ITTO20090860A1

ITTO20090860A1 - Metodo per realizzare microarray a lunghi oligonucleotidi e microarray a lunghi oligonucleotidi

Info

Publication number: ITTO20090860A1
Application number: IT000860A
Authority: IT
Inventors: Andrea Cuppoletti; Davide Dattilo; Michael Pancher; Barbara Pisanelli; Gregory Ridolfi
Original assignee: Molecular Stamping S R L
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2011-05-11

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

“METODO PER REALIZZARE MICROARRAY A LUNGHI OLIGONUCLEOTIDI E MICROARRAY A LUNGHI OLIGONUCLEOTIDI”

La presente invenzione è relativa a un metodo per realizzare microarray per l’analisi di sequenze nucleotidiche. In particolare, la presente invenzione è relativa a un metodo per realizzare una particolare famiglia di microarray di DNA formati da filamenti sonda molto lunghi di DNA (tra 100 e 100000 nucleotidi). La lunghezza dei filamenti sonda può essere adattata all’applicazione specifica: sequenze più lunghe consentono il legame di campioni a concentrazioni molto basse e permettono di eseguire uno screening di porzioni ripetitive del genoma con importanti implicazioni sul loro utilizzo in diagnostica.

Stato dell’Arte

L’analisi di agenti biospecifici, come piccole molecole, proteine e ligandi, che interagiscono selettivamente con biomolecole, per esempio mediante catalisi, legame, proteolisi o altre interazioni biologiche, è di interesse particolare in chimica medica. Tale analisi può essere impiegata per applicazioni diagnostiche e terapeutiche oltre che per la caratterizzazione di biomolecole, per lo screening di attività biologiche e per altri studi funzionali.

Il profilo genico di espressione dell’intero genoma (whole-genome expression profiling), favorito dallo sviluppo di microarray di DNA (M. Schena, D. Shalon, R.W. Davis and P.O. Brown, Science 270 (1995), pagg. 467–470), rappresenta il principale sviluppo dell’analisi funzionale su tutto il genoma. In un unico saggio, è possibile misurare la risposta trascrizionale di ciascun gene a una variazione dello stato cellulare, nel caso in cui si tratti di una malattia, di un processo come la divisione cellulare, o di una risposta a una perturbazione chimica o genetica (J.L. DeRisi, V.R. Iyer and P.O. Brown. Science 278 (1997), pagg. 680–686).

Per questo tipo di analisi sono utili array di biomolecole, come array di peptidi o di polinucleotidi. Tali array comprendono regioni (a cui ci si riferisce talvolta come “spot”) di biomolecole di sequenza solitamente diversa disposte in una configurazione predeterminata su un substrato. Gli array, quando esposti a un campione, presenteranno un motivo di legame o attività che è indicativo della presenza e/o della concentrazione di una o più componenti del campione, come un antigene nel caso di un array peptidico o un polinucleotide avente una particolare sequenza nel caso di un array polinucleotidico. Il motivo di legame può essere rilevato per esempio marcando tutti i potenziali bersagli (per esempio, DNA) del campione con una marcatura idonea (per esempio, un composto fluorescente), e osservando il motivo del segnale (per esempio, fluorescenza) sull’array.

I dispositivi a microstrutture o nanostrutture hanno applicazioni commerciali molto ampie in medicina e in ricerca. I microarray sono solitamente prodotti utilizzando un metodo per sintetizzare sequenzialmente una sonda su un substrato oppure impiegando un metodo di spotting in cui una sonda precedentemente sintetizzata è immobilizzata su un substrato attivato.

Esempi di tali microarray comprendono microarray polinucleotidici e proteici. I microarray di DNA (a cui ci si riferisce comunemente come chip genici) sono un esempio disponibile in commercio di una microstruttura con una particolare disposizione. Utilizzi esemplificativi per i microarray di DNA comprendono studi di espressione genica e sistemi di identificazione di SNP (polimorfismi a un singolo nucleotide).

Il brevetto statunitense N. 5.143.854 descrive il legame di proteine in spot discreti come array su una piastrina di vetro e menziona la necessità di espanderli per creare microarray in cui possano essere immobilizzate delle cellule. La generazione di microarray di cellule viventi su vetrini o altri chip è inoltre affrontata nel brevetto statunitense N. 6.548.263, che descrive l’utilizzo di un wafer di vetro o simile che è inizialmente trattato con un aminosilano per generare una superficie idrofila avente gruppi amminoreattivi, un concetto ormai ben noto nella tecnica. Sono anche stati sviluppati array più specifici per l’analisi delle proteine, che sono focalizzati da una parte sul legame e sulla presentazione di proteine come parte di un microarray e dall’altra su analisi in cui gli array di DNA sono impiegati per interazioni DNA/proteina.

In passato sono stati sviluppati numerosi chip in cui sono state immobilizzate sonde su un substrato di vetro modificato, su un substrato di silicio, o simile, in corrispondenza di posizioni distinte nello spazio, per creare un array con un elevato numero di sonde diverse. Secondo la tecnologia convenzionale, un linker depositato su un substrato e attivato può essere fatto reagire con una sonda. Pertanto, l’efficienza della reazione è bassa e non è possibile ottenere un’attivazione uniforme. Inoltre, un linker convenzionale comprende una porzione idrofobica come un gruppo alchilico. Pertanto, in un metodo in cui sono misurati e analizzati i segnali generati da una reazione tra una sonda e un bersaglio su un microarray fabbricato utilizzando un linker convenzionale, l’efficienza dell’analisi è bassa a causa di un forte segnale generato dal legame non specifico del bersaglio alla porzione di fondo, vale a dire un forte rumore di fondo.

Malgrado i microarray forniscano una piattaforma per saggi paralleli su larga scala per l’espressione genica qualitativa, il loro utilizzo in un contesto clinico, che richiede misurazioni quantitative uniformi, risulta piuttosto carente. È stato osservato che l’espressione differenziale di gruppi di geni identificata su una particolare piattaforma microarray spesso non è riproducibile su altre piattaforme microarray (Shippy, R. et al. BMC Genomics 5, 61 (2004)). Una sorgente di variabilità è la limitata e non omogenea sensibilità delle diverse piattaforme microarray nell’identificazione di geni espressi debolmente, che influenza la riproducibilità tra piattaforme di geni espressi in modo differenziale.

Gli attuali metodi per la sintesi di acidi nucleici utilizzano un approccio tradizionale “monomero per monomero”. Le sonde nucleotidiche utilizzate in microarray di DNA sono sintetizzate in questo modo a costi elevati e con una bassa riproducibilità. Pertanto, vi è una notevole variabilità tra microarray fabbricati in questo modo.

La sintesi “monomero per monomero” non permette inoltre di ottenere sonde nucleotidiche di lunghezza oltre circa 100 nucleotidi a causa della scarsa efficienza del processo e dei costi legati a esso. L’efficienza per step di aggiunta del monomero varia da tecnica a tecnica (fotolitografica, acido catalizzata, ecc.) impiegata e non supera mai la soglia del 95%. Comunemente varia tra il 70 e il 95%, a seconda della tecnica usata e del monomero aggiunto. L’efficienza totale di resa (E) è data dalla formula E=(100)e<n>dove e è l’efficienza media della reazione e n è il numero di monomeri aggiunti.

Ciò impedisce l’utilizzo diffuso e affidabile dei microarray in contesti di ricerca e di clinica, in particolare per applicazioni dove il campione è presente in piccole quantità o dove il bersaglio ha una serie di sequenze ripetute, tipo segmenti telomerici o intronici. Inoltre la maggiore lunghezza della sonda introduce un vantaggio nei tempi di ibridizzazione tra bersaglio e sonda, con la possibilità di utilizzare il microarray in casi in cui è desiderabile se non necessaria una risposta veloce.

Un primo scopo della presente invenzione è di diminuire il rumore di fondo che si ottiene con i microarray noti.

Un secondo scopo della presente invenzione è quello di diminuirne i costi.

Un terzo scopo della presente invenzione è quello di ottenere un’elevata sensibilità anche per geni espressi debolmente.

Un quarto scopo della presente invenzione è quello di ottenere un’elevata riproducibilità tra piattaforme di microarray.

Un quinto scopo della presente invenzione è di rendere possibile l’utilizzo di sonde di lunghezza maggiore di 100 nucleotidi.

Questi scopi sono raggiunti mediante il metodo della rivendicazione 1, il kit della rivendicazione 5 e il microarray della rivendicazione 8.

Tale metodo consente di ottenere microarray con sonde da 100 a 100000 nucleotidi che presentano un basso rumore di fondo, un’elevata sensibilità e riproducibilità, con un basso costo.

Definizioni

A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato qui sotto indicato.

Per “templato” o “filamento templato” si intende un filamento nucleotidico utilizzato per generare un filamento sonda complementare. Il microarray formato da filamenti templato immobilizzati è definito microarray templato.

Per “immagine complementare di un templato” o “copia” si intende un’immagine speculare su un substrato quando il templato è asimmetrico, o una copia quando il templato è simmetrico, delle informazioni chimiche e/o spaziali codificate dal templato o da una porzione di esse.

Per “motivo” o “disposizione” si intende la posizione nello spazio di ciascuna molecola di una pluralità di molecole legate a un substrato e la struttura chimica di ciascuna molecola della pluralità di molecole.

A meno che specificato come legame covalente, per “legare” o “legato” si intende un’associazione sia covalente che non covalente come possono essere legami idrogeno, legami ionici, interazioni elettrostatiche, interazioni magnetiche, legami covalenti, e legami di Van der Waals.

Per “acidi nucleici” o “oligonucleotidi” si intende un polimero di nucleotidi, come DNA, RNA, PNA, LNA e derivati di essi.

Breve descrizione delle figure

Per una migliore comprensione della presente invenzione, vengono nel seguito descritte forme di realizzazione preferite anche con riferimento alle figure allegate in cui:

la Figura 1 rappresenta la sequenza del prodotto di amplificazione mediante PCR della porzione di subunità 16S di E. coli e la coppia di primer utilizzati;

la Figura 2 rappresenta un grafico dei valori di fluorescenza dell’incorporazione di dCTP-Alexa555 dopo la sintesi del secondo filamento su microarray con spot di ampliconi.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Il metodo per realizzare un microarray secondo la presente invenzione comprende una prima fase di fornire un microarray templato che comprende una prima pluralità di oligonucleotidi legati a un primo substrato secondo una particolare disposizione. Ciascuno di detti oligonucleotidi ha una lunghezza di 100-100000 nucleotidi, preferibilmente di 500-10000 nucleotidi, ancor più preferibilmente di 1000-5000. Successivamente si realizza mediante amplificazione una seconda pluralità di oligonucleotidi a partire dalla prima pluralità di oligonucleotidi. Ciascun oligonucleotide della seconda pluralità di oligonucleotidi comprende un gruppo funzionale reattivo. Si porta poi a contatto il gruppo funzionale reattivo della seconda pluralità di oligonucleotidi con una superficie di un secondo substrato, formando così un legame tra la seconda pluralità di oligonucleotidi e il secondo substrato. È possibile ripetere una o più volte l’amplificazione di una nuova pluralità di oligonucleotidi a partire dalla precedente pluralità di oligonucleotidi e la reazione del gruppo funzionale della nuova pluralità di oligonucleotidi con un nuovo substrato. Gli oligonucleotidi possono essere selezionati dal gruppo che consiste di DNA, RNA, sequenze nucleotidiche modificate, e combinazioni di esse.

Secondo la presente invenzione viene inoltre fornito un kit per stampare una disposizione molecolare su un substrato, che comprende una prima pluralità di oligonucleotidi legati a un primo substrato secondo una particolare disposizione, ciascuno di detti oligonucleotidi avendo una lunghezza di 100-100000 nucleotidi, preferibilmente di 500-10000 nucleotidi, ancor più preferibilmente di 1000-5000 nucleotidi, e una seconda pluralità di oligonucleotidi amplificati dalla prima pluralità di oligonucleotidi, in cui ciascun oligonucleotide comprende un gruppo funzionale reattivo.

Secondo la presente invenzione viene infine fornito un microarray comprendente una pluralità di oligonucleotidi legati a un substrato secondo una particolare disposizione, ciascuno di detti oligonucleotidi avendo una lunghezza di 100-100000 nucleotidi, preferibilmente di 500-10000 nucleotidi, ancor più preferibilmente di 1000-5000 nucleotidi.

In una forma di realizzazione gli oligonucleotidi sonda da legare al supporto sono generati mediante amplificazione per PCR della regione di interesse del genoma. L’utilizzo di una sostituzione chimica su uno dei primer permette la sintesi un insieme di ampliconi che possono essere immobilizzati sul supporto. Il microarray di ampliconi ottenuto in questo modo può essere utilizzato come tale a scopo diagnostico.

In un’altra forma di realizzazione il microarray di ampliconi è generato come per la forma di realizzazione precedente e questo microarray di ampliconi può essere utilizzato come templato per la generazione mediante tecnica SuNS di microarray copia. La tecnica SuNS è descritta e rivendicata nella domanda di brevetto WO/2006/112815 qui incorporata per riferimento. In particolare, il microarray templato è sottoposto prima a una fase di sintesi di secondo filamento (second strand synthesis, da qui in seguito: SSS) mediante una reazione di replicazione catalizzata da una polimerasi che agisce insitu. I filamenti complementari generati in questo modo sono successivamente stampati su una superficie che ha un rivestimento tridimensionale funzionalizzato in grado di immobilizzarlo in modo covalente o non covalente. Il microarray copia generato in questo modo mantiene le informazioni topologiche e di sequenza del microarray templato originale, nonostante sia la sua copia complementare e speculare. Il microarray templato è successivamente sottoposto ad altri cicli per generare altri microarray copia.

La presente invenzione sarà descritta nel seguito con riferimento a un esempio di realizzazione senza per questo uscire dall’ambito protettivo della presente invenzione.

Esempio

Sono stati realizzati microarray templato composti da oligonucleotidi di circa 1500 nucleotidi. Tali microarray templato sono stati successivamente utilizzati per generare diversi microarray copia di ampliconi mediante il processo SuNS come descritto sopra.

A partire dalla sequenza del gene della subunità 16S ribosomiale di E. coli, disponibile in GenBank, è stata realizzata una coppia di primer per amplificare una porzione di 1454 paia di basi (Figura 1); la PCR è stata effettuata utilizzando un primer senso amminomodificato.

L’amplificazione mediante PCR è stata eseguita utilizzando condizioni ottimizzate per migliorare l’efficienza della sintesi di ampliconi. Il prodotto è stato purificato mediante dialisi e utilizzato direttamente per preparare una piastrina di spotting per generare il microarray di ampliconi.

Il microarray di ampliconi è stato trattato per denaturare la sonda a doppio filamento, al fine di ottenere un filamento singolo di 1454 nucleotidi.

Sono stati testati diversi lavaggi mediante acqua, formammide, e urea, utilizzando diverse temperature. È stata scelta urea 2M come procedura di denaturazione standard.

Gli esperimenti sono stati eseguiti verificando il segnale di entrambi i filamenti utilizzando diversi primer e fluorofori: l’integrità del filamento legato mediante spotting è stata valutata ibridizzando il primer in posizione 3’, mentre la presenza del filamento complementare è stata verificata utilizzando il primer in posizione 5’.

I microarray templato sono stati sottoposti a una fase di denaturazione e a una successiva sintesi del secondo filamento catalizzata da una polimerasi. L’efficienza della reazione è stata verificata incorporando dNTP marcati.

Tali microarray templato trattati sono stati replicati mediante la tecnica SuNS. Il templato è stato introdotto in un dispositivo per lo stampaggio insieme alla superficie di replica trattata. In seguito allo stampaggio i due substrati sono stati separati e lavati. I microarray copia sono stati ibridizzati utilizzando un primer senso marcato per verificare l’efficienza di trasferimento dell’amplicone. Il microarray templato è stato sottoposto a cicli successivi di SSS e stampaggio per generare altre repliche. La figura 2 rappresenta un grafico che riassume i risultati di 1 e 2 cicli (n=1, n=2), con valori dettagliati ottenuti dopo SSS e ibridizzazione di repliche.

In particolare, per misurare la densità di filamento di DNA generato durante il processo di SSS, si è introdotto un nucleotide marcato con fluoroforo attivo nel canale della cyanine3. L’intensità dell’emissione di tale fluoroforo è proporzionale alla densità di filamento complementare generato durante il processo di SSS. È interessante notale che l’efficienza del processo non è influenzata negativamente dal processo SuNS, infatti l’intensità relativa al ciclo 1 e 2 si SSS sono simili e comparabili. Inoltre, per misurare la quantità di DNA trasferita sulla replica è stato ibridizzato un bersaglio complementare marcato con fluoroforo. Di nuovo, il segnale è proporzionale alla quantità di DNA presente sulla replica. Non solo la replica è funzionale, in quanto si ottiene segnale positivo, ma è possibile osservare che lo stesso templato può essere utilizzato più volte e la replica del ciclo n=2 è funzionale e con intensità simile a quella di ciclo n=1.

Infine è interessante notare che l’ibridizzazione con un campione reale (DNA genomico) ha dato valori elevati di segnale dopo solo un’ora di ibridizzazione, e che il segnale è specifico per il filamento presente sulla replica generata secondo il processo qui descritto.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per realizzare un microarray, comprendente le fasi di: a) fornire un microarray templato che comprende una prima pluralità di oligonucleotidi legati a un primo substrato secondo una particolare disposizione, ciascuno di detti oligonucleotidi avendo una lunghezza di 100-100000 nucleotidi; b) realizzare mediante amplificazione una seconda pluralità di oligonucleotidi a partire dalla prima pluralità di oligonucleotidi, in cui ciascun oligonucleotide della seconda pluralità di oligonucleotidi comprende un gruppo funzionale reattivo; c) portare a contatto il gruppo funzionale reattivo della seconda pluralità di oligonucleotidi con una superficie di un secondo substrato, formando così un legame tra la seconda pluralità di oligonucleotidi e il secondo substrato.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che le fasi da b) a c) sono ripetute più volte.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 500-10000 nucleotidi.
4. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 1000-5000 nucleotidi.
5. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi della prima e della seconda pluralità di oligonucleotidi sono selezionati dal gruppo che consiste di DNA, RNA, sequenze nucleotidiche modificate e combinazioni di esse.
6. Kit per stampare una disposizione molecolare su un substrato comprendente: una prima pluralità di oligonucleotidi legati a un primo substrato secondo una particolare disposizione, ciascuno di detti oligonucleotidi avendo una lunghezza di 100-100000 nucleotidi; e una seconda pluralità di oligonucleotidi amplificati dalla prima pluralità di oligonucleotidi, in cui ciascun oligonucleotide comprende un gruppo funzionale reattivo.
7. Kit secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 500-10000 nucleotidi.
8. Kit secondo le rivendicazioni 6 o 7, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 1000-5000 nucleotidi.
9. Kit secondo una delle rivendicazioni da 6 a 8, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi della prima e della seconda pluralità di oligonucleotidi sono selezionati dal gruppo che consiste di DNA, RNA, sequenze nucleotidiche modificate e combinazioni di esse.
10. Microarray comprendente una pluralità di oligonucleotidi legati a un substrato secondo una particolare disposizione, ciascuno di detti oligonucleotidi avendo una lunghezza di 100-100000 nucleotidi.
11. Microarray secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 500-10000 nucleotidi.
12. Microarray secondo la rivendicazione 10 o 11, caratterizzato dal fatto che gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 1000-5000 nucleotidi.
13. Microarray secondo una delle rivendicazioni 10 a 12, caratterizzata dal fatto che gli oligonucleotidi della prima e della seconda pluralità di oligonucleotidi sono selezionati dal gruppo che consiste di DNA, RNA, sequenze nucleotidiche modificate e combinazioni di esse.