JP2007535928A - 染色体異常の検出 - Google Patents

Abstract

異数性または特定の突然変異、特に微小欠失から生じる複数の染色体異常のうち任意の１つを単一のアッセイで検出する方法、およびそれに用いるためのキット。真核生物のゲノムＤＮＡを増幅するために、複数のプライマーオリゴヌクレオチド対であって、各対の一方のプライマーがその５に付着した検出可能な標識を有するプライマーオリゴヌクレオチド対を用いて、ポリメエラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する。複数のプライマー対が潜在的な染色体異常の指標である様々な目的染色体のＤＮＡセグメントを標的としており、１つの対が対照遺伝子を標的としている。増幅ＰＣＲ産物を精製し、そこから検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを得て、それぞれが各セグメントの１本の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含む、マイクロアレイ上のスポットとハイブリダイズさせる。マイクロアレイを、そのそれぞれのスポット上における標識の存在についてイメージングし、目的の標的ＤＮＡセグメントの１つもしくは複数によって示される染色体異常が存在しないことまたは存在することは、イメージング結果をまず対照遺伝子に特異的なスポットのイメージングと比較し、その後、正常ＤＮＡのイメージングから得られた結果と比較することによって診断される。

Description

本発明は、未知の試料における、全染色体および／または一部分が欠損もしくは顕著に突然変異しているかもしれない染色体の指標であるコピー数を定量的に比較し、正常試料における結果と比較することによる、異数性ならびに突然変異、特に微小欠失の検出に関する。より詳細には、本発明は、２１トリソミー（ダウン症候群）、１３トリソミー、１８トリソミー、および雄性染色体、雌性染色体異常を含めた異数性、ならびにネコ鳴き症候群、ウィリアムズ−ビューレン症候群、およびディジョージ症候群を含めた微小欠失症候群、ならびに他の同様の障害などの、胎児染色体異常の出生前検出に関する。

異数性とは、細胞中に存在するそれぞれの染色体の数が正常細胞中に存在する数よりも増加または減少する、染色体突然変異の一般的な型である。二倍体補体から染色体が１つ欠失していることはモノソミーと呼ばれ、一方で、染色体が１つ余分に存在することはトリソミーと呼ばれる。２１トリソミーとは、２１番染色体が１つ余分に存在する状態であり、潜在的に重篤な精神遅滞の先天性の徴候であるダウン症候群を引き起こす、異数性の最も一般的な型である。

世界中の高度に発展した国において、徴候が存在する場合に核型と羊水採取または絨毛膜採取との組合せを用いた染色体異常の出生前診断は標準的となっている。核型とは、染色体補体の状態を特徴づける指標のコレクションであり、全染色体数、それぞれの染色体型のコピー数および染色体の形態学が含まれる。核型は、分裂中期の（すなわち凝縮した）染色体の染色によって決定される。静止期の染色体の分散された状態およびその染色の感度不足が原因で、最近まで静止期の染色体を可視化することが可能でなかったので、分裂中期の染色体がしばしば用いられていた。分裂中期の染色体はいくつかの細胞学的な技術によって染色することができ、一般にバンドと呼ばれる実体への縦方向のセグメント化を示す。各染色体のバンド形成パターンはそれ固有であり、したがって、任意の異常を含めた染色体の明白な同定が可能となる。残念ながら、このような分析は細胞の培養および高品質な分裂中期の染色体の調製を要し、これは１〜３週間かかり得る。

細胞を培養せずに染色体を分析する試みがいくつか行われており、そのような方法の１つが特許文献１に記載されている。未培養の静止期の羊膜細胞上に存在する染色体に特異的なＤＮＡ標的に関して、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて迅速な部分的核型分析が得られる。この手法では、固体担体に結合した染色体上の相補的部位に蛍光標識したプローブをハイブリダイズさせる。この手法により、染色体に十分に特異的である染色剤の欠如から生じる従来の細胞学的な染色方法の制限が克服され、特異的染色体のＤＮＡ、特異的染色体の特異的サブセットまたは特異的サブ領域にハイブリダイズさせることができる、標識した核酸断片の異種混合物を含む試薬が提供されている。ＦＩＳＨ方法は分裂中期および静止期の細胞のどちらにおいても染色体異常を迅速かつ高感度に検出する可能性を広げるが、幾つかの欠点がないわけではない。すなわち１）そのシグナル感度の不足により、微小欠失に関連するいくつかの染色体異常では依然として分裂中期の染色体を要し、および２）同時に診断することができる染色体の数は蛍光顕微鏡フィルターの解像度によって制限される。さらに、ＦＩＳＨ方法の実行には高度な訓練を受けた技術者ならびに高価な装置および試薬が必要である。

第２の非関連の鋳型を同時に増幅することによる、ＰＣＲによるｃＤＮＡ種の定量方法が非特許文献１に記載されている。この方法は、サイクル数および各種の出発ｍＲＮＡの量を含めた特定の変数に強く依存している。これらの変数が十分に制御されている場合でも、非関連の対照鋳型が未知の鋳型と正確に同じ速度で増幅される可能性は低い。２つの鋳型の増幅速度のわずかな差はＰＣＲ中に拡大し、用いる最終的なアッセイ中に存在する未知の鋳型の量が大幅に過剰または過少推定される恐れがある。

胎児ＤＮＡが遺伝病を引き起こす遺伝子変異型を含むかどうかを決定する分析のための、遺伝病の出生前診断に、ＰＣＲが用いられてきたことが非特許文献２に報告されている。ＰＣＲ増幅の後、標識したプローブを用いて、疾患を引き起こす対立遺伝子の存在についてＰＣＲ試料の試験を行う。いくつかの異なる原因遺伝子の有無を、単一の試料中で判定することができると記述されている。さらに、ＰＣＲ増幅産物をナイロン膜上にスポットし、その後、ドットを含むその膜を、目的のＰＣＲ産物に特異的にアニーリングする一本鎖ＤＮＡプローブであって、放射標識したまたは蛍光もしくは化学発光によって検出可能な分子で標識したプローブに曝すことによるドットブロット様式を用いて病原体を探索する検出方法において、ＰＣＲ検出方法では酵素、化学発光および蛍光に基づいたレポーターが用いられてきたことが示されている。この手順は、一度に１つの分析物のスクリーニングに限定されていた。代替法として、ヌクレオチドの側鎖中の、プライマーが標的にアニーリングする能力またはポリメラーゼによって伸長される能力を妨げない位置に標識を取り込ませることによる、病原体に特異的な産物自体を標識するためのＰＣＲの使用が記載されている。フルオレセインなどの蛍光色素、またはビタミンであるビオチンの取込みが言及されており、これは、短いリンカーアームによってプライマーの５末端またはプライマー配列内の塩基のうち１つに付着することができる。その後、適切に標識した増幅ＰＣＲ産物を産生させたら、この産物を、固体担体に付着した、病原体に特異的な非標識のプローブで「捕捉すること」によって検出することができると提案されている。この代替工程は、Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで開発された際に逆ドットブロット手順と呼ばれた。過剰の標識したプライマーなどをすべて除去するために洗浄した後、細菌性タンパク質ストレプトアビジンと結合させ、その後酵素で処理することによって分析物の存在を検出した。捕捉の別の提案は、一方のプライマーを蛍光色素で標識し、他方をビオチンで標識し、その後、二本鎖産物をストレプトアビジンで捕捉して蛍光について試験することである。この捕捉手法により、様々な特異的病原体のプライマー組を用い、そのうち１つを標識することによって、様々な診断的配列の同時検出が可能となると言及されている。全ＰＣＲ産物を、それぞれが病原体のうち１つのＰＣＲ産物に特異的な捕捉プローブを有する識別可能な領域を有する、適切なナイロン膜担体にハイブリダイズさせることが提案されている。その後、ハイブリダイズの後に担体をストリンジェントに洗浄し、標識がビオチンである場合は、ストレプアビジン−酵素複合体を加え、次いで適切な酵素基質を加えることによって、その特定の領域内での発色により病原体の任意の１つの存在が示される。この手順は、非標識のＰＣＲ産物の別のアリコートを個別のハイブリダイゼーション実験においてそれぞれの標識した病原体に特異的なプローブで試験することを要するのでさらに多くの操作を含む元のドットブロット手順よりも、好ましい可能性があると提案されている。

競合的方法による定量的ＰＣＲの方法がＢｕｎｎ他の特許文献２に開示されており、ＤＮＡ増幅に影響を与えるパラメータならびに鋳型（試験および対照のどちらも）比およびコピー数の差異を識別する機構が検討されている。体細胞の突然変異の検出に用いることができると言及されている。Ｂｕｎｎ他の特許文献２は、主にＤＮＡプライマーの性質およびそのそれぞれのプライマー結合部位に起因する、増幅工程に対する様々なパラメータの効果を扱っている。しかし、この系は、標的と試料とがＰＣＲによって同じ速度で同時増幅されるよう標的に十分近い標準物質の使用に限定されている。さらに、この標準物質は、その長さを後に酵素的作用によって変更でき、したがって標準物質と標的との電気泳動による分離かつ定量を可能とするように、標的とは異なっていなければならない。

染色体ＤＮＡ中に存在する短いタンデムリピートＤＮＡ配列を利用することによって異数性が検出される別の方法が特許文献３に開示されており、ＰＣＲ法は短いタンデムリピート配列を増幅するために利用されている。

ゲノムＤＮＡレベルを定量的に測定するためにＰＣＲ反応中の内部対照として工作したＤＮＡ鋳型が用いられている（Ｈａｎの特許文献４）。これらの対照のＤＮＡ鋳型は、試験試料のＤＮＡ鋳型と同じＰＣＲ反応用プライマーの配列を有するように設計されている。目的は、増幅を同じ速度で進行させることにより増幅速度の対照を提供することである。しかし、この方法では各染色体について特異的な内部対照を要し、複雑である。さらに、各染色体のＰＣＲ反応はマイクロタイタープレートの別個のウェルまたは他の容器中で実施しなければならない。

蛍光プローブが消光色素の近傍から逃れるように蛍光マーカーまたはレポータープローブを増幅されるＤＮＡ鎖から追放した系を用いる、同時ＰＣＲ系アッセイにおける２つの標的遺伝子の発現の定量方法がＣａｒｅｙの特許文献５に教示されている。２つの異なる蛍光プローブを用いることによって、２つの遺伝子の多重ＰＣＲが同時に実施される。標的遺伝子の一方はＧＡＰＤＨまたはＤＡＤ−１などの遍在的に発現されるマーカー遺伝子である。教示されているこの方法は、一度に１つの未知標的に限られている。

特許文献６に開示される別の方法では、標的遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、および点突然変異、挿入または欠失などの突然変異を有するその競合的な鋳型の多重ＰＣＲに基づいて、標的遺伝子が定量される。この方法は最終的な分析でゲル電気泳動を用い、複雑かつ厄介である。

米国特許第５，４４７，８４１号明細書 米国特許第５，２１３，９６１号明細書 国際公開第９４／０３６３８号パンフレット 米国特許第５，８８８，７４０号明細書 米国特許第６，５５１，７８３号明細書 国際公開第９４／２３０２３号パンフレット 米国特許第４，６８３，２０２号明細書 米国特許第４，６８３，１９５号明細書 米国特許第４，８００，１５９号明細書 米国特許第４，９６５，１８８号明細書 米国特許第６，１７４，６８３号明細書 国際公開第０２／０５９３７２号パンフレット Rappolee, D.A., et al., Science 241: 708-712 (1988) Amhelm, Norman et al. Polymerase Chain Reaction, Chemical & Engineering News, 36-47 (October 1, 1990)

前述の染色体異常のスクリーニング方法はいずれも複数の障害を同時にスクリーニングするために完全に満足できるものと考えられず、使用が容易であり、迅速な結果をもたらす包括的なスクリーニング手順の検索は続いている。

本発明は、ゲノムＤＮＡの多重ＰＣＲと、ＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーション用の定量可能なマイクロアレイ基盤との組合せと用い、１）異数体および突然変異、特に微小欠失を同時にカバーする包括的なスクリーニング、２）２４〜４８時間以内の迅速な結果、および（３）容易な使用を提供することによって以前の方法の欠点を克服する。マイクロアレイのイメージングパターンを解釈するためにルールベースの診断的アルゴリズムを使用することで、定量結果の精度が増す。本発明は、迅速、正確、簡単かつ安価に染色体異常を検出するためのキットおよび方法を提供し、これは、異数性（２１トリソミー、１３トリソミー、１８トリソミー、および性染色体、例えばＸ染色体の異常を含む）とウィリアムズ−ビューレン症候群、ネコ鳴き症候群、ディジョージ症候群、プラダー−ウィリ症候群およびアンジェルマン症候群（どちらも１５番染色体の一部の欠失を含む）、カルマン症候群、ならびにステロイドスルファターゼ症候群を含めた微小欠失との同時検出に用いることができる。

より詳細には、本発明は、ダウン症候群ならびに他の異数性および染色体異常の出生前検出を行うための、ＰＣＲ、染色体に特異的なプローブへのハイブリダイゼーション、および診断を用いたキットならびに方法を提供する。ルールベースアルゴリズムを用いることで診断結果が高められる。

１つの特定の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）真核生物のゲノムＤＮＡ、（ｉｉ）複数対のフォワードおよびリバースＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドであって、前記各対の一方のプライマーは真核生物のＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖の標的セグメントの３配列に相補的であり、前記各対の他方のプライマーは標的セグメントの第２の鎖の３配列に相補的であり、真核生物のＤＮＡのセグメントの長さは約５０から約３００塩基対であり、各対のプライマーの一方はその５末端に付着した検出可能な標識を有しており、複数のプライマー対はそれぞれ潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを標的としており、１つの対は対照遺伝子のセグメントを標的としているプライマーオリゴヌクレオチド、ならびに（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の実施に必要なＰＣＲ緩衝液および酵素を含む構成成分を容器中で混合することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を作製するステップと、（ｂ）ＰＣＲを約５から約６０回の温度サイクルで実施して増幅ＰＣＲ産物を作製するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の前記産物を精製して検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを得るステップと、（ｄ）マイクロアレイをステップ（ｃ）の産物と接触させるステップであって、該マイクロアレイが複数のスポットを有し、このスポットのそれぞれが前記標的セグメントのそれぞれの前記鎖の１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含むステップと、（ｅ）前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブと、前記ＰＣＲで増幅した標識含有一本鎖産物とをハイブリダイズさせるステップと、（ｆ）マイクロアレイのイメージングを行うことによって、マイクロアレイにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の存在および相対量を検出するステップと、（ｇ）選択された染色体の前記各標的セグメントについて前記マイクロアレイ上の関連するスポットの前記イメージングを、前記対照遺伝子に関連するスポットのイメージングと比較し、その後、正常であることが知られているゲノムＤＮＡの同様の試験から得られた結果と比較することによって、前記選択された様々な染色体の１つまたは複数に関して染色体異常が存在するかどうかを診断するステップとを含むことを特徴とする、複数の染色体異常のうち任意の１つを単一のアッセイで検出する方法を提供する。

別の特定の態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物ゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして機能する複数対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド対の一方のプライマーは哺乳動物ゲノムＤＮＡの標的セグメントの第１の鎖の３ヌクレオチド配列に相補的であり、前記各オリゴヌセロチド対の他方のプライマーは標的ＤＮＡセグメントの第２の鎖の３ヌクレオチド配列に相補的であり、各対の前記プライマーの一方はその５末端に共有結合した検出可能な標識を有しており、複数の前記ＤＮＡプライマー対は潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを増幅することを標的としており、前記対の１つは対照遺伝子のセグメントを増幅することを標的としているオリゴヌクレオチド、（ｂ）（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｉｉ）比色定量を実施するための緩衝液ならびに酵素、（ｃ）複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイであって、そのスポットの少なくとも１つが、それに付着した、標識を保有するそれぞれの標的とされるゲノムＤＮＡセグメントの増幅された鎖に相補的なＤＮＡ配列を有するマイクロアレイ、ならびに（ｄ）ＰＣＲ増幅産物とマイクロアレイ上のそれぞれのスポットとのハイブリダイゼーション反応からの強度イメージング（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｍａｇｉｎｇ）の結果を用いた染色体異常の診断手段であって、正常ゲノムＤＮＡの同様の試験からのイメージング結果を利用する診断手段を含む、染色体異常を検出するためのキットを含む、染色体異常を検出するためのキットを提供する。

さらなる特定の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）真核生物のゲノムＤＮＡ；（ｉｉ）複数対のフォワードおよびリバースＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドであって、前記各対の一方のプライマーが第１の真核生物のＤＮＡ鎖の標的セグメントの３配列に相補的であり、前記各対の他方のプライマーは標的セグメントの第２の鎖の３配列に相補的であり、真核生物のＤＮＡのセグメントの長さは約１００から約２５０塩基対であり、各対のプライマーの一方はその５末端に付着した色検出可能な標識を有しており、複数のプライマー対は潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを標的としており、１つの対は対照遺伝子のセグメントを標的としているプライマーオリゴヌクレオチド、ならびに（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の実施に必要なＰＣＲ緩衝液および酵素を含む構成成分を容器中で混合することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を作製するステップと、（ｂ）ＰＣＲを約５から約６０回の温度サイクルで実施して増幅ＰＣＲ産物を作製するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の前記産物を精製し、増幅二本鎖ＰＣＲ産物の１本の鎖を消化することによって色検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを得るステップと、（ｄ）マイクロアレイを、ステップ（ｃ）の産物と接触させるステップであって、マイクロアレイが複数のスポットを有しており、このスポットのそれぞれが前記標的セグメントの前記鎖の１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含むステップと、（ｅ）前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブと、前記ＰＣＲで増幅した標識含有一本鎖産物とをハイブリダイズさせるステップと；（ｆ）マイクロアレイの比色イメージングによって、マイクロアレイにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の存在および相対量を検出するステップと、（ｇ）まず前記各目的染色体について前記マイクロアレイ上の関連するスポットの前記イメージングを前記対照遺伝子に関連するスポットのイメージングと比較してＩ比を得た後、それぞれのＩ比を正常であることが知られている同様のゲノムＤＮＡの試験の結果として得られたＮ比と比較することによって、前記様々な目的染色体の１つまたは複数に関して染色体異常が存在するかどうかを診断するステップとを含むことを特徴とする、複数の染色体異常のうち任意の１つを単一のアッセイで検出する方法を提供する。

上記に概要を示したように、本発明は、時々遺伝子量異常（ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙまたはａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミーおよび性染色体異常を含めた染色体異数性の検出を容易にする。同時に、染色体突然変異、特に微小欠失症候群と呼ばれる様々な障害の１つをもたらす、遺伝子配列の一部分の欠失の形態である染色体突然変異は、冒された遺伝子領域（すなわち欠失領域）内またはそれを取り囲む標的配列を選択し、そのような欠失が起こる領域の指標である遺伝子量を内部対照および正常ＤＮＡと比較することによって検出することができる。標的とするそのような染色体の微小欠失症候群および欠失領域の一部の例には、プラダー−ウィリ症候群およびアンジェルマン症候群（欠失部位１５ｑ１１〜ｑ１３）、ウィリアム−ビューレン症候群（欠失部位７ｑ１１．２３）、ネコ鳴き症候群（欠失部位５ｐ）、カルマン症候群（欠失部位Ｘｐ２２．３）、ディジョージ症候群（欠失部位２２ｑ１１．２）、デュシェーヌ／ベッカー症候群（欠失部位Ｘｐ２１）、およびステロイドスルファターゼ欠損症（欠失部位Ｘｐ２２）が含まれる。一部の比較では、同じ性別の対照の正常ＤＮＡに対して行うことが最もよい。

以下の用語および頭字語の定義は、本明細書中以下に記載する詳細な説明のより良く理解するために提供する。

染色体異常とは、染色体または染色体数の任意の大きな異常性が含まれることを意図する。例えば、これには、２１番染色体のトリソミー、Ｘ染色体およびＹ染色体の異常の検出、ならびに個々の遺伝子中の欠失、挿入および／または変更などの突然変異の検出が含まれる。

本出願中で用いるハイブリダイゼーションとは、ＤＮＡの相補的な鎖間の二重鎖構造の形成を示し、２本の鎖の一方は固体表面またはマトリクス上に固定されていることが好ましい。

本明細書中で用いるアニーリングとは、プローブまたはプライマーと核酸分析物中のその相補的配列との結合を可能にするハイブリダイゼーション条件下、ゆっくりと低下する温度または単一の温度のどちらかにおける、一本鎖または熱変性した二重鎖核酸分析物とオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとのインキュベーションを意味する。

分析物または核酸分析物とは、分析の対象であるＤＮＡ試料中の化合物を記載するために用いる。

標識もしくは検出可能な標識（または「タグ」）とは、核酸配列に付着させることができ、その検出および／または定量を可能にする置換基をいう。例には、^３２Ｐ、^３３Ｐ、および^３５Ｓなどの放射標識；蛍光化合物、化学発光化合物または有色化合物などの比色指示薬；ビオチンなどのリガンド；ならびに質量または他の分光学的特性によって識別可能な化学基が含まれる。適切な標識のさらなる具体例には、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、シアニン３およびシアニン５が含まれる。標識は、プライマーの一部として直接取り込ませることによって核酸分析物内に導入することが好ましいが、化学反応、酵素反応、もしくはハイブリダイゼーションによる間接的な付加、または中間体リガンドを用いた標識のアニーリングを用いてもよい。

プローブとは、ハイブリダイゼーション反応によって核酸分析物中のその相補的配列を結合するための試薬として用いる核酸配列である。本明細書中で用いることができる捕捉プローブとは、一方の末端で固体表面に結合されており、ハイブリダイゼーション反応において相補的配列を含む核酸またはオリゴヌクレオチドを固体表面上に捕捉することを可能にするプローブ（すなわちテザー）を意味する。

配列とは、特定の順序および鎖長で連結された、ＤＮＡ中のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ残基を含む核酸中のひと続きの塩基を意味する。

相補的または相補的配列とは、ストリンジェントな条件下で二本鎖（二重鎖）構造を形成する能力を有する２つの配列をいう。

本明細書中で使用する標的、標的配列、標的鎖または標的核酸とは、その存在が検出、例えば特異的ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによる検出の対象である核酸配列をいう。用語「標的とした」とは、場合によっては広義に用いられ、染色体の特定の核酸セグメントの選択を意味する。

本明細書中で使用するテザーまたは表面テザーとは、表面上の官能基とＤＮＡプローブの一方の末端にある官能基との間に形成される共有結合または他の強力な結合を介して、一方の末端で何らかの表面と結合したオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブをいう。

固相ハイブリダイゼーションとは、二重鎖構造の形成に参加する２つの「反応鎖」のうち１つがテザーであるかまたは他の方法で固体担体上に固定されて実施されるハイブリダイゼーション反応を意味する。

フランキングまたは辺縁（ｂｏｒｄｅｒｉｎｇ）とは、染色体の標的ＤＮＡセグメントの末端の近隣にある、隣接するかつ／またはそれを含む核酸セグメントをいう。

オリゴヌクレオチドとは、化学合成することができる短いＤＮＡ鎖を意味し、典型的には約１００個のヌクレオチドまでの長さである。

遺伝子とは、タンパク質をコードしている配列、遺伝子内に差し挟まれたイントロン（非コード）配列、および遺伝子制御に機能する付加配列を含めた遺伝機能の単位を意味する。

マイクロアレイまたはＤＮＡチップとは、表面上または表面に固定したマイクロスポット上に形成された表面テザーＤＮＡプローブの二次元または三次元（３Ｄ）のアレイを意味し、これにより、典型的には小型化した様式でハイブリダイゼーション反応の多重度の同時分析が可能となり、個々のＤＮＡプローブは１ミリメートル未満の中心間の間隔で配置されている。

プライマーとは、「鋳型鎖」と塩基対合し、したがってポリメラーゼ酵素によって伸長することができる、遊離３’−ＯＨ末端を有するオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、ＤＮＡ鋳型とアニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマーは（デオキシヌクレオシド５’−三リン酸とともに）ＤＮＡポリメラーゼの基質として役割を果たすことができ、ＰＣＲ反応と同様に「プライマー伸長」をもたらす。

プライマー対とは、標的核酸セグメントの逆の鎖に結合する２つのプライマーを意味する。

ＰＣＲ断片とは、ポリメラーゼ連鎖反応によって形成された、定義された長さのＤＮＡ断片を意味する（鋳型上のプライマー開始部位間の間隔によって定義される）。

変性するまたは変性したとは、二重らせんを不安定にする条件下、最も一般的には温度上昇（「熱変性」）における、二重鎖核酸分子の２つの鎖の分離（解離）を意味する。

５’−末端（ｅｎｄ／ｔｅｒｍｉｎｕｓ）とは、そのデオキシリボース上にエステル化されていない炭素−５を有するヌクレオチドを含む核酸鎖の末端を意味する。

３’−末端（ｅｎｄ／ｔｅｒｍｉｎｕｓ）とは、そのデオキシリボース上にエステル化されていない炭素−３を有するヌクレオチドを含む核酸鎖の末端を意味する。

ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応。

ＳＳＣ−生理食塩水クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む溶液。

出願人の診断方法は、全ＤＮＡに比べて低い存在量で存在する特異的ＤＮＡ配列を最初に増幅するためにＰＣＲを利用する。ＰＣＲを用いることによって、特異的ＤＮＡ配列を１０万倍以上増幅して、出発ＤＮＡ中に存在する場合にその検出を容易にすることができる。

その開示が本明細書中に参考として組み込まれている特許文献７、特許文献８、特許文献９および特許文献１０には、本発明によって利用される現在では周知のＰＣＲ工程の詳細が開示されている。ＰＣＲは、特定の目的領域に隣接する配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してプライマーに導かれるＤＮＡ合成を逆かつ重複する方向で実行することによって、数時間内でＤＮＡ配列を数桁まで増幅する。このようなフランキング配列の知識を用いて、プライマーとして役割を果たす、通常は長さ約２０個のヌクレオチドの、２本の合成一本鎖オリグヌクレオチドを設計する。これらプライマーのそれぞれの配列は、選択されたそのそれぞれのフランキング配列と塩基対相補性を有するように選択する。ＰＣＲは、二本鎖標的ＤＮＡを変性させることによって開始され、次いで、プライマー（それぞれの鎖に１つ）を標的分析物に隣接する配列とアニーリングさせる。各プライマーは、プライマーの３ヒドロキシル末端が標的分析物の配列の方向を向いているように、１つのフランキング配列と二重鎖を形成する。ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の追加により、プライマーの位置から開始して標的配列をわたって伸長される新しいＤＮＡ鎖の形成が引き起こされ、したがって標的のコピーが作製される。これらのステップ、すなわちＤＮＡの変性、プライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによる伸長が、１つのＰＣＲサイクルを表し、各ステップは適切な温度で実施される。伸長産物は一般に、標的配列の他方の末端の位置のプライマーに相補的な配列まで伸長し、それを含むようになる。したがって、新しい伸長産物のそれぞれが、変性の後の次のサイクルの鋳型として作用する。

高温の鋳型変性の繰返しサイクル、オリゴヌクレオチドプライマーの再アニーリング、およびポリメラーゼで媒介される伸長を用いることによって、ＤＮＡ配列を数１０万倍、忠実に増幅することができる。一般に、ＰＣＲは、各鋳型について２つの異なるプライマー、すなわちセンス鎖用のフォワードプライマー１つおよびアンチセンス鎖用のリバースプライマー１つを設計できるように、鋳型または増幅するセグメントの５末端および３末端のどちらの配列の情報も要する。

本発明のＰＣＲ工程は、所望の目的ＤＮＡセグメントのＤＮＡ合成の開始点として作用する能力を有する、様々なオリゴヌクレオチドを含む複数のプライマー対を用いる。これらのそれぞれが、増幅を所望する二重鎖セグメントの２つの３辺縁のうち１つに相補的であり、これらはしばしばフォワードプライマーおよびリバースプライマーと呼ばれる。フォワードプライマーは遺伝子の５領域から３領域に向かう方向であり（すなわち、これらは非コード鎖またはアンチセンス鎖に相補的である）、リバースプライマーは遺伝子の３領域から５領域に向かう方向である（すなわち、これらはコード鎖またはセンス鎖に相補的である）。プライマー伸長が誘導される条件下でプライマーを他のＰＣＲ試薬、すなわち、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（またはその類似体）、適切なポリメラーゼおよび適切な緩衝液（「緩衝液」には所望のｐＨおよびイオン強度などをもたらす薬剤が含まれる）と合わせ、適切な温度で維持する。ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼまたは同等のポリメラーゼであるＰＣＲ方法では、緩衝液は、１．５〜２ｍＭのマグネシウム塩、好ましくはＭｇＣｌ_２、１５〜２００ｃＭの各ヌクレオシド三リン酸、１ｃＭの各プライマー、および例えば５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．４、ならびに１００ｃｇ／ｍｌのゼラチンを含んでいてもよい。ＰＣＲ増幅を行うためのこのようなキットは数々の販売会社から販売されている。

ヒト染色体異常を検出するための適切なオリゴヌクレオチドプライマーは、現在利用可能な配列情報ならびにプライマー配列の設計および最適化を行うための当分野で知られている標準技術を用いて、容易に設計することができる。オリゴヌクレオチドは、当分野で知られている標準方法、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ（カリフォルニア州Ｎｏｖａｔｏ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）等から販売されているものの１つなどの自動ＤＮＡ合成機を用いることによって合成することができる。本発明で用いるプライマーは、特定の関心が持たれる障害の指標となる染色体のＤＮＡセグメントに近接する選択されたフランキング部位で１本の鎖に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さである。このようなＤＮＡセグメントの長さは、わずか１４、１５、１６、１７、１８または１９塩基対でありうるが、多くの場合、通常は２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個以上のヌクレオチドが含まれる。多くの場合、増幅するＤＮＡセグメントは１００から２５０個のヌクレオチド塩基対（ｂｐ）であるが、例えば異数性について分析する場合など、５０から３００ｂｐのセグメントを増幅することを所望してもよい。短くてもよいプローブおよびプライマーの長さは１４、１５、１６、１７、１８または１９個のヌクレオチドであるが、通常は少なくとも２０、３０、４０、もしくは５０個のヌクレオチドまたはそれ以上を含む。

各プライマーは、適切なポリメラーゼおよび上述のものなどの他の薬剤の存在下で伸長ＤＮＡ産物の合成を開始するまたは初回刺激を行うのに十分に長くあるべきである。周知のとおり、適切なプライマー長は多数の要因に依存する。典型的には、本方法の実施においては、用いるプライマーは通常約１５〜４０個のヌクレオチド残基を含む。比較的短いプライマー分子は、一般に、鎖の伸長反応を支援するプライマー−鋳型の複合体を形成および維持するためにより低い反応温度を必要とする。

用いるプライマーは、増幅する選択された配列を含む核酸に実質的に相補的でなければならない。すなわち、プライマーは選択された配列（またはその補体）を含む核酸と結合、すなわちハイブリダイズしなければならない。プライマー配列は必ずしも鋳型の正確な補体である必要はないが、例えば、非相補的ヌクレオチド断片または他の部分がプライマーの５末端に付着していてもよい。しかし、プライマー配列の残りは選択された核酸配列に相補的であることが好ましく、そのようなプライマーが典型的に用いられる。

一般に、核酸配列に沿った所望の相対位置に位置する所望配列の異なる鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが調製できるように、配列の両末端における十分な数の塩基が十分詳細に知られている限りは、ＰＣＲ工程によって任意の特異的核酸配列を増幅することができる。その結果、一方のプライマーから合成した伸長産物は、その鋳型（補体）からそれを分離した後、次のサイクルにおいて、前記各対の他方のプライマーを、定義された長さの核酸へと伸長させるための鋳型として役割を果たす。

本発明の好ましい実施形態では、プライマーは対で用いる。プライマーの一方、すなわちフォワードプライマーは、標的ＤＮＡセグメントのアンチセンスの３末端の配列に相補的である。この配列は標的セグメントのアンチセンス鎖の３末端に近隣する、隣接するかつ／またはそれを含む。前記各対の他方のプライマー、すなわちリバースプライマーは、標的ＤＮＡセグメントのセンス鎖またはコード鎖の３末端の配列の補体である。これは、標的セグメントのセンス鎖の３末端を含む、それに隣接するかつ／または近隣する。

プライマーの長さは好ましくは約１５から約４０個のヌクレオチドであり、より好ましくは約１８から約３５個のヌクレオチドの長さである。マイクロアレイ上のスポットに付着またはテザーされているプローブの長さは、好ましくは約２５から約６０個のヌクレオチドであり、より好ましくは約３５から約５０個のヌクレオチドの長さである。標識した産物を捕捉するためのプローブ配列は、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするほどに十分なヌクレオチドを含んでいるべきである。プローブは２Ｄアレイなどの平坦な基材の表面に付着させることができるが、本明細書中で以下に言及する３Ｄアレイが好ましい。

胎児ＤＮＡなどのヒトＤＮＡ、多くの場合羊水または場合によっては母体血液から得た出生前ＤＮＡは、多数の販売会社から入手可能な種類の市販のＤＮＡ精製キットを用いて適切に精製する。真核生物のゲノムＤＮＡの濃度は、蛍光計および染色剤としてのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素を用いて評価する。あるいは、ＤＮＡは標準のＤＮＡ抽出技術によって胎児細胞から抽出することができ、細胞は羊水穿刺などの適切な手順によって得る。適切な希釈後、精製した胎児ＤＮＡのアリコートをＰＣＲ反応管に加える。本発明の好ましい実施形態では、加えた反応用構成成分には適切な濃度の酵素および緩衝液が含まれ、これには所望のｐＨおよびイオン強度、他の反応状態を維持するための薬剤、ならびに適切な量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が含まれる。

プライマー組は、目的の障害の指標となる特異的染色体のセクションまたはセグメントに特異的となるように選択する。例えば、存在する全染色体のコピー数を定量的に比較することを所望してもよい。あるいは、正常な染色体と比較して欠損している染色体の小さなセクションが存在することができるかどうかを決定することを所望してもよい。この目的を達成するために、分析する状態の指標となる標的領域に隣接するようなプライマーを適切に選択する。さらに、全体のプライマー組は対照遺伝子を増幅するように設計した１つの対を含む。対照遺伝子は、ヒト真核生物のＤＮＡ中に存在し、好ましくは遍在的に発現され、障害の診断に用いられている標的セグメントが存在する染色体以外の染色体上に存在する遺伝子である。１つの好ましい遺伝子は、１２番染色体上に見つかるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）である。

対照遺伝子ＧＡＰＤの適切なフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ、ならびに５つの例示的な異数性の染色体異常を診断するために用いることができるプライマー対の例を本明細書中で以下に記載する。

ＧＡＰＤについては、プライマーは以下のオリゴヌクレオチド配列、すなわち配列番号１および２を有することができる。対応するプローブ配列は、以下の配列、すなわち配列番号１９を含むことができる。

女性における異常な数のＸ染色体に関するターナー病もしくはトリプルＸ病、または男性が複数のＸ染色体を有するクラインフェルター症候群には、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの対を用いてＸｐ２２領域が含まれる１５８ｂｐのＰＣＲ断片を産生することができる。プライマーは、以下の配列、すなわち配列番号３および４を有することができる。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２０を含むことができる。

男性および女性を識別し、一部の稀な症例ではクラインフェルター症候群を診断するために、配列番号５および６であるプライマー対を用いてＹ染色体上のＳＲＹ遺伝子に関連する１４８ｂｐのＰＣＲ断片を産生する。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２１を含むことができる。

パトー症候群、すなわち１３トリソミーを診断するために設計した、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子に関連する１２７ｂｐのＰＣＲ断片の産生をもたらすプライマー対は、配列番号７および８である。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２２を含むことができる。

エドワード症候群、すなわち１８トリソミーを診断するために設計した、ＷＤＲ７遺伝子に関連する１５４ｂｐのＰＣＲ断片の産生をもたらすプライマー対は、配列番号９および１０である。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２３を含むことができる。

ダウン症候群または２１トリソミーを診断するために設計した、ＳＯＤ１遺伝子に関連する１２４ｂｐのＰＣＲ断片の産生をもたらすプライマー対は、配列番号１１および１２である。対応するプローブ配列は、以下の配列、すなわち配列番号２４を含むことができる。

本明細書中で以下に、ヒト染色体中の微小欠失を分析するために設計した特定のプライマー対の例を記載する。

ネコ鳴き症候群については、５番染色体上の潜在的に欠失部位が現れるＴＡＳ２Ｒ１遺伝子の領域を標的とした１６７ｂｐのＰＣＲ断片を作製するために用いることができる適切なプライマー対は、配列番号１３および１４である。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２５を含むことができる。

ウィリアムズ−ビューレン症候群については、７番染色体上の潜在的に欠失部位が現れるＥＬＮ遺伝子の領域を標的とした１３８ｂｐのＰＣＲ断片を作製するために用いることができる適切なプライマー対は、配列番号１５および１６である。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２６を含むことができる。

ディジョージ症候群には、２２番染色体上に潜在的に欠失部位が現れるＤＧＣＲ２遺伝子の領域を標的とした１４５ｂｐのＰＣＲ断片を作製するために用いることができる適切なプライマー対は、配列番号１７および１８である。対応するプローブは、以下の配列、すなわち配列番号２７を含むことができる。

前述のフォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに対応するプローブの組は、本発明の様々な特徴を具体化するアッセイで用いるために十分であると考えられるが、最初の研究が実施されて以来、現在では３組の好ましいプライマーおよび対応するプローブの組が、これらの異常のうち３つを診断するために開発されており、１組が、異なるマーカー、すなわちＦＧＦ９遺伝子を用いてパトー症候群（１３トリソミー）についてアッセイを行うために開発されている。このプライマーおよびプローブの群は、必要最低限量のＤＮＡのみがアッセイに利用可能である場合に好ましい。これら４組のプライマーおよびプローブの組は本明細書中で以下に記載されており、以下の４つの遺伝子、すなわちＳＲＹ、ＦＧＦ９、ＷＤＲ７およびＳＯＤ１上の異常についてアッセイを行うために用いられる。これら４組は、現在、そのそれぞれの障害の診断に好ましい。

ＳＲＹ：配列番号２８および２９のプライマー、配列番号３６のプローブ。これらのプライマーにより１７５ｂｐのＰＣＲ断片が産生される。

ＦＧＦ９：配列番号３０および３１のプライマー、配列番号３７のプローブ。これらのプライマーにより１３９ｂｐのＰＣＲ断片が産生される。

ＷＤＲ７：配列番号３２および３３のプライマー、配列番号３８のプローブ。これらのプライマーにより１７２ｂｐ塩基のＰＣＲ断片が産生される。

ＳＯＤ１：配列番号３４および３５のプライマー、配列番号３９のプローブ。これらのプライマーにより１２９ｂｐのＰＣＲ断片が産生される。

１３番染色体上のＡＴＰ７Ｂ遺伝子を標的とするものを置き換えて、代わりにＦＧＦ９遺伝子を標的とする別のプライマーおよびプローブの組が開発されている。この組は、少なくとも約１０ｎｇのＤＮＡがアッセイに利用可能である場合に好ましい可能性があり、配列番号４０および４１のプライマーならびに配列番号４２のプローブからなる。

アッセイを容易にするために、必要な用具がすべて含まれるキットを提供する。例えば、複数の染色体異常を検出するためのキットは、
（ａ）哺乳動物ゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応においてフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する複数対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって（これらのプライマーは、潜在的な染色体異常の指標である様々な目的哺乳動物染色体の標的ＤＮＡセグメントを増幅するように設計し、１つの対は対照遺伝子を増幅することを標的とする）、各対の一方のプライマーはその５末端に共有結合した検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）ＤＮＡｃＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、ならびに（ｉｉｉ）比色量子化を実施するための緩衝液および酵素；
（ｃ）複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイ（および好ましくは２つの、２つ組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）のマイクロアレイ）であって、スポットの少なくとも１つが、それに付着した、標識を保有する、それぞれの標的としたゲノムＤＮＡセグメントの増幅した鎖に相補的なＤＮＡプローブ配列を有するマイクロアレイ；ならびに
（ｄ）ＰＣＲ増幅産物とマイクロアレイ上のそれぞれのスポットとのハイブリダイゼーション反応からの強度イメージング結果を用いた染色体異常の診断手段であって、正常ゲノムＤＮＡの同様の試験からのイメージング結果を利用する診断手段
を含んでいるべきである。

マイクロアレイは複数のマイクロスポットを有しており、スポットにはＤＮＡプローブが付着している。これらのプローブのそれぞれが増幅したＤＮＡの標識した鎖の１つに相補的である。標的に対するプローブが平坦な基材またはマイクロタイタープレートのウェル中に直接結合している二次元アッセイを含めた、標識したＤＮＡ標的に対する開発された無数のアレイのうち任意のものを用いることができるが、三次元バイオチップを提供することが好ましい（例えば、特許文献１１および「三次元様式バイオチップ」と題する特許文献１２に記載のもの）。このような三次元アレイでは、プローブはプレート中のウェルもしくはスライドガラスまたは他の平坦なプレートの固体表面に連結されておらず、その代わりに重合ヒドロゲルのマイクロスポットに付着させることによって三次元アレイ中に提供されている。この配置により、プローブが固体基材から隔離され、プローブの提示および標識した分子の最終的な捕捉のために拡大した表面積が提供される。好ましくは、アッセイで用いる様々な標的のそれぞれについて、複数のこのような３Ｄマイクロスポットを各スライドガラス上またはマイクロウェルプレートの各ウェル中に提供する。

キットの分類された部分の一部として供給される、プライマー組およびマイクロアレイ以外の品目は、市販されており、任意のＰＣＲキットの一部として一般に含められる周知の品目である。これらは、現在では周知のＰＣＲ工程の詳細を提供している上記の４つのＵ．Ｓ．文献の群（特許文献７、特許文献８、特許文献９および特許文献１０）に記載されている。上述のように、キットにはハイブリダイゼーション反応を促進するための適切な化学薬品も含まれる。ハイブリダイゼーション溶液をスライドまたはウェルとともにインキュベーションを行った後、洗浄を実施して結合していない標識した標的物質を除去し、これにより、得られたスライドを、例えば蛍光色素を用いた場合は蛍光検出器を用いることによって、またはキット用に選択された特定の標識の性質に応じて他の適切な検出器を用いることによって、任意の適切な方法で観察することができる。キットには、その後マイクロアレイの比色走査の結果を解釈するために用いる適切なアルゴリズムが提供されている。そのようなアルゴリズムが開発されており、対照試料から事前に作成したデータに基づいている。

異数性または微小欠失から生じる複数の染色体異常のうち任意の１つを検出するために用いることができる本発明の様々な特徴を有するアッセイ手順の一例として、まず少量の真核生物のゲノムＤＮＡを得る。これは、胎児源または他の源から得ることができ、頻繁には、羊水から得たゲノムＤＮＡを分析するためにこのアッセイを用いる。少なくとも約０．１ナノグラムのゲノムＤＮＡで十分であると考えられるが、そのような量が利用可能な場合は１０ｎｇもの量でも用いることができる。ＤＮＡは、市販のものなどの精製キットを用いて通常どおりに精製する。精製後、濃度および純度を適切に評価し、純度および濃度の肯定的表示が得られた後、多重ＰＣＲ反応を実施する。

約５０マイクロリットルの体積を有する反応チャンバを用いることができ、この中に、市販のＰＣＲ系の成分を、調査が所望される潜在的な障害の指標となる様々な染色体の標的領域に隣接するように設計された複数のプライマー対の組とともに加える。これらのプライマー対は当然、アッセイキットの一部として提供するマイクロアレイ上のスポットと連結させるプローブと協調している。プローブは、例えば微小欠失を調査する場合は、好ましくは潜在的に欠失が生じる領域中の正常なアンチセンス鎖のセグメントに結合するように設計し、したがって、プローブの位置で測定した強度が実質的に低い場合にこのような微小欠失の発生の指標となる。このようなプライマー対を任意数で、例えば１００対以上のこのような対を含めることができる。しかし、約５から２５対の異なる対を単一キットの一部として含めることがより一般的であろう。目的染色体異常の指標として選択されたこのような複数のプライマー対にくわえて、選択された対照遺伝子に特異的な１対のプライマーも含める。各プライマー対は、約５０から３００塩基対の範囲、より好ましくは約１００ｂｐから２５０ｂｐ、最も好ましくは約１２０ｂｐから２００ｂｐのＤＮＡ配列の増幅をもたらす染色体上の位置に結合するように選択されることが好ましい。それぞれ約１ｃＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを提供する。当然、市販のＰＣＲ系キットには、適切な量のデオキシリボヌクレオシド基質、Ｔａｑなどの適切な酵素、好ましくはホットスタートが可能なポリメラーゼ、および緩衝液が含まれる。

各対のプライマーの一方を標識し、前記各対の他方のプライマーを５−リン酸で誘導体化する。好ましい実施形態では、フォワードプライマーを５リン酸化し、リバースプライマーを検出可能な標識と共有結合させる。本明細書中に定義で既に示したが、含めることができる検出可能な標識が多種多様に存在し、好ましくは、比色標識を用い、より好ましくは、シアニンなどの蛍光標識を用いる。

一般に、ＰＣＲ複製工程を約５から６０回の温度サイクルで実施する。多くの場合、実施する調査を容易にするために様々な増幅した核酸配列を所望量で作製するには、約２０〜３０回のサイクルで十分である。ＰＣＲ増幅が完了した後、例えば１００塩基対またはそれ以上の大きさを有する分子を保持するように設計したカラム精製などの標準の手順を用いて、二本鎖産物を精製する。このような精製を容易にするために市販のキットが利用可能である。

精製後、その目的に適したエキソヌクレアーゼを用いて精製した物質のセンス鎖を消化する。このステップの結果、ＰＣＲ増幅の一本鎖産物が得られる。消化後、消化した混合物をハイブリダイゼーション緩衝液で適切に希釈する。エキソヌクレアーゼを失活させ、一本鎖産物を変性させるために、生じた溶液を約５から１０分間、約９５℃の温度まで加熱する。生じた標識したアンチセンス鎖をハイブリダイゼーション溶液に溶かし、２つ組マイクロアレイの対を平行して用いることができるようにこれを２つの等量に分割することが好ましい。各マイクロアレイとのハイブリダイゼーションを、適切な緩衝液を含むこの溶液中で、約１０から２０時間、好ましくは約１４から１６時間の間、４５℃などの適切な温度で実施する。ハイブリダイゼーション後、緩衝液を含む溶液を用いて各マイクロアレイを複数回洗浄し、レーザースキャナーまたは他の同等の装置を用いた蛍光イメージングに供する。当然、異なる種類の比色分析標識を用いた場合、または代わりに放射標識もしくは他の既知の部類の標識を用いた場合は、適切なスキャナー／検出器を代わりに用いる。

好ましいアッセイ手順では増幅二本鎖ＰＣＲ産物のセンス鎖を消化するので、マイクロアレイには、調査する核酸の各ストレッチのセンス鎖の選択されたセグメントおよび選択された対照遺伝子のセンス鎖の適切なセグメントであるプローブを提供する。開示したプライマー対とともに用いるための対応するプローブの例は、本明細書中に既に記載した。一般に、プローブの長さは約２５から約６０個のヌクレオチドの範囲である。２つ組マイクロアッセイを平行して実行した後、各マイクロアレイ上のプローブの蛍光強度を記録し、その後、ルールベースアルゴリズムを用いてこれらのイメージング結果を診断に使用する。

各プローブのシグナル強度は、記録された値を内部標準のシグナル強度、例えば１２番染色体上のＧＡＰＤ遺伝子のセンス鎖のセグメントであるプローブを有するスポットにおけるシグナル強度で除算することによって初期正規化を行う。この初期計算により、選択された内部標準に対する比の形で各プローブの値が生じ、これはそれのＩ比と呼ばれる。

その後、２つの２つ組スライドのそれぞれ上の同じプローブについて、得られたＩ比を比較した。Ｘ染色体およびＹ染色体について、２つ組スライド間で特定のプローブのこれらの比に３０％を超えるばらつきが存在する場合は、これらの値は信頼できない可能性があると考えられ、さらなる計算から排除される。同様に、他の染色体上の標的セグメントについて特定のプローブのＩ比のばらつきが２０％を超える場合は、この特定のプローブも同様にさらなる計算および分析から排除する。このような排除の後に残った値について、２つのＩ因子を平均し、それ以降この値を用いる。

このような未知の試料から得た結果を分析するための基準を提供するために、まず正常であることが知られているＤＮＡの組で分析を行い、これらの結果を用いて選択されたＤＮＡ配列のそれぞれに関する正常比を決定する。例えば、１２個の正常な男性試料で分析を行い、各試料に関して、内部標準（ここではＧＡＰＤ遺伝子が選択された）に対する各プローブの比を計算した。その後、これら１２個の比を平均して正常な男性ＤＮＡ試料から期待される「正常比」（Ｎ比）を得た。１２人の正常な女性由来のＤＮＡを分析する同様の工程を実施した。これらの値を同様に平均し、これらを用いて正常な女性ＤＮＡから期待されるＮ比を得た。

分析の次のステップとして、内部標準に対して分析中の未知のＤＮＡから得た初期比（Ｉ比）をそれぞれ同じ性別の人のＮ比で除算して、換算係数（Ｃ因子）と呼ばれる因子を得た。この手順を用いて各プローブのＣ因子を計算した。これらのＣ因子のそれぞれが約１．２５から０．７５であるべきと考えられ、この範囲外のすべてのＣ因子は異常であると決定され、その後の分析から排除される。内部対照遺伝子を表すプローブ以外のマイクロコアレイ上の各プローブについてＣ因子を計算した後、これらをすべて平均して平均Ｃ因子を得た（これは当然０．７５から１．２５となる）。２つ組マイクロアレイの１つの組についてこの平均Ｃ因子が確立された後、最初に得られた最初の平均Ｉ比のそれぞれをこの平均Ｃ因子で除算して、それぞれの調整比（Ａ比）が得られた。この特定のステップは、マイクロアレイの任意の特定の製造実行における内部標準のばらつきから生じる可能性がある、全体のばらつきを低下させるのに有効であることが判明した。このようにして、全体的な変動係数が約２〜４％低下し、これは有意義であると考えられる。

平均Ｃ因子を用いてＡ比を得るＮ比のこの調整を行った後、正常比の値から２５％を超えて逸脱するすべての比の値はゲノムＤＮＡ試料がその特定の標的セグメントに関して異常であることの指標であるとする、別のルールを用いて各プローブの診断を実施した。例えば、２つの２つ組マイクロアレイで用いた内部標準に対する、男性試料の２１番染色体の指標であるプローブのシグナルのＩ比が１．０１であり、またこの特定の試験手順において平均Ｃ因子が１．１０であると計算された場合、２１番染色体プローブの比の再調整は以下のように表される：１．０１／１．１０＝０．９２（Ａ比）。その後、Ａ比（すなわち０．９２）を、約０．６８であると事前に判明している正常な男性試料の２１番染色体プローブのシグナルのＮ比と比較する。したがって、この値が正常比よりも約３５％高いことを見ることができ、それによりこの試料は２１トリソミーの指標であると診断される。興味深いことに、２１トリソミーの理論値は一般に約１．０２であると認められており、これは、分析の結果として得られた再調整比０．９２に十分近い。

各プローブから得られた値の分析を同様に実施し、その結果、単一のアッセイ手順におけるこれらの選択された潜在的な障害のそれぞれに関して染色体異常の有無の診断が可能である。例えば、トリソミー障害が検出された場合は、それぞれのプローブにおける強度は実質的に高くなり、他の突然変異上の微小欠失が見つかった場合は、それぞれのプローブの強度は実質的に低くなる。マイクロアレイを用いたこの試験手順の有効性を立証するために、今回、本明細書中で既に言及した８つの特異的な染色体異常のそれぞれを有するＤＮＡを用いて試験を実施し、得られた試験結果により、正常であることが知られている２４個のＤＮＡ試料に関して、および特定の異常を含むことが知られている４８個の異なるＤＮＡ試料に関して、１００％の感度および１００％の特異性が実証された。現在までに８つ潜在的な染色体異常のみが試験されているが、他の異数性および／または微小欠失の状態も単一のマイクロアレイ上で行うこのような試験の一部として容易に含めることができることは明らかであり、同様の検出および診断が得られることが完全に期待される。

以下の実施例は、９つもの異なる染色体に向けられたプローブおよびプライマーの組であって、そのうち８つは潜在的な障害に向けられている組を用いた、本発明を実施する現在知られている最良の形態を提供するために提示する。しかし、これらの実施例は例示目的のみで提示し、いかなる様式でも当然本明細書に添付の特許請求の範囲によって定義されている本発明の範囲を限定するとみなすべきでないことを、理解されたい。

８つの異なる染色体に関して異数性または微小欠失から生じる染色体異常のうち任意の１つを検出するために用いることができるアッセイ手順の一例として、１０ｎｇの真核生物のゲノムＤＮＡを得て、通常どおりに精製した。精製後、表１の配合物を用いて多重ＰＣＲ反応を実施した。

約５０マイクロリットルの体積を有する反応チャンバを用いた。プライマーミックス中のプライマー対、すなわち配列番号１から配列番号１８は、調査のために選択された様々な染色体の標的領域に隣接するように設計した。

プライマーミックス（１０×）中の濃度は、１．２５ｃＭから２．５ｃＭの範囲であった。市販のＰＣＲマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）には、適切な量のデオキシリボヌクレオシド基質、Ｔａｑなどの適切な酵素、および緩衝液が含まれていた。フォワードプライマーは５−リン酸化されており、リバースプライマーは蛍光標識、すなわちシアニン（Ｃｙ−３）と共有結合させた。ＡＢＩ９７００サーモサイクラーを用いて全構成成分の混合物を増幅した。ＰＣＲサイクルの時間および温度は以下のとおりであった：
９５℃で１１分；９６℃で１分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７０℃で３０秒、１０サイクル；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７０℃で３０秒、１３サイクル；６０℃で１０分。

ＰＣＲ増幅が完了した後、二本鎖の増幅された物質をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製した物質のセンス鎖をλエキソヌクレアーゼ（１．５ｃＬ、１ｃＬあたり５単位、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で３０分間、３７℃で消化した。

生じた標識した単鎖物質を３×ＳＳＣおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むハイブリダイゼーション溶液に溶かし、２つの等しいアリコートに分割した。各試料を、９つの異なるプローブ、すなわち配列番号１９から配列番号２７が別々の位置で結合された３Ｄマイクロアレイとハイブリダイズさせ、４５℃で１４時間インキュベーションを行った。１×ＳＳＣおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む洗浄溶液で１５分間、３７℃で洗浄することによって、結合していない標的を除去した。その後、これらを１０ｍＭのＭｇＣｌ_２および５ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０でさらに１回、１５秒間、室温で洗浄した。乾燥後、それぞれのハイブリダイズさせた３Ｄマイクロアレイ（ＡおよびＢ）の蛍光イメージをレーザースキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）Ｌｉｔｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で得た。

イメージを以下のようにルールベースアルゴリズムを用いて分析した。

まずＧＡＰＤのシグナルに対するそれぞれの遺伝子のシグナルの比を計算した。結果を表３に示す。

その後、平均比およびそれぞれの遺伝子の値間の％差を計算した。

この試料では、％差はいずれも高いばらつきを示さなかった。

この試料では、ＳＯＤ１を除いたすべての遺伝子のＡ比がＮ比の約１５％以内であり、これは、これらの遺伝子によって表される障害が試料中に存在しないことを意味する。ＳＯＤ１のＡ比は０．９２であり、これはＮ比からの０．６８よりも３５％高い。この％差異の規模により、この試料が２１トリソミーに罹患した対象由来であることが示される。さらに、２１トリソミーの理論値は０．９３である。試験したＤＮＡは実際に２１トリソミーに罹患した対象のＤＮＡを有することが後に示されたので、この試験は、このキットを用いた診断方法が有効であると承認すると考えられる。

別の例として、８つの異なる染色体を標的としたプライマーおよびプローブを用いた、実施例１に記載のものと同様のアッセイを実施した。１０ｎｇの真核生物のゲノムＤＮＡを得て、通常どおりに精製した。精製後、実施例１と同じ配合物を用いて多重ＰＣＲ反応を実施した。

約５０マイクロリットルの体積を有する反応チャンバを用いた。実施例１で用いたものと同じプライマーミックスを用い、プライマー対は、調査する９つの染色体の標的領域に隣接するように設計した。

プライマーミックス中の濃度は、１．２５ｃＭから２．５ｃＭの範囲であった。市販のＰＣＲマスターミックスには、適切な量のデオキシリボヌクレオシド基質、Ｔａｑなどの適切な酵素、および緩衝液が含まれていた。フォワードプライマーは５−リン酸化されており、リバースプライマーは蛍光標識、すなわちシアニン（Ｃｙ−３）と共有結合させた。

精製した物質のセンス鎖のＰＣＲ増幅、精製および消化を実施例１と同様に実施した。

生じた標識した単鎖物質を３×ＳＳＣおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むハイブリダイゼーション溶液に溶かし、２つの等しいアリコートに分割した。４５ｃＣで１４時間インキュベーションを行うことによって、各試料を、９つの異なるプローブが別々の位置で結合された、実施例１で用いたものと同じ３Ｄマイクロアレイとハイブリダイズさせた。１×ＳＳＣおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む洗浄溶液で１５分間、３７ｃＣで洗浄することによって結合していない標的を除去した。乾燥後、それぞれのハイブリダイズさせた３Ｄマイクロアレイ（ＡおよびＢ）の蛍光イメージをレーザースキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）Ｌｉｔｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で得た。

イメージを以下のようにルールベースアルゴリズムを用いて分析した。

まずＧＡＰＤのシグナルに対するそれぞれの遺伝子のシグナルの比を計算した。結果を表７に示す。

その後、平均比および各遺伝子の値間の％差を計算した。

この試料では、％差はいずれも高いばらつきを示さなかった。

この試料では、ＳＲＹ遺伝子の欠如により対象が女性であったことが示される（Ｙ染色体が存在しない）。ＤＧＣＲ２を除いた残りの遺伝子すべてのＡ比は、Ｎ比の約１２％以内であり、これは、これらの遺伝子によって表される障害が試料中に存在しないことを意味する。ＤＧＣＲ２のＡ比は０．２２であり、これはＮ比からの０．３２よりも３１％低い。この％差異の規模により、この試料がディジョージ症候群に罹患した対象由来であることが示される。

試験したＤＮＡは実際にディジョージ症候群に罹患した女性対象の組織由来のものであることが後に示された。したがって、この試験は、このキットを用いた診断方法が有効であると承認すると考えられる。

実施例１で用いたものと同じＤＮＡの０．３ｎｇの試料を得て、上記実施例１に記載したように精製し、増幅し、消化し、ハイブリダイゼーション用に調製した。しかし、本手順では、遺伝子ＧＡＰＤ、ＸＰ２２、ＳＲＹ、ＦＧ９、ＷＤＲ７、およびＳＯＤ１のみについてアッセイを実施した。プライマーミックスに含まれるプライマー組は、配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号２８および２９、配列番号３０および３１、配列番号３２および３３、ならびに配列番号３４および３５であった。

適切な緩衝液を含む得られたハイブリダイゼーション溶液をここでも２つの等しいアリコートに分割した。各アリコートを、６つの異なるプローブが別々の位置で結合された３Ｄマイクロアレイとハイブリダイズさせた。用いたプローブは、配列番号１９および２０ならびに配列番号３６から３９であった。インキュベーションを以前と同様に実施し、結合していない標的を同様の方法で洗浄によって除去した。乾燥後、各マイクロアレイを実施例１で用いたレーザースキャナーで走査し、その蛍光イメージを得た。

結果を、実施例１に関して記載したものと同様の方法で、ルールベースアルゴリズムを用いて分析した。ここでも、結果は４つの遺伝子のＡ比はＮ比の１５％以内であり、ＳＯＤ１のＡ比は例外的であった。その結果、ゲノムＤＮＡの０．３ｎｇの試料を用いた試験によっても、これが２１トリソミー（ダウン症候群）に罹患した対象の試料であることが診断された。

本発明では、本発明を実施するための本発明者に現在知られている最良の形態を構成する、一部の好ましい実施形態に関して記載したが、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を逸脱せずに、当業者には明らかであろう様々な変更および改変を行うことができることを理解されたい。例えば、少なくとも本明細書中に記載した配列の全体を含むプローブを用いることが好ましいが、所望する場合は、記載した配列の大部分を含むプローブも用いることができる。参考としてすべての米国特許および出願ならびに論文の開示は、明確に本明細書中に参考として組み込む。

配列表の簡単な説明
配列番号１および配列番号２は、ヒトＧＡＰＤ遺伝子の１３９塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号３および配列番号４は、Ｘ染色体の１５８塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号５および配列番号６は、ヒトＳＲＹ遺伝子の１７１塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号７および配列番号８は、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子の１２７塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号９および配列番号１０は、ヒトＷＤＲ７遺伝子の１５１塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号１１および配列番号１２は、ＳＯＤ１遺伝子の１２４塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号１３および配列番号１４は、ヒトＴＡＳ２Ｒ１遺伝子の１６７塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号１５および配列番号１６は、ＥＬＮ遺伝子の１３８塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号１７および配列番号１８は、ＤＧＣＲ２遺伝子の１４５塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号１９から配列番号２７は、マイクロアレイプレート上のスポットに付着するように設計した５末端と、１本の鎖の消化後にそれぞれの増幅ＰＣＲ産物にハイブリダイズすることができる３領域とを有するプローブオリゴマーである。

配列番号２８および配列番号２９は、ヒトＳＲＹ遺伝子の１７５塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号３０および配列番号３１は、ＦＧＦ９遺伝子の１３９塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号３２および配列番号３３は、ヒトＷＤＲ７遺伝子の１７２塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号３４および配列番号３５は、ＳＯＤ１遺伝子の１２９塩基対のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号３６から配列番号３９は、マイクロアレイプレート上のスポットに付着するように設計した５末端と、１本の鎖の消化後にそれぞれの増幅ＰＣＲ産物にハイブリダイズすることができる３領域とを有するプローブオリゴマーである。

配列番号４０および配列番号４１は、ＦＧＦ９遺伝子のセグメントを増幅するためのプライマーである。

配列番号４２は、マイクロアレイプレート上のスポットに付着するように設計した５末端と、１本の鎖の消化後にＦＧＦ９遺伝子のＰＣＲで増幅したセグメントにハイブリダイズすることができる３領域とを有するプローブオリゴマーである。

Claims (21)

1. ａ．（ｉ）真核生物のゲノムＤＮＡ；
   （ｉｉ）複数対のフォワードおよびリバースＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドであって、前記各対の一方のプライマーは前記真核生物のＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖の標的セグメントの３配列に相補的であり、前記各対の他方のプライマーは前記標的セグメントの第２の鎖の３配列に相補的であり、前記真核生物のＤＮＡのセグメントの長さは約５０から約３００塩基対であり、各対の前記プライマーの一方はその５末端に付着した検出可能な標識を有しており、複数の前記プライマー対はそれぞれ潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを標的としており、１つの対は対照遺伝子のセグメントを標的としているプライマーオリゴヌクレオチド；ならびに
   （ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の実施に必要なＰＣＲ緩衝液および酵素；
   を含む構成成分を容器中で混合することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を作製するステップと：
   ｂ．ＰＣＲを約５から約６０回の温度サイクルで実施して増幅ＰＣＲ産物を作製するステップと；
   ｃ．ステップ（ｂ）の前記産物を精製して検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを得るステップと、
   ｄ．マイクロアレイをステップ（ｃ）の産物と接触させるステップであって、前記マイクロアレイは複数のスポットを有し、このスポットのそれぞれが前記標的セグメントのそれぞれの前記鎖の１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含むステップと；
   ｅ．前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブと、前記ＰＣＲで増幅した標識含有一本鎖産物とをハイブリダイズさせるステップと；
   ｆ．前記マイクロアレイのイメージングを行うことによって、前記マイクロアレイにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の存在および相対量を検出するステップと；
   ｇ．選択された染色体の前記各標的セグメントについて前記マイクロアレイ上の関連するスポットの前記イメージングを、前記対照遺伝子に関連するスポットの前記イメージングと比較し、その後、正常であることが知られているゲノムＤＮＡの同様の試験から得られた結果と比較することによって、前記選択された様々な染色体の１つまたは複数に関して染色体異常が存在するかどうかを診断するステップと
   を含むことを特徴とする、複数の染色体異常のうち任意の１つを単一のアッセイで検出する方法。
2. 前記診断ステップは、同じ性別の正常ゲノムＤＮＡの前記結果との最終比較の前に、前記ステップ（ｆ）の検出結果にルールベースアルゴリズムを適用することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 選択された真核生物のゲノムＤＮＡの前記標的セグメントの少なくとも２つは、
   ウィリアムズ−ビューレン症候群、
   ネコ鳴き症候群、および
   ディジョージ症候群
   からなる群から選択される染色体異常を生じさせる染色体ＤＮＡの潜在的な微小欠失に関連していることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. 前記標的セグメントのうち少なくとも２つは、１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミーならびにＸ染色体およびＹ染色体異常からなる群から選択される染色体異常を検出するために選択されることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
5. 前記検出可能な標識は色検出可能な標識であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記色検出可能な標識は前記リバースプライマーに付着しており、各対の前記フォワードプライマーはその５末端にリン酸を有することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記検出可能な標識は蛍光色素であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. ステップ（ｂ）の前記二本鎖産物をまず精製し、その後、前記精製産物の前記センス鎖をエキソヌクレアーゼで消化してステップ（ｃ）の前記一本鎖の標識したアンチセンス鎖を得ることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記対照遺伝子はＧＡＰＤであることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記プローブの大きさは約２５から約６０個のヌクレオチドの範囲であり、前記標的セグメントの長さは約１００から２００塩基対であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. ２つのマイクロアレイを平行して用い、その両方からの前記イメージング結果を前記ハイブリダイズステップおよびイメージングステップの有効性の初期チェックとして比較することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. （ａ）哺乳動物ゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして機能する複数対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド対の一方のプライマーは哺乳動物ゲノムＤＮＡの標的セグメントの第１の鎖の３ヌクレオチド配列に相補的であり、前記各オリゴヌクレオチド対の他方のプライマーは前記標的ＤＮＡセグメントの前記第２の鎖の前記３ヌクレオチド配列に相補的であり、各対の前記プライマーの一方はその５末端に共有結合した検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド；
    （ｂ）複数の前記ＤＮＡプライマー対は、潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを増幅することを標的としており、前記対の１つは対照遺伝子のセグメントを増幅することを標的としていること；
    （ｃ）（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、ならびに（ｉｉｉ）比色定量を実施するための緩衝液および酵素；
    （ｄ）複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイであって、スポットの少なくとも１つが、それに付着した、前記標識を保有するそれぞれの標的としたゲノムＤＮＡセグメントの増幅した鎖に相補的なＤＮＡ配列を有するマイクロアレイ；ならびに
    （ｅ）ＰＣＲ増幅産物と前記マイクロアレイ上のそれぞれのスポットとのハイブリダイゼーション反応からの強度イメージング結果を用いた染色体異常の診断手段であって、正常ゲノムＤＮＡの同様の試験からのイメージング結果を利用する診断手段
    を含むことを特徴とする、染色体異常を検出するためのキット。
13. ２つ組のマイクロアレイの対を提供し、前記マイクロアレイの前記強度走査の前記結果を分析するための前記診断手段の一部としてルールベースアルゴリズムを提供することを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
14. 前記プライマー対のうち少なくとも２つは哺乳動物ゲノムＤＮＡのセグメントを標的とし、
    ウィリアムズ−ビューレン症候群、
    ネコ鳴き症候群、および
    ディジョージ症候群
    からなる群から選択される染色体異常を生じさせる染色体ＤＮＡの微小欠失の潜在性が存在することを特徴とする、請求項１２または１３のいずれかに記載のキット。
15. 前記プライマー対は、１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミーならびにＸ染色体およびＹ染色体異常からなる群から選択される染色体異常を検出するために選択された少なくとも２つのＤＮＡセグメントを標的としていることを特徴とする、請求項１２または１３のいずれかに記載のキット。
16. 各対の前記一方のプライマーは蛍光色素標識を有し、各対の前記他方のプライマーはその５末端にリン酸を有することを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のキット。
17. 前記１対のプライマーは前記対照遺伝子としてＧＡＰＤを標的とすることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のキット。
18. 前記プローブの大きさは約２５から約６０個のヌクレオチドの範囲であり、前記標的ＤＮＡセグメントの長さは約１２０から２００塩基対であることを特徴とする、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のキット。
19. 前記酵素は、前記ＰＣＲ増幅産物の前記センス鎖を消化するためのエキソヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のキット。
20. ａ．（ｉ）真核生物のゲノムＤＮＡ；
    （ｉｉ）複数対のフォワードおよびリバースＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドであって、前記各対の一方のプライマーは第１の真核生物のＤＮＡ鎖の標的セグメントの３配列に相補的であり、前記各対の他方のプライマーは前記標的セグメントの第２の鎖の前記３配列に相補的であり、真核生物のＤＮＡのセグメントの長さは約１００から約２５０塩基対であり、各対の前記プライマーの一方はその５末端に付着した色検出可能な標識を有しており、複数の前記プライマー対は潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを標的としており、１つの対は対照遺伝子のセグメントを標的としているプライマーオリゴヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の実施に必要なＰＣＲ緩衝液および酵素；
    を含む構成成分を容器中で混合することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を作製するステップと：
    ｂ．ＰＣＲを約５から約６０回の温度サイクルで実施して増幅ＰＣＲ産物を作製するステップと；
    ｃ．ステップ（ｂ）の前記産物を精製し、前記増幅二本鎖ＰＣＲ産物の１本の鎖を消化することによって前記色検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを得るステップと、
    ｄ．マイクロアレイをステップ（ｃ）の産物と接触させるステップであって、前記マイクロアレイは複数のスポットを有し、このスポットのそれぞれが前記標的セグメントの前記鎖の１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含むステップと；
    ｅ．前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブと、前記ＰＣＲで増幅した標識含有一本鎖産物とをハイブリダイズさせるステップと；
    ｆ．前記マイクロアレイの比色イメージングによって、マイクロアレイにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の存在および相対量を検出するステップと；
    ｇ．まず前記各目的染色体について前記マイクロアレイ上の関連するスポットの前記イメージングを前記対照遺伝子に関連するスポットのイメージングと比較してＩ比を得た後、それぞれのＩ比を正常であることが知られている同様のゲノムＤＮＡの試験の結果として得られたＮ比と比較することによって、前記様々な目的染色体の１つまたは複数に関して染色体異常が存在するかどうかを診断するステップと
    を含むことを特徴とする、複数の染色体異常のうち任意の１つを単一のアッセイで検出する方法。
21. 前記Ｉ比は、まずすべてのＩ比をそれぞれのＮ比と比較して個々のＣ因子を得た後に得られる平均Ｃ因子を用いることによって、それを最終診断で用いる前に各Ｉ比を調節することを含むルールベースアルゴリズムに供することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。