JP2003135069A - 塩基多型の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に
有用な、核酸配列の変異または多型の検出方法及びそれ
に用いられるオリゴヌクレオチドを提供することを目的
とする。 【解決手段】 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を
含む核酸配列に、一定量の野生型用オリゴヌクレオチド
及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時
に又は別々に反応させ、該オリゴヌクレオチドが反応し
たか否かによってその核酸試料中に含まれる塩基多型を
同定する方法であって、未反応の該オリゴヌクレオチド
の量を測定することで該オリゴヌクレオチドが反応した
か否かを検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列の変異ま
たは多型の同定方法に関する。本発明は、遺伝病の診
断、塩基多型解析等に際して特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】本発明において、塩基多型とは野生型と
は異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多
型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生にお
いて個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質
として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知ら
れている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカー
としての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明
は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研
究における精神医学患者および自発志願者にとって特に
推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Co
nference on Pharmacogenetics. Commission of the Eu
ropean Communities, Luxembourg, 1990,第８７〜９６
頁; Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、
第５５１〜５５４頁、(1989)）。また、原因となる変異
型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核
酸配列分析法が所望される。

【０００３】従来の核酸配列分析技術としては、例えば
核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配
列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定
することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラ
ーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列
の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。ま
た近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行
うことができるが、高価な装置が必要であるという問題
がある。

【０００４】一方、遺伝子の点突然変異により引き起こ
される遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺
伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより
遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくな
い。

【０００５】このような予想される点突然変異を検出す
る方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain r
eaction)法（特公平４−６７９６０号公報、特公平４−
６７９５７号公報）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝
子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法で
は、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドの
うちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子
の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴ
ヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に
完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用い
る。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予
想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的な
ヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異
型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺
伝子を遺伝子増幅法に供する。

【０００６】試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オ
リゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きる
が、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オ
リゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレ
オチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が
起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変
異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用
いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチ
ドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌク
レオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べるこ
とにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別するこ
とができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同
定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べ
る方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した
後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬
を用いて染色の後、UV照射して増幅核酸の有無を検出で
きる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸
を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロッ
ト法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後
検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブ
リダイゼーション法などが開発されてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のような方法によ
り増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように
思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数
値化することが困難である為に野生型シグナルと多型シ
グナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多
型を同定するには多大な作業が必要であった。

【０００８】たとえば電気泳動法によれば野生型及び多
型型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量
を正確に数値化することは困難である。またサザンブロ
ット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、
その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプロ
ーブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑で
ある。

【０００９】本発明の目的は、上記のような課題を解決
して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出す
ることができる方法及びそのための試薬を提供すること
である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定
の塩基多型部位を含む核酸配列に、一定量の野生型用オ
リゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌ
クレオチドを同時に又は別々に反応させた後、未反応の
該オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検
出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得ら
れ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出
し、本発明を完成させるに至った。

【００１１】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 ［１］試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸
配列に、一定量の野生型用オリゴヌクレオチド及び１種
又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別
々に反応させた後、未反応の該オリゴヌクレオチドの量
を測定することで塩基多型を同定する方法。 ［２］オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを
特徴とする［１］に記載の方法。 ［３］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素
よりなる群から選ばれたいずれかである［２］に記載の
方法。 ［４］反応した特定核酸配列検出用試薬を分離除去する
ことを含む［１］から［３］に記載の方法。 ［５］塩基多型部位を含む核酸配列が予め増幅されてい
ることを特徴とする［１］から［４］に記載の方法。 ［６］試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸
配列に、一定量の野生型用オリゴヌクレオチド及び１種
又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別
々に用いて増幅反応をさせた後、未反応の該オリゴヌク
レオチドの量を測定することで塩基多型を同定する方
法。 ［７］増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤ
Ａ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれ
かの方法であることを特徴とする［６］記載の方法。 ［８］オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを
特徴とする［６］から［７］に記載の方法。 ［９］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素
よりなる群から選ばれたいずれかである［８］に記載の
方法。 ［１０］反応したオリゴヌクレオチドを分離除去するこ
とを含む［６］から［９］に記載の方法。 ［１１］試料中に含まれる核酸配列の塩基多型を同定す
る方法において、 e)標的核酸に対し、一定量の野生型用オリゴヌクレオチ
ド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同
時に又は別々に作用させ、ポリメラーゼによる伸長反応
反応を行う工程。 f)a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖にす
る工程。 g)ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な共通オリ
ゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼによる伸長反
応を行う工程。 h)ｃ）の工程の後、未反応の野生型用及びまたは変異型
用オリゴヌクレオチドの量を測定する工程を含む塩基多
型の同定方法。 ［１２］オリゴヌクレオチドが予め標識されていること
を特徴とする［１１］に記載の方法。 ［１３］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵
素よりなる群から選ばれたいずれかである［１１］から
［１２］に記載の方法。 ［１４］共通オリゴヌクレオチドの標識が結合性標識で
あることを特徴とする［１１］から［１３］に記載の方
法。 ［１５］結合性標識がビオチンまたはジゴキシゲニンで
あることを特徴とする［１１］から［１４］に記載の方
法。 ［１６］工程ｄ）において反応したオリゴヌクレオチド
を分離除去することを含む［１１］から［１５］に記載
の方法。 ［１７］工程ｄ）において、共通オリゴヌクレオの結合
性標識と結合する試薬有する個体担体を用いて反応した
オリゴヌクレオチドを分離除去することを含む［１１］
から［１６］に記載の方法。 ［１８］結合性標識と結合する試薬がアビジンまたは抗
ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とする［１１］か
ら［１７］に記載の方法。 ［１９］固体担体が磁性ビーズであることを特徴とする
［１１］から［１８］記載の方法。 ［２０］少なくとも標識オリゴヌクレオチド、磁性ビー
ズ、ポリメラーゼを含む特定核酸検出キット。 ［２１］試料中に含まれる核酸配列の塩基多型を同定す
る方法において、 ａ）標的核酸に対し、一定量の野生型用オリゴヌクレオ
チド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを
同時に又は別々に作用させ、ポリメラーゼによる伸長反
応反応を行う工程。 ｂ）a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖に
する工程。 ｃ）ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な共通オ
リゴヌクレオチドを作用 させ、ポリメラーゼによる伸長反応を行う工程。 ｄ）ｂ）ｃ）の工程を少なくとの１回以上繰り返し塩基
多型特異的に標的核酸配列の一部を増幅する工程。 ｅ）ｄ）の工程のの後、未反応のオリゴヌクレオチドの
量を測定する工程 を含む塩基多型を同定する方法。［２２］オリゴヌクレ
オチドが予め標識されていることを特徴とする［２１］
に記載の方法。 ［２３］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵
素よりなる群から選ばれたいずれかである［２１］から
［２２］に記載の方法。 ［２４］共通オリゴヌクレオチドの標識が結合性標識で
あることを特徴とする［２１］から［２３］に記載の方
法。 ［２５］結合性標識がビオチンまたはジゴキシゲニンで
あることを特徴とする［２１］から［２４］に記載の方
法。 ［２６］工程ｄ）において反応したオリゴヌクレオチド
を分離除去することを含む［２１］から［２５］に記載
の方法。 ［２７］工程ｄ）において、共通オリゴヌクレオの結合
性標識と結合する試薬有する個体担体を用いて反応した
オリゴヌクレオチドを分離除去することを含む［２１］
から［２６］に記載の方法。 ［２８］結合性標識と結合する試薬がアビジンまたは抗
ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とする［２１］か
ら［２７］に記載の方法。 ［２９］固体担体が磁性ビーズであることを特徴とする
［２１］から［２８］記載の方法。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又は
その断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を
含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸
の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子の
エキソンやイントロン、プロモーターなどが例示でき
る。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代
謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子
が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ(Angiotens
in IConverting Enzyme)遺伝子が挙げられる。

【００１３】本発明において、核酸配列を単に核酸とい
うことがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少な
くとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変
異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生
型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであ
り、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明さ
れているものである。このような塩基多型により体質等
が異なっていることが解明されてきており、本発明の方
法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有して
いるか否かを検査する方法である。

【００１４】本発明において、野生型オリゴヌクレオチ
ドと変異型オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一
般的に、一本鎖に変性した標的核酸にオリゴヌクレオチ
ド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核
酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核
酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。

【００１５】本発明において、野生型用オリゴヌクレオ
チドとは、通常の表現型を有している塩基多型部位を含
む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌ
クレオチドであって、変異型用オリゴヌクレオチドと
は、野生型とは異なる配列を有している塩基多型部位を
含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴ
ヌクレオチドである。

【００１６】本発明に用いられる上記オリゴヌクレオチ
ドは、野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドの３’末
端もしくは３‘末端から２番目のヌクレオチドが変異型
配列のヌクレオチドと対応するように設計された。この
ように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生
型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の
組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも
３' 末端から２番目の配列までは一致する為伸長反応は
起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核
酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合
せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３
‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミ
スマッチがあるため伸長反応が起こらない。

【００１７】本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さ
としては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩
基であり、上記ミスマッチ部位は、該オリゴヌクレオチ
ド中に少なくとも１つ存在する。また、その位置は、
３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれ
ば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番
目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が
好ましい。

【００１８】３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、
伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩
基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反
応が強く阻害される。

【００１９】本発明においては、上記野生型用オリゴヌ
クレオチドと１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチ
ドを、試料に別々、又は同時に作用させる。

【００２０】本発明において、オリゴヌクレオチドの伸
長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことが
できる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位
を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレ
オシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと
共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の
変異型用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に
用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴ
ヌクレオチドが伸長する。

【００２１】該伸長反応は、Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual (Sambrookら、１９８９)に記載の方法
に従って行うことができる。また、該オリゴヌクレオチ
ドが伸長されたか否かによって塩基多型を検出する方法
において、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれて
いない場合、予め前記多型配列を含む核酸断片を以下に
示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能であ
る。

【００２２】本発明において、特定の塩基多型部位を含
む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方
法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた
特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤ
ＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生
型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オ
リゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を
同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的
核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバ
ースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。

【００２３】核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢ
Ａ（Nucleic acid sequence-basedamplification metho
d；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、Ｌ
ＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２
９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplif
ication：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９
１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公
報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification
method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁
(1993)）などが挙げられる。

【００２４】なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類の
デオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオ
チド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、
アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返
すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれ
る試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法であ
る。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くア
ニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それ
ぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダ
イズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起
点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各
一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖
ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖Ｄ
ＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、この
サイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌ
クレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ⁿ倍に増幅
される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、
電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺
伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、
極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出するこ
とが可能であり、最近非常に広く用いられている技術で
ある。

【００２５】上記のような核酸増幅法を利用した方法で
は、野生型核酸を増幅できる野生型用オリゴヌクレオチ
ドと、変異型核酸を増幅できる変異型用オリゴヌクレオ
チドをそれぞれ別個又は同時にに用いて遺伝子増幅法を
行う。

【００２６】野生型用オリゴヌクレオチドを用いて試料
核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野
生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きな
い。逆に、変異型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核
酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異
型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こ
らない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生
型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変
異型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が
起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型で
あるか変異型であるかを明確に知ることができる。特
に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子につい
て、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１
つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が
野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘ
テロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場
合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するか
ら野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型用
オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。

【００２７】また、オリゴヌクレオチドが反応したか否
かを検出する方法とは、特定の塩基多型部位を含む染色
体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型用オリゴ
ヌクレオチドと及び１種又は２種の変異型用オリゴヌク
レオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にま
たはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、反応に供し
なかったオリゴヌクレオチド量を測定し、反応に用いた
一定量から減じることで、オリゴヌクレオチドが反応し
たか否かを検出できる。

【００２８】上記検出方法としては、標識したオリゴヌ
クレオチドを用いることができる。

【００２９】例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチ
ドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗
原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識し
ておき、反応液中に一定量の該標識オリゴヌクレオチド
を入れ、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレ
オチドを除去し、残ったオリゴヌクレオチドの標識を検
出することによって、行うことができる。除去する方法
としてはリバースオリゴヌクレオチドをビオチン等で標
識しておき、上記標識オリゴヌクレオチドと、該リバー
スオリゴヌクレオチドとの反応物をアビジン等を含む個
体担体によって、捕捉除去できる。この時磁性ビーズ等
の個体担体を用いれば捕捉除去が容易に可能となる。

【００３０】酵素としては、アルカリフォスファター
ゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質とし
ては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭ
ＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられ
る。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなど
が挙げられる。放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓなどが
挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げら
れる。

【００３１】該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応
に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのど
の位置に結合させてもよい。好ましくは、５' 部位であ
る。野生型用オリゴヌクレオチドと変異型用オリゴヌク
レオチドに異なる標識を用いた場合には、１つので検出
ができる。

【００３２】キット 本発明において、キットとしては、野生型用オリゴヌク
レオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチ
ド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キッ
トを含むものである。増幅によって検出する場合には、
更に、リバースオリゴヌクレオチドを含んでいてもよ
い。また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したよ
うな酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗
体、放射性物質および発光団などによって標識されてい
てもよい。

【００３３】

【実施例】以下、実施例に基づき本発明をより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００３４】実施例１ β3 adrenergic receptor遺伝
子の塩基多型 (Trp64Arg)の検出（１）β3 adrenergic receptor遺伝子の190番目の多型
を検出するオリゴヌクレオチドの合成 パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用い
て、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜3に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1
〜3と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各
種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、
一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエ
ルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託
会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、
ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア バイオテ
ク（株）等）に依頼した。オリゴ１は3'末端から2番目
に野生型(T)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的
ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ2は3'末端から2番目に
変異型(C)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミ
スマッチ(C→A)を有し、オリゴ３がアンチセンス鎖であ
り、オリゴ１、2と組み合わせて増幅反応のオリゴヌク
レオチドとして使用される。なお、オリゴ1、2、3は必
要により標識して使用される。

【００３５】（２）PCR法によるβ3 adrenergic recept
or遺伝子多型の解析 PCR法による増幅反応 ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽
出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を
添加して、下記条件によりヒトβ3 adrenergicreceptor
遺伝子の塩基多型 (Trp64Arg)を解析した。試薬 以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。 Taq DNAポリメラーゼ反応液 オリゴ１および／または２(オリゴ1は5'をFITCにより標
識、オリゴ2はTexas Redにより標識) 5 pmol オリゴ3 (5'をビオチンにより標識) 5 pmol ×10緩衝液 2.5 μl 2mM dNTP 2.5 μl 25 mM MgCl₂ 1.5 μl Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ 抽出DNA溶液 100 ng増幅条件 95℃・5分 95℃・30秒、62.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル） 72℃・2分。 アビジン結合磁性粒子による検出 の増幅反応液10μｌを500mMトリス緩衝液(pH7.5)、2M Na
Cl、1mM EDTA 1.25μgアビジン結合磁性粒子（Genovisi
on製）の溶液40μlに加えて、室温にて15分間反応させ
た。これによって、増幅されたヒトβ3 adrenergic rec
eptor 遺伝子断片および、ビオチン標識オリゴヌクレオ
チドがアビジン結合磁性粒子に捕捉される。次に、磁性
粒子を磁石で分離し、未反応蛍光標識オリゴヌクレオチ
ドが含まれる上清を7.5ｍMnaOH 100μlと混和する。室
温で10分間放置後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大
日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約0.
5時間であった。得られた蛍光強度から、以下の計算式
を用いて試料の蛍光強度量を算出した。 FL（試料の蛍光強度）＝FLb-FLs FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度 FLｓ：各試料の蛍光強度

【００３６】

【表１】

【００３７】上記のように、一定量のオリゴヌクレオチ
ドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応
物質を磁性ビーズを用いて除き、上澄みの未反応のオリ
ゴヌクレオチド量を測定することで、容易にかつ迅速に
遺伝子型を明確に判定することができた。

【００３８】

【発明の効果】上述したように、本発明により、試料核
酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提
供される。本発明の方法では、これまでの方法のように
煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の
良い結果が得られた。

【００３９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA <120> A METHOD FOR DETECTING SNPs <130> 01-0922 <141> 2001-10-31 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide described in example 1 <400> 1 gtcatcgtgg ccatcgcatg 20

【００４０】 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide described in example 1 <400> 2 gtcatcgtgg ccatcgcacg 20

【００４１】 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide described in example 1 <400> 3 acgaacacgt tggtcatggt ct 22

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 FB02 FB03 FB12 GC15 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA13 QA17 QA20 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR56 QR62 QR83 QS24 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を
   含む核酸配列に、一定量の野生型用オリゴヌクレオチド
   及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時
   に又は別々に反応させた後、未反応の該オリゴヌクレオ
   チドの量を測定することで塩基多型を同定する方法。
2. 【請求項２】 オリゴヌクレオチドが予め標識されてい
   ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
   よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
   ２に記載の方法。
4. 【請求項４】反応した特定核酸配列検出用試薬を分離除
   去することを含む請求項１から３に記載の方法。
5. 【請求項５】塩基多型部位を含む核酸配列が予め増幅さ
   れていることを特徴とする請求項１から４に記載の方
   法。
6. 【請求項６】試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含
   む核酸配列に、一定量の野生型用オリゴヌクレオチド及
   び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に
   又は別々に用いて増幅反応をさせた後、未反応の該オリ
   ゴヌクレオチドの量を測定することで塩基多型を同定す
   る方法。
7. 【請求項７】増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、
   ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたい
   ずれかの方法であることを特徴とする請求項６記載の方
   法。
8. 【請求項８】 オリゴヌクレオチドが予め標識されてい
   ることを特徴とする請求項６から７に記載の方法。
9. 【請求項９】 標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
   よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
   ８に記載の方法。
10. 【請求項１０】反応したオリゴヌクレオチドを分離除去
    することを含む請求項６から９に記載の方法。
11. 【請求項１１】試料中に含まれる核酸配列の塩基多型を
    同定する方法において、 a)標的核酸に対し、一定量の野生型用オリゴヌクレオチ
    ド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同
    時に又は別々に作用させ、ポリメラーゼによる伸長反応
    反応を行う工程。 b)a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖にす
    る工程。 c)ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な共通オリ
    ゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼによる伸長反
    応を行う工程。 d)ｃ）の工程の後、未反応の野生型用及びまたは変異型
    用オリゴヌクレオチドの量を測定する工程を含む塩基多
    型の同定方法。
12. 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドが予め標識されて
    いることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
    よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
    １１から１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 共通オリゴヌクレオチドの標識が結合
    性標識であることを特徴とする請求項１１から１３に記
    載の方法。
15. 【請求項１５】 結合性標識がビオチンまたはジゴキシ
    ゲニンであることを特徴とする請求項１１から１４に記
    載の方法。
16. 【請求項１６】 工程ｄ）において反応したオリゴヌク
    レオチドを分離除去することを含む請求項１１から１５
    に記載の方法。
17. 【請求項１７】 工程ｄ）において、共通オリゴヌクレ
    オの結合性標識と結合する試薬有する個体担体を用いて
    反応したオリゴヌクレオチドを分離除去することを含む
    請求項１１から１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 結合性標識と結合する試薬がアビジン
    または抗ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とする請
    求項１１から１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 固体担体が磁性ビーズであることを特
    徴とする請求項１１から１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 少なくとも標識オリゴヌクレオチド、
    磁性ビーズ、ポリメラーゼを含む特定核酸検出キット。
21. 【請求項２１】試料中に含まれる核酸配列の塩基多型を
    同定する方法において、 ａ）標的核酸に対し、一定量の野生型用オリゴヌクレオ
    チド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを
    同時に又は別々に作用させ、ポリメラーゼによる伸長反
    応反応を行う工程。 ｂ）a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖に
    する工程。 ｃ）ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な共通オ
    リゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼによる伸長
    反応を行う工程。 ｄ）ｂ）ｃ）の工程を少なくとの１回以上繰り返し塩基
    多型特異的に標的核酸配列の一部を増幅する工程。 ｅ）ｄ）の工程のの後、未反応のオリゴヌクレオチドの
    量を測定する工程を含む塩基多型を同定する方法。
22. 【請求項２２】 オリゴヌクレオチドが予め標識されて
    いることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
    よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
    ２１から２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 共通オリゴヌクレオチドの標識が結合
    性標識であることを特徴とする請求項２１から２３に記
    載の方法。
25. 【請求項２５】 結合性標識がビオチンまたはジゴキシ
    ゲニンであることを特徴とする請求項２１から２４に記
    載の方法。
26. 【請求項２６】 工程ｄ）において反応したオリゴヌク
    レオチドを分離除去することを含む請求項２１から２５
    に記載の方法。
27. 【請求項２７】 工程ｄ）において、共通オリゴヌクレ
    オの結合性標識と結合する試薬有する個体担体を用いて
    反応したオリゴヌクレオチドを分離除去することを含む
    請求項２１から２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 結合性標識と結合する試薬がアビジン
    または抗ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とする請
    求項２１から２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 固体担体が磁性ビーズであることを特
    徴とする請求項２１から２８記載の方法。