的に対合できるようにする、特定の認識構造を形成する。
非天然オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの例は、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的に修飾された誘導体で、例えば、それらのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ，２’−フルオロＲＮＡなどである。加えて、ロックされた核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のように、ＤＮＡおよびＲＮＡと対合できる、より構造的に異なる分子も、核酸の定義のなかに含まれる（Ｓａｎｇｈｉｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｏｏｋ，Ｄ．Ｐ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ワシントン １９９４；Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｐｅｙｍａｎ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ９０（４），５４３−５８４（１９９０））。本明細書で定義される場合、すべての核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの重要な特徴は、天然に存在する核酸と対合するまたは結合するそれらの能力である。
本明細書で定義される場合の、核酸の特殊なカテゴリーは、アプタマーまたはアプタザイムである。ヌクレオチドから構成されるこれらの分子は、標的分子へのそれらの特異的親和性または結合により、（たとえ構造的でなくても）機能的に識別可能である。アプタマーおよびアプタザイムの分子認識は、抗体・抗原認識原理に類似して、空間構造および動力学および当該分子の部分の空間提示を経由して仲介される結合に基づいている。ヌクレオチドの配列により配置された、核酸アプタマーの極性窒素塩基成分は、かくして標的分子をつかむための空間的に配置された“手”を形成できる。それらの特異的認識性質に加えて、アプタザイムは触媒機能を備えている。例えば、反応体標的分子のペアを適切な空間関係で近接させることにより、アプタザイムは、反応を促進する好ましい熱力学的環境をつくることも可能である。
本定義に従う核酸はまた、ペアリングにまたは、潜在的標的分子の分子認識に必要な核酸配列に加えて、例えば、検出、他の分子ユニットとの共役、スペーシング、または分枝形成のような他の目的に役立つ別の部分を含むような分子も含む。それらの分子は、特に、蛍光色素、ペプチド、タンパク質、抗体、アプタマー、有機および無機分子との、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの共有結合または安定な非共有結合共役体を含む。
特に、共役体の核酸またはＳＢＵを、検出可能な標識成分で標識したいと考えることがあるかも知れない。しばしば、標識成分は、図５に図解されているように、共役の部位の反対側にある、ＮＡまたはＳＢＵの末端で共役体に付着される。標識は、本発明のシステム中のいくつかの目的のために有用で、それらは、核酸がＳＢＳにより特定の場所に固定化されていることを確かめること、および、例えば、図２０にあるように、標識塩基を取込んだ、またはクエンチャーが切断された、酵素的に修飾された共役体を定量すること、を含む。本発明で使用するために好ましい標識成分は、蛍光成分、クエンチャー成分、可視色素成分、放射活性成分、化学発光成分、ビオチン成分、ハプテン成分、微小粒子（例えば、可視コロイド金微小球、蛍光微小球、など）成分、（常）磁性微粒子、および酵素性標識成分を含む。特に蛍光成分は、それらの取扱いの容易さおよび安全性ゆえに、好まれる。本発明での使用に適した蛍光成分は、ＢＯＤＩＰＹ（商標）色素，シアニン色素、Ａｌｅｘａ（商標）色素，フルオレセイン色素、ローダミン色素、フィコエリスリン色素、クーマリン色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素，Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標），ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，ＲＯＸ，ＥＤＡＮＡ，４−アセタミド−４’−イソチオシアネート−スチルベン−２，２’−ジスルフォン酸，４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２‘−ジスルフォン酸，サクシニミジルピレンブチレート、アクリジンイソチオシアネート、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ，Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ，Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗビニルスルフォン，およびＩＲ１４４６（Ｋｏｄａｋ（商標）Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅ）を含む。蛍光成分に加えて、光の特定波長を吸収するために、クエンチャー成分の使用を望むことも可能である。本発明で使用するために適したクエンチャー成分は、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）成分，ＤＡＢＣＹＬ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ），マラカイトグリーン、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオチアシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），および４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルフォン酸配列（ｅｑｕｅｎｚｅ）を含む。
相互に特異的に結合する結合システムのパートナーは、結合ユニットおよびアドレスユニットにより表される。支持材料に固定される結合システムの部分は、合成アドレスユニット（ＳＡＵ）と呼ばれ、一方、核酸共役部分は、相補的合成結合ユニット（ＳＢＵ）を含む。それゆえ、本発明で使用される共役体中の核酸は、支持材料に固定された相補的合成アドレスユニットを特異的に認識することができる合成結合ユニットに連結される。本発明で有用な合成結合ユニット（ＳＢＵｓ）および合成アドレスユニット（ＳＡＵｓ）は、特定の分子ペアリングができる分子ユニットである。ＳＢＵおよびＳＡＵが認識し、そして対合する場合、それら二者は、安定でそして特定の超巨大分子複合体、すなわち合成結合システム（ＳＢＳ）を形成する。本発明で使用が可能なＳＢＵ／ＳＡＵｓは特定の分子種（例えば、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡ，またはＣＡＮ）に限定されないが、それらはそれらの重要な機能および特徴に関して説明されてもよい。
当該結合システムの特徴は、結合事象を促進し、または会合ＳＢＵｓをそれらの対応当ＳＡＵｓから取外すために、当該結合システムの構成要素の結合が、通常、可逆的で、そして当該結合システムの遊離および複合体化構成要素間の平衡の位置が、温度、ｐＨ，濃度および他の溶液条件により影響されることがあり得ることである。本発明に従う合成結合システムのもう１つの主要な特徴は、それらが非天然起源で、核酸ハイブリッド形成構造の空間関係を模倣していないことである。このように、本発明で使われるＳＢＵ／ＳＡＵｓは合成的に調製されており、天然の核酸と相互作用しないという利点をもつ。もう１つの長所は、天然起源の核酸よりも、特に酵素分解過程に関して、安定な複合体を形成する能力である。合成結合システムは、核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと対合、またはハイブリッド形成、または結合しないので、核酸を選別することおよび固定化することにその種のシステムを使うのは、当該試料の核酸（ＮＡ）、他の生体分子または他の構成要素との固定化による、望ましくない相互作用または干渉をもたらさない。
好ましい合成結合システムは、伸長直線状重合体構造をもつ、非らせんペアリングシステムである。一般に、そうした構造は、下記の一般式をもつ単量体の重合体であり：
ここでＢbは単量体ユニットをオリゴマーに接続するバックボーン成分で、そしてここでＲsは、ＳＢＵが対応する合成アドレッシングユニットと特異的に相互作用することができるようにする、分子相互作用を提供する、特定の認識成分である。Ｒsにより提供される特異的分子相互作用は、水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用などのような何らかの非共有結合相互作用によることも可能である。そうした重合体性構造は、ＳＢＳ中へインフォーマティック構成要素を取込むという利点をもっており、すなわち、相互に特異的に対合する、少数の基本的単量体ユニットの多くの異なる組合せが作出可能である。例えば、もし基本的ヌクレオチド塩基類（Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ）がＲs成分として使われるならば、4単量体配列の４4＝２５６の組合わせができる。水素結合により特異的に相互作用するヘテロ環を含む窒素は、本発明での使用に好ましいＲs’ｓであるが、他の特異的認識成分も当業者により考案も可能である。一般に、好ましい窒素含有ヘテロ環は、天然に存在するプリンおよびピリミジン塩基で、それらは天然核酸源から大量に容易に得られるからである。しかし、トリプタミンのような、合成または修飾窒素ヘテロ環の使用は、ＳＢＵｓまたはＳＡＵｓではめずらしいことではなく、本発明でも計画される。
一般に、Ｂbとして使用するためのバックボーン構成要素は、その補体と相互作用するための位置にＲsをもつことができるが、またそのＲs成分の空間的関係が、天然に存在する核酸と相互作用を許さない、どのような容易に連結される単量体構成要素であってもよい。出願人は、６員環構造、好ましくは炭素を含み、そしてＯ，Ｎ，Ｓのようなヘテロ原子を選択的に含むものが、本目的のために有効なことを、見いだしている。特に、ピラノシル糖環構造は、伝統的な核酸化学によく似ている化学反応および処理が可能なので、有用とされてきた。しかしシクロヘキシル環もバックボーン成分として用いられてきた。また、クラウンエーテル、アゾクラウンエーテル、多環炭素構造体、または他の分子構造体のような他のタイプの分子も使用可能である。
本発明に従う合成結合システムの合成に利用可能な、特に好ましい単量体ユニットは、例えば、ｐＲＮＡｓ，ｐＤＮＡｓ，またはＣＡＮｓである。その種のビルディングブロックは、例えば、ＷＯ９８／２５９４３，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９３，７６，２１６１−２１８３，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９５，７８，１６２１−１６３５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，２３１６−２３４５，Ｈｅｌｖ．ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，８０，１９０１−１９５１，ＷＯ９９／１５５３９（“ｐＲＮＡ”），ＷＯ９９／１５５０９（“ＣＡＮ”）およびＢｅｉｅｒ，Ｍ．らによる；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３，６９９−７０３（１９９９）に記載されている。これらの分子の有用な特徴は、例えば、バックボーンの糖残基の間のリン酸以外の異なる連結成分または他の小変更をもつ、よく似た構造体にも一般に適用可能である。注目しておきたい興味ある点は、これらのタイプの単量体ユニットを用いるＳＢＵｓおよびＳＡＵｓが、特異的認識が維持される限り、異なるクラスの単量体からできていてもよい。ここで好ましい異型の結合システムは、ｐＲＮＡ／ｐＤＮＡ，ｐＲＮＡ／ＣＡＮまたはｐＤＮＡ／ＣＡＮである。しかし、ＳＢＵおよびＳＡＵが同じクラスの単量体を利用することが、なお一層望ましい。
ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡまたはＣＡＮは、選択的そして安定な仕方で、対合する合成結合システム（ＳＢＳ）を形成する。対合形成の安定性は、オリゴマー結合システム中の単量体性ビルディングブロックの数、組成および配列に、そして鎖間の塩基重層相互作用（鎖間塩基重層作用）の数に、依存する。天然に存在する核酸と違って、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡおよびＣＡＮに対するＳＢＳ相互作用の強度は、同じ配列を利用する核酸に対するより当初は強く、そして当該相互作用の強度は、ペアリング配列の長さが増加するにつれて大きな動的範囲にわたって、増加する。それゆえ、天然の核酸のものより大きな結合強度の増加をもち、そして、共役体の核酸配列部分について厳しい条件下でも結合状態を保つ、ＳＢＳｓを、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡおよびＣＡＮで容易に考案することも可能である。特異的認識を生成するＳＢＵ領域またはＳＡＵ領域は、好ましくは３から１５、さらに好ましくは６から１０の単量体を含む。共役体のライブラリーまたはセットで使用するための特に有用な配列は、以下に説明する。
合成結合システム（ＳＢＳ）またはそれらの構成要素（ＳＢＵおよびＳＡＵ）自身は、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、制限酵素などのような、核酸技術から知られる酵素類によっては、合成、増幅、修飾、処理、結合、断片化、または加水分解されない。この性質は、合成結合ユニットおよび核酸の共役体を用いる場合は、特に有利であるが、それは、当該合成結合システムに関連する会合体の部分は、例えば、先行増幅のような、試料または核酸の処理に通常必要な酵素的工程により、修飾、遮断、除去、または処理されることはないからである。当該合成結合システム（ＳＢＳ）またはその構成要素（ＳＡＵ／ＳＢＵ）は、試料に含まれるかもしれない酵素による分解を受けないので、その性質はまた有利である。
上述のように、合成結合システム（ＳＢＳ）および／または合成結合ユニット（ＳＢＵ）および／または合成アドレスユニット（ＳＡＵ）は、検出、他の分子ユニットとの共役、スペーシング、または分枝形成のために使われる付加的な分子群を含むことも可能である。当該分子群は、上記のように、標識成分をもつｐＲＮＡ，ｐＤＮＡまたはＣＡＮの共有結合または安定な非共有結合共役体を特に含む。
ＳＢＵ構成要素にｐＲＮＡ，ｐＤＮＡまたはＣＡＮを利用するような共役体の特定の例は、全部が参考文献により本明細書に援用される、ＷＯ９９／１５８９３（ＵＳＳＮ．０９／５０９０５１，２０００年３月２０日出願）、ＷＯ９９／１５５４２（ＵＳＳＮ，０９／５０９０１１，２０００年３月２０日出願），ＷＯ９９／１５５４１（ＵＳＳＮ０９／５０９０３９，２０００年３月２０日出願），およびＷＯ９９／１５５０９（ＵＳＳＮ０９／５０９０４０，２０００年３月２０日出願）に既に記載されている。本明細書に記載されている新たに開発された共役体に加えて、これらもまた、本発明の新規アレイ構築方法、超巨大分子構造体、生物学的アッセイ、および酵素修飾方法で有用である。

使用のための特定の共役体構造およびそれらの産生：
ｎおよびｍが両方とも１の場合、その共役体は、単一のＮＡに共役された単一のＳＢＵを含む。これらは、本発明での使用のための共役体の最も基本的な形である。これらの共役体は下記の一般式をもつ：
（ＮＡ）−Ｘ−（ＳＢＵ）
ここで、
（ＮＡ）は、 核酸、以下にさらに説明するように、好ましくはＤＮＡ，ＲＮＡ，修飾ＤＮＡ，または修飾ＲＮＡである。当該核酸は、末端ヌクレオチドの１つの３’または５’酸素を経由して共有結合でＸへ好ましくは連結される。図１参照。
（ＳＢＵ）は、 上記のように合成結合ユニットで、好ましくはｐＲＮＡ，ｐＤＮＡまたはＣＡＮまたはそれらの修飾型である。好ましくは、そして当該合成結合ユニットは、末端単量体の１つの２’または４’炭素（またはシクロヘキシルＣＡＮ成分の相当する炭素）を好ましくは経由してＸへ連結される。しかし、トリプタミンリンカーを介するような、窒素ヘテロ環成分を通じる連結も、本発明内にある。図１参照。
Ｘは、 合成結合ユニットと核酸を共役させるのに適した連結基である。いくつかのそうした基は当業者により考案可能であるが；次の構造（いずれの方向にも配向される）の１つをもつリンカー基が優先される：
そしてここで
Ｙ1，Ｙ2は 相互に独立してＯＨ；ＳＨ，ＮＨ2またはＣＨ3であり、そしてここで
Ｇは ＯまたはＳであり、そしてここで
Ｌ1，Ｌ2は 下記より成る群から相互に独立に選択されるリンカーであり：
共有結合；および飽和または不飽和の、分枝または非分枝の、置換または非置換の、１−６０炭素原子および、Ｎ，Ｏ，およびＳより成る群から選択される０−４０ヘテロ原子の鎖を含む、リンカー鎖成分。模範的な非共有結合リンカーで好ましいリンカーは、下記を含む
−［−（ＣＨ2）n−］−
または−［−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）m］−
または−［−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ2）q］−
または−［−（ＣＨ2）v−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）z−］−
または−［−（ＣＨ2）v−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ2）z−］−
なお、ｎ，ｍ，ｑ，ｖ，ｚは、いずれの場合も相互に独立に１および２０の間の整数で、そしてさらに好ましくは、ｎは２および１２の間であり，ｍは１および５の間であり，ｑは１および４の間であり，そしてｖおよびｚは独立に２および６の間である；そしてここで
Ｖ1，Ｖ2は 下記より選択された相互に独立した群であり
−［−ＣＨ2−］−
および 、そしてここで
Ｒ1，Ｒ2は 相互に独立してＨまたはＯＨであり、そしてここで
Ｂａは 例えば、インドールリンカーまたは、天然に存在するまたは人工核酸（アデノシン、シトシン、グアニン、チミジン、イデノシン、など）および合成結合システムで通常利用される種類の塩基のような、窒素ヘテロ環成分である。
Ｘ構造を用いる共役体：すなわち
は、本発明での使用に特に好まれるが、それは、ｐＲＮＡおよびｐＤＮＡ態様は、固相ホスホルアミダイト合成法を利用して、容易に合成も可能だからである。本発明の新規Ｌリンカー共役体をつくるために、広範な種類のＬ成分とともに、多数の“スペーサー”ホスホルアミダイト試薬が、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア）のような商業源から入手可能である。これらは、ポリエチレングリコール鎖、アルキル鎖、非塩基性リボースなどを含む。加えて、通常技術の有機化学者は、適切なポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、または他のスペーサー成分から適切なリンカーホスホルアミダイトを合成することも可能である。さまざまな連結配置が図２に図解されている。
核酸部分中の遊離３’端と共役体を調製するための選択は、ＣＰＧ支持体上に結合システムの合成を開始し、そしてそれから当該ＳＢＵの後に核酸を組立てることである。もしこの目的のために逆向きビルディングブロックが使われるならば、当該核酸を５’→３’方向に合成することも可能である。その結果は、図１Ｂおよび図２Ｂ／２Ｅに表されるような連結である。当該核酸側に遊離の３’端が必要でないかぎり、核酸合成は、結合ユニット上の標準ビルディングブロックで行われることが可能である。その結果は、図１Ａおよび図２Ａ／Ｄに示すような連結である（ＤＥ１９７４１７１５またはＷＯ９９／１５５３９：“Ｐｅｎｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｎｕｃｌｅｏｓｉｄ，ｓｅｉｎｅ Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｕｎｄ Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ”を参照）。
出願人は、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡまたは他のリン酸バックボーン共役体の直接固相合成のための改良法を、最近考案した。驚いたことに、出願人は、合成結合システムおよび核酸の共役体を、もし特定の保護基戦術が適用されるならば、化学固相合成で特に容易に調製することが可能なことを、見いだした。前に使われたアリル保護基、およびパラジウム触媒を用いるｐＲＮＡホスホエステル上のその脱保護は、支持体上に比較的長い鎖が合成された場合には、脱保護中に当該合成オリゴマーの部分的断片化をもたらした。それに対して、β−シアノエチル保護基および標準ヒドラジン脱保護工程の使用は、所望の共役体ＰＲＮＡの非常に低収量をもたらす。ヒドラジンによるβ−シアノエチル基の除去、およびヒドラジンによる脱保護が可能なホスホジエステルへの望ましい変換は、ヒドラジンによる当該共役体のホスホトリエステル結合の求核切断という望ましくない副反応より遅い。驚いたことに、合成の完了後に、不活性の溶媒中でアルキルアミンの溶液で、ＣＰＧ支持体に結合された状態のｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体を処理すれば、この問題を避けられる。処理後、β−シアノエチル保護基は、ｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体を切断せずにヒドラジンによる脱保護が可能である。好ましくは、不活性の溶媒中で第二級アルキルアミンが用いられる。好ましい第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、ジ−Ｎ−オクチルアミン、ジ−Ｎ−デシルアミン、ジドデシルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルアミン、Ｎ−メチルブチルアミン、Ｎ−メチルペンチルアミン、Ｎ−メチルヘキシルアミン、Ｎ−エチルプロピルアミン、Ｎ−（Ｎ−ブチル）−Ｎ−プロピルアミン、Ｎ−アミル−Ｎ−ブチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｎ−ブチル−１，６−ヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミンを含む。ジエチルアミンは特に好まれる。当該アルキルアミンは、好ましくは約０．２％から１０％の濃度の溶液中で、より好ましくは約１％から約５％、そしてさらに好ましくは約１．５％の濃度である。使用に適する溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、トルオール、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、およびヘプタンを含む。出願人は、ジクロロメタン中ジエチルアミンの約１．５％溶液が特に適していることを見いだした。処理後に得られる中間体は、ヒドラジンによる脱保護、そしてクロマトグラフィーによる精製が容易にできる。このように、直接合成されたｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体は、今では高収率で容易につくることも可能である。
仕上げられた核酸に前合成結合システムを連結するのが望ましいことが多い。天然源から、または例えば、インビトロ転写（アプタマーおよびアプタザイムを調製するためにもしばしば使われる）のような酵素的反応を経由して、得られる核酸は、機能性リンカーでＳＢＳｓへより有利に共役される。しかし、文献に記載されている多くの生化学的共役法（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンジエゴ １９９６）は、核酸および／または合成結合ユニットには化学的に不適当と証明されている。核酸を核酸と連結するためのいくつかの方法は、最初の付着と位置づけを達成するために、それらの核酸のハイブリッド形成を利用し、続いて（例えば、プソラレンを介して光化学的に）鎖を共有結合的に連結することによる。そのような方法は、ＳＢＵｓが核酸と対合しないので、ＳＢＵ／ＮＡ共役には有用ではない。
出願人は、仕上がり前の（ｐｒｅ−ｍａｄｅ）ＳＢＵｓおよびＮＡｓを共役体へ連結するための、ヒドラジンおよびヒドラジド化学に基づいたいくつかの新規な共役体を開示している。ヒドラジド修飾核酸または合成結合ユニットは、アミノ修飾核酸または合成結合ユニットと比較して、長所をもつが、それらがより広いｐＨ範囲にわたって使用可能であり、形成された生成物が、アミノ修飾核酸または合成結合ユニットに必要な還元工程なしにでも、比較的安定なためである。ヒドラジン共役化学は、ＷＯ００／１９６５３に記載されているように、核酸用に利用されてきた。しかし出願人は、ヒドラジン化学が、核酸へｐＲＮＡ，ｐＤＮＡおよびＣＡＮ ＳＢＵｓをカップリングするのに特に有用かつ有効なことを、見いだしている。例えば、下式のＸとの共役体は：
ヒドラジドを含む第１共役体成分（当該共役体のＳＢＵまたはＮＡ）を、末端リボヌクレオシド（または、塩基なしの、単にリボース）を含む第２共役体成分と反応させることにより得ることが可能である。これは図５に図解されている。本法の長所は、共役される核酸が、化学的に修飾される必要がないことである：天然に存在する末端リボシドを使ってもよく、あるいはそれを、酵素的に末端トランスフェラーゼとともにデオキシリボ核酸に加えてもよい。リボヌクレオチドは過ヨウ素酸塩で酸化し、相当するアルデヒドをつくり、次いでそれがアミンまたはヒドラジドと反応して、安定な共役体を与えてもよい。
さらに、出願人は、本発明での使用のためのいくつかの他の新規なヒドラジドおよびヒドラジンがカップルした共役体を、開発した。下式をもつそれらは：
アルデヒド第１成分を、それぞれ、ヒドラジドまたはヒドラジン第２成分と反応させることにより、産生可能である。実施例２．２はヒドラジド修飾ｐＲＮＡ共役体を調製するための方法を示す。アルデヒド官能基は、当該核酸が商業的に入手できるグリセリル支持体（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア、米国；カタログ番号２０−２９３３−４１）上で合成され、次いで過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された場合、当該オリゴヌクレオチドの３’端に得られる。このバリエーションはＲＮＡとの特に有用な共役であるが、それは３’端の第１ＲＮＡビルディングブロックが過ヨウ素酸塩によりもはや攻撃されず、完全に無傷のままであるためである。アルデヒド官能基を５’端に導入するのが望ましい場合には、保護されたアルデヒド官能基を既に含むか、あるいは、過ヨウ素酸塩によって後で切断可能な、保護されたジオール（例えば、ＥＰ０３６０９４０に記載されている）を含む、ホスホルアミダイトビルディングブロックを合成中に連結することが可能である。それら２つの構成要素は、シアノボロ水素化ナトリウムの存在下でリン酸緩衝液、ｐＨ７．４，中で反応させ、そしてその生成物を単離する（例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣにより）。
加えて、下式のＸにより連結された新規共役体は：
本発明において有用である。これらは、セミカルバゾンまたはチオセミカルバゾン含有第１共役体成分を、アルデヒド含有第２共役体成分と反応させることによって、ヒドラジド共役体のものと類似の方法により得ることも可能である。
本発明での使用のための別の共役体は、下式のＸを含む：
これは、第１共役体成分上のチオールをヨード酢酸塩で処理し、次いでそれを第２共役体成分上のアミンと反応させることにより、得ることも可能である。参照。
上記の比較的単純な共役体に加えて、ｎ，ｍ、または両方が≧２である、より複雑な新規共役体構造は、本明細書に提示された指導を用いて容易に調製が可能である。ｎ≧２の場合、共役体は複数の核酸を含む。同様に、ｍ≧１の場合、共役体は複数のＳＢＵｓを含む。合成結合ユニットおよび核酸の共役体を調製し、そして精製するための方法を用いて、さまざまな共役体を調製し、そして支持材料上で核酸（ＮＡ）をアドレッシング、選別、および固定化するためのそれらの適応性をテストすることが可能である。それゆえ、下記により異なる共役体を設計することも可能である：
ａ） 結合ユニットの選択、
ｂ） 核酸の選択、
ｃ） 核酸と結合ユニットとの間の連結の構造、
ｄ） 当該核酸の配向
ｅ） 核酸と共役された合成結合ユニットの数。
そうした多構成要素共役体は、以下に説明するように、直線性連結鎖構造として、または分枝成分を利用する分枝構造として、形成することも可能である。多ＳＢＵ構造は、下記を含むいくつかの用途をもつ：すなわち、１つまたは１つより多い共役核酸を固定化するため複数のＳＢＳｓの形成を通じて固定化結合強度を高めること、固定化ＳＡＵｓの異なるアレイでの使用のために複数のＳＢＵｓを提供すること、そして固定化のために複数のＳＢＵ／ＳＡＵ結合事象を必要とするようにＳＢＵｓがＳＡＵｓに結合する条件（例えば、当該核酸は、ＳＡＵ1およびＳＡＵ2の両方が付着された場所にのみ固定化されるが、ＳＡＵ1だけが付着された場所には固定化されない）を選択することにより当該分子に余分の情報次元性を提供することである。この後者の選択は大量生産系では特に魅力的であるが、それは、より長い配列と同じレベルの特異性を伝えるために、合成結合システム構成要素のより短い配列を利用することを可能にするからである（例えば、単一の１２マーではなく２つの６マー）。さらに、分枝群または直線構造を利用することにより、複数のＮＡｓを１つまたは１つ以上のＳＢＵｓに共役させることも可能である。これにより、複数の官能基をもつ固定化可能なプローブ構造の創出が可能になる（例えば、２つの遺伝子座用の捕捉プローブ、または図２５に図解されたような順向および逆向ＳＤＡプローブ）。
複雑な共役体のＳＢＵｓおよびＮＡｓは、さまざまな立体配置で、リンカー基Ｘまたは分枝基Ｗを経由して相互に連結されてもよい。例えば、共役体は、次の構造のいずれで形成されてもよい：
（ＮＡ）−Ｘ1−（ＳＢＵ）−Ｘ2−（ＮＡ）
（ＳＢＵ）−Ｘ1−（ＮＡ）−Ｘ2−（ＳＢＵ）
（ＮＡ）−Ｗ−（−（ＳＢＵ））u
（ＳＢＵ）−Ｗ−（−（ＮＡ））u
（（ＮＡ）−）u−Ｗ−（−（ＳＢＵ））u
なおｕは２および６の間の整数で、好ましくは２または３であり、ここで
（ＮＡ）は 上記のように定義され、
（ＳＢＵ）は 上記のように定義され、
Ｗは、複数の合成結合システムを、少なくとも１つの核酸と共役させることを可能にする、分枝基である。Ｗは好ましくは下記の一般式をもつ：
ここでＹ1はＯＨ，ＳＨ，ＮＨ2またはＣＨ3であり；
ここでＤ1，Ｄ2，Ｄ3，およびＤ4は、独立に、共有結合、または飽和または不飽和の、分枝または非分枝の、置換または非置換の、１から１０炭素原子および、Ｏ，ＳおよびＮより成る群から選択される０から４ヘテロ原子の鎖、を含むリンカー鎖成分であり；
ここでＪは炭素または窒素であり；
ここでｚは０または１、さらにここでＪが窒素であれば、ｚは０であり；そして
ここでＸ1，Ｘ2，およびＸ3は、上記のように独立にＸである。
好ましい分枝基は下記を含む：
である。
重合体性ＳＢＵｓを利用する場合、共役体の構築における選択の１つは、ＳＢＵおよびその対応するＳＡＵにおける単量体性ユニットの配列である。ＳＢＵｓおよびＳＡＵｓのセットがアレイおよび他の超分子構造を作出するのに利用される、本発明の方法での使用のために、適当な合成結合ユニット（ＳＢＵ）および相補的アドレスユニット（ＳＡＵ）のセットは大変有利である。説明した合成結合ユニットおよびアドレスユニットを用いて、それらの性質は同様であるが、相互に直交性であるペアリングシステムのセットを定義することが可能である。本明細書で使われる場合、用語“直交性”は、ＳＢＵｓのセットまたは群のメンバーが、当該セットの他のメンバーおよび当該セットの他のメンバーの相補的ＳＡＵｓと、同じ長さのあり得る全配列の平均ハイブリッド形成より少ない程度に、ハイブリッド形成することを意味する。直交性の概念は図１４のデータに図解されている。そこに示されるように、この群の配列の大部分は、相互に実質的に直交性である。ただ、１１８および１１９ペアは、他のものより相互に直交性が少なく、そして恐らく、同じセットの中では利用すべきでない。
一般に、合成結合ユニットおよびアドレスユニットのセットは、３から５の、特に好ましくは６から１０の単量体ビルディングブッロクをもつ、単量体ユニット（Ｒsｓ）の異なる配列のセットを好ましくは含む。Ｒs配列は当該群内で好ましくは直交性である。窒素ヘテロ環成分、特に含窒素塩基成分は非常に有用であるが、それは、非常に多くの可能性のあるサブユニットの組合わせをつくることができ、ＳＢＵｓの比較的大きな直交性群の生成を可能にするからである。説明したＳＢＵｓおよびＳＡＵｓは、高度に厳格な条件下で、相互に直交性の行動を示し、そしてこの点では、ＤＮＡまたはＲＮＡより実質的により能率的である。しかしさらに、厳密性のより低い条件下でも相互に直交性の行動を示す、セットの個々のサブグループを規定することが可能である。
特に出願人は、下記の構造をもつ、合成結合ユニットおよび合成アドレスユニットの有用なセットを見いだしている：
ここでＢbは、単量体性ユニットをそのオリゴマーへ接続するバックボーン成分（例えば、ピラノシルまたはシクロヘキシル環）であり、そしてここでＲsは、窒素ヘテロ環成分を含む特定認識成分であり、
ここで前記単量体性ユニットは、下式に従って直線的に配列されており、
Ｂs1−（Ｊ）−Ｂs2 または
Ｂs1−（Ｊ）−Ｂs2−（J’）−Ｂs3
ここでｓ１，ｓ２およびｓ３は、独立に、０および１０の間の整数で、より好ましくは０および２の間で、そしてＢは合成結合ユニット（ＳＢＵ）を合成するために使われるような任意の単量体性ビルディングブロックであり、そしてＪは認識成分（Ｒs）の配列で、ここでＪはＪ’と同じでもあるいは異なってもよい。これらの構造で、配列ＪおよびＪ’は好ましくは、独立に、下記の群Ａから選択され、または下記の群Ｂから選択され、そして配列ＪおよびＪ’は同じ群から選択される。
したがって、ＳＢＵｓまたはＳＡＵｓの実質的に直交性の群を、下記の配列のいずれかの群からのセット中のＳＢＵｓまたはＳＡＵｓとして使用するための配列の任意の数（２、５、１０など）を単に選択することにより、つくることが可能である：
群Ａ：SEQ ID NO. ３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、および７５
群Ｂ：SEQ ID NO. ４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、および７６
選別のために厳密な直交性を必要とするアレイ中で使用するための合成結合ユニットおよび合成アドレッシングユニットをそこから選択するための配列のより好ましいサブグループは、以下に与えられる：
群Ａ’（８マー）：SEQ ID NO. ３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７
群Ｂ’（８マー）：SEQ ID NO. ４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８
群Ａ”（１０マー）：SEQ ID NO. ４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、および７５
群Ｂ”（１０マー）：SEQ ID NO. ５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、および７６
群Ａ”’（さらに好ましい１０マー）：SEQ ID NO. ４９、５１、５３、５７、５９、６１、６５、６９、７１、および７５
群Ｂ”’（さらに好ましい１０マー）：SEQ ID NO. ５０、５２、５４、５８、６０、６２、６６、７０、７２、および７６
共役体またはアドレスのセットで使用するために、直交性配列のセットが、ｐＲＮＡ、ｐＤＮＡ、ｐＲＮＡおよびｐＤＮＡの混合物としてまたはＣＡＮとして、存在することも可能である。本発明の合成結合システムを使う場合、天然の核酸との相互作用は問題にならないので、共役体またはアドレッシングユニットのセットで使用するための配列は、天然に存在するいずれの配列をも除去することを必要とせずに、直交性に十分最適化することも可能である。これは、従来の方法で固定化成分として核酸を使用することに対して、かなりの長所である。

本発明においてＳＢＵ共役体とともに使用するためのＳＡＵｓ：
ＳＡＵｓは、共役体のＳＢＵｓの協調性の特異的結合ペアであり、そしてそのため一般に、ＳＢＵｓと同じような特徴を共有する。主な相違は、ＳＡＵｓが、核酸または他の生体分子に共役されているのではなく、支持材料に付着されていることである。ＳＡＵｓは、（平面矩形アレイにおけるように）単一の固体支持体に、または（ビーズ、ディップスティックのセット、またはマイクロタイタープレートのウエルの中のように）いくつかの異なる支持体に付着されてもよい。特定の適用条件（例えば、平面アレイ中で物理的に分離されている；対；ビーズのセット上で互いに相互作用できる）下で交差反応せず、そして例えば、ｐＨ，イオン強度、温度、電位、変性剤などのような、厳密な条件に同じような仕方で反応し、そして同じような安定性性質を示す、結合アドレスのセットを利用することが優先される。それゆえに、ＳＡＵｓは好ましくは、１つの分子クラス（例えば、すべてｐＲＮＡ，すべてＣＡＮなど）に所属する。しかし特別の態様については、同じ支持体上に異なる性質をもつＳＡＵｓを組合わせることも可能である。
任意の適当な支持材料を、ＳＡＵが付着される表面として使用することが可能である。例えば、適用条件下で不溶性の固体材料が使用可能である。これらは、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、調整多孔性ガラス、セラミック、金属、好ましくは貴金属、特に金または白金、または半導体、金属ケイ化物、導電性ポリマーを含むプラスチックおよびポリマーを含む。さらに、無機のソル・ゲル、およびヒドロゲルまたはバイオポリマーのような多孔性材料も、支持材料として使用することも可能である。これらは、例えば、セルロース、アガロースポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、および有機ポリマーヒドロゲルを含む。支持材料の表面は、層またはコーティング材中の単一材料、または複数の材料であってもよい。コーティング材は、単分子層の、複数の積重ね層を含むコーティング材の、または無秩序な層を含むコーティング材の、形であってもよい。支持体層の構造はその目的次第である：例えば、アガロースビーズまたはシリコンウェーハー表面は、特定の既知位置にＳＡＵを局在させるための固体支持体としてだけ役立つこともあり得る。当該実験で利用されたＳＰＲデバイスのようなセンサーアレイでは、支持体は、当該センサーへのＳＡＵの直接付着のための誘導体化金属表面を含むこともある。逆に、下記の能動的超巨大分子アレイ構築で利用されるような、能動的電子アレイは、浸透層（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドヒドロゲル）の下のアレイ場所で電極を含む。
本発明のＳＢＳｓは（参考文献により本明細書に援用されている、上に参照した特許中に当該デバイスが記載されているように）、能動的電子アレイで特に有利に利用が可能なので、この特別な実施態様では、さらに詳しく説明することにする。能動的電子アレイで利用される浸透層の特別の特徴は、それらが多孔性で、、共役体、核酸または試料を当該層中に深く浸透させることが可能で、そして相互作用が起るための大きな面積を提供することである。これらの浸透層はまた、活性化場所の核酸を、電極のごく付近のきびしい電気化学的環境から離す。さらに、支持材料のまたは支持材料に適用されるポリマーの表面は、当該結合システムのアドレスユニットの共有結合または安定な非共有結合付着または連結を可能にする官能基をもつことが多い。そうした官能基の例は、活性化エステル、アルデヒド、チオール、アミン、ならびにストレプトアビジン、アビジンおよび他のビオチン結合タンパク質などである。
（参考文献により十分に本明細書に援用されている、上に参照の特許中に、およびＵＳ５６０５６６２中にも、記載されているように）、能動的電子アレイに加えて、典型的な支持材料はまた、センサーチップ、フロースルーシステムまたはチャネルをもつチップ、流動性システム、ビーズ、磁性ビーズ、マイクロタイタープレート、クロマトグラフィー固定相、そしてまた、不均質アッセイシステムで使うことができる他の固体材料のような、他のデバイスも含む。

超巨大分子アレイ構造を産生する受動的および能動的方法
上記のように、共役体形成は、１つまたは１つより多い合成結合ユニットで、個々の核酸（Ｎａｓ）をコード化することを可能にする。コード化は、ある核酸への特異的にアドレス可能な合成結合ユニットの疑う余地のない割当てとして、本明細書では定義され、その結果その後当該核酸は、特異的に、空間的に場所決めされ、固定化され、選別され、そしてそれにより、アドレスユニットと相補的結合ユニットとの間の特異的相互作用を経由して支持材料上に検出されことが可能である。したがって、さまざまなＮａｓがＳＢＵｓの１つまたは群によりコード化される共役体のセットまたはライブラリーの、調製が可能である。例えば、すべてのＮａｓが異なるＳＢＵによりコード化される、またはすべてのＮａｓがＳＢＵｓの既知群によりコード化されされる、ライブラリーを産生可能である。逆に、すべてのＳＢＵｓが単一ＮＡまたはＮａｓの既知群をコード化するライブラリーを産生可能である。もしすべてのＮａｓが単一の独特なＳＢＵによりコード化されるライブラリーを産生するならば、厳密な１：１共役体ライブラリーが得られる。
結合のための適切な条件下で、協調性ＳＡＵと接触させた場合、共役体のＳＢＵは当該ＳＡＵと結合して、ＳＢＳ固定化核酸を形成する。合成結合ユニット（ＳＢＵ）の合成アドレスユニット（ＳＡＵ）への特異的結合は、好ましくは位置分解性合成結合システム（ＳＢＳ）および構築体を形成し、そしてこれが、当該ＳＡＵｓが付着されている特定の場所で支持体の表面上への当該共役体の選別および／または固定化をもたらす。それゆえ、ＳＡＵｓまたはＳＡＵｓの決められた群を、支持体上の既定の場所に付着させることが都合がよく、その結果、固定化された核酸の正体を位置依存的な仕方で決定することも可能である。例えば、既定の場所に固定化核酸のアレイをつくるために、ＳＡＵｓは、場所のアレイ（矩形、円形、または任意の他の適当なパターン）中に付着させることが可能である。この種のアレイはＤＮＡチップ技術で使われる方法と同じように調製される（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，２０００；ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ中，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード １９９９参照）。共有結合連結を経由する支持材料上への合成アドレスユニットの付着は特に優れているが、ビオチン／ストレプトアビジン型システムも使われ、よい結果が得られている。１つのＳＡＵに反応性群として複数のヒドラジドが供給されている分枝システムは、特に能動的電子アレイ上の活性エステル浸透層で、有用と証明されている。ある分子中に複数の反応性群を供給すれば、支持材料上により迅速でかつより安定な固定化をもたらす（ＰＣＴ／ＵＳ００／２２２０５）。（図４Ｂ参照）ある場所がＳＡＵｓの混合物を含むならば、そのときには異なるＳＢＵｓをもついくつかの核酸がその場所で固定化されることが可能であり（図１０参照）、または複数の異なるＳＢＵｓへの核酸共役体がその場所で固定化されることが可能である（図７参照）。
このように、本発明の態様の１つの群では、核酸が複数の（同じまたは違ういずれかの）合成結合ユニットと共役される共役体が使われる。この種類のシステムは、上記の方法と組合わせて、分枝ビルディングブロック（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ，Ｍ．Ｓ．；Ｕｄａｌｏｖａ，Ｉ．Ａ．：Ｂｒｉｄｇｍａｎ，Ａ．Ｊ．；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；２５，４４４７−４４５４（１９９７））を使うことにより可能である。図７を参照されたい。そのような分子構造体の長所は、１つの共役体中の複数の結合システムのために、可動の結合システムと、支持材料上に固定化されている結合システムの部分との相互作用が多様かつ協調的になることである。結果として、当該結合システムの選択性を維持しながら、特定の応用のために支持材料上に共役体のきわめて安定な固定化を達成することが可能である。先に論じたように、これらのシステムはまた、より短いＳＢＵｓの使用も可能にし、同じ長さの単一ＳＢＵを用いてできるより、ずっと多様な特異的結合ペアをつくれる。この種類のシステムは新規であり、そして出願人らは初めてそれらを得ることができた。
図１は、支持材料の表面上でＳＡＵｓに結合された共役体の可能な配向のいくつかを示す。応用次第で、特定の態様が好まれる。ポリメラーゼ反応用のプライマーとして共役体の核酸部分の酵素的処理のためには、当該核酸の３’端は好ましくは遊離である。これは例えば、当該核酸部分とＣＰＧ支持体上で化学合成を開始し、次いで当該核酸上へ結合ユニットを合成することにより達成可能である（図１Ｃ；図２Ｃ）（ＤＥ１９７４１７１５またはＷＯ９９／１５５３９：“Ｐｅｎｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｎｕｃｌｅｏｓｉｄ，ｓｅｉｎｅ Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｕｎｄ Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ”［“ペントピラノシルヌクレオシド、およびその調製と使用”］を参照）。ここで適切な場合には、上記のように、当該核酸を修飾するか、または商業的に入手可能な修飾ビルディングブロックを用いることにより、図２Ｆに示されるようにリンカーまたはスペーサーとしてセグメントを挿入することも可能である。結合ユニットと核酸とのそのような分離は、当該応用条件下で、システムの空間的接近が立体的問題、例えば、試料との核酸のハイブリッド形成がしにくくなるなど、をもたらす場合にはいつでも、有用である。その種の共役体は、前記新規の脱保護方法を用いることにより、特に能率よく得ることが可能である。
合成結合システム、特にｐＲＮＡ，ｐＤＮＡおよびＣＡＮは、ＤＮＡのような天然に存在する核酸より、実質的に相当安定な対合を形成する。驚いたことに、８単量体ユニット（８マー）から成るｐＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡについては２５マーでやっと同等になる安定性を達成することがわかった。さらに、ｐＲＮＡの安定性は、ＣＧ含量によるのではなく、鎖間の塩基重層相互作用の数により決定される。塩基のπ電子系を経由する鎖間のこのタイプの強い塩基重層相互作用は、普通のＲＮＡ／ＤＮＡ塩基重層エネルギー効果に比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡのらせん構造中では可能ではない（図３参照）。結果として、温度安定性は、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡまたはＣＡＮ二重鎖、またはヘテロ二重鎖の配列長とともに連続的に増加し、そしてこれは、当該合成結合システムが、共役体の核酸構成要素にとってはより厳しい、比較的高い調製およびアッセイ温度に耐えることを可能にしている。
さらなる態様において、支持材料上の固定化のモニタリング、管理および品質確証のために、合成結合ユニットおよび核酸の標識された共役体を使うのが有利である（図９を参照）。上記のように、適切な標識は、ここでは特に蛍光色素、色素、放射性同位元素、および酵素または微粒子である。これらは、蛍光、発光、可視部スペクトル吸収または透過（比色的）、シンチレーション計数、または他の適当な手段により検出が可能である。１つの態様では、合成結合ユニットおよび核酸の共役体は、当該核酸と試料構成要素との間の相互作用を検出するための第２標識から区別可能な標識を供給される。好ましくは、“品質管理”標識は、第２標識と作用、干渉、または重複しない。共役体上の標識分子種の検出または標識分子種により発生されるシグナルの検出は、当該共役体が所望どおりに固定化されているかどうかを示す。もう１つの態様で、支持材料上に固定化されている合成結合システムのアドレスユニットは、合成結合システムおよび核酸の共役体と接続されている標識分子種２と特異的に相互作用できる分子種１で標識されることも可能である。図９を参照されたい。そのような相互作用の典型的な例は、クエンチャーおよび蛍光共鳴エネルギー転移を用いる蛍光消光である。蛍光消光のための好ましい基は、ＤＡＢＣＹＬおよびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）成分である。この種のシステムは、特異的相互作用により、共役体の正しい固定化を都合よく示す。蛍光消光の場合、正しい固定化は蛍光シグナルの減少をもたらすので、支持材料上に固定化された共役体が得られ、それは、当該共役体の固定化を検出するために使われる蛍光の干渉なしに、蛍光による別の検出を行うために用いることが可能である。
固定化核酸の超巨大分子構築体は、それゆえ、固体支持体に付着された１つまたはそれ以上のＳＡＵｓへのＳＢＵ／ＮＡ共役体の受動的結合により生成が可能である。受動的な、拡散または対流制御のアレイ支持体上では、各結合アドレスは、当該結合アドレスの相補的部分を備えた特定の共役体の固定化のみを可能にする。これは、当該アレイが、そのアレイ全体にわたって同一である共役体の１つの混合物にのみ各サイクルで曝露されることが可能だという、事実に由来する。それゆえに、当該アレイ全体が、共役体Ｃのセットの全共役体と接触するので、１サイクル（Ｍ＝１）だけが可能である。この場合、したがって、結合アドレスの数Ｎは、支持材料上に固定化され、そして選別されることが可能な、合成結合ユニットおよび核酸の固定化可能な異なる共役体の数を、同時に決定する（図１３を参照）。
自己編成のためのアドレスの特異的認識は、１サイクルで支持材料上にＮ個の共役体を、したがって、Ｎ個の異なる核酸を、同時に固定化するための記載の方法を可能にする。同様に、そうしたアレイのすべての位置は、同じ時に試料の１タイプだけの適用という条件で、および当該アレイのすべての位置について同一という条件で、接触が可能である。本態様の長所は、核酸のアレイを生成させるために、ユーザーは、何ら特定の装置または器械を準備する必要がないことである。合成アドレスユニットのアレイは普遍的であり、そしてそれゆえ、さまざまな核酸アレイをつくるために使用が可能である。ユーザーは、ＳＢＵｓで個々にコード化された核酸の１セットまたは複数のセットが必要なだけである。当該核酸は、ＳＡＵｓおよびＳＢＵｓの特異的分子認識により、固定されたＳＡＵｓと支持材料上で自身を編成し、そして分離し、そして特異的固定化を提供する。
個々の核酸をスポットすることに比べて、もう１つの長所は、コード化された核酸のセットを支持材料へ適用するので、ユーザーは、ＳＢＵｓとの核酸の共役後、全セットとして共役体上へすべての必要な処理工程を行うことができることである。例えば、Ｎ回の個々の脱塩、精製、または濃縮の工程の代わりに、たった１回のそれらの工程が、当該セットには必要なだけである。これは、材料および処理工程の節約を可能にする。さらに、これらのエラーを起し易い工程を、１工程ですべて行うので、核酸ごとによる偏差がない。これは、当該アレイ上で行われるアッセイから集められるデータの定量的品質をゆがめる恐れのある、核酸の個々の取扱いに起因する変動性を、除去する。
受動的アレイ構築技術に比べて、能動的場所デバイス上へのアレイの作製は、共役体の複数のセットの選択的選別を可能にする。一般に、能動的場所アレイデバイスは、当該場所で特異的にＳＢＳ形成に有利な条件を生むように、個々の場所が活性化可能なデバイスである。それゆえ、当該“活性化可能な”場所は、制御された仕方で、個々に選択可能である。そのような活性化は、化学的（例えば、当該場所でのハイブリッド形成促進剤の遠隔操作放出）、または物理的性質（例えば、電場または磁場、赤外線（熱）または光子エネルギー、機械的露出［例えば、ＷＯ０１／０２０９４に記載のＣｌｏｎｄｉａｇ、ドイツにより製作されたデバイスを参照］など）でもよい。本発明のアレイ構築方法で特に有用かつ有効なのは、アレイ上の個々の場所が随伴電極により活性化される、能動的電子アレイである。例えば、米国特許第５６０５６６２号“Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（分子生物学分析および診断法用の能動的プログラム可能な電子デバイス）”を参照されたい。能動的電子アレイは、当該アレイの特定の場所への、合成アドレスユニット（ＳＡＵ）の、ＳＢＵ−ＮＡ共役体の、および試料の、界面動電移動および濃縮、またはアドレッシングを、能動的に制御することを可能にするので、Ｍ回のアドレッシングサイクルを連続して実施することにより、Ｎ個の異なる結合アドレスをもつ、そのような能動的電子アレイ上に、ＮｘＭ個の異なる共役体を固定化することが可能である。
したがって、アレイの能動的構築に使用するための固定化合成アドレスユニットのアレイをつくる場合、当該アレイのいくつかの位置は、最初に（および、選択的に、同時に）同一の結合アドレスを供給される。当該ＳＡＵｓは、高速処理製造用にスポットされてもよいし、または図１２Ａに示されるように、電子的にアドレスされてもよい。電子アドレッシング法では、Ｎ工程のそれぞれで、少なくともＭ個の同一の合成アドレスユニット（ＳＡＵ）が並行して固定化され、そのため最後には、少なくともＭ回反復中に存在する各ＳＡＵをもつ、Ｎ個の異なる合成アドレスユニットのチップアレイが得られる。
核酸（ＮＡ）および相補的ＳＢＵｓのＮ個までの共役体のＭ個の混合物（セット）が、次いでＮ個のアレイ位置にアドレスされる。全Ｎ個の共役体が固定化される純粋なアレイ０−構築態様では、特異的アドレスユニットに相補的な各個々の合成結合ユニットが、特異的核酸との共役体として存在し、そして活性化された場所の群（セット）は、対応する核酸（ＮＡ）の固定化が望ましい任意の場所に、個々の結合アドレスを含む。いくつかのアッセイ型の態様では、ユーザーは、Ｎ個すべての共役体が存在するかどうか（例えば、試料からのある種のアンプリコンが存在するかどうか）を、当初知らないこともある。これらの態様では、存在するＮ個の共役体は、活性化された場所のＳＡＵｓとＳＢＳｓを形成し、試料からの核酸の位置決めをする。
本システムを用いて、固定化のための任意の数のパターンを得ることが可能である。普通は、後に使用するためのアレイを形成するために核酸の固定化用には、１サイクルでアドレスされる位置のセットは、各結合アドレスを一度だけ含むはずである。混合物のアドレッシングがＭ回繰返され、そして工程間の洗浄が、新しいセットが適用され、そしてアドレスされる前に、第１セットの非結合共役体が完全に除去されることを、保証する。選択的には、活性化場所は、当該場所で電極のバイアスを短時間逆転することにより、電子的に洗浄することも可能である。もし能動的電子アレイが、収集電極をもつ一層複雑な試料調製システムの一部であれば、洗浄された非結合共役体は、さらなる廃棄のために対向荷電電極で収集することも可能である。所望されるならば、ＳＡＵｓ、またはより好ましくは使われるすべてのＳＡＵｓの混合物、またはすべての可能なＳＡＵｓが、電子洗浄工程により当該場所から洗浄される全共役体用の収集“シンク”として働くための対向電極に、付着されることも可能である。
本操作は、アレイ上への異なる核酸の固定化の方法の、著しい時間短縮および簡素化を可能にする。もしアドレスの数Ｎおよびサイクルの数Ｍが、アレイ位置の数の平方根であれば、当該長所は最もよく利用される。１００位置アレイの最適は、１０固定化サイクルおよび１０アドレッシングサイクルで使用される１０の異なる結合アドレスである。したがって、１００の異なる核酸でアレイを負荷するためには、個々の核酸のための１００の個々の固定化工程ではなく、２０（１０＋１０）の処理工程が必要である。仮に各工程がサイクルするのに３分間を要するとするならば、アレイは、５時間に比べて、１時間で負荷が可能なことになる。
１００位置アレイの利点は、消費される時間が５の倍率で短縮することである。もしＳＡＵｓからのアレイを調製するために必要な時間が当該計算に含まれないならば、その時間は１０の倍率で短縮する。ＳＡＵｓのアレイは普遍的なので、当該アレイは予め調製が可能である。これらの時間の節約のため、１０，０００の異なる核酸のメガアレイは５時間（前作製されたＳＡＵアレイの場合は２．５時間）で、そして１００，０００は１６時間（８時間）で作製が可能である。本態様の場合、合成アドレスユニットが、図１２に示されるように列および欄に、または他の適当なフォーマットで固定されているかどうかは、重要ではない。
当業者は誰でも、新規アレイ構造が、受動的アレイ構築技術を利用して作製されたものに比べて、本発明の能動的アレイ構築法により作製されることを、理解するだろう。受動的アレイでは、仕上げられた生産物は、Ｎ個の異なったＳＢＳｓにより固定化された、Ｎ個の固定化核酸のセットである。それに対して、能動的構築法により作製されたアレイでは、少なくとも２つの異なる核酸が、異なる場所に同じＳＢＳにより固定化される。実際には、１０、２０、１００、またはそれ以上の異なる核酸の大きな群が、同じＳＢＳにより異なる場所に固定化されるはずである。

生物学的アッセイにおける共役体および超巨大分子アレイ構造の使用：
本方法に従って調製された受動的および能動的アレイは、従来法ににより作製されたアレイと全く同様に使うことが可能で、さらにいくつかの別個の用途もある。当該アレイは、参考文献により本明細書にすべて完全に援用されている、ＧｉｌｌｅｓらＷＯ００／５８５２２により，またはＳｏｓｎｏｗｓｋｉらＵＳ６２０７３７３により記載されているように、例えば、ＳＮＰまたはＳＴＲ（短い縦列反復）アッセイに使用が可能である。
当該態様の１つの応用は、ＳＮＰアッセイ（Ｇｉｌｌｅｓ，Ｐ．Ｎ．ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３６５−３７０（１９９９））のための捕捉安定剤オリゴヌクレオチドを固定化するために合成結合ユニットでコード化された核酸の使用である。ＳＮＰアッセイでは、捕捉安定剤オリゴヌクレオチドまたは増幅された核酸が、アレイ上に固定化される。１０（Ｎ）のＳＢＳアドレスをもつ１００（Ｗ）の異なる捕捉安定剤オリゴヌクレオチドのアレイが、実施例１に記載の方法に従って、ＳＢＵｓおよびＮＡからの共役体を調製することによって、調製される。使用される捕捉安定剤オリゴヌクレオチドは、当該核酸の遊離の５’または３’端をもつ共役体であってもよい。当該捕捉安定剤オリゴヌクレオチドは、１０（Ｎ）の共役体のセットに組合わせられるが、当該セット中の各ＳＢＵは特異的な核酸と共役し、各ＳＢＵは一度だけ当該セット中に存在する。全部で１０（Ｍ）のセットが調製される。１０（Ｍ）回の反復で各ＳＡＵが存在する、１０（Ｎ）の異なるＳＡＵｓをもつアレイが、実施例５に記載の方法に従って、調製される。本実施例は、それらの位置が、核酸、共役体、およびセット、好ましくは能動的電子アレイと個々に（Ｍサイクルで）接触が可能な、能動的場所アレイを使用している。ＳＢＵｓでコード化された捕捉安定剤オリゴヌクレオチドの第１セットが、当該アレイに適用される。この適用は、ＳＢＵのＳＡＵへの特異的で安定な結合を可能にするような厳密な条件下で、行われる。当該セットは、特異的ＳＡＵが各場合一度（または特異的捕捉安定剤オリゴヌクレオチドの固定化が所望されるだけの多くの回数で）生じる、位置の群またはセットと接触される。能動的電子アレイについては、当該接触は、当該セットの所望される位置への能動的電子指図により行われる。当該接触は、当該セットのすべての位置へ連続して、または同時に、行われることが可能である。ＳＡＵおよびＳＢＵの特異的結合は、当該位置上で共役体の選別および固定化をもたらし、その結果、各位置に１つの特異的捕捉安定剤オリゴヌクレオチドが固定化される。
当該アレイは次いで洗浄され、特異的に固定化された共役体以外、第１セットの全共役体を除去する。次に第２セットの共役体が適用され、そして上記の工程が繰返される。このようにして、１０（Ｍ）サイクルの後にアレイが得られるが、そこには１００（Ｗ）の異なる捕捉安定剤オリゴヌクレオチドが固定化され、そして当該アレイは次いで、捕捉サンドイッチアッセイを行うため、試料核酸と接触させることが可能である。電子的または受動的ハイブリッド形成アッセイフォーマットが利用可能であるが、ただ、電子アッセイフォーマットの方が、複数の試料について有利に利用される。例えば、仮に捕捉固定化工程で、１００の異なる捕捉の１０セットが１０００場所デバイス上に同時に作製されたとすると、次に１０の異なる試料が個々に捕捉の各セットに電子的にハイブリッド形成されることが可能で、そして次に最後のリポータープローブハイブリッド形成工程で一度に分析することが可能である。これは、アレイのＳＢＵ共役体が試料と接触される前に、当該アレイが構築されるアッセイの例である。
増幅された核酸を固定化するためには、ＳＢＵコード化プライマーが使われる。そうしたプライマーは、試料核酸増幅反応の生成物中へ直接、ＳＢＵｓの取込みを可能にする。当該増幅、および増幅生成物の選択的組合わせを行った後、コード化され、増幅された核酸は、上記のように、それらのＳＢＵｓにより活性化された場所のセット上に容易に選別可能である。増幅では、コード化プライマーの単一セットが複数の増幅で利用可能であり、そして電子アドレッシングのために組合わされた当該生成物、またはコード化プライマーの複数のセットが、核酸の同時増幅のために使用可能である。多重反応では、当該コード化増幅核酸の処理（例えば、脱塩、精製、濃縮）は一緒に行うことが可能で、必要な工程および材料の節約をもたらす。当該セットは次いで、個々の位置にやはり固定化される個々の増幅核酸とともに、上記のように、当該アレイ上に固定化される。固定化されたアンプリコンは次に、リポーター／安定剤プローブの受動的または電子的ハイブリッド形成により、または任意の他の適切な方法により、分析および検出が可能である。これは、ＳＢＵ共役体が試料と接触された後に、アレイが構築されるアッセイの例である。
本明細書に定義されているように、標的分子はすべて、配列特異的な仕方で核酸と相互作用できる化合物である。例えば、標的分子は、特定の核酸；オペレータータンパク質、受容体、抗体またはそれらの機能的部分（例えば、Ｆｖフラグメント，一本鎖Ｆｖフラグメント，またはＦａｂフラグメント）または酵素のような、核酸結合ペプチドまたはタンパク質；そしてまた、核酸結合細胞構成要素（例えば、脂質、糖タンパク質、フィラメント構成要素）、またはウイルスおよびウイルス構成要素（例えば、キャプシド、ウイロイド）および、例えば、それらの酢酸塩のようなそれらの誘導体、であってもよい。しかし通常、“標的分子”は、試料中の核酸を指す。
また、本明細書で使われる場合、“試料”は、ここで記載されるシステムの構成要素と接触される、天然のまたは人工の起源の構成要素の任意の溶液および／または混合物である。生物学的試料がしばしば好まれるが、それらは興味ある核酸の普通の発生源だからである。本発明で使用するための生物学的試料は、ヒト材料、動物材料、植物材料、真菌材料、細胞培養、ウイルス培養、食物試料、および水試料より成る群から選択される試料に、好ましくは由来する。このような状況において、“材料”は、すべての体液、分泌物、排泄物、軟または硬組織、および感染性生物からの核酸を含め、核酸を含むことがあり得る他の生物関連物質、を含む。試料は、使用前に、核酸の精製、増幅、または他のタイプの酵素処理のような、準備工程を受けてもよい。
試料の可能性のある標的分子と、共役体のＮＡｓとの間の接触は、ＳＡＵアドレスによる支持材料上へのＮＡ／ＳＢＵ共役体の固定化の前に、後に、またはときどき間に、行ってもよい。当該共役体に特異的に結合する試料中の標的の存在および／または量（ハイブリッド形成アッセイの場合）および／または核酸（ＮＡ）自身の存在、量、または性質（増幅された、または酵素的に修飾された共役体の場合）は、次いで適当な手段により検出も可能である。このような状況において、試料は、当該試料中の標的分子のタイプおよび／または存在または頻度についての情報を得るために、支持材料上に固定化された核酸（ＮＡ）と接触される、すべての分子、生体分子、混合物、および試薬を含む。試料は、それゆえ特に、標識されたおよび／または標識されないプローブ、ハイブリッド形成プローブ、酵素および酵素反応のための混合物、または特定のアッセイフォーマット用の他の試薬を、含むことも可能である。試料構成要素は、特定のアッセイ方法に適合するように処理または標識されてもよい。本発明のアッセイでの使用に適する標識は、共役体およびＳＡＵｓについて上にリストされたものを含む。
本発明のさらなる側面は、ＳＡＵアドレス支持体の独特の再使用性である。共役体の固定化核酸は、伝統的な固定化システム（例えば、共有結合またはビオチン／ストレプトアビジン連結）に比べて、比較的容易に除去することも可能である。合成結合システムの結合性質は、支持材料から合成結合ユニットおよび核酸のすべての共役体を除去するためには、特に厳しい条件（ｐＨ，塩含量、温度、電圧、変性剤など）を設定することにより、影響されることがある。好ましい方法は、ｐＨを低下させるための塩基性溶液（ＮａＯＨ，ＫＯＨ，ＮＨ4ＯＨなど）の添加である。別の方法は、ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、ジメチルスルホキシドのような変性剤の使用を含む。支持材料への合成結合システムの合成アドレスユニットの連結が、当該条件に対して自身が安定であれば、その場合、固定化合成アドレスユニット（ＳＡＵ）のアレイは、そのような厳しい処理の後にも保持される。するとそのアレイは、まるでＳＡＵｓの新たに調製されたアレイのように、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および核酸（ＮＡ）の新しい共役体の固定化に再び使用することが可能である。固定化合成アドレスユニット（ＳＡＵ）とともに当該支持材料を再使用することは、材料（支持材料およびアドレスユニット）および固定化ＳＡＵｓのアレイを調製する際の時間の節約になる。それゆえに合成結合システム（ＳＢＳ）の使用は、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンのような不可逆的なシステムの使用に比べて、有利である。支持材料を再生させる例は実施例８に記載されている。本発明のこれらの態様は、センサーアレイまたは能動的電子アレイデバイスのような複雑な機能エレメントを含むアレイが使われるときには、特に魅力的である。
ＳＮＰ例で簡単に説明したように、本発明の方法はまた、配列または組成については同一であるが、異なる発生源から得られた核酸を、同時に、選別し、支持材料にアドレスするために、合成結合ユニットおよび核酸の共役体を使用するための方途を提供する。本側面は、アレイ中の特定の場所を活性化することによるだけでは支持体上で試料を選別できない、受動的アレイでは、特に有用である。例えば、遺伝子発現パターンの決定の場合、同一遺伝子の異なる発現を、異なる発生段階で、刺激後の複数の時点で、または異なる集団で、すべて同じ受動的アレイ上で比較することも可能である。好都合なことに、合成結合システム（ＳＢＳ）の情報次元性は、ｃＤＮＡ試料とともに増幅プライマーとしてＳＢＵ共役体を利用することによって、各試料中の調べられる各遺伝子を個々のアドレス（結合ユニット、ＳＢＵ）でコード化するために、利用される。
異なる起源の試料の遺伝子アンプリコンがそうして標識された後で、それらは組合わされて、そして一緒にさらに処理されてもよい。これは、試料の個々の処理における可変性を避け、そして正確に同じ条件下で同じアレイ上で異なる発生源からの同一の核酸の均質で同等のアドレッシングを可能にする。結果として、当該データの相当に高い正確さと低い可変性（標準偏差）とが達成可能である。さまざまな色素による普通に使われるコード化と違って、特異的合成結合ユニット（ＳＢＵ）によるコード化は、相当に多くのさまざまな同時に使用可能なコードを可能にする。ここでのコード化は、コード化された核酸を空間的に分離するのに役立つので、可視部スペクトルシグナルの重複も防がれる。それに対して、色素はこの種の分離はできないので、その結果、色素類の頻繁なスペクトル重複が生じ、それがシグナル分離を一層困難にする。
実施態様の本発明の本タイプの態様は、図１３Ｂに示される。ここでは、アレイ上の核酸の特定分子種、例えば特定遺伝子、の異なる時点、段階、または集団が、相互に比較される。この目的のために、付着された合成アドレスユニットの標準アレイを利用することが可能で、ここで各位置は個別のＳＡＵアドレスをもつ。この受動的例では、各試料中の各遺伝子が個別のＳＢＵを与えられるが、別の例では、それらのアドレスが能動的場所アレイを用いる分離セットで取扱われる限り、繰返しアドレスおよびＳＢＵ共役体が使われるはずである。１つの分子種について比較される時点は、混合物として同時に、または連続的に、当該位置に向けられる。合成結合ユニットによる合成アドレスユニットの特異的認識は、その位置でＳＡＵと特異的に対合する共役体のみを、各アレイ位置に固定化する。
試料中の標的核酸は、品質管理標識について前に説明したように、標的自身上に、またはハイブリッド形成プローブ上のいずれかで、標識により、検出および／または定量されることが可能である。別の態様で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのような質量分析法も、質量標識技術の有無で、利用することも可能である。さまざまな検出スキームが、固定化核酸アレイフォーマットについて考案されており、普通の当業者は、本発明のアレイおよび方法を利用するアッセイへのそれらの適用を容易に理解するはずである。

ＳＢＵ−ＮＡ共役体を利用する酵素反応：
前に議論されたように、本発明の共役体は、試料中の標的核酸の酵素的増幅のためのポリメラーゼ反応で利用可能である。意外にも、出願人らは、少なくとも１つの合成結合ユニット（ＳＢＵ）および少なくとも１つの核酸セクション（ＮＡ）を含む共役体が、基質として核酸を利用する酵素反応のための基質として役立つことが可能であり、そしてそれゆえ、バイオテクノロジー的生産法の普通に使われる酵素処理に適合することを、見いだしている。本発明の酵素的方法での使用のためには、当該共役体の合成結合ユニットは、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡおよび／またはＣＮＡセクションを好ましくは含み、これらのセクションはハイブリッド形成による特異的および可逆的結合を仲介できる。当該核酸セクション（ＮＡ）は、少なくとも１つのヌクレオチドまたは核酸適合性ヌクレオチドアナログを含む。
それゆえに、本発明の基本的酵素的方法は、天然に存在する核酸を基質として利用する少なくとも１つの酵素と共役体とを単純に接触させ、そしてさらに当該酵素の作用に必要な他の試薬と当該混合物を接触させることである。次いで当該混合物は、共役体の酵素的修飾を行うのに十分な量の時間の間、当該酵素に適した条件下で、インキュベートされる。必要な試薬および条件はいずれも、酵素により、そして異なる作用のために利用される工程間で、相当変わるはずである。例えば、ポリメラーゼまたは鋳型依存性リガーゼ反応におけるように、試薬は添加鋳型核酸または標的核酸を含んでもよい。方法次第では、例えば、緩衝液、酸、塩基、補酵素、ヌクレアーゼ阻害剤などのようなさらなる副物質を添加することも可能である。あるいは、試薬は、ポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ反応用のヌクレオチドを含むこともあり得る。同様に、温度のような条件は、好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）および類似の種類に由来するもののような“熱安定性”酵素、および例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の熱不安定性酵素の間では、広く変動する。しかし出願人らは、当該共役体が、通常の核酸基質と同様に使用可能なことを、見いだしている。それゆえ、特定の既知酵素的核酸反応における共役体の使用は、最少の実験を必要とするだけである。加えて、酵素の組合わせは、ＴＭＡ（ＲＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡアーゼＨおよび逆転写酵素）、およびＳＤＡ（制限エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼ）のような、協調的な酵素活性を利用する典型的な方法で利用が可能である。
それゆえ、記述のＮＡ／ＳＢＵ共役体は、使われる方法次第で、任意の必須鋳型核酸、標的核酸および／またはヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ）を用いて、特定の酵素により修飾される。用語の鋳型核酸は、ＮＡ／ＳＢＵ共役体基質の核酸セクション（ＮＡ）にハイブリッド形成し、そして標的核酸の連結または合成用の鋳型として役立つ、天然核酸を意味する。標的核酸は、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の核酸セクション（ＮＡ）に酵素的に連結される、または当該共役体のＮＡに接触した後、当該反応により酵素的に合成、修飾、または分解される、天然核酸であると理解される。核酸セクション（ＮＡ）は、標的核酸に共有結合的に連結されてもよく、あるいは、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の核酸セクション（ＮＡ）にハイブリッド形成し、そして酵素的に分解または修飾されてもよい。当該ハイブリッド形成はまた、核酸セクション（ＮＡ）そのものの（例えば、ＲＮアーゼＨ活性による）酵素的分解または酵素的修飾を開始させることも可能である。
共役体の酵素的修飾の生成物は、その核酸部分が処理された共役体である。最終生成物は、したがって、使われる酵素的処理に依存するはずである。（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素反応を含む））ポリメラーゼ反応は、ＳＢＵｓに共役されたアンプリコンを産生する。ライゲーション反応は、付加された別の核酸配列をもつＳＢＵ共役体を産生する。ヌクレアーゼ反応（制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼなど）は、共役体の核酸セクションの部分を切離す。ターミナルトランスフェラーゼ反応は、（ラベリングまたはホモポリマーテーリングのように）共役体の核酸の末端に１つまたは１つより多いヌクレオチドを付加する。そして実に多くの他の酵素反応が、核酸を、リン酸化、脱リン酸、メチル化、またはそれ以外の修飾をするために、利用可能である。
当該酵素的方法で使用するために好ましいＮＡ／ＳＢＵ共役体は、上記のようなものを含む。適用次第で、特定の態様が好まれる。それゆえに、ポリメラーゼまたは増幅反応については、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の核酸セクションは遊離の３’端をもたなければならない。それに対して、リガーゼは、核酸の３’端へ連結するための、核酸の５’端に遊離のリン酸が必要である。本発明のいくつかの態様では、これはＲＮＡの３’端への連結である。
模範的な酵素は、核酸を増幅するために使われるポリメラーゼ類、特に、例えばＴａｑポリメラーゼ，Ｖｅｎｔエキソポリメラーゼ，Ｋｌｅｎｏｗエンザイム，Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ，ＰｏｌＩ，Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ，ＰＦＶ１ポリメラーゼ，Ｐｗｏポリメラーゼ，またはＰｆｕポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼ類，加えて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ，Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ，ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼ類および逆転写酵素、を含む。別の模範的な酵素は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、のようなヌクレアーゼ類、例えばＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＡのようなＲＮアーゼ類を含む。これらは加えて、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ，Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、のようなＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼ類、キナーゼ類、メチラーゼ類、およびターミナルトランスフェラーゼ類またはメチルトランスフェラーゼ類を含む。ＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡリガーゼによる反応は、伸長された共役体を産生するのに非常に有用である。さらに、ヌクレアーゼも有用なのは、図２０に図示されるクエンチャー放出型制限エンドヌクレアーゼアッセイのような、酵素的修飾アッセイである。
好ましい態様では、共役体は、付着ＳＢＵｓでアンプリコンを産生するために、ヌクレオシド三リン酸の添加で酵素的に修飾されたポリメラーゼである。本目的のために、ＮＡ／ＳＢＵ共役体が、鋳型核酸でハイブリッド形成されたＮＡ／ＳＢＵの核酸セクションとともに、ポリメラーゼ反応でのプライマー基質として用いられる。ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸単量体類（ＮＴＰｓ）の添加で、当該ポリメラーゼは、当該鋳型核酸鎖を用いて、核酸セクション（ＮＡ）の３’端へ相補的ヌクレオチドを添加し、それによって相補鎖を合成した。ＰＣＲおよび類似の方法論が好まれ、そして鎖置換増幅（ＳＤＡ）も好まれる。
この種の酵素反応で核酸プライマーとしてのＮＡ／ＳＢＵ共役体の使用のために、当該共役体は反応条件下で、特にＰＣＲ反応の反復加熱および冷却に対して、安定でなければならない。ここで、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡ，および／またはＣＮＡを含む合成結合ユニット（ＳＢＵ）をもつ核酸セクション（ＮＡ）の共役体は特に適していることが明らかになった。さらに、共役体の合成結合ユニット（ＳＢＵ）は、当該酵素の阻害剤でも、拮抗基質であってもならない。当該酵素の阻害におけるそのような拮抗物質は、上記のＮＡ／ＳＢＵ共役体によっては好都合にも示されない。
アンカーされた鎖置換増幅（ＳＤＡ）は遺伝子標的の多重増幅および識別のための能率的な方法で、本発明の新規混合アドレスアレイ構造（図２４参照）および分枝共役体構造（図２５参照）を好都合にも利用可能である。アンカーＳＤＡは多重増幅を容易にするが、それは、増幅プライマーセット（順向および逆向）が、能動的電子マイクロチップの場所上のように、アレイ上の各場所で個別のユニットとして働くからである。当該増幅プライマーセットは、当該場所でそれらの対応する特異的アドレスユニット（ＳＡＵ）に排他的に結合する特異的結合ユニット（ＳＢＵ）に当該プライマーを付着させることによって、チップ上の個別のゾーンに空間的に分離されることが可能である。これは、酵素および試薬だけを共有する、増幅の個別ゾーンの創製を可能にし、そこでは、増幅産物は局所的に高濃度のプライマーにより迅速に捕捉される。プライマーおよびアンプリコンのこの局在は、増幅プロセスを大いに簡素化する、完全に開放された構造体を維持しながら、プライマー・プライマー相互作用を大きく減少させる。
図２７Ａから２７Ｅは、ＳＢＵアンカーされたＳＤＡの原理を図解する。単純化のために、この説明は、単一標的配列を増幅するために使われる単一プライマーペアについてである：しかし当該方法は、所望される任意の数の標的およびプライマーに拡張も可能である。独特のＳＤＡプライマー・ＳＢＵ構築体（プライマー１およびプライマー２）が、マイクロチップ上の特定の場所に電子的にアドレスされる。標的は、適切なｄＮＴＰ，緩衝液、塩類、制限酵素、およびポリメラーゼとともに導入される。二本鎖鋳型を解離させるためにチップが加熱され（またはこの工程は鋳型を導入する前に行われる）、そして各標的は、ポリメラーゼの作用によりそのそれぞれのＳＢＵアンカーＳＤＡプライマー上にコピーされる。バンパープライマーの伸長は、ＳＢＵ１に付着された標的コピー（Ｓ１）を残した新しい二本鎖標的を創製する。第２バンパープライマーは、Ｓ１の遠位端から重合化を開始し、そしてＳＢＵ１付着点に近位の二本鎖標準制限部位を創製する。当該プロセスは、短小化された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｓ１の複数コピーを産生するために、反復する（ニック鎖置換合成サイクル）。類似のプロセスはプライマー２−ＳＢＵ２で生じることも可能である。これで開始プロセスが完了する（第１期）。第２期では、第１期で生成されたＳ１の複数コピーが、プライマー２−ＳＢＵ２により捕捉され、それは続いてポリメラーゼにより伸長されることが可能である。第２バンパープライマーの封入および第２制限部位の導入は、結果としてＳ２の鎖置換および増幅を生じ、対数的増幅をもたらす（第３期）。第２バンパープライマーおよび制限部位がなければ、プライマー１で産生された増幅Ｓ１は、プライマー２で捕捉され、そして続いて、適切に設計され蛍光的に（または別の仕方で）標識されたリポータープローブのハイブリッド形成を経由して検出が可能である。増幅を増加させるために、対数的増幅を進行させるようにしてもよい。この場合、増幅産物を捕捉し、それらをチップ上の離散した場所に閉込めるために、別の独特の捕捉プローブＳＢＵ構築体を使うことも可能である。
本発明のもう１つの好ましい態様で、ＮＡ／ＳＢＵ共役体は標的核酸と連結される。ここで、リガーゼは、ＮＡ共役体基質の遊離５’端を、標的核酸の３’端とリンクする。いくつかの一本鎖リガーゼが知られているが、それらは好都合にも、２つの核酸を連結するために、付加的な鋳型核酸鎖を全く必要としない。ＤＮＡリガーゼと違って、特にＲＮＡリガーゼは、鋳型なしにかなり能率的に核酸をリンクする（Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ．；Ｎａｔｕｒｅ，２７５，５６０−５６１（１９７８）またはＥｎｇｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ．；Ｂｒｕｃｅ，Ａ．Ｇ．；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ６５（１），６５−７４（１９８０）またはＲｏｍａｎｉｕｋ，Ｐａｕｌ Ｊ．；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏｌｋｅ Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，５２−９（１９８３）を参照）。このように、ＲＮＡリガーゼは、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および短い修飾された核酸セクション（ＮＡ）（１つのヌクレオチドのように小さくても）の共役体を使い、そしてその共役体をＲＮＡの３’端とリンクする。この反応は、鋳型核酸を使わずに、上記の適用のための酵素的に処理された共役体を提供するのに好まれる。本態様のバリアントでは、２つの核酸のライゲーションを行う鋳型依存性リガーゼが使われる。
もう１つの態様で、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の核酸セクションにハイブリッド形成された標的核酸は、ヌクレアーゼの添加により特異的に分解される。本態様では、制限エンドヌクレアーゼおよびＲＮアーゼＨ（これは二本鎖特異的である）の使用が、特に優先される。これらの態様では、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の核酸（ＮＡ）または標的核酸のいずれかが、ヌクレアーゼにより分解、切断、加水分解、または断片化される。ここでも当該酵素は、標的核酸とハイブリッド形成されたＮＡ／ＳＢＵ共役体を基質として認識する。例えば、ＲＮアーゼＨは、その鎖がＤＮＡ鎖またはＳＢＵ修飾ＤＮＡ鎖（ＤＮＡ／ＳＢＵ共役体）にハイブリッド形成するならば、ＲＮＡ鎖を消化する。そうした反応は、例えば、生物学的試料中に存在する特異的妨害性ＲＮＡｓの選択的破壊に重要である。本例では、標的ＲＮＡを含む試料または細胞は、そのＤＮＡ配列が当該ＲＮＡに相補的であるＤＮＡ／ＳＢＵ共役体と混合される。ＲＮアーゼＨが当該混合物に添加されてもよく、または全細胞抽出物の場合には、天然の内因性ＲＮアーゼＨ活性が使われてもよい。意外なことに、出願人らは、非共役ＤＮＡを使う場合に比較して、ＮＡ／ＳＢＵ共役体が、酵素活性の減少なしに当該方法で使用できることを、示すことができる。
好ましくは、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の核酸セクション（ＮＡ）は、少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは１から５０のヌクレオチドを含む。ライゲーション反応のためには、特に好ましい核酸セクション長は、１から２０ヌクレオチド、より好ましくは１から１０、そして最も好ましくは１から５のライゲーション用の核酸である。特異的にハイブリッド形成された配列が必要な重合化および酵素的核酸分解反応のための、好ましい核酸長は、１０から４０ヌクレオチド、より好ましくは１７から３０ヌクレオチドである。驚いたことに、出願人らは、当該酵素活性が、当該ＮＡおよびＳＢＵの間で共役の点の３０、２０、１５、１０、７、５、または２ヌクレオチド以下ほどに近く、または１ヌクレオチドでも生じることがあることを、見いだしている。
当該酵素反応は、ここでは溶液中のＮＡ／ＳＢＵ共役体または固定化ＮＡ／ＳＢＵ共役体を用いて（例えば、プライマー伸長による酵素的リポーティングの場合におけるように）起ることが可能である。溶液中で酵素的に修飾されたＮＡ／ＳＢＵ共役体は、次いで、当該酵素反応の完了後、ＳＡＵ選別によりそのような表面上に固定化されることが可能である。このように産生され、そして固定化された酵素的に得られた共役体は、上記のように、さまざまなアッセイフォーマット中の試料を研究するために、ここで使用することも可能であり、あるいは当該酵素プロセスそのものも、アッセイの一部として利用することも可能である。
合成結合ユニット（ＳＢＵ）自身は、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、制限酵素のような、核酸技術から知られる酵素類によっては、合成、増幅、修飾、処理、連結、断片化、または加水分解されることはない。この性質は、ここで説明したように、酵素プロセスで合成結合ユニットおよび核酸の共役体を用いる場合は、特に都合がよいが、それは、試料または核酸を処理するのに普通は必要な酵素的工程により、ＳＢＵが修飾、遮断、除去、または処理されないからである。それゆえに、ＮＡ／ＳＢＵ共役体の使用は、ＪＰ０３１５１９００およびＷＯ９３／２５５６３に記載された方法に類似した、増幅共役体の産生にはそれだけに好都合である。
（実施例１）：核酸および合成結合システムの共役体の合成
核酸、オリゴヌクレオチド、合成結合システムおよび／またはＮＡ／ＳＢＵ共役体は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の自動合成機Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０５で固相法に従って調製することが可能である。次の実施例で利用されるように、核酸またはオリゴヌクレオチドまたは共役体の相当する核酸部分は、５’−３’合成（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）用の逆向きホスホルアミダイトを含む、商業的に入手可能なホスホルアミダイトを用いて合成される。核酸の固相合成については、当該装置の製造業者および／またはアミダイト供給業者により示唆された合成サイクルおよび条件を使用した。（Ｇｌｅｎｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍｇｅｎｅｓから入手可能なような）リンキングビルディングブロック、リンカー、モディファイヤーまたは分枝アミダイトの利用についても同様である。
ｐＲＮＡ合成結合システムについては、適切な参考文献に記載されている条件および単量体を使用する。ｐＲＮＡ合成結合システムの固相合成の基本的方法は同じであるが、標準ＤＮＡ合成と比較して重要な相違は、より長いカップリング時間、脱トリチル基のための６％ジクロロ酢酸の使用、およびアクチベーターとしてのピリジニウム塩酸塩の使用である。共役体については、以下に記載の特定の脱保護プロトコールと組合わせて、ホスホルアミダイト上のβ−シアノエチル保護基の使用が優先される。単量体は水酸化カリウム上で真空で予め乾燥し、そして無水アセトニトリル中０．１Ｍ溶液として使用する。ホスホルアミダイト化学により合成されるｐＲＮＡまたはｐＤＮＡに対する代替物として、そのアミド性バックボーンをもつＣＮＡをＷＯ９９／１５５０９に記載の方法に従って合成し、そして以下のカップリング反応における適正な官能基修飾とともに利用してもよい。
核酸、合成結合システムおよび共役体のクロマトグラフィーによる精製は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより行う。カラム：Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ１８またはＰｈｅｎｏｍｅｘ Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ−Ｈｅｘｙｌ，１０μＭ，分析用：４ｘ２５０ｍｍ，流速＝１．０ｍｌ／分，半調製用：１０ｘ２５０、流速＝３．０ｍｌ／分；緩衝液：Ａ：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）ｐＨ＝７．０ 水中，Ｂ：０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ＝７．０ アセトニトリル／水（９５：５）中；グラジエント：分析用および調製用分離について１００分間でＢ０％からＢ１００％）。
エレクトロスプレイマススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）はネガティブイオン化モードでＦＩｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ装置により記録した。ＭＡＬＤＩマススペクトルはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥＰｒｏにより記録した。
驚いたことには、出願人らは、もしジクロロメタン中のジエチルアミンのようなアルキルアミンによる処理が、脱保護および合成支持体からの取外しの前に行われれば、合成結合システムおよび共役体が特によい収率で、しかも特によい純度で得られることを見いだした。
合成結合システムおよび共役体のシアノエチル脱保護についての一般的プロトコール：
ホスホルアミダイト法に従う固相合成後に、当該支持体はまずジクロロメタン中のジエチルアミンの１．５％（ｗ／ｖ）溶液と混合し、室温、暗所で、一晩（１５時間）震盪する。バッチ方法を使う代わりに、連続して試薬の溶液で合成支持体を濯ぐことも可能である。当該溶液を捨て、そして支持体を次の溶液：ジクロロメタン、アセトン、水の各々で３回づつ洗浄する。この処理の際、標的分子は支持体上に固定化されたままである。それらは、次の工程ではじめて取外ずされ、脱保護される。
合成結合システムおよび共役体の合成支持体からの脱保護および取外しについての一般的プロトコール（ヒドラジン分解）：
上記のプロトコールからの湿ったＣＰＧ支持体を２４％水性ヒドラジン水和物と混合し、４℃で１８時間震盪する。ヒドラジンは、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ カートリッジ ０．５ｇ Ｗａｔｅｒｓ，Ｎｏ．２０５１５を用いる固相抽出により除去する。この目的のために、当該カートリッジは１０ｍｌのアセトニトリルで濯ぐことにより活性化する。５倍容量のトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＢ）ｐＨ７．０で希釈されたヒドラジン溶液は、次いで当該カラムに負荷すると、当該生成物が結合される。ヒドラジンはＴＥＡＢで洗浄することにより除去される。生成物は次いでＴＥＡＢ／アセトニトリル（１：２）で希釈される。あるいは、ヒドラジン耐性カラムを使用すれば、ヒドラジンはＲＰ−ＨＰＬＣにより除去することも可能である。ここで、Ｐｏｒｏｓ Ｒ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が有用なことが明らかになっている。溶出条件は、上記のものに相当する。生成物含有画分を合一し、真空で蒸発乾固する。分析および調製精製は、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより行う。ｐＤＮＡおよびその共役体については、ＤＮＡ合成化学に共通の条件（２５％溶液、５５℃、一晩）で脱保護のために水性アンモニアを使うことも可能である。
（実施例１．１）：4'ｐＲＮＡ2'−5'ＤＮＡ3'の共役体（図１Ｃ；図２Ｃ；図２Ｆ）
本合成は、所望のＤＮＡ配列を産生するための、３’−５’方向に標準固相ＤＮＡ合成で始められた。リンキング基または分枝基が所望されるならば、適切な合成ビルディングブッロクが、前記製造業者により指示された条件下で、当該生成物の５’端にカップルされた。当該ＤＮＡがリン酸を通じて直接ｐＲＮＡにリンクされる場合には（図２Ｃ）、リンカーホスホルアミダイトは使われなかった。次に、ｐＲＮＡの単量体ビルディングブッロクが、上記の特定の条件下でカップルされ、その結果、所望の長さおよび配列のＳＢＵ結合アドレスが得られた。標識共役体が所望された場合には、マーカーホスホルアミダイトが選択的最終工程で当該共役体にカップルされるか、または当該合成における初期カップル試薬として利用された。ここで、蛍光色素ホスホルアミダイトＣｙ３およびＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が有用であったが、ＤＮＡ合成から知られている任意の他の適当なホスホルアミダイト色素誘導体を使うことも可能である。当該共役体は、上記のように、仕上げられ、脱保護され、単離され、そして精製された。同様に、ｐＲＮＡおよび修飾核酸（例えば、２’−０−メチルＲＮＡ）の共役体を調製することが可能である。このために、２’−０−メチルホスホルアミダイトをｐＲＮＡの後にカップルする。当該核酸はまた場合により、下に示すように、その５’端でリン酸化された。この目的のために、リン酸を導入することについて当業者に知られているビルディングブッロクが使われた。
前記一般的プロトコールを適用すると、以下の共役体（太字＝ｐＲＮＡ；イタリック体＝ＤＮＡ）が得られた：
（実施例１．２）：5'ＤＮＡ3'−4'ｐＲＮＡ2'の共役体（図１Ａ；図２Ａ；図２Ｄ）
本合成は、上記のようにｐＲＮＡ合成で始められ、当該合成支持体上に所望のｐＲＮＡ ＳＢＵを産生した。リンキング基または分枝基が所望されるならば、適切な合成ビルディングブロックが、前記製造業者により指示された条件下で、当該生成物にカップルされた。上記のように、ｐＲＮＡがリン酸によって直接ＤＮＡにリンクされる場合には（図２Ａ）、別のリンカーは添加されなかった。次に、所望のＤＮＡ配列を合成するため、標準ＤＮＡホスホルアミダイトおよび合成サイクルが使われた。標識共役体が所望された場合には、マーカーホスホルアミダイトが、上記のように当該共役体にカップルされた。当該共役体は、上記のように、仕上げられ、脱保護され、単離され、そして精製された。同様に、２’０−メチルＲＮＡおよびｐＲＮＡの共役体も、ＤＮＡホスホルアミダイトの代わりに２’−０−メチルホスホルアミダイトを使えば得られた。
一般的プロトコールを適用すると、以下の共役体（太字＝ｐＲＮＡ；イタリック体＝ＤＮＡ）；イタリック体、下線＝２’−０−メチルＲＮＡ）をもたらした：
（実施例１．３）：3'ＤＮＡ5'Ｄ−4'ｐＲＮＡ2'の共役体（図１Ｂ；図２Ｂ；図２Ｅ）
この好ましい態様は、実施例１．２に記載のプロトコールに似せて行った。唯一の相違は、５’−３’方向にＤＮＡ鎖の組立てを可能にする、ＤＮＡ部分逆向きホスホルアミダイト（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）の合成のために使用したことである。実施例１．２におけるように、これもまた、遊離３’端をもつ共役体をもたらした。もし例えば、酵素的伸長反応（ＰＣＲ）のために、３’端が必要であれば、このリン酸にはマーカーを付着させてはならない。支持体結合色素で合成を開始することにより、または固相合成の開始に分子の合成の継続を可能にする標識アミダイトを用い、遊離３’リン酸をもつ標識共役体を調製することが可能である。その種のアミダイトはＣｙ３ホスホルアミダイト（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。
前記一般的プロトコールを適用すると、以下の共役体（太字＝ｐＲＮＡ；イタリック体＝ＤＮＡ）をもたらした：
（実施例１．４）：前形成された合成結合システムを核酸と共役させる例としてのｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体
修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドＩＬ４ＣｓｒＵ，
［SEQ ID NO. ８７］（図５）は、ｒｉｂｏ−Ｕ ＣＰＧ支持体上の標準ＤＮＡ合成により得、そして商業的ＤＮＡオリゴ供給業者（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ）から入手した。この核酸のアリコートを、適量の脱イオン水に溶解し、５ｍＭ溶液を得た。その溶液の２０μｌ（１００ｎｍｏｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフミクロ反応容器に入れた。１μｌの０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加した。当該容器は室温で暗所に１時間放置した。次いで過剰の過ヨウ素酸を、１μｌの０．５Ｍ亜硫酸ナトリウムを添加することにより除去した。１５分間後、１０μｌの１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４を添加し、そして得られた溶液を１．５ｍｌエッペンドルフミクロ反応容器に移したが、その容器中には、８．４ｎｍｏｌのヒドラジド修飾色素標識ｐＲＮＡオリゴ，
［SEQ ID NO. ８８］が予め蒸発乾固されていた。混合後、当該溶液を暗所で１時間放置した。仕上げ：当該生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣによれば、収率は、用いたヒドラジド−ｐＲＮＡオリゴに基づき８４％である。４．１ｎｍｏｌの共役体が単離されたが、それは４９％共役体の単離収率に相当する。当該共役体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより特徴解明を行った：分子量理論値：７２１０；分子量測定値７１８０（広シグナル）；保持時間：ＤＮＡ２０．４分；ヒドラジドｐＲＮＡ：４１．２分；共役体：３８．２分。
末端環状シスジオール（例えば、ＲＮＡ，アプタマーおよびアプタザイム）を含むすべての核酸は、本法により共役可能である。あるいは、リボヌクレオシドは、カップリング成分として使用するために、ＤＮＡ，ＰＮＡ，または他の核酸末端、またはＳＢＵ（例えば、ｐＲＮＡ）中に取込むことも可能である。
（実施例１．５）：前形成された合成結合システムを核酸と共役させる例としてのｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体
この方法のために、当該ＤＮＡはシスジオールを含まなければならないが、それはグリセリル支持体上に核酸を合成することにより供給が可能である、例えば：Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，バージニア、米国；カタログ番号２０−２９３３−４１（図６）。修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば：ＩＬ４ＣＳＧｌｙ，
［SEQ ID NO. ８９］を水に溶解し、そして１．５ｍｌエッペンドルフミクロ反応容器中で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させた。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを、亜硫酸ナトリウム溶液を添加することにより除去した。リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４を添加し、そして得られた溶液をヒドラジド修飾ｐＲＮＡオリゴ（例えば：
［SEQ ID NO. ９０］およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムと混合した。混合後、当該溶液を暗所に放置した。当該混合物をＨＰＬＣにより仕上げ、そして当該生成物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより特徴解明を行った。
（実施例１．６）複数の合成結合ユニットと核酸との共役：
オリゴヌクレオチドの固相合成で使用される分枝ビルディングブロックは文献から知られる（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ，Ｍ．Ｓ．；Ｕｄａｌｏｖａ，Ｉ．Ａ．；Ｂｒｉｄｇｍａｎ，Ａ．Ｊ．；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；２５，４４４７−４４５４（１９９７））。トリプル分枝ビルディングブロックのカップリング（Ｔｒｅｂｌｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９２２−９０）および配列
［SEQ ID NO. ９１］とともにまだ支持体に結合されているＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’端へのヒドラジドホスホルアミダイトのその後のカップリングは、３つの反応性ヒドラジド前駆体末端基を含む核酸をもたらした。当該ビルディングブロックは、実施例２．２に記載されるように、標準法により脱保護し、そして仕上げた。その生成物ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、実施例１．４における方法と同様に、一端にリボヌクレオチドビルディングブロックをもつｐＲＮＡ合成結合ユニットと反応させた。当該ｐＲＮＡは、リボ−Ｕ支持体上にＳＢＵを合成し、そして続く脱保護により得た。上述のプロトコールに従って、共役反応を行うと、所望の生成物が提供された（図８）。
（実施例２．１）：合成アドレスユニットを合成する例としての４’−ビオチン−ｐＲＮＡの産生（図４Ａ）
既述の方法に従って合成された１０マーｐＲＮＡアドレスユニットを、ジクロロ酢酸によるそのトリチル保護基を除くことによって、ＣＰＧ支持体上でまず脱保護した。ＤＣＩによるビオチンホスホルアミダイト（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）の活性化とカップリングおよびその後の酸化の後に、ビオチン誘導体は、かくして、ｐＲＮＡアドレスの４’端にホスホジエステル結合を経由して導入された。クロマトグラフィーによる精製および分析による特徴解明は、既述のプロトコールにより行う。
例えば、下記の実施例８に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験で利用される他のビオチン標識ｐＲＮＡ ＳＡＵｓは、上に示されたものと同様に調製された。
（実施例２．２）：合成アドレスユニットを合成する例としての４’−テトラヒドラジド−ｐＲＮＡの産生（図４Ｂ）
ｐＲＮＡ合成プロトコールに従って調製された１０マーアドレスユニットを、ジクロロ酢酸によりそのトリチル保護基を除くことによって、ＣＰＧ支持体上でまず脱保護した。ピリジニウム塩酸塩による対称分枝ホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）の活性化とカップリングおよびその後の酸化の後に、分枝ジオールは、当該ｐＲＮＡの４’端にホスホジエステル結合を経由して導入された。次に、ジエステルホスホルアミダイトをダブルカップルし、分枝テトラエステル結合アドレスをつくり、それは、シアノエチル脱保護および続くヒドラジン分解の後、直接反応され、当該テトラヒドラジドを与えた。
当該ジエステルホスホルアミダイト ジエチル５−［［［［ビス（１−メチルエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）ホスフィノ］オキシ］メチル］−１，３−ベンゼンジカルボン酸塩を調製するためのプロトコール：１．２９ｇ（５ｍｍｏｌ）のジエチル５−（ヒドロキシメチル）イソフタル酸塩［２５２．２７］（９８％，Ａｌｄｒｉｃｈ；ＣＡＳ１８１４２５−９１−２）を２０ｍｌの無水ジクロロメタンに室温で溶解し、そして２．５９ｇ（４０ｍｍｏｌ，４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミン［１２９．２５］および１．３ｇ（１１ｍｍｏｌ，１．１当量）の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト［２３６．６８］（Ａｌｄｒｉｃｈ；ＣＡＳ８９９９２−７０−１）と混合した。室温で１５分間後、薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１：４））は、当該反応の完了を示した。当該混合物を濃縮し、そして３０ｍｌの酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：３）と混合した。沈澱した塩酸塩は濾過により除去した。ろ液を濃縮し、そしてクロマトグラフィーカラムに直接かけた。酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１：４）による溶出は、１．６ｇ（７０％）のジエチル５−［［［［ビス（１−メチルエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）ホスフィノ］オキシ］メチル］−１，３−ベンゼンジカルボン酸塩を無色の油として与えた。Ｃ22Ｈ33Ｎ2Ｏ6Ｐ；1Ｈ−ＮＭＲ ８．５８（ｍ，１Ｈ，ａｒｏｍ．），８．２１（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍ．），４．８７−４．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ），４．４１（ｑ，Ｊ＝６．９８Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ2ｅｔｈｙｌ），３．９５−３．８０（ｍ，２Ｈ，２ｘ ＣＨｉ−Ｐｒ），３．７４−３．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ），２．６６（ｔ，Ｊ（Ｐ，Ｈ）＝６．４５Ｈｚ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ2−ａｒｏｍ），１．４１（ｔ，Ｊ＝６Ｈ，２ｘＣＨ3ｅｔｈｙｌ），１．２３−１．２０（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ3，ｉ−Ｐｒ）；31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ＝１４９．９４；13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ＝１６５．８（Ｃ＝Ｏ），１４０．２（Ｃ−ＣＨ2−Ｏ−Ｐ），１３２．１（２ｘＣａｒｏｍ．），１３１．１（２ｘＣ−Ｈａｒｏｍ），１２９．７（ＣＨａｒｏｍ），１１７．６（ＣＮ），６４．７（Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−ａｒｏｍ．），６１．４（２ｘＣＨ2ｅｔｈｙｌ），５８．６（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＮ），４３．４（２ｘＣ−Ｈｉ−Ｐｒ），２４．７（４ｘＣＨ3 ｉ−Ｐｒ），２０．５（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＮ），１４．４（ＣＨ3ｅｔｈｙｌ）；ＨＲＭＳ４５３．２１５６（［Ｍ＋Ｈ］+ Ｃ22Ｈ34Ｎ2Ｏ6Ｐ 理論値４５３．２１５４５）。クロマトグラフィーによる精製および分析による特徴解明は、上記のプロトコールに従って行った。
（実施例３．１）：能動的電子アレイ上のヒドラジド修飾ＳＡＵｓの固定化
実験は，ＮａｎｏＣｈｉｐ（商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｎａｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．サンジエゴ、米国）上で行った。ヒドラジド修飾ＳＡＵｓの固定化は、ヒドラジドと反応できる化学修飾をもつアレイを使用する。そのような使用のためのアレイ修飾は、（ＰＣＴ／ＵＳ００／２２２０５）に記載されているような活性化エステル修飾浸透層アレイである。ここで、支持材料の表面は、その中へＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル類が共重合されたポリアクリルアミドでコートされた。固定化効率は、いくつか（例えば４つ）のヒドラジドを一端にもつＳＡＵｓを使うことにより改良された（実施例２．２を参照）。ヒドラジド修飾ＳＡＵｓを、５００ｎＭの濃度に５０ｍＭヒスチジン緩衝液中に溶解し、２．２Ｖで３分間当該デバイス上の所望の場所に電子的にアドレスした。それらは、共有結合を形成するために活性化エステルとヒドラジドとを反応させることによって当該場所に付着された。
このようにして得られたアレイは、非共有結合ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介して固定されたＳＡＵｓをもつアレイと同様な仕方で共役体の固定化に使われた。
（実施例３．２）：能動的電子アレイ上のビオチニル化合成アドレスユニットの固定化
実験は，ＮａｎｏＣｈｉｐ（商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎおよびＮａｎｏＣｈｉｐ（商標）カートリッジ（Ｎａｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．サンジエゴ、米国）上で行った。アレイ上の合成アドレスユニットの固定化は、ＤＮＡについて製造業者により記述されているような標準電子アドレッシングプロトコールを用いた。つまり、ビオチニル化ｐＲＮＡアドレスユニットを、５００ｎＭの濃度に５０ｍＭ
β−ヒスチジン中に溶解した。この溶液を当該チップに適用し、そしてアドレスユニットを所望の場所へ電子的に向けた。この目的のために、所望のアレイ場所は、当該ＳＡＵｓの濃縮をもたらす電位で偏らされる。負に荷電した合成アドレスユニット、例えばｐＲＮＡｓについては、当該位置は正に偏向された。ｐＲＮＡおよびｐＤＮＡについての良好なアドレッシング操作は、出願人らの経験では、＋２．０Ｖで１分間のアドレッシングであった。
このようにして、または上のヒドラジド付着法により、得られた合成アドレスユニットのアレイは、普遍的に使うことが可能である。適用される共役体のセット次第で、そうしたアレイは特定の応用に基づくアレイになる。
（実施例４）：能動的電子アレイ上の１０の異なる共役体の選択的固定化
実施例８に記載されている合成結合システムから、実質的に直交性で、相互に有意に作用しない１０（Ｎ＝１０）システムを選択した（１０２ａ，ｂ；１０３ａ，ｂ；１０４ａ，ｂ；１０６ａ，ｂ；１０９ａ，ｂ；１１０ａ，ｂ；１１７ａ，ｂ；１１９ａ，ｂ；１２０ａ，ｂ；１２２ａ，ｂ）。固定化スケジュールおよびアドレッシングスケジュールは下の表に示す。
合成アドレスユニットは、ビオチン・ストレプトアビジンにより実施例３．２中のように、ＮａｎｏＣｈｉｐ（商標）上の場所に付着された。１０の異なるアドレスユニット（“ｂ”シリーズ）は、同一のアドレスユニットが１つの列の１０の場所の各々に固定されるように、列ごとに負荷された。１０アドレスユニットの各々が、１つの列にのみ負荷されることを確実にするため、１０回の能動的ＳＡＵ付着工程を、工程間にリンシング（濯ぎ、ｒｉｎｓｉｎｇ）を入れながら、連続的に行った。
使用した相補的結合ユニットは、１０アドレスユニットに相補的な１０ｐＲＮＡ配列（“ａ”シリーズ）であった。当該アレイ上での検出のために、結合ユニットは色素成分（Ｃｙ３）で２’端に標識した。当該合成結合システムの親和性は、１８０秒間、＋２．０Ｖの電圧を用いてチェックした。個々の結合ユニットの濃度は、５０ｍＭヒスチジン緩衝液中いずれの場合も１００ｎＭであった。各相補的結合ユニットは欄ごとに能動的にアドレスしたので、その結果、１回の電気的活性化で全１０アドレスユニットへの１つの結合ユニットの結合を調べることが可能であった。１０回の能動的アドレッシング工程を連続的に用いて（Ｍ＝１０）、それゆえ、１０アドレスユニットとのそれらのペアリング性質について１０合成結合ユニットをテストすることが可能であった。本並行（ｐａｒａｌｌｅｌ）アッセイのための時間は２時間であったが、表面プラズモン共鳴システム（実施例８）上での１０対合をアッセイするには５０時間を要した。ここで、作業工程の並行化の可能性により認識されるコード化の時間的利点は、直ちに明白になる。相補的結合アドレスを能動的に指令した後、当該チップを４０ｍｌの５０ｍＭ ＮａＣｌ ＨＢＳ緩衝液で洗い、そして次にＮａｎｏｇｅｎワークステーションリーダーで読取った。得られたフルオログラフを図１５に示す。所望のペアリングのみが強い蛍光を示している。図１５の表中の太い境界をもつ分野は、付着されたＳＡＵｓとアドレスされたＳＢＵｓとが相互に対応する場所に合成結合システムがある、Ｎａｎｏｇｅｎチップのそれらの位置を表している。
（実施例５）：合成結合システムを介する能動的電子アレイ上の捕捉／安定剤オリゴヌクレオチドの固定化
１００の異なる捕捉／安定剤オリゴヌクレオチドを、次のように能動的電子アレイ上に固定化する：まず１０の異なるＳＡＵｓ（Ｎ＝１０）を用いて固定ＳＡＵｓのアレイを作製する。欄の１０アレイ場所（図１２参照）は、いずれの場合も、同一のＳＡＵｓを供給される。そのようなアレイの調製は、実施例３．１および実施例３．２に記載されている。
次に、捕捉／安定剤オリゴヌクレオチドおよびＳＢＵｓの共役体を、実施例１に記載のように、調製する。各オリゴヌクレオチドは特定のＳＢＵアドレスをもつ。当該共役体は各々が１０共役体のセットに組合わされ（合計１０セット、Ｍ＝１０）、各ＳＢＵは各セット中でそれに共役された特定のＮＡをもつ。当該セットを１０ｎＭ（１共役体当り）の濃度に５０ｍＭヒスチジン緩衝液に溶解し、１０位置の最初のセットに電子的に指示される。各ＳＡＵはアドレスされた場所のセット中に一度だけ現れることを、ここで注意する。これを確かめる容易な方法は、図１２に示されるように、ＳＡＵｓを欄に付着させ、共役体のセットを列にアドレスすることによる。電子指示は＋２．１Ｖで１２０秒間行う。当該セットは、セットのすべての位置について、連続的に、一部並行的に、または同時に、のいずれによっても当該位置に指示されてもよい。ＳＡＵおよびＳＢＵの特異的認識は、各個々の場所上で符合する認識配列をもつ共役体のみを固定化する：すなわち、当該セットは個々の共役体へ選別され、そして個々の共役体は特異的アレイ場所に固定化される。次いで、当該アレイは、５０ｍＭヒスチジン緩衝液で洗浄され、そして次のセットの共役体が適用される。再び１０位置への指示と洗浄が行われる。１０サイクル（Ｍ＝１０）の後、１００位置が異なる捕捉／安定剤オリゴヌクレオチドにより占められ、そして当該アレイは、ハイブリッド形成または他のアッセイに使うことが可能である。１００サイクルを要する、１００の個々の核酸をアレイに連続的に負荷することに比べて、サイクル数が９０％減少する。
このようにして得られた核酸アレイを用いて、遺伝子発現、ＳＮＰ，およびＳＴＲアッセイのような、アレイ位置上に核酸の直接固定化を介して調製されるアレイを用いて行うことができる、すべての実験およびアッセイを行うことが可能である。
（実施例５．２）：ｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の混合物の並行固定化：固定化の感度：
能動的電子アレイ上に、５つのｐＲＮＡ ＳＡＵｓ（“ｂ”シリーズ，配列１０２ｂ，１０３ｂ，１０４ｂ，１０６ｂ，１０９ｂ）を、前述のように（実施例２．１）、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を用いて列に付着させた。標準ストレプトアビジン／アガロースＮａｎｏＣｈｉｐカートリッジを用いる。付着条件：５０ｍＭヒスチジン ５００ｎＭ ＳＡＵ，２．０Ｖ，６０秒。
１０のｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の５つの異なる混合物を、個々に合成された共役体（実施例１．２）を各５０ｎＭで混合することにより、つくった。各混合物内で、９の共役体はＣｙ３標識し、そして１つは非標識であった。各混合物は、５つの異なるｐＲＮＡアドレスをもつ場所の欄に同時にアドレスされた。アドレッシング条件は、５０ｍＭヒスチジン、各共役体につき５０ｎＭ，２．０Ｖ，１８０秒であった。
混合物１：ＤＴＤ−１０２ａ；ＥＨ１−１０３ａ−Ｃｙ３；ＣＹＰ１９−１０４ａ−Ｃｙ３；１７８８５０−１０６ａ−Ｃｙ３；１９２６１０−１０９ａ−Ｃｙ３；１９５０８８−１１０ａ−Ｃｙ３；ＥＰＨＸ２−１１７ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１２−１１９ａ−Ｃｙ３；ＧＳＴＡ１−１２０ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１Ｂ−１２２ａ−Ｃｙ３
混合物２：ＤＴＤ−１０２ａ−Ｃｙ３；ＥＨ１−１０３ａ；ＣＹＰ１９−１０４ａ−Ｃｙ３；１７８８５０−１０６ａ−Ｃｙ３；１９２６１０−１０９ａ−Ｃｙ３；１９５０８８−１１０ａ−Ｃｙ３；ＥＰＨＸ２−１１７ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１２−１１９ａ−Ｃｙ３；ＧＳＴＡ１−１２０ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１Ｂ−１２２ａ−Ｃｙ３
混合物３：ＤＴＤ−１０２ａ−Ｃｙ３；ＥＨ１−１０３ａ−Ｃｙ３；ＣＹＰ１９−１０４ａ；１７８８５０−１０６ａ−Ｃｙ３；１９２６１０−１０９ａ−Ｃｙ３；１９５０８８−１１０ａ−Ｃｙ３；ＥＰＨＸ２−１１７ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１２−１１９ａ−Ｃｙ３；ＧＳＴＡ１−１２０ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１Ｂ−１２２ａ−Ｃｙ３
混合物４：ＤＴＤ−１０２ａ−Ｃｙ３；ＥＨ１−１０３ａ−Ｃｙ３；ＣＹＰ１９−１０４ａ−Ｃｙ３；１７８８５０−１０６ａ；１９２６１０−１０９ａ−Ｃｙ３；１９５０８８−１１０ａ−Ｃｙ３；ＥＰＨＸ２−１１７ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１２−１１９ａ−Ｃｙ３；ＧＳＴＡ１−１２０ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１Ｂ−１２２ａ−Ｃｙ３
混合物５：ＤＴＤ−１０２ａ−Ｃｙ３；ＥＨ１−１０３ａ−Ｃｙ３；ＣＹＰ１９−１０４ａ−Ｃｙ３；１７８８５０−１０６ａ−Ｃｙ３；１９２６１０−１０９ａ；１９５０８８−１１０ａ−Ｃｙ３；ＥＰＨＸ２−１１７ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１２−１１９ａ−Ｃｙ３；ＧＳＴＡ１−１２０ａ−Ｃｙ３；ＮＡＴ１Ｂ−１２２ａ−Ｃｙ３
非結合材料を洗い去り、そして当該アレイのＣｙ３蛍光をＮａｎｏＣｈｉｐ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ上に画像する。結果を次表にまとめて示す（図１８参照）。混合物内の非標識共役体のＳＡＵ／ＳＢＵに相当する欄当りの１パッドは低蛍光を示した：これらの位置に９つの他の共役体の非特異的結合がほとんどなかったことを、これは証明していた。

１ ２ ３ ４ ５
１０２ｂ ９７．２ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６
１０３ｂ １０４８．６ ２１１．１ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６
１０４ｂ １０４８．６ １０４８．６ ２３３．０ １０４８．６ １０４８．６
１０６ｂ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６ １７１．３ １０４８．６
１０９ｂ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６ １７９．６
註：１０４８．６の蛍光値は飽和蛍光を示す。真の値はそれより高い。

第２工程として、当該共役体のＤＮＡ部分に相補的なＣｙ５標識ＤＮＡ鎖の混合物（Ｃｙ５−ＤＴＤ−Ｃｏｍｐ，Ｃｙ５−ＥＨ１−Ｃｏｍｐ；Ｃｙ５−ＣＹＰ１９−Ｃｏｍｐ，Ｃｙ５−１７８８５０−Ｃｏｍｐ；Ｃｙ５−１９２６１０−Ｃｏｍｐ）を、固定化共役体の欄に同時にアドレスした（ＤＮＡ当り２５ｎＭ，２．０Ｖ，１８０秒）。再び、非結合材料を洗い去り、そしてＣｙ５蛍光を画像した。すべての位置における蛍光シグナルは、共役体が相補的ＤＮＡを捕捉することを示した。非標識共役体をもつパッドもＤＮＡ補体を捕捉したことは、当該標識がハイブリッド形成能率に何ら影響しなかったことを証明している。

１ ２ ３ ４ ５
１０２ｂ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６ １０４８．６
１０３ｂ ７２４．６ ６６３．４ ６３１．１ ８６８．７ １０４８．６
１０４ｂ ６６６．０ ６１１．３ ５２５．１ ５５２．９ ５５７．４
１０６ｂ ６１１．２ ６９２．６ ４８８．１ ５４０．４ ６８２．６
１０９ｂ ５４１．６ ６１４．７ ５５２．４ ６１１．１ ６６８．９
註：１０４８．６の蛍光値は飽和蛍光を示す。真の値はそれより高い。

配列：
（実施例５．３）：ｐ−ＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の混合物の並行固定化：１０ＳＡＵ／ＳＢＵとの固定化の選択性
工程１：ｐ−ＲＮＡ合成アドレスユニット（ＳＡＵ）アレイ構築
能動的電子アレイ上に、１０ｐ−ＲＮＡ ＳＡＵｓ（“ｂ”シリーズ，配列１０２ｂ，１０３ｂ，１０４ｂ，１０６ｂ，１０９ｂ，１１０ｂ，１１７ｂ，１１９ｂ，１２０ｂ，１２２ｂ）を、ビオチン／ストレプトアビジン付着により列に付着した（実施例２．１）。標準ストレプトアビジン／アガロースＮａｎｏＣｈｉｐカートリッジを用いた。付着条件：５０ｍＭヒスチジン ２５０ｎＭＳＡＵ，２．０Ｖ，６０秒。各列が異なるｐ−ＲＮＡアドレスをもち、各列に１０の同一ｐ−ＲＮＡアドレスをもつアレイが得られた。
工程２：ＤＮＡアレイ構築
１０ｐ−ＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の１つの混合物を、個々に合成された共役体（実施例１．２）を各４０ｎＭ混合することにより、つくった。当該共役体混合物内で、各ＤＮＡ配列は、特定のｐ−ＲＮＡ ＳＢＵ（ＤＴＤ−１０２ａ、ＥＨ１−１０３ａ、ＣＹＰ１９−１０４ａ、１７８８５０−１０６ａ、１９２６１０−１０９ａ、１９５０８８−１１０ａ、ＥＰＨＸ２−１１７ａ、ＮＡＴ１２−１１９ａ、ＧＳＴＡ１−１２０ａ、ＮＡＴ１Ｂ−１２２ａ）によりコードされた。当該共役体混合物は、１０の異なるｐ−ＲＮＡアドレスをもち１０の場所のセットをもつ１つの欄の１０パッド全部に同時に能動的にアドレスされた。１０の欄は同じ共役体混合物で連続的にアドレスされた。註：ＤＮＡ−ｐ−ＲＮＡ共役体の１０の異なる混合物を用いることにより（ここで、各混合物内で各ＤＮＡは異なるｐ−ＲＮＡ− ＳＢＵによりコードされるが、異なる混合物では異なるＤＮＡ’ｓは反復性ｐ−ＲＮＡ ＳＢＵ’ｓでコードされる）、１つの共役体混合物の代わりに、本実験におけるのと同じ数のアドレッシング工程および同じ時間内で、１００の異なるＤＮＡ配列のアレイを構築することが可能である。アドレッシング条件は、５０ｍＭヒスチジン、各共役体につき４０ｎＭ，２．０Ｖ，１８０秒であった。当該共役体混合物は、二次構造および推定ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を分裂させるために、アドレッシングの直前に、９５℃で５分間加熱され、そしてアイスバスで急速に冷却された。当該混合物中の共役体の配列は、次のとおりであった：
（太字：ｐ−ＲＮＡ；イタッリク体：ＤＮＡ）

能動的電子Ｎａｎｏｇｅｎ Ｃｈｉｐ上に固定化されたＤＮＡ捕捉のアレイが得られた。当該チップの各列内に、同じＤＮＡ捕捉配列が固定化された。
工程３：プロービング
ＤＮＡ捕捉配列の固定化の選択性を示すために、ＳＢＳｓにより固定化されたＤＮＡ捕捉配列に相補的な、非標識、Ｃｙ３、およびＣｙ５標識のＤＮＡレポーター配列の１０混合物でチップをプローブした。
当該混合物は次のとおりであった：
ａ） 各混合物内で１つのＤＮＡレポーターが非標識であった（混合物Ｎｏ．１：レポーターＮｏ．１；混合物Ｎｏ．２：レポーターＮｏ．２；・・・・混合物Ｎｏ．１０：レポーターＮｏ．１０）
ｂ） 各混合物内ですべての第２レポーター配列は同じタイプの蛍光色素で標識され、そして当該混合物内で、隣接レポーターは異なる色素をもつ。
混合物１：ＤＴＤｃｏｍｐ，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ３
混合物２：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＨ１ｃｏｍｐ，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ５
混合物３：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ３
混合物４：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１７８８５０ｃｏｍｐ，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ５
混合物５：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９２６１０ｃｏｍｐ，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ３
混合物６：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９５０８８ｃｏｍｐ，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ５
混合物７：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ３
混合物８：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ５
混合物９：ＤＴＤｃｏｍｐＣｙ５，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ−Ｃｙ３
混合物１０：ＤＴＤｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＥＨ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＣＹＰ１９ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１７８８５０ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，１９２６１０ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，１９５０８８ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＥＰＨＸ２ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１２ｃｏｍｐ−Ｃｙ５，ＧＳＴＡ１ｃｏｍｐ−Ｃｙ３，ＮＡＴ１Ｂｃｏｍｐ
レポーター混合物は能動的にアドレスした。１０の異なるＤＮＡ捕捉のセットを表す１つの欄の全１０パッドを、１つのレポーター混合物とともに並行してアドレスした。１０の欄を、それぞれ異なるレポーター混合物とともに連続してアドレスした。アドレッシング条件は、５０ｍＭヒスチジン、各共役体につき２５ｎＭ，２．０Ｖ，１８０秒であった。当該レポーター混合物は、二次構造および推定ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を分裂させるために、アドレッシングの直前に、９５℃で５分間加熱され、そしてアイスバスで急速に冷却された。当該混合物中のレポーターの配列は、上の表に記されたとおりであった。非結合レポーターオリゴヌクレオチドを除去するため、チップは高塩類緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、５００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．０；７５μｌ／秒で２０工程 各３秒間）で洗浄した。
このように、隣接レポーターが異なる蛍光色素で標識される結合レポーターオリゴヌクレオチドのアレイを作製した。対角線の位置（１，１；２，２；・・・１０，１０）では、レポーターは非標識であった。
工程４：蛍光リードアウト
チップはＣｙ３（赤色）およびＣｙ５（緑色）両チャネルにおいて低ゲイン（１２８μｓ）で画像する：

フレーム１：緑色（Ｃｙ３チャネル）
列
欄 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ｓ
1 31 461 38 484 38 496 40 518 53 585
2 572 47 529 65 535 66 656 69 783 63
3 58 267 87 269 98 294 89 298 101 341
4 553 74 656 84 643 83 658 69 657 65
5 32 568 55 717 68 727 66 722 77 659
6 573 x 586 72 863 77 859 89 826 81
7 39 352 62 448 77 500 67 525 72 400
8 466 75 641 115 722 111 711 88 670 97
9 58 478 94 576 102 650 107 645 92 582
10 456 90 455 93 488 99 527 107 559 63
註：位置６−２は基準電極であり、アドレッシングには使用されない

フレーム１：赤色（Ｃｙ５チャネル）
列
欄 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ｓ
1 14 15 583 16 467 15 527 15 644 16
2 14 17 19 606 30 542 28 667 30 720
3 189 20 21 34 156 36 158 42 177 36
4 15 414 22 18 18 415 25 448 28 490
5 336 19 358 18 18 17 458 23 496 23
6 15 x 22 686 22 17 20 723 34 717
7 356 31 411 38 484 29 22 28 484 34
8 20 468 41 528 46 542 32 27 26 497
9 331 35 411 34 454 38 485 34 23 24
10 19 388 43 345 47 351 39 403 23 16
註：位置６−２は基準電極であり、アドレッシングには使用されない

当該アドレッシングパターンが使われれば、蛍光パターンはアレイ上の蛍光の予想した場所と符合する。これは下記を証明している：
１） 共役体の混合物は並行にアドレスされるが、各ＤＮＡ捕捉配列は、そのｐ−ＲＮＡ ＳＢＵ／ＳＡＵ認識により規定されるようにアレイ上の特定のパッド（場所）に固定化される
２） 並行にアドレスされても、各ＤＮＡレポーターオリゴヌクレオチドはその符合するＤＮＡ捕捉により特異的に結合される
（実施例５．４）：ＳＮＰ決定における固定化核酸の使用
さまざまなアッセイフォーマットへの合成結合システム固定化核酸の実用的応用の証明として、一塩基多型（ＳＮＰ）タイプの実験を、ＮａｎｏＣｈｉｐ（商標）デバイス上で固定化ｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体を用いて行った。ＳＮＰ識別アッセイフォーマットは当該デバイス上では標準であり、そしてこの特別のバリアントは、野生型と変異体の核酸とをよりよく識別するために、塩基スタッキングプローブを利用する。ＰＣＲアンプリコンの代わりに、合成オリゴヌクレオチドを標的として用いた。
野生型標的（合成）
変異体標的（合成）
捕捉／安定剤３’ｐ−ＲＮＡ−１０２ａ
野生型レポーター（５’Ｃｙ３）
変異型レポーター（５’Ｃｙ５）
ｐ−ＲＮＡ合成結合アドレス（実施例２．２からのＨ４−１０２ｂ）を、実施例３．１に記載されているようにＮａｎｏＣｈｉｐカートリッジの4つの位置上に固定した。捕捉／安定剤ＤＮＡ−ｐ−ＲＮＡ共役体を、全4位置にアドレスした。共役体は特異的ｐ−ＲＮＡ相互作用により当該表面に結合し、チップ表面上にに固定化された一本鎖ＤＮＡ捕捉／安定剤をもたらした。捕捉のためのアドレッシング条件は、５０ｎＭ共役体；５０ｍＭヒスチジン；２．０Ｖ，１２０秒であった。野生型標的配列は、チップの位置＃１にアドレスされた（４０ｎＭ ＤＮＡ；５０ｍＭヒスチジン；２．０Ｖ，１２０秒）。ヒスチジン緩衝液で非結合材料を洗浄後、単一塩基変異をもつ変異体ＳＮＰ標的を、同じ条件でチップの位置＃２にアドレスした。位置＃３には野生型と変異体標的の１：１混合物をアドレスした。位置＃４には野生型と変異体標的の１：４混合物をアドレスする。
レポーティングは、当該チップの全位置にＣｙ３標識野生型レポーターおよびＣｙ５標識変異体レポーターの混合物を受動的にハイブリッド形成させることにより、行う（５００ｎＭレポーター、５０ｍＭリン酸塩 ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌで）。高塩類緩衝液（５０ｍＭリン酸塩 ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄後、４つのチップ位置の蛍光をＣｙ３およびＣｙ５チャネルで測定する。当該Ｃｙ３は標準化し（位置＃１におけるＷＴ（野生型）を１００％）、そして変異体ＳＮＰ標的のＣｙ５シグナルを標準化する（位置＃２で１００％）。
次のシグナルが測定される：

位置 １ ２ ３ ４
試料 ＷＴ ＳＮＰ ＷＴ／ＳＮＰ１：１ ＷＴ／ＳＮＰ１：４
Ｃｙ３シグナル １００ １ ３０ ７
（１＝１００）
Ｃｙ５シグナル １ １００ ２０ ６３
（２＝１００）

（実施例６）：増幅核酸の固定化
増幅核酸は、合成結合ユニットおよび増幅核酸の共役体を用いることにより、固定化される。そうした共役体を得る１つの方法は、下に記載するように、酵素的増幅のためのプライマーとしてＳＢＵｓおよび核酸の共役体を用いることによる。核酸の典型的な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），またはＷｅｓｔｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３９（３）１０９７−１１０４（２００１））により記載されるような等温法である。そうした方法で使われるプライマーが共役体であるならば、増幅された核酸がＳＢＵにリンクされた共役体が得られる。
この種の共役体は、捕捉／安定剤共役体について上に説明したアドレッシングプロトコールにおける共役体を用いることにより、支持材料上に固定化される：増幅反応後、共役体は、各ＳＢＵが一度だけ生じるセットを形成するように、望みどおりに組合わせられる。当該共役体は脱塩（ＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎカラム）され、５０ｍＭヒスチジン緩衝液で２．５から１０ｎＭの終濃度にまで希釈される。当該共役体は、製造業者のプロトコールに従ってＮａｎｏｇｅｎ機器上所望の場所へ指示される（＋２．０Ｖ；３分間）。ＳＢＵおよびＳＡＵの特異的認識および結合は、当該共役体を固定化し、そのため結果として、増幅された核酸のアレイが得られる。このアレイを用いて、遺伝子発現およびＳＮＰアッセイのような、アレイ位置上に核酸アンプリコンの直接固定化により調製されるアレイを用いて行うことが可能な、すべての実験およびアッセイを行うことが可能である。
（実施例７）：遺伝子発現研究のための増幅核酸の固定化
特定の核酸、遺伝子のｍＲＮＡ、の相対的頻度の問題は、遺伝子発現研究の中心である。この目的のために、ｍＲＮＡｓが組織または細胞から単離され、そしてそれらの特定のセクションが増幅される。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード、１９９９）に記載のように、組織から単離され、そして特定の核酸配列（遺伝子）が、特定のビオチニル化プライマーで増幅される。核酸およびＳＢＵｓの共役体が代わりにプライマーとして使われるならば、コード化された増幅産物が適切な種用に得られる。増幅反応は、記述のプロトコールに従って、各時点、段階、または集団ごとに個々に行われる。同一の遺伝子配列で、異なる時点、段階、または集団からのものは、異なるＳＢＵｓでコード化される。複数の配列を同時に調べる場合、当該核酸は多重増幅反応に従って同時に増幅されてもよい。増幅後、共役体は下記のようにセットに組合わせられる、
ａ） 比較される予定の１つの種のすべての時点、段階、または集団は、１つのセットにまとめられる（各場合で異なるＳＢＵで）、そしてまた
ｂ） 各ＳＢＵはどの１つのセット中でも一度だけ生じる。
付着された合成アドレスユニット（ＳＡＵ）のアレイが、実施例３．１および３．２（図１３Ｂを参照）に記載の方法に従って調製される。このアレイ上で当該セットは、セット中に含まれるＳＢＵｓに相補的なＳＡＵｓの場所へ、電圧（＋２．０Ｖ，３分間）をかけることにより、向けられる。これに関連して、１つの遺伝子のＳＢＵｓに相補的なＳＡＵｓをもつ少なくともそれらの場所は、同時にアドレスされる。その結果、比較される予定の１つの遺伝子の時点、段階、または集団は、同一の条件で固定化されることが可能である。それらのアレイ位置に結合されたアンプリコンは、次いで、遺伝子アンプリコンに相補的な標識核酸とのハイブリッド形成により検出される。
（実施例８）：１４の異なるｐＲＮＡアドレスユニット／結合ユニットペアでの多重ＳＰＲ実験における合成結合システムの結合の安定性および選択性の検出
記載の全ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ３．１ソフトウェアにより、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，スエーデン）製のＢＩＡｃｏｒｅ ２０００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ中で行った。記録されたセンソグラムは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１ソフトウェアを用いて評価および処理をした。ビオチニル化ｐＲＮＡアドレスユニットを、ＢＩＡｃｏｒｅチップ“Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ”の表面に付着させた。各チップは、固定化用および検出用の両方に利用できる４つの“チャネル”（センサー表面をもつ流体導管）を含む。使用した緩衝液系はＢＩＡｃｏｒｅ標準緩衝液ＨＢＳ−ＥＰであった。使用した各センサーチップは、アドレスユニットの結合の前に清浄処理を受けたが、そのためその後は全４チャネルで一定のベースラインが得られた。
実験で最適使用できるように当該Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐをきれいにするために、次の工程を含むプロトコールを開発した：
１． ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１０分間洗浄（５μｌ／分）
２． １０ｍＭ ＮａＯＨの１分間注入（５μｌ／分）
３． ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で５分間洗浄（５μｌ／分）
４． 工程１から３を２回反復
ｐＲＮＡ合成アドレスユニットの固定化：
４’ビオチンをもつ“ｂ”配列をもつビオチニル化ｐＲＮＡアドレスユニット（実施例２．１におけるように作製）を、当該機器の製造業者により提供されたプロトコールを用いてＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ表面に固定した。各チャネル（ＢＩＡｃｏｒｅチップ上の位置）は、このようにして規定のアドレスユニットを提供される。これを確実にするために、付着工程は、４チャネルについて連続的に行う必要があった。表面の結合能率は、アドレスユニットを別々に５００ｍＭ ＮａＣｌ ＨＢＳ−ＥＰ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ＢＩＡｃｏｒｅ緩衝液１５０ｍＭ ＮａＣｌ ＨＢＳ−ＥＰの代わりに）に溶解することにより、改善された。合成アドレスユニットの濃度は常に１００ｎＭであった。
各チャネルは２９５Ｋで２分間、５μｌ／分の流速で調製されたが、その結果、固定化後約７００−８００ＲＵ（共鳴単位）の物質が結合された。結合後、各チャネルはＨＢＳ−ＥＰ標準緩衝液でさらに１０分間洗浄した。このようにして、チップ当り４つの異なるアドレスユニットを結合することが可能であった。１４の異なるアドレスユニットをアッセイするために、それゆえ、４チップ（４アドレスユニットをもつ３チップおよび２アドレスユニットをもつ１チップ）を使う必要があった。各チップは常に同一プロトコールおよび緩衝液で処理した。
表面への相補的結合ユニットの結合：
相補的合成結合ユニットをＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐの４チャネル全部へ注入したので、その結果、基質の１注入を用いて、4合成アドレスユニットの、結合ユニットに対するそれらの親和性を直接テストすることが可能であった。相補的結合ユニットの結合は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、３０μｌ／分の流速、２９５Ｋおよび２分間の注入時間で調べた。１４相補的結合ユニットの濃度は常に３００ｎＭであった：当該溶液は別々に調製した。各注入後、続いて２０分間の洗浄工程を行い、結合アドレスの結合／親和性の強度を推定できるようにした。個々の共役体の結合をテストした後、当該共役体は、１５ｍＭ ＮａＯＨでＳＡＵ／ＳＢＵ相互作用を分裂させることにより、取去った。引続き、当該チップは次の注入の準備ができた；すなわち、支持材料の表面は再生され、さらなるアッセイに利用可能になった。合成結合ユニットに対する親和性について各合成アドレスユニットを調べるため、当該プロトコールを１チップ上で１４回行った。全４チップについては、したがって、当該プロトコールを６４回行う必要があった。
４チャネル上のＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐの結合プロトコール：
１． 相補的結合ユニットの２分間注入ｘ（３０μｌ／分）＊
２． ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で２０分間洗浄（３０μｌ／分）
３． １０ｍＭ ＮａＯＨの１分間注入（５μｌ／分）
４． ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で５分間洗浄（５μｌ／分）
５． １０ｍＭ ＮａＯＨの１分間注入（５μｌ／分）
６． ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で２０分間洗浄（３０μｌ／分）
７． 工程１から６を１３回反復
それらの親和性および特異性について調べた合成結合ユニットおよび合成アドレスユニットの名前は図１４に示す。数は結合システムの名前を表す；本実験中の“ｂ”はＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐの表面に固定された合成アドレスユニットであった；本実験中の“ａ”はアドレスユニットへのその結合が示された合成結合ユニットであった。合成アドレスユニットは、実施例２．１に記載の方法に従ってｐＲＮＡとして合成され、そして精製された。
ＳＰＲ結合研究の結果を図１４に示す。対角線は合成結合システムの特異的結合を明らかに示している。対角線を外れると、ＳＢＵｓの大部分は、非対応のＳＡＵｓとは相互作用しない、またはしても、それらの対応するＳＡＵとの相互作用よりずっと低い程度に過ぎない。これらの配列は相互に“直交性”である。対角線外で、少数の位置、例えば１１８および１１９ペアで好ましくない相互作用が現れている。これら２つのＳＢＳ配列は相互に僅かに直交的であるに過ぎない。そうした交差反応を示す合成アドレスユニットおよび合成結合ユニットの組合わせは、特定の実験のために、または特定のアレイの構築のために、必要であれば、避けることは可能である。
（実施例９）：ＰＣＲ反応におけるｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の使用
ＰＣＲ反応のために、増幅反応中のプライマーとして役立つ２つの異なるｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体のセット（セット１およびセット２）を使用した。固相合成によるプライマーの調製は、実施例１．１に記載されている。これらの新規プライマーの助けを借りて、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）からのα−フェトプロテインの遺伝子からの規定の配列セクションを増幅し、単離した。当該遺伝子のｃＤＮＡをここでは増幅に使用した。プライマー構築体は次の配列をもっていた：
そこから当該配列が増幅されたα−フェトプロテイン遺伝子ｃＤＮＡの配列は、下記のとおりである：
プライマーセット１を用いて予想される増幅遺伝子断片は、配列中に下線をしてある。

増幅プロトコール：
当該増幅のために、４μｌのｄＮＴＰｍｉｘ（２．５ｍＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ），２．５μｌのＦｅｔｏ１−１０２ａ（ｒｅｖ．）（１０μＭ），２．５μｌのＦｅｔｏ１（ｆｏｒ．）（１０μＭ），１μｌのｔａｑ−ポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）および２μｌの、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓから単離されたｃＤＮＡを、３０μｌのＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ）、５μｌの１０ｘｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＤＮＡ−ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ），３μｌのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加した。ＰＣＲ反応には、当該５０μｌ混合物を次の増幅サイクルに付した：９５℃で２分間のプレインキュベーション；９４℃（１５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）で３５サイクルＰＣＲおよび最後に７２℃（７分）。当該増幅の完了後、反応混合物を移し、そして４℃で貯蔵した。
増幅は、プライマーセット１および２を用い、α−フェトプロテイン遺伝子の発現の異なる段階について行った。それゆえ、マウス胎児肝臓中でのマウスα−フェトプロテイン遺伝子の発現は、８日目および１４日目の発生段階について、新規プライマーを用いて決定した。対照として、標準ＤＮＡプライマーを用いて並行反応を実施し、比較のために、アガロースゲル上で分析した（図２２参照）。遺伝子発現の分析のために、試料（２０μｌ）をＰＣＲ混合物から移し、２μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）と混合し、そしてバンドを１．７％アガロースゲル上で分離した。
図２２に示すように、Ｆｅｔｏ１およびＦｅｔｏ２特異的増幅で、当該遺伝子の産物が共役体プライマーを用いて形成されているが、なお常に当該産物はＤＮＡプライマーでも得られる。逆にＤＮＡプライマーが産物をつくらないときは常に（例えばＦｅｔｏ２ｄ８）、共役体プライマーは産物をつくらず、非特異的な増幅は生じていないことを示している。共役体プライマーを濃度を次第に低下させ用いた、Ｆｅｔｏ１−１０２ａ（ｒｅｖ．）の希釈系列は、比較的低量のプライマーを用いれば、プライマー二量体が現れないことを示している。
加えて、当該ＰＣＲ反応のＳＢＵ共役体は、実施例４におけるものと類似の操作で、ＮａｎｏＣｈｉｐ（商標）上のＳＢＵｓにより固定化が可能であった。
（実施例１０）：中規模ＰＣＲ（５００μｌ反応）におけるｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の使用
特別の応用のためには、より多量のコード化増幅核酸が必要である。次の例は、比較的大きなＰＣＲ混合物（５００μｌ）中のｃＤＮＡライブラリーからのマウスα−フェトプロテイン遺伝子の断片のプライマー増幅のためのｐＲＮＡ−ＤＮＡ共役体の使用を説明する。実施例９に記載のように、同一のプライマーセットを用い、次の増幅プロトコールを適用した。
当該増幅のために、４μｌのｄＮＴＰｍｉｘ（２．５ｍＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ），２５μｌのＦｅｔｏ１−１０２ａ（ｒｅｖ．）（１０μＭ），２５μｌのＦｅｔｏ１（ｆｏｒ．）（１０μＭ），１０μｌのｔａｑ−ポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）および２０μｌの、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓからのｃＤＮＡライブラリーを、３３６μｌのＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ）、５０μｌの１０ｘｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＤＮＡ−ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ），３０μｌのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加した。ＰＣＲ反応には、当該５００μｌ混合物を次の増幅サイクルに付した：９５℃で２分間のプレインキュベーション；９４℃（１５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）で３５サイクルＰＣＲおよび最後に７２℃（７分）。当該増幅の完了後、反応混合物を移し、そして４℃で貯蔵した。
実施例９と同様に、分画のためにアガロースゲル電気泳動を行った。結果は図２２Ｂに示す。得られた遺伝子断片を、Ｑｕｉａｇｅｎ精製キットの助けを借りて精製し、そして引続き配列決定をした。所望の配列の増幅が確認された。
（実施例１１）：Ｔ４ＲＮＡリガーゼによる核酸との共役体のライゲーション
Ｔ４ＲＮＡリガーゼによる、５’−リン酸−（３’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ）−ｐＲＮＡハイブリッド分子（ドナー）およびＲＮＡ（アクセプター）の間の酵素的カップリングを以下に説明する。ライゲーション反応の背景については、Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ．：Ｎａｔｕｒｅ，２７５，５６０−５６１（１９７８）またはＥｎｇｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ．；Ｂｒｕｃｅ，Ａ．Ｇ．；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５（１），６５−７４（１９８０）またはＲｏｍａｎｉｕｋ，Ｐａｕｌ Ｊ．；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏｌｋｅ Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，５２−９（１９８３）を参照されたい。本反応では、ＲＮＡ−ｐＲＮＡハイブリッド分子の５’−リン酸とアクセプターＲＮＡの３’ＯＨ基との間にリン酸ジエステル結合が形成される。使われたアクセプターＲＮＡは、５’Ｔ７プロモーターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用い、ＤＮＡ鋳型からに従いインビトロ転写により調製した。
次のプライマーを用いるＰＣＲによる（アクセプターＲＮＡを作製するための）インビトロ転写鋳型の調製：
１μＭプライマー順向（オリゴヌクレオチド＃１），１μＭプライマー逆向（オリゴヌクレオチド＃２），０．２μＭ鋳型（オリゴヌクレオチド＃３），２ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（２５℃でｐＨ９．０），０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，０．０５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から成るＰＣＲ反応混合物を、次の温度プログラムに従う２０サイクルにわたるＰＣＲ増幅に用いた：
６０秒 ９５℃
３０秒 ９５℃ ｜
３０秒 ５３℃ ｜２０サイクル
６０秒 ７２℃ ｜
１２０秒 ７２℃
アクセプターＲＮＡを次いでインビトロ転写により当該鋳型から調製した。未精製ＰＣＲ産物を、インビトロ転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）大規模ＲＮＡ産生システムＴ７）に対するＤＮＡ鋳型として用いた。インビトロ転写混合物は３７℃で２−６時間インキュベートした。続いて、転写産物を、調製用尿素ゲルによる、またはＲＮｅａｓｙ（商標）精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）による、のいずれかで精製した。転写反応の成功は、１０％ポリアクリルアミド尿素ゲル上で転写産物を分画することによりモニターした。
Ｔ４ＲＮＡリガーゼによるＲＮＡ−ｐＲＮＡハイブリッド分子とアクセプターＲＮＡとの間の酵素的連結：
５’−リン酸−（３’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ）−ｐＲＮＡハイブリッド分子（ドナー）のアクセプターＲＮＡとの連結のために、１００ｐｍｏｌの精製アクセプターＲＮＡを、３００ｐｍｏｌまたは１０００ｐｍｏｌの５’−リン酸−（３’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ）−ｐＲＮＡハイブリッド分子（実施例１．２に記載）および１０Ｕ Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＭＢＩ ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ８．０），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとともに、１５μｌの最終反応容量で１６℃、３０分間インキュベートした。
当該ライゲーションの成功をチェックするため、等容量のｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（負荷緩衝液）（８．３Ｍ尿素，５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を当該混合物に添加し、それを、熱変性（８０℃で５分間）後、１０％ポリアクリルアミド尿素ゲル上で分画した（４０ｍＡ約２０分間）。核酸はＵＶシャドーイングによりゲル中で視覚化した（図２３Ａ）。さらに、当該分子の半分、（３’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ）−ｐＲＮＡを蛍光色素Ｃｙ３で標識してあるため、蛍光走査法によりゲル中で特定のライゲーション産物をを検出することが可能であった（図２３Ｂ）。アクセプターＲＮＡは色素を含んでいないので、当該ＲＮＡは蛍光画像中では検出できない。その短い長さのため、遊離のｐＲＮＡ共役体も蛍光画像には現れない。
（実施例１２）：アンカーされたＳＤＡ反応におけるプライマーとしてのＳＢＵ−ＮＡ共役体の使用
ＳＤＡ順向および逆向プライマー（それぞれ、標的核酸に対して特異的である配列の、ＢｓｏＢｌエンドヌクレアーゼ認識配列５’を含む）は、実施例１に記載の方法により、ＳＢＵｓに付着可能である。これらは次いで、マイクロチップアレイ上の個々の場所へ電子的にアドレスされる。単一産物の増幅または多重増幅のために、単一または複数のＳＡＵ／ＳＢＵペアを、任意の１つの場所で使用することが可能である。増幅の模範的な標的は、上記のＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのα−フェトプロテインがあり、それのために上のプライマー配列が、ＢｓｏＢｌ認識部位配列（Ｃ／ＹＣＧＲＧ）の付加で使用することが可能である。試料からの鋳型ＤＮＡは次いで、固定化プライマーへ電子的にアドレスされ、そしてハイブリッド形成される。
増幅反応は、酵素類およびバンパープライマー（それらは標的核酸の各鎖上のＳＤＡプライマーの５’にハイブリッド形成する）の添加により開始される。チップは６０℃で５分間温められる。１０μＬの予め温められたＳＤＡ混合物（６ｍＭモルホリノプロパンスルフォン酸［ＭＯＰＳ］，ｐＨ７．８；１．７ｍＭ［各］ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＡＴＰ，およびチオラート化されたｄＣＴＰ；８５ｍＭ ＫＣｌ，１８ｍＭ ＭｇＣｌ2；２３ｍＭ ＮａＣｌ；３．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９；３５μＭジチオスレイトール；１．５Ｕ ＢｓｏＢｌ；０．８Ｕ Ｂｓｔｌポリメラーゼ；および２５ｎＭ各バンパープライマー）を、当該チップに導入する。６０℃で３０分間インキュベーション後、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ，３．７５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．２でチップを５回洗浄することにより、当該増幅反応を停止させる。アンカーされたアンプリコンは、非アンカー相補的アンプリコンを除くため、アルカリ性溶液（７５ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ１２．５）で4分間変性させ、そして３７．５ｍＭ ＮａＣｌ，３．７５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．２で５回洗浄する。アンカーされたアンプリコンはその後、適当なレポータープローブとのハイブリッド形成により検出される。
（実施例１３）：ｐ−ＲＮＡコード化Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）アッセイ
本実施例は、ヒトＶ因子ライデン遺伝子の１６９１位における単一点変異（Ｇ→Ａ）の検出を目的とする。個々の起源からの試料をｐ−ＲＮＡでコード化し、そしてそれにより能動的チップの特定の位置に固定化する。試料は、ＰＣＲ増幅され、そして個々にコード化された４試料を各セットが含む、１０セットでアドレスされる。当該変異は、Ｇｉｌｌｅｓ，Ｐ．Ｎ．，Ｗｕ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｃ．Ｂ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｓ．Ｊ．；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３６５−３７０（１９９９）により記載されている、塩基スタッキングアッセイによりタイプ化する。
試料調製
精製Ｖ因子試料ＤＮＡの増幅は並行して行ったが、ＰＣＲ反応は、ｐ−ＲＮＡコード化プライマー（順向）［SEQ ID NO. １８６］および逆向プライマー［SEQ ID NO. １８５］を用いることにより、別々に行った。各ＰＣＲ反応は、標準ＰＣＲプライマー濃度および条件を用いることにより、異なる特異的ｐ−ＲＮＡコード化プライマー（ｐ−ＲＮＡコードの配列：SEQ ID NO. ４９、５１、５３、５７）および逆向プライマーを含む。

逆向ＰＣＲプライマー ５’ＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡ３’
［SEQ ID NO. １８５］
ｐ−ＲＮＡコード化プライマー １−４（順向）
ｐ−ＲＮＡ−５’ＡＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣ３’
［SEQ ID NO. １８６］

詳細な試料調製
次のｘＰＣＲ（ｘ＝１，２，３，４）反応混合物を、各々１．５ｍｌ微小遠心管（１０反応に十分）中に、調製した：

反応混合物Ｘ
試薬 容量（μｌ）
ｄＨ2Ｏ １６４
１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液 ２５
ＭｇＣｌ2 ２５
ｄＮＴＰ混合物 ５
逆向プライマー ５
ｐ−ＲＮＡコード化プライマーＸ ５
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ １．３
ここでＸ＝ｐ−ＲＮＡコード化プライマー１，ｐ−ＲＮＡコード化プライマー２，・・・・ｐ−ＲＮＡコード化プライマー４である

ＰＣＲ反応混合物１（ｘ＝１）からの２３μｌをＰＣＲウエルプレートの列１（Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，・・・Ａ１０）のウエルに、ＰＣＲ反応混合物２（ｘ＝２）からの２３μｌをＰＣＲウエルプレートの列２（Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，・・・Ｂ１０）のウエルに、・・・ＰＣＲ反応混合物４（ｘ＝４）からの２３μｌをＰＣＲウエルプレートの列４（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４，・・・Ｄ１０）のウエルに、移した。Ｖ因子ＤＮＡ試料の２μｌをＰＣＲウエルの１つに入れ、ＰＣＲ反応混合物と混合した。この工程を、ウエルプレート上のすべての他の３９試料について繰返した。次いで、ＰＣＲ反応を、サーモサイクラー中で下記のプロトコールにより、ウエルプレート上で行い、そして増幅した：

温度 時間 サイクルの数
９５℃ ５分間 １
９４℃ ２０秒間
５５℃ ２０秒間 ４０
７２℃ ４５秒間
７２℃ ５分間 １
４℃ 保持 １

ＰＣＲウエルプレートをサーマルサイクラー外した。ウエルプレートの欄Ａ中のＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物Ａ１，Ｂ１，Ｃ１，Ｄ１を含むアンプリコンの、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＰＣＲ脱塩プレートの１つのウエル中への移動により、アンプリコン混合物１へ合一した。ウエルプレートの欄２中のＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物Ａ２，Ｂ２，Ｃ２，Ｄ２を含むアンプリコンの、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＰＣＲ脱塩プレートの１つのウエル中への移動により、アンプリコン混合物２へ合一したが、以下同様であった。最後に、欄１０中のＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物Ａ１０，Ｂ１０，Ｃ１０，Ｄ１０を含むアンプリコンの、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＰＣＲ脱塩プレートの１つのウエル中への移動により、アンプリコン混合物１０へ合一した。５０μｌのｄＨ2Ｏをアンプリコン混合物を含む脱塩プレートの各ウエルに添加し、当該脱塩プレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ真空マニホールド中に置き、真空ポンプにより５００ｍｂａｒで乾燥した。次に、１００μｌのｄＨ2Ｏを、アンプリコン混合物を含む各ウエルに添加した。この工程を２回繰返した。次に１００μｌの５０ｍＭヒスチジン緩衝液を、アンプリコン混合物を含む各ウエルに添加した。脱塩プレートをオービタルローター上に５分間置き、速度を最高設定速度に設定した。各アンプリコン混合物は、ここでウエルプレート中に移し、当該アンプリコン二重鎖を分離するために９５℃まで５分間加熱（変性工程）し、当該混合物を震盪し、そして直ちに当該物質を氷上に置いた（０℃で保管）。
Ｎａｎｏｃｈｉｐ（商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ上のチップローダー（ｃｈｉｐ ｌｏａｄｅｒ）操作
ａ） ｐ−ＲＮＡアドレスローダー操作
６０μｌのｐ−ＲＮＡアドレス（ＳＡＵ）（５０ｍＭ Ｈｉｓ緩衝液中、各２００ｎＭ）（ｐ−ＲＮＡアドレスの配列：SEQ ID NO. ５０、５２、５４、５８）を、Ｎｕｎｃウエルプレートの異なるウエルに移した。ｐ−ＲＮＡアドレスの固定化は、ローダードローワー（ｌｏａｄｅｒ ｄｒａｗｅｒ）で、列方向に行った（１０パッドが１つの特定のｐ−ＲＮＡアドレスのよりアドレスされる、活性化時間：６０秒間、電圧：２０Ｖ）。ローディング操作のために、１００部位の能動的電子チップを用いた。ローディング操作は、下記のプロトコールに記載されているように行った。
ｐ−ＲＮＡアドレスの固定化のために、（ｐ−ＲＮＡアドレス１、ｐ−ＲＮＡアドレス２・・・ｐ−ＲＮＡアドレス４）をフリーザーから出し、そして室温で融解させた。６０μｌの各ｐ−ＲＮＡアドレスを、各ｐ−ＲＮＡアドレスのための別々のウエルを用いて、Ｎｕｎｃウエルプレートに移した。Ｎｕｎｃウエルプレートは指定されたスコッチバンドテープを用いてカバーした。チップカートリッジおよびウエルプレートをローダーに移し、そしてローダーファイルを実行した。
ｂ） アンプリコンローダー操作
１００μｌの５０ｍＭヒスチジン緩衝液中に希釈された６０μｌのアンプリコン混合物（０℃に貯蔵）をＮｕｎｃウエルプレートのウエルに移した。適用したアンプリコン混合物の各々は、最初のローディング操作（ａ）で調製されたプレロードチップ上にローダードローワーにより、２．０Ｖ，１８０秒間、欄方向に（４パッド同時に）能動的にハイブリッド形成される。
試料アドレッシングのために、各々が4つの異なるｐ−ＲＮＡコード化ＰＣＲ産物を含む、アンプリコン混合物１，２，３，・・・１０を室温で融解させ、ローダーマップファイルを創製した。６０μｌのアンプリコン混合物溶液を、各混合溶液について別々のウエルを用いて、ウエルプレートのウエルに移した。ウエルプレートは指定されたスコッチバンドテープを用いてカバーした。ｐ−ＲＮＡアドレスでプレロードされた（ｐ−ＲＮＡアドレス固定化を参照）カートリッジをローダーに挿入し、ローダーファイルを実行した。
チップリーダー操作、試料検出：
Ｖ因子アッセイの読取りは、Ｇｉｌｌｅｓ，Ｐ．Ｎ．，Ｗｕ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｃ．Ｂ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｓ．Ｊ．；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３６５−３７０（１９９９）に記載されている、スタッキングアッセイを用いることにより行うことが可能である。２０μｌの野生型レポーター（５０μＭ）［SEQ ID NO. １８８］，２０μｌの変異レポーター（５０μＭ）［SEQ ID NO. １８９］，および４０μｌの安定剤（５０μＭ）［SEQ ID NO. １８７］を添加した。Ｃｙ３またはＣｙ５蛍光シグナルの検出は、３１℃の識別温度で行った。データは、Ｎａｎｏｃｈｉｐ（商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにより供給されたＳＮＡ分析ツールで分析した。
核酸（ＮＡ）の合成結合ユニット（ＳＢＵ）への連結のためのいくつかの好ましい配置の、およびどのようにそのような共役体が、合成アドレッシングユニト（ＳＡＵ）を用いて支持材料（ＳＭ）上の固定化に使用可能かの、図解的表示。図１Ａは、ＳＡＵと対合されたとき、支持体から離れるように向くＳＢＵの末端にその３’端を経由する核酸の連結を示す。図１Ｂは、支持体から離れるように向くＳＢＵの末端にその５’端を経由する核酸の連結を示す。図１Ｃは、支持体の方に向く結合ユニットの末端にその５’端を経由する核酸の連結を示す。図１Ｄは、結合ユニットの中央の位置にその５’端を経由する核酸の連結を示す。このタイプの連結の例は、ｐＲＮＡ中のトリプタミン塩基リンカーの核酸の末端上のアルデヒドとの共役であろう。 核酸およびｐＲＮＡ合成結合ユニットとに使用されるいくつかの好ましい連結配置およびスペーサーの図解。Ｒ１＝Ｈ，ＯＨ，Ｏｍｅ，Ｍｅ；Ｒ２＝Ｈ，ＯＨ，Ｏｍｅ；Ｌ＝（ＣＨ2）n；ＣＨ2−ＣＨ2−（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）m−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2；ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）q−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2；Ｂａ＝ヘテロ環塩基（Ｃ，Ｔ，Ｕ，Ｇ，Ａ，など）。Ａ：ＳＢＵのピラノシルビルディングブロックの４’端の、リン酸を直接通じる核酸の３’端への連結。Ｂ：ＳＢＵのピラノシルビルディングブロックの４’端の、リン酸を直接通じる核酸の５’端への連結。Ｃ：ＳＢＵのピラノシルビルディングブロックの２’端の、リン酸を直接通じる核酸の５’端への連結。Ｄ：ＳＢＵのピラノシルビルディングブロックの４’端の、リンカー（Ｌ）を経由する核酸の３’端への連結。Ｅ：ＳＢＵのピラノシルビルディングブロックの４’端の、リンカー（Ｌ）を経由する核酸の５’端への連結。Ｆ：ＳＢＵのピラノシルビルディングブロックの２’端の、リンカー（Ｌ）を経由する核酸の５’端への連結。 本発明での使用のための核酸および好ましい合成結合システムの間の三次元構造の相違の図解的表示。図３Ａは、Ｂ−ＤＮＡヘリックスに基づく核酸二重鎖のらせん型を示す。図３Ｂは、ｐＲＮＡ，ｐＤＮＡ，およびＣＡＮのような合成結合システムの非らせん性質を示す。図３Ｃは、結合ユニット（ＳＢＵ）１０２ａおよびアドレスユニット（ＳＡＵ）１０２ｂの例を示す。ＮＡ＝核酸；ＳＭ＝支持材料；本例では、アドレス１０２ｂは固定化され、そして１０２ａはリンカーを経由して核酸（ＮＡ）と共役されている。鎖間塩基重層相互作用（スタック）を、プリン・プリン塩基重層相互作用（Ｐｕ−Ｐｕスタック）およびピリミジン・プリン塩基重層相互作用（Ｐｕ−Ｐｙスタック）の例を用いて示す。０スタックは、そのような塩基重層相互作用の欠如を意味する。原理的に可能なプリン・ピリミジンスタックは、この特定な例には存在しない。 ｐＲＮＡ結合アドレスおよび共役体のいくつかの態様の模範的図解。４Ａはストレプトアビジンでコートされた支持材料上に固定化のための４’端ビオチン（ＢＩＯ）をもつ合成アドレスユニット（ＳＡＵ）を示す、４Ｂは活性エステル表面上に固定化のためのテトラヒドラジド（４ＨＹ）成分をもつ合成アドレスユニット（ＳＡＵ）を示す、そして４ＣはｐＲＮＡユニット（ＳＢＵ）およびＤＮＡ（ＮＡ）の共役体を示す。 実施例１．４．に記載のように共役体ＣＡＮを与えるための、隣位のジオールをもつ３’末端リボヌクレオチドをもつＤＮＡ（ＮＡ）と、２’Ｃｙ３標識および４’モノヒドラジド修飾ｐＲＮＡ（Ｌ ＨＹ ｐＲＮＡ）との共役の図解。 実施例１．５．に記載のように共役体ＣＡＮを与えるための、酸化型アルデヒドＤＮＡ（ＯＢ ＮＡ）中間体を経由する３’グリセリル修飾ＤＮＡ（ＧｌｙＮＡ）と、２’Ｃｙ３標識および４’モノヒドラジド修飾ｐＲＮＡ（Ｌ ＨＹ ｐＲＮＡ）との共役の図解。 図７Ａは、支持材料（ＳＭ）上に固定化のために複数の同一の結合ユニットへ、分枝部位（ＢＳ）を経由して連結される核酸（ＮＡ）の固定化を図解する。図７Ｂは、分枝構造による核酸の固定化のための、２つの異なる合成結合システム（ＳＡＵ１およびＳＢＵ１そしてまたＳＡＵ２およびＳＢＵ２）の使用を示す。これらの構造の長所は、当該核酸を固定化する付加的結合エネルギーの増加にある。 核酸（ＮＡ）が、分枝部位（ＢＳ）または分枝成分Ｗを経由して、複数の同一の結合ユニット（ＳＢＵ）へ連結される図解的共役体。 標識合成結合アドレスおよび合成結合ユニットすなわち共役体のいくつかの可能な態様の図形。９Ａは、末端リン酸を通じるような、結合ユニットの末端にマーカーをもつ核酸（ＮＡ）および合成結合ユニット（ＳＢＵ）の共役体（ＳＭ＝支持材料））を示す。Ｂは、例えば塩基標識成分の使用を通じて、共役体中のどこの位置にも場所決めされるマーカー群（Ｍ）についての配置を表す。Ｃは標識合成結合アドレスの使用を示す。Ｄは、相互に調整済みで、共役体が合成結合アドレスに結合するとき、蛍光消光または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の形でシグナルを与える、２つのマーカー群（Ｍ１およびＭ２）の共同使用を示す。 複数の異なる分子種または核酸（ＮＡ１およびＮＡ２）が、同じアレイ位置または捕捉部位上に相互に隣合わせに固定化される、別の態様の図解である。これは、１０Ａに表わされているように、１つのアレイ場所（Ｌ）で２つの異なる結合システム（ＳＢＳ）を形成するため、１つの部位に２つの異なるＳＡＵ’ｓを固定することにより、達成可能である。または、Ｂに表わされているように、同じ効果は、同じ結合システム（ＳＢＳ）を用いることにより、および同じＳＢＵと異なる核酸（ＮＡ１およびＮＡ２）との共役体を用いて、達成することも可能である。 支持材料（ＳＭ）上のアレイの構築のための、合成結合アドレスおよび核酸との合成結合ユニットとの共役体の使用の図解。図Ａは、異なる核酸（ＮＡ１，ＮＡ２，ＮＡ３，・・・）が、異なる結合ユニット（ＳＢＵ１，ＳＢＵ２，ＳＢＵ３，・・・）および異なるアドレスユニット（ＳＡＵ１，ＳＡＵ２，ＳＵＡ３・・・）を用いて、支持材料の異なる場所（Ｌ）に固定化される、態様を示す。当該場所のＳＡＵｓを、例えば、受動的アレイ上に単純にスポットするか、または能動的電子アレイの場合は電極上の捕捉部位に電子的にアドレスすることも可能である。本態様の特徴は、各アレイ場所が個別の結合アドレスをもつことである。これは、各ＳＰについて別々のＳＡＵとしてここでは図解されているが、個別のアドレスは、ＳＡＵ’ｓの混合物（例えば、Ｌ１でＳＡＵ１＆２，Ｌ２でＳＡＵ３＆４など）により、容易に形成も可能である。図１１Ｂは、支持材料（ＳＭ）上に核酸（ＮＡ）を固定化するために、ＳＢＵ（ここではｐＲＮＡ）およびＳＡＵ（ここではＣＡＮ）は、１つの分子クラスに属する必要がないことを示す。認識して、安定かつ選択的固定化を形成する、どのような立体的に適合した分子でも、これらのフォーマットでの使用に適している。 支持材料上にアレイを構築するために、合成アドレスユニットおよび核酸との合成結合ユニットとの共役体を用いるための方法の態様を示す図形。図解のように、個々のアレイ位置は、例えば能動的電子アレイのような、個々に活性化可能な場所をもつアレイ表面を利用することにより、相互に特異的にそして独立に、アドレスすることが可能である。まず、Ｎ個の異なる結合アドレス（ａ，ｂ，ｃ，・・・Ｎ）を、支持材料の表面に固定する。この工程で、合成アドレスユニットは、同じ固定化法（例えば、ビオチン・ストレプトアビジン相互作用、またはヒドラジド・活性エステル化学）を利用して多数の工程（例えば、スポッティングまたは電子アドレッシング）で、Ｍ数の活性部位の群に、くっつけられる。その固定化は、同一の合成結合ユニットが、列または欄のいずれかに置かれるように、好ましくは行われるが、他の形（例えば、四角、十字、円、またはランダムに選ばれた部位群でさえも）も用いてもよい。このように、各ユニットがＭ回の反復で現れる、Ｎ個の異なる結合アドレスのアレイが得られる（図１２Ａ）。次の工程で、核酸および合成結合ユニットの共役体が、予め生成された当該アレイと接触される。これは個々のＳＢＵ／ＮＡを用いていずれも個々に行うことも可能であるが、一回の工程でＮ個にのぼる異なるＳＢＵコード化核酸を固定化するのには、異なるＳＢＵ／ＮＡ共役体のセットの使用が有利である。当該方法は、例えば、能動的電子アレイにおいて、個々のアレイ位置が相互に特異的にそして独立に活性化できる、そうしたアレイでのみ使用可能なことが、重要である。各工程で活性化された位置は、付着されたＳＡＵｓとのＳＢＵｓの結合に有利な条件を創出する。好ましい態様では、Ｎ個の異なる共役体（または共役体のＳＢＵコード化群）が、Ｎ個のアレイ位置にアドレスされ、そしてこのアドレッシングは、連続的に、または全Ｎ位置に並行に行うことも可能である。これらのセットは、そのすべてが、個々の合成結合ユニット（ａ’，ｂ’，ｃ’，・・・Ｎ）と共役されている、Ｎ個の異なる核酸（ｖ，ｗ，ｘ，ｙ，・・・Ｎ）を含んでもよい。固定された合成アドレスユニットの結合ユニットによる特異的認識は、固定された結合ユニットに相補的な、対応合成結合ユニットと共役された、核酸の当該タイプのみをもたらし、各アレイ位置に固定化される。言い換えれば、共役体の当該セットが特定の場所に選別される。このように、一回の処理工程で、Ｎ個の異なる共役体（ａ’−ｖ１，ｂ’−ｗ１，ｃ’−ｘ１，ｄ’−ｙ１・・・Ｎ）が固定化される。列／欄アドレッシング図をここでは示すが、他の図形も可能である。共役体の各セットの、場所の各活性化セットへの結合の後、不結合共役体は除去される。この手順は、次いで、共役体の新たな第２セット（ａ’−ｖ２，ｂ’−ｗ２，ｃ’−ｘ２，ｄ’−ｙ２・・・Ｎ）を用いて、繰返すことが可能である。各繰返しで、再びＮ個までの共役体が、並行して固定化される。それゆえ、Ｍ回の反復後、Ｗ個の異なる共役体がアレイ上に固定化される、なおＷ＝ＮｘＭである。 本図は、支持材料上に核酸を固定化するための、合成結合システムを用いるためのさらなる態様を示す。図１３Ａは、Ｎ個の異なるアドレスユニットのアレイの事例を示す。別の態様で、それらの位置での重複アドレッシングのために、個々のアドレスユニットを２回またはそれ以上の回数、異なるアレイ位置に付着させたいことがあるかも知れない。この態様は受動的アレイに典型的であるが、能動的場所アレイシステムでも利用可能である。図１３Ｂは、遺伝子発現研究に適用可能なように、核酸の異なる試料の分析の用に核酸のアレイを生成させるための合成結合システムを用いる態様を、事例によって、示す。ここでは、異なる時点、段階、または集団の核酸、例えば異なる試料にハイブリッド形成された特定の遺伝子プローブ配列が、アレイ上で相互に比較される。ここでは、事例によって、さまざまな核酸配列（遺伝子；Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，・・・）の３時点Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３の固定化が表わされている。まず、固定された合成アドレスユニットのアレイが調製される。比較される時点は、その後、モニターされる核酸配列のセットと共役されたＳＢＵ’ｓの特定のセットにより区別が可能である。比較される時点は、同時にまたは連続的にのいずれかで、ＳＡＵ’ｓと会合することが可能であってもよい。合成結合ユニットによる合成アドレスユニットの特異的認識は、各アレイ位置に、当該位置に特異的に所属する共役体のみを固定化し、そうして、利用されるＳＢＵに従ってハイブリッド形成された試料核酸を局在させる。一度にいくつかの試料を同時にアドレッシングすることの利点は、アレイとの試料の個々のインキュベーションによって起るハイブリッド形成条件の変動が避けられ、結果のより厳密で定量的な比較を可能にすることである。加えて、複数の試料を１サイクルでアッセイできれば、個々のアドレッシングまたは別々のアレイでのハイブリッド形成と比較して、時間の節約になる。 １４合成アドレスユニットが１４合成結合ユニットと接触される、表面プラズモン共鳴実験（ＳＰＲ）の結果のグラフ。ベースラインから上方に増加しているシグナルは、結合を示す。予想されたように、すべてのアドレスユニットは、各場合で対応する特定の結合ユニットに結合している（例えば、１０２ａ対１０２ｂ）。しかし、いくつかのアドレスユニットおよび結合ユニットは、正確には相補性でないユニットと、ある程度のクロス会合を示している（例えば、１０５ｂと１１０ａ）。その種のクロス会合反応が実質的に減少している結合ユニットのセットは、“直交性”と言われる。用途によっては適する場合もあるが、アッドレッシングユニットに従って厳格な選別が望ましい場合には、非直交性ユニットは、合成結合システムの１つのセット中で一緒に使うべきではない。 能動的電子アレイの表面に付着された合成アドレスユニットへの蛍光標識結合ユニットの特異的会合の写真およびチャート。予想どおり、最強の蛍光シグナルはすべて、特異的ＳＢＵ・ＳＡＵペアをもつ対角線上にある。 ＳＰＲチップの表面に付着されたｐＲＮＡ／ＳＡＵ’ｓと、核酸ＣＡＮおよびｐＲＮＡ／ＳＢＵ’ｓの共役体の会合のチャートで、これも協応ペア間の特異的結合を証明している。実施例２．１におけるように調製された、４’−ビオチニル化１０２ｂ，１０３ｂ，１０４ｂ，および１０５ｂは、実施例８に記載のようなＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐチャネル上に固定化された。実施例１．１におけるように調製された、共役体ＩＬ４ＲＰ１０２ａ，ＩＬ４ＲＰ１０３ａ，およびＩＬ４ＲＰ１０４ａは、当該チャネル中のＳＡＵｓへの結合について、次いで連続的にアッセイされた。 ＳＰＲチップ上のビオチニル化合成アドレスユニット１０２ｂ（実施例２．１）による共役体ＩＬ４ＲＰ１０２ａ（実施例１．１）の固定化、およびそれに続く、当該共役体の核酸部分と３つの相補的ＤＮＡ断片とのハイブリッド形成、のチャート。ＩＬ４ＲＰ１０２Ｃ１はＩＬ４ＲＰ１０２ａのＮＡ部分の５’３ヌクレオチド以外のすべてに相補的配列であり、ＩＬ４ＲＰ１０２Ｃ２は完全相補的配列であり、そしてＩＬ４ＲＰ１０２Ｃ３は完全相補的配列プラス３ヌクレオチドであった。本実験はまた、弱い塩基性溶液（例えば、１０ｍＭ ＮａＯＨ）で結合されたＳＢＵ共役体を簡単に取除くことにより、付着されたＳＡＵｓが繰返し利用できることを、例証している。 実施例５．２の結果のセットアップおよびネガ写真の図形。ｃｙ３標識および１つの非標識合成結合ユニット・核酸共役体（ＳＢＵ−ＮＡ）の混合物が、能動的電子アレイ上にアドレスされている。各共役体は、合っている合成アドレスユニット（ＳＡＵ）と当該位置に固定化される。測定された蛍光は、図形およびチップ画像として示される。 １９Ａ：増幅反応における最初の工程である、核酸鋳型依存性合成を行うポリメラーゼ（Ｅ）の基質（プライマー）として、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および核酸部分（ＮＡ）の共役体ＣＡＮの使用の図形。１９Ｂ：共役体を核酸へ連結する一本鎖リガーゼ（Ｅ）のための基質として、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および核酸部分（ＮＡ）の共役体ＣＡＮの使用の図形。当該共役体上には比較的長いＮＡ部分で示されているが、リガーゼ反応は、僅か１核酸残基をもつ共役体も利用可能である。 ヌクレアーゼ反応のための基質として、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および核酸部分（ＮＡ）の共役体ＣＡＮの使用の図形。Ａ：当該共役体および標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼ（Ｅ）反応中で切断される。ここで示されるように、本反応は、蛍光エネルギー転移標識と組合わせると、特に有用なことがある。蛍光基成分（Ｆ）の発光は、同じ共役体上にクエンチャー成分（Ｑ）を置くことにより、マスクが可能である。切断後、蛍光基の発光は、当該クエンチャーによりもはや吸収されず、可視性になる。試料中の標的の量を定量するため、本反応の進行は、動的に（リアルタイムで）、または完了後、に定量が可能である。 ヌクレアーゼ反応のための基質として、合成結合ユニット（ＳＢＵ）および核酸部分（ＮＡ）の共役体ＣＡＮの使用の図形。Ｂ：標的核酸は、共役体核酸部分にハイブリッド形成されている場合、エンドヌクレアーゼ（Ｅ）により選択的に分解される。ＲＮＡアーゼＨのような二本鎖特異的ＲＮＡアーゼでＲＮＡ標的核酸を分解するには、これは特に有用なことがある。 代表的なｐＲＮＡ・ＤＮＡ共役体の図解。Ａ：２’−Ｏｍｅ−ＲＮＡ（ＮＡ）および５’リン酸（Ｐ）とのｐＲＮＡ（ＳＢＵ）のＮＡ／ＳＢＵ共役体（リガーゼ反応に適した基質）；当該共役体は、その３’端に蛍光色素を、付加的にもつ。Ｂ：ｐＲＮＡユニット（ＳＢＵ）および遊離３’端をもつＤＮＡ（ＮＡ）のＮＡ／ＳＢＵ共役体（ポリメラーゼまたは制限エンドヌクレアーゼ反応に適した基質）。 Ａ：プライマーとしてｐＲＮＡ・ＤＮＡ共役体を用いるＰＣＲ反応における特異的な増幅産物の形成を示すアガロースゲルの写真。比較のために、標準ＤＮＡプライマーを用いる混合物も適用した（実施例２を参照）。Ｂ：ＮＡ／ＳＢＵ共役体をプライマーとして用いる大規模ＰＣＲ反応の結果を示す、アガロースゲルのもう１つの写真（実施例３を参照）。 ＵＶシャドーイング法および蛍光画像法の両方で、ｐＲＮＡおよび２’−Ｏｍｅ−ＲＮＡと標的ＲＮＡとの蛍光標識共役体のライゲーションの産物を示す、１０％ポリアクリルアミドゲルの写真。その短い長さのため、遊離の非結合ＮＡ／ＳＢＵ共役体はゲル上に示されていない（実施例４を参照）。ゲルのレインは以下のとおりである： レイン１： アクセプターＲＮＡ（ネガティブコントロール） レイン２： １００ｐｍｏｌのアクセプターＲＮＡおよび３００ｐｍｏｌのｐＲＮＡハイブリッドとのライゲーション混合物 レイン３： １００ｐｍｏｌのアクセプターＲＮＡおよび１０００ｐｍｏｌのｐＲＮＡハイブリッドとのライゲーション混合物 レイン４： １００ｐｍｏｌのアクセプターＲＮＡおよび３００ｐｍｏｌのｐＲＮＡハイブリッドとのライゲーション混合物 レイン５： １００ｐｍｏｌのアクセプターＲＮＡおよび１０００ｐｍｏｌのｐＲＮＡハイブリッドとのライゲーション混合物。 ＳＡＵおよびＳＡＵ間の相互作用を経由して、一連の異なったＳＤＡプライマーがアドレスされている場所（Ｌ）上のＳＡＵのアレイを模式的に示す図解。 当該プライマー類を１つのＳＢＵに付着させるために、分枝リンカーを用いることにより、単一ＳＢＳを用いて、２つの異なるプライマーをアドレスできることを示す図解。 ＳＢＵアンカーされたＳＤＡ構築体の全体的構造を示す図解。ＳＤＡプライマーは、制限部位鋳型および標的ＤＮＡに相補的な領域を含む。バンパープライマーは、ＳＤＡプライマーが結合する、標的ＤＮＡ上流の領域に相補的な配列である。バンパープライマーは、ポリメラーゼのための開始部位を形成し、そして伸長したプライマーからの標的核酸の最初の鎖置換をもたらす。 ＳＢＵアンカーＳＤＡに対する開始工程の図解（第１期）：ＳＢＵアンカーＳＤＡプライマー上への標的配列のコピーイング、バンパープライマー１からの伸長によるゲノムＤＮＡの置換、制限部位の活性化、および置換Ｓ１鎖の生成。 ＳＢＵアンカーＳＤＡに対する開始工程の図解（第１期）：ＳＢＵアンカーＳＤＡプライマー上への標的配列のコピーイング、バンパープライマー１からの伸長によるゲノムＤＮＡの置換、制限部位の活性化、および置換Ｓ１鎖の生成。 ＳＢＵアンカーＳＤＡの直線的増幅反応の図解（第２期）：捕捉されたすべての第１期置換鎖に対する一本鎖アンカーアンプリコンの生成。 ＳＢＵアンカーＳＤＡの指数的増幅反応の図解（第３期）：両アンカーアンプリコン中の制限部位の活性化、置換Ｓ１およびＳ２鎖の生成、および架橋および捕捉を経由する指数的増幅。 ＳＢＵアンカーＳＤＡの指数的増幅反応の図解（第３期）：両アンカーアンプリコン中の制限部位の活性化、置換Ｓ１およびＳ２鎖の生成、および架橋および捕捉を経由する指数的増幅。 実施例５．３に記載された特異的アドレッシング実験の図解。アドレスされ、固定化された核酸／ＳＢＵ共役体およびハイブリッド形成され、標識された核酸の最初の２つのカラムが、見出し“カラム１”および“カラム２”の下の小さな図形により図解されている。２つのカラムの各々について、緑色蛍光シグナルが左側に、そして赤色蛍光シグナルが右側に示されている。当該アレイ内の非活性化場所に相補的な配列の有意なハイブリッド形成がなく、異なる場所で異なる試料からの同じ配列を用いて、ハイブリッド形成反応を効率的に単離することを可能にすることを、本実験が証明していることに注目されたい。
配列表

Claims (32)

  1. 標的核酸を、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）と少なくとも１つの合成結合ユニット（ＳＢＵ）とを含む共役体で酵素的に修飾するための方法であり、当該共役体の核酸を基質として利用する方法であって、
    ａ）当該共役体を、天然に存在する核酸を基質として利用する少なくとも１つの酵素と当該酵素の作用に必要な他の試薬とに接触させること；および
    ｂ）当該標的核酸の修飾を行うのに十分な時間の間、当該酵素が機能するのに適した条件下で、ａ）で得られた混合物をインキュベートすること
    を含み、該少なくとも１つの合成結合ユニット（ＳＢＵ）がｐ−ＲＮＡ、ｐ−ＤＮＡ、およびＣＮＡより成る群から選択される方法。
  2. 前記他の試薬が前記共役体の核酸にハイブリッド形成する核酸を含む、請求項１の方法。
  3. 前記他の試薬がヌクレオシド三リン酸または修飾ヌクレオシド三リン酸を含む、請求項１の方法。
  4. 少なくとも１つの酵素が、ポリメラーゼ、リガーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、キナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、およびターミナルトランスフェラーゼより成る群から選択される、請求項１の方法。
  5. 前記酵素がリガーゼで、そして共役体の核酸が少なくとも１つの付加核酸への当該核酸の末端のライゲーションにより修飾される、請求項１の方法。
  6. 前記ライゲーションが鋳型依存性であり、そして前記共役体の核酸および付加核酸が鋳型核酸の隣接配列にハイブリッド形成される、請求項５の方法。
  7. 前記ライゲーションが鋳型非依存性であり、そして前記共役体の核酸および付加核酸が一本鎖である、請求項５の方法。
  8. 使われるリガーゼがＴ４ＲＮＡリガーゼである、請求項７の方法。
  9. 前記ライゲーションが平滑末端であり、そして前記共役体の核酸および付加核酸が二本鎖である、請求項５の方法。
  10. 前記酵素がポリメラーゼであり、共役体の核酸が非遮断３’末端をもち、前記他の試薬が当該核酸の非遮断３’末端がハイブリッド形成する鋳型核酸を含み、そして当該鋳型核酸に相補的な少なくとも１つのヌクレオシドの当該核酸の３’末端への添加により当該核酸が修飾される、請求項１の方法。
  11. ジデオキシヌクレオチドが前記共役体の核酸に付加される、請求項１０の方法。
  12. 標識されたヌクレオチドが前記共役体の核酸に付加される、請求項１０の方法。
  13. 鋳型核酸が生物学的試料に由来する、請求項１０の方法。
  14. 前記生物学的試料が、ヒト材料、動物材料、植物材料、真菌材料、細胞培養、ウイルス培養、食物試料、および水試料より成る群から選択される試料に由来する、請求項１３の方法。
  15. 前記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ，および逆転写酵素より成る群から選択される少なくとも１つの酵素である、請求項１０の方法。
  16. 鋳型核酸配列の少なくとも一部が増幅される、請求項１０の方法。
  17. 前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼあり，そして前記ｂ）の条件がａ）の混合物について、ｉ）前記鋳型核酸から伸長生成物を解離させ、及びｉｉ）当該鋳型への共役体核酸のハイブリド形成および当該共役体の核酸の酵素的伸長を可能にすること、を交互にサーモサイクリングして、当該鋳型核酸配列の少なくとも一部を増幅させることを含む、請求項１０の方法。
  18. 当該共役体をａ）の混合物中の制限エンドヌクレアーゼに接触させ、ここで、前記共役体の核酸は前記鋳型核酸にハイブリド形成する当該３’末端の５’にエンドヌクレアーゼ認識配列５’を含み、そして当該鋳型核酸配列の少なくとも一部が標準置換増幅により増幅されることをさらに含む、請求項１０の方法。
  19. 前記ポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の混合物であり、当該共役体人をａ）の混合物中のＲＮＡアーゼＨ活性に接触させることをさらに含み、ここで当該鋳型核酸配列の少なくとも一部が転写仲介増幅により増幅される、請求項１０の方法。
  20. 前記酵素がターミナルトランスフェラーゼであり、そして前記共役体の核酸が当該核酸の３’端への少なくとも１つのヌクレオシドの付加により修飾される、請求項１の方法。
  21. 標識されたヌクレオシドが前記共役体の核酸に付加される、請求項２０の方法。
  22. ホモポリマー尾部が前記共役体の核酸に付加される、請求項２０の方法。
  23. 前記酵素が制限エンドヌクレアーゼであり、前記他の試薬が前記共役体の核酸の少なくとも一部がハイブリッド形成する標的核酸を含み、そして当該共役体の核酸および当該標的核酸が工程（ｂ）で当該制限エンドヌクレアーゼにより切断される、請求項１の方法。
  24. 前記酵素が制限エンドヌクレアーゼであり、前記他の試薬が前記共役体の核酸の少なくとも一部がハイブリッド形成する標的核酸を含み、そして当該共役体の核酸が工程（ｂ）で当該制限エンドヌクレアーゼにより切断されるが、当該標的核酸は切断されない、請求項１の方法。
  25. 前記酵素が制限エンドヌクレアーゼであり、前記他の試薬が前記共役体の核酸の少なくとも一部がハイブリッド形成する標的核酸を含み、そして当該標的核酸が工程（ｂ）で当該制限エンドヌクレアーゼにより切断されるが、当該共役体の核酸は切断されない、請求項１の方法。
  26. 前記酵素がＲＮＡアーゼＨであり、前記共役体の核酸の少なくとも一部がハイブリッド形成するＲＮＡ標的核酸を前記他の試薬が含み、そして当該共役体の核酸にハイブリッド形成する標的ＲＮＡ核酸が工程（ｂ）で当該ＲＮＡアーゼＨにより分解される、請求項１の方法。
  27. 前記合成結合ユニットがｐＲＮＡまたはｐＤＮＡであり、そして当該合成結合ユニットがその２’端を介して核酸の５’端とまたはその２’端を介して核酸の３’端とまたはその４’端を介して核酸の３’端とまたはその４’端を介して核酸の５’端と連結されている、請求項１の方法。
  28. 前記核酸が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、化学的に修飾された核酸、ホスホロチオエート核酸、ホスホロジチオエート核酸、メチルホスホネート核酸、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、アプタマーおよびアプタザイムより成る群から選択される、請求項１の方法。
  29. 前記共役体が少なくとも１つの標識成分をさらに含む、請求項１の方法。
  30. 前記標識成分が、蛍光成分、クエンチャー成分、可視色素成分、放射活性成分、化学発光成分、ビオチン成分、ハプテン成分、微小粒子、常磁性微粒子、および酵素性標識成分より成る群から選択される、請求項２９の方法。
  31. 前記標識成分が、ＢＯＤＩＰＹ（商標）色素，シアニン色素、Ａｌｅｘａ（商標）色素，フルオレセイン色素、ローダミン色素、フィコエリスリン色素、クーマリン色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素，Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標），ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，ＲＯＸ，ＥＤＡＮＡ，４−アセタミド−４’−イソチオシアナト−スチルベン−２，２’−ジスルフォン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２‘−ジスルフォン酸，サクシニミジルピレンブチレート、アクリジンイソチオシアネート、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ，Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ，Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗビニルスルフォン，およびＩＲ１４４６（Ｋｏｄａｋ（商標）Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅ）：より成る群から選択される蛍光色素成分である、請求項２９の方法。
  32. 前記標識成分が、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）成分，ＤＡＢＣＹＬ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ），マラカイトグリーン、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオチアシアナト（ＤＡＢＩＴＣ），および４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルフォン酸成分より成る群から選択されるクエンチャー成分である、請求項２９の方法。
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