JP2003125800A

JP2003125800A - 核酸の検出方法

Info

Publication number: JP2003125800A
Application number: JP2001328110A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Soya; 義博曽家; Yutaka Takarada; 裕宝田; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2001-10-25
Publication date: 2003-05-07

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、試料中に存在する特定の標的核酸分
子を検出する方法に関する。【解決手段】試料中に含まれる特定の核酸配列に一定量
の該特定核酸配列検出用試薬を加え、該特定核酸配列と
反応させた後、未反応の該特定核酸配列検出用試薬量を
測定することで、該特定核酸配列を検出する方法。本発
明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検
出できる方法が提供される。本発明の方法では、これま
での方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速
で容易に再現性の良い結果が得られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
特定の標的核酸分子を検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中に存在する特定の核酸分子を
検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質
の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系で
の情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等にお
いて重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の
検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診
断においても極めて重要である。

【０００３】しかしながら、従来の技術は、煩雑で且つ
多くの工程を含み、熟練を要するために、操作によって
はかなりの時間が必要とされることが多い。

【０００４】また、遺伝子診断などは確定診断として用
いられるため誤りが許されず、さらに迅速性も要求され
るために、迅速性を保ちながら高い精度有していなけれ
ばならないが、従来の技術は、かかる要請を十分に満足
するものとはいえない。

【０００５】試料中に存在する特定の核酸分子を検出す
る代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法が
ある。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の
核酸の中から非常に少数の標的核酸(DNAやRNA)をプロー
ブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法
では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオア
イソトープ等）を用いても、低コピー数（1〜1000個）
の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハ
イブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな
問題点が存するため、特定の核酸分子を正確に検出する
為には担体のブロッキング、非特異シグナルの除去等の
操作が不可欠であり、多大な労力が必要となる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる事情
に鑑みてなされたものであり、従来の核酸検出技術に比
べて、操作が簡便であるとともに特異性が向上した核酸
検出法を提供することを特徴とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、上記の従来法において、必要とされるブロッキ
ング、洗浄操作を必要としない方法として、特定の核酸
配列に一定量の該特定核酸配列検出用試薬を加え、該特
定核酸配列と反応させた後、未反応の該特定核酸配列検
出用試薬量を測定することで、該特定核酸配列を検出す
る可能となることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。

【０００８】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。［１］試料中に含まれる特定の核酸配列に一定量の該
特定核酸配列検出用試薬を加え、該特定核酸配列と反応
させた後、未反応の該特定核酸配列検出用試薬量を測定
することで、該特定核酸配列を検出する方法。［２］該特定核酸配列検出用試薬がオリゴヌクレオチ
ドを含むことを特徴とする［１］に記載の方法。［３］オリゴヌクレオチドが予め標識されていること
を特徴とする［２］に記載の方法。［４］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵
素よりなる群から選ばれたいずれかである［３］に記載
の方法。［５］反応した特定核酸配列検出用試薬を分離除去する
ことを含む［１］から［４］に記載の方法。［６］試料中に含まれる特定の核酸配列に一定量の該特
定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応
をさせた後、未反応の該オリゴヌクレオチドの量を測定
することで、該特定核酸配列を検出する方法。［７］増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤ
Ａ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれ
かの方法であることを特徴とする［６］記載の方法。［８］オリゴヌクレオチドが予め標識されていること
を特徴とする［６］から［７］に記載の方法。［９］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵
素よりなる群から選ばれたいずれかである［８］に記載
の方法。［１０］反応したオリゴヌクレオチドを分離除去するこ
とを含む［６］から［９］に記載の方法。［１１］試料中に含まれる特定の核酸配列の検出法にお
いて、下記の工程を含む該特定核酸配列を検出する方
法。 e)標的核酸に対し、一定量の第一オリゴヌクレオチドを
作用させ、ポリメラーゼによる伸長反応反応を行う工
程。 f)a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖にす
る工程。 g)ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な一定量の
第２オリゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼによ
る伸長反応を行う工程。 h)ｃ）の工程の後、未反応のオリゴヌクレオチドの量を
測定する工程。［１２］オリゴヌクレオチドが予め標識されているこ
とを特徴とする［１１］に記載の方法。［１３］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵
素よりなる群から選ばれたいずれかである［１１］から
［１２］に記載の方法。［１４］第一又は第２オリゴヌクレオチドの一方の標
識が固体支持体結合性標識であることを特徴とする［１
１］から［１３］に記載の方法。［１５］固体支持体結合性標識がビオチンまたはジゴ
キシゲニンであることを特徴とする［１１］から［１
４］に記載の方法。［１６］工程ｄ）において反応したオリゴヌクレオチ
ドを分離除去することを含む［１１］から［１５］に記
載の方法。［１７］工程ｄ）において、固体担体に結合した第一
又は第２オリゴヌクレオチドの固体支持体結合性標識と
結合性試薬を用いて反応したオリゴヌクレオチドを分離
除去することを含む［１１］から［１６］に記載の方
法。［１８］固体支持体結合性標識と結合する試薬がアビ
ジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とす
る［１１］から［１７］に記載の方法。［１９］固体担体が磁性ビーズであることを特徴とす
る［１１］から［１８］記載の方法。［２０］少なくとも標識オリゴヌクレオチド、磁性ビ
ーズ、ポリメラーゼを含む特定核酸検出キット。［２１］試料中に含まれる特定の核酸配列の検出法にお
いて、下記の工程を含む該特定核酸配列を検出する方
法。ａ）標的核酸に対し、一定量の第一オリゴヌクレオチド
を作用させ、ポリメラーゼによる伸長反応反応を行う工
程ｂ）a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖に
する工程ｃ）ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な一定量
の第２オリゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼに
よる伸長反応を行う工程ｄ）ｂ）ｃ）の工程を少なくとも１回以上繰り返し特定
核酸配列の一部を増幅する工程。ｅ）ｄ）の工程の後、未反応のオリゴヌクレオチドの量
を測定する工程［２２］オリゴヌクレオチドが予め標識されているこ
とを特徴とする［２１］に記載の方法。［２３］標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵
素よりなる群から選ばれたいずれかである［２１］から
［２２］に記載の方法。［２４］第一又は第２オリゴヌクレオチドの一方の標識
が固体支持体結合性標識であることを特徴とする［２
１］から［２３］に記載の方法。［２５］固体支持体結合性標識がビオチンまたはジゴ
キシゲニンであることを特徴とする［２１］から［２
４］に記載の方法。［２６］工程ｄ）において反応したオリゴヌクレオチ
ドを分離除去することを含む［２１］から［２５］に記
載の方法。［２７］工程ｄ）において、固体担体に結合した第一
又は第２オリゴヌクレオチドの固体支持体結合性標識と
結合性試薬を用いて反応したオリゴヌクレオチドを分離
除去することを含む［２１］から［２６］に記載の方
法。［２８］固体支持体結合性標識と結合する試薬がアビ
ジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とす
る［２１］から［２７］に記載の方法。［２９］固体担体が磁性ビーズであることを特徴とす
る［２１］から［２８］記載の方法。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
試料中に含まれる特定の核酸配列を含む染色体又はその
断片は、目的の遺伝子の情報を担う標的核酸であれば、
特に制限されない。該標的核酸の例としては、ウイルス
や病原体由来の遺伝子、Alu配列、蛋白質をコードする
遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例
示できる。

【００１０】本発明における核酸配列検出用試薬とは核
酸と特異的に反応する試薬であれば何でも良く一般的に
は核酸配列とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレ
オチド、核酸配列を複製する酵素、酵素の基質、等が用
いられる。

【００１１】核酸を複製する反応の場合、一本鎖に変性
した標的核酸にプライマー、４種類のデオキシヌクレオ
シド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用
させることで、標的核酸を鋳型としてプライマー伸長反
応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される。

【００１２】本発明において、この場合用いられる核酸
配列検出用試薬はプライマーであっても、ｄＮＴＰであ
っても良い。たとえばプライマーを用いる場合反応前に
投入したプライマー量に比して、反応後に残っている未
反応のプライマー量を測定し投入した量から減じること
で反応したプライマー量を測定できることとなる。ｄＮ
ＴＰの場合も同様に未反応のｄＮＴＰ量を測定すること
で消費されたｄＮＴＰ量を容易に算出することが可能で
ある。

【００１３】プライマーを用いた場合に未反応のプライ
マー量を測定する方法として、標識したプライマーを用
いることが可能である。たとえば検出可能な標識プライ
マーと、固体支持体に結合可能な標識プライマーを用い
て複製反応を行った後、固体支持体結合標識を用いて複
製反応した標識プライマーを除去し、上澄に残った標識
プライマー量を測定することで可能となる。

【００１４】他方法としては、標識プライマーを用いて
複製反応の後、複製して２本鎖になった伸長生成物を２
本鎖特異吸着材を用いて除去する方法も用いることが可
能である。この方法は標識したdNTPを用いて未反応のdN
TPを検出する場合にも利用可能である。

【００１５】また別の反応様式としてハイブリダイゼー
ション法がある。核酸配列の検出には標識したオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイズさせて検出する方法が一般
的に用いられるが、標的核酸に一定量の標識プローブを
作用させ、ハイブリダイズしたプローブを除去した後未
反応のプローブ量を測定することで反応したプローブ量
を算出できる。反応したプローブを除去する方法として
は、標的核酸を予め固体結合標識で標識しておき、プロ
ーブと反応させたのち、標的核酸の標識を用いてプロー
ブの結合した標的核酸を除去する方法等が利用可能であ
る。

【００１６】その他の様式としてリガーゼ、ヌクレアー
ゼ、制限酵素等の酵素を用いる方法がある。リガーゼを
用いる方法としては、標識した隣接するオリゴヌクレオ
チドを標的核酸にハイブリダイズさせた後、２本のオリ
ゴヌクレオチドをリガーゼ反応で結合させた後一方の標
識で結合されたオリゴヌクレオチドを除去し残った標識
オリゴヌクレオチド量を測定する方法などが考えられ
る。ヌクレアーゼを用いる場合は、標識したオリゴヌク
レオチドをハイブリダイズさせた後、２本差となったオ
リゴヌクレオチドを特異的にヌクレアーゼで分解する。
その後分解して低分子になったオリゴヌクレオチドを除
去することで未反応のオリゴヌクレオチド量を測定可能
となる。また制限酵素を用いた場合も同様にハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチドを制限酵素で分解して低分
子にすることができる。

【００１７】上記のような方法で測定する時に、標的核
酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め
前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によ
って、増幅しておくことも可能である。

【００１８】本発明においての増幅方法は、基本的に
は、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖
に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその
断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮ
ＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及び１組のプライマーを
作用させることで、標的核酸を鋳型として増幅される。

【００１９】核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢ
Ａ（Nucleic acid sequence-basedamplification metho
d；Ｎａｔｕｒｅ第３５０巻、第９１頁(1991)）、Ｌ
ＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２
９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplif
ication：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９
１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公
報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification
method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁
(1993)）などが挙げられる。

【００２０】なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類の
デオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリ
ング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことに
より、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域
を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性
工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程にお
いて各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核
酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、
各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きに
より鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を
伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルによ
り、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅さ
れる。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上
上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２
ⁿ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在
するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。
よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能
であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも
検出することが可能であり、最近非常に広く用いられて
いる技術である。

【００２１】標識本発明において用いられる標識としては酵素、ビオチ
ン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質およ
び発光団などがある。酵素としては、アルカリフォスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物
質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，
ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙
げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニ
ンなどが挙げられる。放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓ
などが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが
挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えるこ
とがなければなにを用いても良い。また反応に影響がな
ければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよ
い。好ましくは、５' 部位である。

【００２２】キット本発明において、キットとしては、少なくとも標識オ
リゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオ
キシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び磁性ビーズ
を含む特定核酸検出キットを含むものであり、該標識プ
ライマーが標的核酸と反応した後、反応したプライマー
だけ磁性ビーズで除去するキットがある。増幅によっ
て検出する場合には、更に、リバースプライマーを含ん
でいてもよい。また、該各プライマーは、予め上述した
ような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗
体、放射性物質および発光団などによって標識されてい
てもよい。

【００２３】このように、本発明の方法では、標的核酸
と、一定量の核酸検出用試薬を反応させた後、未反応の
標識核酸検出用試薬量を測定することで、標的核酸を検
出できる。したがって、本発明の方法によれば、従来法
のように煩雑な検出操作が不要で、試料核酸中の標的核
酸を明確に検出することができる。

【００２４】

【実施例】以下、実施例に基づき本発明をより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２５】実施例１ β3 adrenergic receptor遺伝
子の検出（１）β3 adrenergic receptor遺伝子を検出するオリ
ゴヌクレオチドの合成パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用い
て、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜2に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1
〜3と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各
種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、
一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエ
ルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託
会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、
ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシアバイオテ
ク（株）等）に依頼した。オリゴ１はセンス鎖であり、
オリゴ2がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応
のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ
1、2は必要により標識して使用される。

【００２６】（２）PCR法によるβ3 adrenergic recept
or遺伝子の検出 PCR法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽
出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を
添加して、下記条件によりヒトβ3 adrenergicreceptor
遺伝子を検出した。試薬以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。 Taq DNAポリメラーゼ反応液オリゴ１(5'をFITCにより標識) 5 pmol オリゴ2 (5'をビオチンにより標識) 5 pmol ×10緩衝液 2.5 μl 2mM dNTP 2.5 μl 25 mM MgCl₂ 1.5 μl Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ抽出DNA溶液 100 ng増幅条件 95℃・5分 95℃・30秒、62.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル） 72℃・2分。アビジン結合磁性粒子による検出の増幅反応液10μｌを500mMトリス緩衝液(pH7.5)、2M Na
Cl、1mM EDTA 1.25μgアビジン結合磁性粒子（Genovisi
on製）の溶液40μlに加えて、室温にて15分間反応させ
た。これによって、増幅されたヒトβ3 adrenergic rec
eptor 遺伝子断片および、ビオチン標識オリゴヌクレオ
チドがアビジン結合磁性粒子に捕捉される。次に、磁性
粒子を磁石で分離し、未反応蛍光標識オリゴヌクレオチ
ドが含まれる上清を7.5ｍM NaOH 100μlと混和する。室
温で10分間放置後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大
日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約0.
5時間であった。得られた蛍光強度から、以下の計算式
を用いて試料の蛍光強度量を算出した。 FL（試料の蛍光強度）＝FLb-FLs FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度 FLｓ：各試料の蛍光強度

【００２７】

【表１】

【００２８】上記のように、一定量のオリゴヌクレオチ
ドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応
物質を磁性ビーズを用いて除き、上澄みの未反応のオリ
ゴヌクレオチド量を測定することで、容易にかつ迅速に
遺伝子型を明確に判定することができた。

【００２９】

【発明の効果】上述したように、本発明により、試料核
酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提
供される。本発明の方法では、これまでの方法のように
煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の
良い結果が得られた。

【００３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA <120> 核酸の検出方法 <130> 01-0894 <141> 2001-10-25 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide described in example 1 <400> 1 gtcatcgtgg ccatcgc 17

【００３１】 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide described in example 1 <400> 2 acgaacacgt tggtcatggt ct 22

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/58 ＡＦターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 FB03 FB07 FB12 FB13 4B063 QA01 QQ43 QR08 QR62 QS25 QS26 QS33 QS34 QX01 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中に含まれる特定の核酸配列に一定
量の該特定核酸配列検出用試薬を加え、該特定核酸配列
と反応させた後、未反応の該特定核酸配列検出用試薬量
を測定することで、該特定核酸配列を検出する方法。
【請求項２】該特定核酸配列検出用試薬がオリゴヌク
レオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方
法。
【請求項３】オリゴヌクレオチドが予め標識されてい
ることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
３に記載の方法。
【請求項５】反応した特定核酸配列検出用試薬を分離除
去することを含む請求項１から４に記載の方法。
【請求項６】試料中に含まれる特定の核酸配列に一定量
の該特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増
幅反応をさせた後、未反応の該オリゴヌクレオチドの量
を測定することで、該特定核酸配列を検出する方法。
【請求項７】増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、
ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたい
ずれかの方法であることを特徴とする請求項６記載の方
法。
【請求項８】オリゴヌクレオチドが予め標識されてい
ることを特徴とする請求項６から７に記載の方法。
【請求項９】標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
８に記載の方法。
【請求項１０】反応したオリゴヌクレオチドを分離除去
することを含む請求項６から９に記載の方法。
【請求項１１】試料中に含まれる特定の核酸配列の検出
法において、下記の工程を含む該特定核酸配列を検出す
る方法。 a)標的核酸に対し、一定量の第一オリゴヌクレオチドを
作用させ、ポリメラーゼによる伸長反応反応を行う工
程。 b)a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖にす
る工程。 c)ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な一定量の
第２オリゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼによ
る伸長反応を行う工程。 d)ｃ）の工程の後、未反応のオリゴヌクレオチドの量を
測定する工程。
【請求項１２】オリゴヌクレオチドが予め標識されて
いることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
１１から１２に記載の方法。
【請求項１４】第一又は第２オリゴヌクレオチドの一
方の標識が固体支持体結合性標識であることを特徴とす
る請求項１１から１３に記載の方法。
【請求項１５】固体支持体結合性標識がビオチンまた
はジゴキシゲニンであることを特徴とする請求項１１か
ら１４に記載の方法。
【請求項１６】工程ｄ）において反応したオリゴヌク
レオチドを分離除去することを含む請求項１１から１５
に記載の方法。
【請求項１７】工程ｄ）において、固体担体に結合し
た第一又は第２オリゴヌクレオチドの固体支持体結合性
標識と結合性試薬を用いて反応したオリゴヌクレオチド
を分離除去することを含む請求項１１から１６に記載の
方法。
【請求項１８】固体支持体結合性標識と結合する試薬
がアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体であることを特
徴とする請求項１１から１７に記載の方法。
【請求項１９】固体担体が磁性ビーズであることを特
徴とする請求項１１から１８記載の方法。
【請求項２０】少なくとも標識オリゴヌクレオチド、
磁性ビーズ、ポリメラーゼを含む特定核酸検出キット。
【請求項２１】試料中に含まれる特定の核酸配列の検出
法において、下記の工程を含む該特定核酸配列を検出す
る方法。ａ）標的核酸に対し、一定量の第一オリゴヌクレオチド
を作用させ、ポリメラーゼによる伸長反応反応を行う工
程ｂ）a)の工程で得られた伸長生成物を変性させ１本鎖に
する工程ｃ）ｂ）の工程で得られた１本鎖核酸に相補的な一定量
の第２オリゴヌクレオチドを作用させ、ポリメラーゼに
よる伸長反応を行う工程ｄ）ｂ）ｃ）の工程を少なくとも１回以上繰り返し特定
核酸配列の一部を増幅する工程。ｅ）ｄ）の工程の後、未反応のオリゴヌクレオチドの量
を測定する工程
【請求項２２】オリゴヌクレオチドが予め標識されて
いることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団お
よび酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項
２１から２２に記載の方法。
【請求項２４】第一又は第２オリゴヌクレオチドの一
方の標識が固体支持体結合性標識であることを特徴とす
る請求項２１から２３に記載の方法。
【請求項２５】固体支持体結合性標識がビオチンまた
はジゴキシゲニンであることを特徴とする請求項２１か
ら２４に記載の方法。
【請求項２６】工程ｄ）において反応したオリゴヌク
レオチドを分離除去することを含む請求項２１から２５
に記載の方法。
【請求項２７】工程ｄ）において、固体担体に結合し
た第一又は第２オリゴヌクレオチドの固体支持体結合性
標識と結合性試薬を用いて反応したオリゴヌクレオチド
を分離除去することを含む請求項２１から２６に記載の
方法。
【請求項２８】固体支持体結合性標識と結合する試薬
がアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体であることを特
徴とする請求項２１から２７に記載の方法。
【請求項２９】固体担体が磁性ビーズであることを特
徴とする請求項２１から２８記載の方法。