JP2002209584A - 塩基多型を検出する方法 - Google Patents
塩基多型を検出する方法Info
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- JP2002209584A JP2002209584A JP2001008205A JP2001008205A JP2002209584A JP 2002209584 A JP2002209584 A JP 2002209584A JP 2001008205 A JP2001008205 A JP 2001008205A JP 2001008205 A JP2001008205 A JP 2001008205A JP 2002209584 A JP2002209584 A JP 2002209584A
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- nucleic acid
- nucleotide polymorphism
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Abstract
(57)【要約】
【課題】試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配
列中に塩基多型の種類を容易に検出できる核酸配列分析
法を提供すること。 【解決手段】試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核
酸配列に、該核酸配列中に含まれる多型配列部分に特異
的な２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを作用さ
せ、ハイブリダイゼーション反応を行い、各々のプロー
ブにより得られる検出シグナルの比を求めることを特徴
とする塩基多型を検出する方法において、作用させるプ
ローブの融解温度より低い温度でハイブリダイゼーショ
ン反応を行うことを特徴とする方法。
列中に塩基多型の種類を容易に検出できる核酸配列分析
法を提供すること。 【解決手段】試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核
酸配列に、該核酸配列中に含まれる多型配列部分に特異
的な２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを作用さ
せ、ハイブリダイゼーション反応を行い、各々のプロー
ブにより得られる検出シグナルの比を求めることを特徴
とする塩基多型を検出する方法において、作用させるプ
ローブの融解温度より低い温度でハイブリダイゼーショ
ン反応を行うことを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列の分析法
に関する。さらに詳しくは、特定の核酸配列中に含まれ
る塩基多型を検出することができる核酸配列分析法に関
する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生
物学及びこれらに関連する産業分野において有用であ
る。
に関する。さらに詳しくは、特定の核酸配列中に含まれ
る塩基多型を検出することができる核酸配列分析法に関
する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生
物学及びこれらに関連する産業分野において有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】本発明において、塩基多型とは野生型と
は異なる配列を有する遺伝子型であって、多型遺伝子は
薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において
個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。ま
た体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因として
も知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マ
ーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異
の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が
臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとっ
て特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consen
sus Conference on Pharmacogenetics. Commission of
the European Communities, Luxembourg,1990, pp87-9
6; Balantら, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-55
4、1989）。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に
続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所
望される。
は異なる配列を有する遺伝子型であって、多型遺伝子は
薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において
個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。ま
た体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因として
も知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マ
ーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異
の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が
臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとっ
て特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consen
sus Conference on Pharmacogenetics. Commission of
the European Communities, Luxembourg,1990, pp87-9
6; Balantら, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-55
4、1989）。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に
続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所
望される。
【０００３】従来の核酸配列分析技術としては、例えば
核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配
列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定
することができるが、鋳型核酸の調製、ポリメラーゼ反
応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析
等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年
の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うこと
ができるが、高価な装置が必要であるという問題があ
る。
核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配
列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定
することができるが、鋳型核酸の調製、ポリメラーゼ反
応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析
等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年
の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うこと
ができるが、高価な装置が必要であるという問題があ
る。
【０００４】他の方法として、サザンハイブリダイゼー
ション法がある（村松正實編「ラボマニュアル遺伝子工
学 増補版」丸善株式会社発行、第７０〜７５頁）。こ
の方法によれば、標識されたＤＮＡプローブと相補的な
塩基配列を持つＤＮＡの領域を同定することができる。
即ち、サザンハイブリダイゼーション法では、核酸断片
をアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で
電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した
後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロー
スやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電
気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した
後、ＲＩ（放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的
ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させ、プローブに
相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフ
ィー等により検出する。
ション法がある（村松正實編「ラボマニュアル遺伝子工
学 増補版」丸善株式会社発行、第７０〜７５頁）。こ
の方法によれば、標識されたＤＮＡプローブと相補的な
塩基配列を持つＤＮＡの領域を同定することができる。
即ち、サザンハイブリダイゼーション法では、核酸断片
をアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で
電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した
後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロー
スやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電
気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した
後、ＲＩ（放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的
ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させ、プローブに
相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフ
ィー等により検出する。
【０００５】サザンハイブリダイゼーション法によれ
ば、目的とするＤＮＡ断片の電気泳動位置や分子量を決
めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィ
ー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことがで
きないこと、塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションしたか否かだけで検出するため、プロー
ブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出す
るための類似配列を識別することが困難である等の問題
があった。
ば、目的とするＤＮＡ断片の電気泳動位置や分子量を決
めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィ
ー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことがで
きないこと、塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションしたか否かだけで検出するため、プロー
ブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出す
るための類似配列を識別することが困難である等の問題
があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、試料
中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多
型の種類を容易に検出できる核酸配列分析法を提供する
ことにある。
中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多
型の種類を容易に検出できる核酸配列分析法を提供する
ことにある。
【０００７】本発明者らは、先に、相補的な核酸ハイブ
リッド形成における相互作用に着目し、目的とする核酸
断片に相補的な塩基配列を持つ核酸をプローブとし、相
補的な核酸の示す特異的な相互作用を利用することによ
って、目的とする核酸断片の配列を分析できることを見
出した。また、本発明者らは、核酸配列分析法の開発研
究を進める過程で、相補的な核酸配列間の相互作用は、
温度に依存し、しかも、その相互作用開始温度は、塩基
配列が完全に相補的な場合と、１か所以上にミスマッチ
（不適正塩基対）がある場合とで異なり、またミスマッ
チの種類によっても異なることを見出した。
リッド形成における相互作用に着目し、目的とする核酸
断片に相補的な塩基配列を持つ核酸をプローブとし、相
補的な核酸の示す特異的な相互作用を利用することによ
って、目的とする核酸断片の配列を分析できることを見
出した。また、本発明者らは、核酸配列分析法の開発研
究を進める過程で、相補的な核酸配列間の相互作用は、
温度に依存し、しかも、その相互作用開始温度は、塩基
配列が完全に相補的な場合と、１か所以上にミスマッチ
（不適正塩基対）がある場合とで異なり、またミスマッ
チの種類によっても異なることを見出した。
【０００８】しかし１塩基のミスマッチを検出するのは
厳密なハイブリダイゼーションが必要でオリゴヌクレオ
チドプローブにおいてはその融解温度付近でハイブリダ
イゼーションを行う必要があった。特に一般的に用いら
れるマイクロプレートを用いたハイブリダイゼーション
反応において、そのような温度でマイクロプレート１枚
全体を均一に昇温する事は困難であり中心部と周辺部で
の温度差ができる。その為、多型解析にばらつきができ
解析結果の信頼度が低下する。一方免疫反応においても
マイクロプレートが使われるが、多くの場合37℃で反応
させることで一様な温度反応を行えることが可能となっ
ている。本発明者らは通常行われるハイブリダイゼーシ
ョン反応温度より低い温度でハイブリダイゼーションを
行うことにより、免疫反応同様一様な温度反応が行える
と考え、反応液に融解温度低下剤を加えることで一般的
なオリゴヌクレオチドの融解温度より低い温度で厳密な
ハイブリダイゼーション反応が可能であることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。
厳密なハイブリダイゼーションが必要でオリゴヌクレオ
チドプローブにおいてはその融解温度付近でハイブリダ
イゼーションを行う必要があった。特に一般的に用いら
れるマイクロプレートを用いたハイブリダイゼーション
反応において、そのような温度でマイクロプレート１枚
全体を均一に昇温する事は困難であり中心部と周辺部で
の温度差ができる。その為、多型解析にばらつきができ
解析結果の信頼度が低下する。一方免疫反応においても
マイクロプレートが使われるが、多くの場合37℃で反応
させることで一様な温度反応を行えることが可能となっ
ている。本発明者らは通常行われるハイブリダイゼーシ
ョン反応温度より低い温度でハイブリダイゼーションを
行うことにより、免疫反応同様一様な温度反応が行える
と考え、反応液に融解温度低下剤を加えることで一般的
なオリゴヌクレオチドの融解温度より低い温度で厳密な
ハイブリダイゼーション反応が可能であることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、試
料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列に、該核
酸配列中に含まれる多型配列部分に特異的な２種以上の
オリゴヌクレオチドプローブを作用させ、ハイブリダイ
ゼーション反応を行い、各々のプローブにより得られる
検出シグナルの比を求めることを特徴とする塩基多型を
検出する方法において、作用させるプローブの融解温度
より低い温度でハイブリダイゼーション反応を行うこと
を特徴とする方法を提供するものである。
料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列に、該核
酸配列中に含まれる多型配列部分に特異的な２種以上の
オリゴヌクレオチドプローブを作用させ、ハイブリダイ
ゼーション反応を行い、各々のプローブにより得られる
検出シグナルの比を求めることを特徴とする塩基多型を
検出する方法において、作用させるプローブの融解温度
より低い温度でハイブリダイゼーション反応を行うこと
を特徴とする方法を提供するものである。
【００１０】本発明の好ましい実施態様は、融解温度よ
り低い温度が、融解温度より少なくとも１０度以上低い
こと。
り低い温度が、融解温度より少なくとも１０度以上低い
こと。
【００１１】本発明の好ましい実施態様は、融解温度よ
り低い温度が３７℃以下である。
り低い温度が３７℃以下である。
【００１２】本発明の好ましい実施態様は、ハイブリダ
イゼーション反応液がホルムアミドまたはジメチルスル
ホキシドを含む。
イゼーション反応液がホルムアミドまたはジメチルスル
ホキシドを含む。
【００１３】本発明の好ましい実施態様は、試料中に含
まれる塩基多型を含む特定の核酸配列の塩基多型を検出
する方法において、予め該核酸配列を増幅させる。
まれる塩基多型を含む特定の核酸配列の塩基多型を検出
する方法において、予め該核酸配列を増幅させる。
【００１４】本発明の好ましい実施態様は、ＰＣＲ、Ｎ
ＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりな
る群から選ばれたいずれかの方法に該核酸配列を増幅さ
せる。
ＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりな
る群から選ばれたいずれかの方法に該核酸配列を増幅さ
せる。
【００１５】本発明の好ましい実施態様は、塩基多型が
１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む。
１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明における方法は、試料中に
含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列に、該核酸配列
中に含まれる多型配列部分に特異的な２種以上のオリゴ
ヌクレオチドプローブを作用させ、ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行い、各々のプローブにより得られる検出シ
グナルの比を求めることを特徴とする塩基多型を検出す
る方法において、作用させるプローブの融解温度より低
い温度でハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴
とするものである。ここで、塩基多型としては、１塩基
多型、挿入、欠失多型などの態様が挙げられる。
含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列に、該核酸配列
中に含まれる多型配列部分に特異的な２種以上のオリゴ
ヌクレオチドプローブを作用させ、ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行い、各々のプローブにより得られる検出シ
グナルの比を求めることを特徴とする塩基多型を検出す
る方法において、作用させるプローブの融解温度より低
い温度でハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴
とするものである。ここで、塩基多型としては、１塩基
多型、挿入、欠失多型などの態様が挙げられる。
【００１７】本発明で使用されるプローブは塩基多型を
含みその種類により検出シグナルが異なれば良いが、好
ましくは連続した少なくとも１５塩基、より好ましくは
連続した少なくとも１８塩基からなる塩基配列が必要で
ある。プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すればＤ
ＮＡでもＲＮＡでもＰＮＡでもよく、化学合成または生
物学的な方法により調製することができる。例えば、パ
ーキンエルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成できる。精製はＦＰ
ＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや逆相カラムにて実施しても
良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−
ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。
含みその種類により検出シグナルが異なれば良いが、好
ましくは連続した少なくとも１５塩基、より好ましくは
連続した少なくとも１８塩基からなる塩基配列が必要で
ある。プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すればＤ
ＮＡでもＲＮＡでもＰＮＡでもよく、化学合成または生
物学的な方法により調製することができる。例えば、パ
ーキンエルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成できる。精製はＦＰ
ＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや逆相カラムにて実施しても
良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−
ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。
【００１８】また、合成時にビオチン、リンカーアー
ム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧ
ＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴ
Ｐ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入し
ても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物
質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中
のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入
しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から32
Ｐ、35Ｓなどの放射性物質、ＡＬＰ、ＰＯＤなどの酵
素、 ＦＩＴＣ、ＨＥＸ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴなどの蛍
光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入
しても良い。また本発明において、プローブで検出する
前に、予め試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸
配列を増幅させておいてもよい。
ム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧ
ＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴ
Ｐ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入し
ても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物
質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中
のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入
しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から32
Ｐ、35Ｓなどの放射性物質、ＡＬＰ、ＰＯＤなどの酵
素、 ＦＩＴＣ、ＨＥＸ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴなどの蛍
光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入
しても良い。また本発明において、プローブで検出する
前に、予め試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸
配列を増幅させておいてもよい。
【００１９】上記増幅法としては特に限定されるもので
はないが、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction；特公
平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公
報）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based ampl
ification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１
頁(1991)）、ＬＣＲ（WO089/12696、特開平2-2934号な
ど）、ＳＤＡ（Strand Displacment Amplification；Nuc
leic Acids Res. 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、
ＲＣＲ（WO90/01069 ）、ＴＭＡ（Transcription Medi
ated amplification Method；J.Clin.Microbiol. 第３
１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられ、いずれに
おいても適用することが可能である。具体的には、例え
ば、ビオチン等で標識したプライマーを用いて特定核酸
配列を増幅した後、増幅核酸を１本鎖にし、例えば、マ
イクロタイタープレートのような固相に結合させた多型
特異的プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ
しなかった核酸を洗いだし、プローブとハイブリダイズ
した核酸のプライマーの標識によりハイブリダイズした
か否かを検出し、各プローブの検出シグナルの比により
塩基多型が野生型か変異型もしくは混合型であるのかを
同定する方法が挙げられる。このときにハイブリダイゼ
ーション反応液にホルムアミドまたはジメチルスルフォ
キシド（ＤＭＳＯ）などプローブに適した濃度を添加す
ることでオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より低
い温度で厳密なハイブリダイゼ−ション反応を行うこと
ができる。融解温度より低い温度でマイクロプレートを
用いた多型解析は簡便で特別な機器を必要としないため
非常に有用である。
はないが、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction；特公
平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公
報）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based ampl
ification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１
頁(1991)）、ＬＣＲ（WO089/12696、特開平2-2934号な
ど）、ＳＤＡ（Strand Displacment Amplification；Nuc
leic Acids Res. 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、
ＲＣＲ（WO90/01069 ）、ＴＭＡ（Transcription Medi
ated amplification Method；J.Clin.Microbiol. 第３
１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられ、いずれに
おいても適用することが可能である。具体的には、例え
ば、ビオチン等で標識したプライマーを用いて特定核酸
配列を増幅した後、増幅核酸を１本鎖にし、例えば、マ
イクロタイタープレートのような固相に結合させた多型
特異的プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ
しなかった核酸を洗いだし、プローブとハイブリダイズ
した核酸のプライマーの標識によりハイブリダイズした
か否かを検出し、各プローブの検出シグナルの比により
塩基多型が野生型か変異型もしくは混合型であるのかを
同定する方法が挙げられる。このときにハイブリダイゼ
ーション反応液にホルムアミドまたはジメチルスルフォ
キシド（ＤＭＳＯ）などプローブに適した濃度を添加す
ることでオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より低
い温度で厳密なハイブリダイゼ−ション反応を行うこと
ができる。融解温度より低い温度でマイクロプレートを
用いた多型解析は簡便で特別な機器を必要としないため
非常に有用である。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるも
のではない。
明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるも
のではない。
【００２１】実施例１ ＡＣＥ遺伝子の遺伝子多型検出 （１）ＡＣＥ遺伝子断片増幅用プライマーの合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー１）
および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド（プライマー２）を合成した。プライマー２
は５’側にビオチンを連結している。合成はマニュアル
に従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア
水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製
はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー１）
および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド（プライマー２）を合成した。プライマー２
は５’側にビオチンを連結している。合成はマニュアル
に従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア
水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製
はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
【００２２】（２）リンカーアームを有するオリゴヌク
レオチドの合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号７に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｉプローブ）お
よび配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド（Ｄプローブ）を合成した。この際、特表昭６
０−５００７１７号公報に開示された合成法により、デ
オキシウリジンから化学合成により調製した、５位にリ
ンカーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレオチ
ドに導入した。合成されたリンカーオリゴヌクレオチド
はアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、
パーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
レオチドの合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号７に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｉプローブ）お
よび配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド（Ｄプローブ）を合成した。この際、特表昭６
０−５００７１７号公報に開示された合成法により、デ
オキシウリジンから化学合成により調製した、５位にリ
ンカーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレオチ
ドに導入した。合成されたリンカーオリゴヌクレオチド
はアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、
パーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
【００２３】（３）プローブオリゴヌクレオチドのマイ
クロタイタープレートへの結合 上記（２）で合成したプローブオリゴヌクレオチドにつ
いて、そのリンカーアームを介して、マイクロタイター
プレート内面へ結合した。オリゴヌクレオチドを５０ｍ
Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ１０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 の
溶液に０．００５ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈し、
マイクロタイタープレート（MicroFLUORB；ダイナテッ
ク社）に各１００μｌずつ分注し、１５時間程度室温に
放置することで、リンカーオリゴヌクレオチドをマイク
ロタイタープレート内面に結合させた。その後、０．１
ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶＰ、５×ＳＳＣに置
換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温
で２時間程度行った。最後に１×ＳＳＣで洗浄して乾燥
させた。
クロタイタープレートへの結合 上記（２）で合成したプローブオリゴヌクレオチドにつ
いて、そのリンカーアームを介して、マイクロタイター
プレート内面へ結合した。オリゴヌクレオチドを５０ｍ
Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ１０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 の
溶液に０．００５ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈し、
マイクロタイタープレート（MicroFLUORB；ダイナテッ
ク社）に各１００μｌずつ分注し、１５時間程度室温に
放置することで、リンカーオリゴヌクレオチドをマイク
ロタイタープレート内面に結合させた。その後、０．１
ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶＰ、５×ＳＳＣに置
換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温
で２時間程度行った。最後に１×ＳＳＣで洗浄して乾燥
させた。
【００２４】（４）ＰＣＲ法によるヒトＡＣＥ遺伝子断
片の増幅 ヒト白血球より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使
用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＣ
Ｅ遺伝子断片を増幅した。 試薬：以下の試薬を含む２５μl溶液を調製した。 プライマー１ ５ｐｍｏｌ プライマー２ ５ｐｍｏｌ ×１０緩衝液 ２．５μｌ ２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＳｏ４ ２．５μｌ ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ １Ｕ 抽出ＤＮＡ溶液 ４０ｎｇ 増幅条件 ９４℃・５分 ９４℃・１５秒、６５℃・３０秒、６８℃・３０秒（３
５サイクル）
片の増幅 ヒト白血球より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使
用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＣ
Ｅ遺伝子断片を増幅した。 試薬：以下の試薬を含む２５μl溶液を調製した。 プライマー１ ５ｐｍｏｌ プライマー２ ５ｐｍｏｌ ×１０緩衝液 ２．５μｌ ２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＳｏ４ ２．５μｌ ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ １Ｕ 抽出ＤＮＡ溶液 ４０ｎｇ 増幅条件 ９４℃・５分 ９４℃・１５秒、６５℃・３０秒、６８℃・３０秒（３
５サイクル）
【００２５】（５）マイクロタイタープレート中でのハ
イブリダイゼーション （４）の増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ Ｎａ
ＯＨ中で増幅反応液中の増幅されたＤＮＡを変性させ、
各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、２％ＳＤＳ、７５
０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3および０，１０，
２０，３０，４０％のホルムアミドを含む溶液８０μｌ
に加えて、上記（３）の捕捉プローブが結合したマイク
ロタイタープレートに投入した。３７℃で３０分間振盪
させた。これによって、増幅されたヒトＡＣＥ遺伝子断
片が、固定化されたプローブによって特異的にマイクロ
タイタープレートに捕捉される。
イブリダイゼーション （４）の増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ Ｎａ
ＯＨ中で増幅反応液中の増幅されたＤＮＡを変性させ、
各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、２％ＳＤＳ、７５
０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3および０，１０，
２０，３０，４０％のホルムアミドを含む溶液８０μｌ
に加えて、上記（３）の捕捉プローブが結合したマイク
ロタイタープレートに投入した。３７℃で３０分間振盪
させた。これによって、増幅されたヒトＡＣＥ遺伝子断
片が、固定化されたプローブによって特異的にマイクロ
タイタープレートに捕捉される。
【００２６】次に、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）、１％Ｓ
ＤＳおよび０，１０，２０，３０，４０％のホルムアミ
ドを含む溶液に置換し同様に３７℃で２０分間振盪させ
た。その後、２５０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、０．０２５％ Tween20溶液と置換
し、すぐに除去した後、アルカリフォスファターゼを標
識したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ製D0396）を５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１％ＢＳＡの
溶液で２０００倍に希釈した溶液１００μｌを添加し、
３７℃で１５分間振盪させた。これによって、捕捉され
たＤＮＡのビオチンにアルカリ性ホスファターゼ標識し
たストレプトアビジンが特異的に結合した。２５０μｌ
の５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０
２５％ Tween20溶液で３回洗浄後、アルカリ性ホスフ
ァターゼの発光基質であるジオキセタン化合物（商品
名：Lumiphos480；Lumigen 社）５０μｌを注入し、３
７℃で１５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜
松ホトニクス社）で発光量を測定した。これらの工程は
すべて、ＤＮＡプローブ自動測定システム（日本臨床検
査自動化学会会誌 第２０巻、第７２８頁（１９９５
年）を参照）により自動で行われ、所要時間は約２.５
時間であった。
ＤＳおよび０，１０，２０，３０，４０％のホルムアミ
ドを含む溶液に置換し同様に３７℃で２０分間振盪させ
た。その後、２５０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、０．０２５％ Tween20溶液と置換
し、すぐに除去した後、アルカリフォスファターゼを標
識したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ製D0396）を５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１％ＢＳＡの
溶液で２０００倍に希釈した溶液１００μｌを添加し、
３７℃で１５分間振盪させた。これによって、捕捉され
たＤＮＡのビオチンにアルカリ性ホスファターゼ標識し
たストレプトアビジンが特異的に結合した。２５０μｌ
の５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０
２５％ Tween20溶液で３回洗浄後、アルカリ性ホスフ
ァターゼの発光基質であるジオキセタン化合物（商品
名：Lumiphos480；Lumigen 社）５０μｌを注入し、３
７℃で１５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜
松ホトニクス社）で発光量を測定した。これらの工程は
すべて、ＤＮＡプローブ自動測定システム（日本臨床検
査自動化学会会誌 第２０巻、第７２８頁（１９９５
年）を参照）により自動で行われ、所要時間は約２.５
時間であった。
【００２７】（６）ヒトＡＣＥ遺伝子多型測定検討結果 上記（４）にて増幅し、（５）にて検出されたヒトＡＣ
Ｅ遺伝子の挿入遺伝子多型検出結果を図１に示す。各サ
ンプルにつきＴタイプ測定用プレートの発光量（cps：c
ount/second）をＡタイプ測定用プレートの発光量で割
り算し、その値の対数値をグラフ化したものである。表
１から分かるように、ホルムアミド濃度が３５％の時、
各多型タイプの判定が容易に可能である。
Ｅ遺伝子の挿入遺伝子多型検出結果を図１に示す。各サ
ンプルにつきＴタイプ測定用プレートの発光量（cps：c
ount/second）をＡタイプ測定用プレートの発光量で割
り算し、その値の対数値をグラフ化したものである。表
１から分かるように、ホルムアミド濃度が３５％の時、
各多型タイプの判定が容易に可能である。
【００２８】
【発明の効果】上述したように、本発明の方法は、多型
配列部分に特異的な２種以上のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用い、作用させるプローブの融解温度より低い温
度でハイブリダイゼーション反応を行い、試料中に含ま
れる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多型の種類
を容易に検出、同定できることを可能とするものであ
る。
配列部分に特異的な２種以上のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用い、作用させるプローブの融解温度より低い温
度でハイブリダイゼーション反応を行い、試料中に含ま
れる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多型の種類
を容易に検出、同定できることを可能とするものであ
る。
【００２９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..19 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相同な配列を有する。 配列 GTGGGCAGGC TCGGGTGTT 19
【００３０】 配列番号：2 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。５’末端にビオ チンを有する。 配列 CCCGCAGAGG AAGCTGGAGA A 21
【００３１】 配列番号：3 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。５’末端にリン カーアームを有する。１塩基多型部位の配列がＴである。 配列 TTTTTCCCCA TCTTCTAAAG AGAGG 25
【００３２】 配列番号：4 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。５’末端にリン カーアームを有する。1塩基多型部位の配列がAである。 配列 TTTTTCCCAT CTTCAAAAGA GAGGA 25
【図１】実施例１における本発明の方法により、ＡＣＥ
遺伝子の塩基多型検出の結果を示す図である。サンプル
として遺伝子型がＴ／Ｔ、Ｔ／Ａ、Ａ／Ａの３タイプを
用いてＰＣＲ増幅の後、ハイブリダイゼーション反応を
ホルムアミド濃度０，１０，２０，３０，４０％で行い
多型シグナルを検出した。
遺伝子の塩基多型検出の結果を示す図である。サンプル
として遺伝子型がＴ／Ｔ、Ｔ／Ａ、Ａ／Ａの３タイプを
用いてＰＣＲ増幅の後、ハイブリダイゼーション反応を
ホルムアミド濃度０，１０，２０，３０，４０％で行い
多型シグナルを検出した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古賀 聡子 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA09 HA14 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QR32 QR56 QR62 QR63 QR84 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】 試料中に含まれる塩基多型を含む特定の
核酸配列に、該核酸配列中に含まれる多型配列部分に特
異的な２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを作用さ
せ、ハイブリダイゼーション反応を行い、各々のプロー
ブにより得られる検出シグナルの比を求めることを特徴
とする塩基多型を検出する方法において、作用させるプ
ローブの融解温度より低い温度でハイブリダイゼーショ
ン反応を行うことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 融解温度より低い温度が、融解温度より
少なくとも１０度以上低いことを特徴とする請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 融解温度より低い温度が３７℃以下であ
ることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 ハイブリダイゼーション反応液がホルム
アミドまたはジメチルスルホキシドを含むことを特徴と
する請求項１乃至３に記載の方法 - 【請求項５】 試料中に含まれる塩基多型を含む特定の
核酸配列の塩基多型を検出する方法において、予め該核
酸配列を増幅させる請求項１乃至４に記載の方法。 - 【請求項６】 ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、
ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの
方法に該核酸配列を増幅させる請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 塩基多型が１塩基多型、挿入、欠失多型
のいずれかを含む請求項１乃至６に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001008205A JP2002209584A (ja) | 2001-01-16 | 2001-01-16 | 塩基多型を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001008205A JP2002209584A (ja) | 2001-01-16 | 2001-01-16 | 塩基多型を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002209584A true JP2002209584A (ja) | 2002-07-30 |
Family
ID=18875855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001008205A Withdrawn JP2002209584A (ja) | 2001-01-16 | 2001-01-16 | 塩基多型を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002209584A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004061130A1 (ja) * | 2002-12-27 | 2004-07-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 塩基多型の同定方法 |
| JP2007319121A (ja) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | Toyobo Co Ltd | ヒトパピローマウイルスの検出法及びタイピング方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056954A1 (en) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Affymetrix, Inc. | Method to detect gene polymorphisms and monitor allelic expression employing a probe array |
| WO1999040189A2 (en) * | 1998-02-09 | 1999-08-12 | Genset | Cdnas encoding secreted proteins |
| WO1999047535A1 (en) * | 1998-03-16 | 1999-09-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING AND TREATING CHROMOSOME-18p RELATED DISORDERS |
| WO2000018909A2 (en) * | 1998-09-29 | 2000-04-06 | Diversa Corporation | NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS FROM $i(CENARCHAEUM SYMBIOSUM) |
| WO2000018922A2 (en) * | 1998-10-01 | 2000-04-06 | Incyte Genomics, Inc. | Human carbohydrate-associated proteins |
| JP2000504575A (ja) * | 1996-02-08 | 2000-04-18 | アフィメトリックス，インコーポレイテッド | 微生物のチップベースの種分化および表現型特徴付け |
| JP2001095574A (ja) * | 1999-09-27 | 2001-04-10 | Toyobo Co Ltd | 塩基多型を検出する方法 |
-
2001
- 2001-01-16 JP JP2001008205A patent/JP2002209584A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (7)
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| JP2007319121A (ja) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | Toyobo Co Ltd | ヒトパピローマウイルスの検出法及びタイピング方法 |
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