CN105378106B - 遗传变体的基于连接的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测样品中的遗传变体的分析系统和方法,所述遗传变体包括拷贝数变异和单核苷酸多态性。优选地,本发明采用串联连接的技术,联合利用阵列杂交的具体的基因组区域的水平的检测,所述串联连接的技术例如,两个或更多个固定序列寡核苷酸和与固定序列寡核苷酸之间的区域互补的一个或更多个桥接寡核苷酸的连接。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的,美国专利申请号13/840,383的优先权,美国专利申请号13/840,383是2011年11月10日提交的美国专利申请号13/293,419的CIP,美国专利申请号13/293,419是2011年8月8日提交的13/205,603的CIP,13/205,603是2011年1月25日提交的13/013,732的CIP,13/013,732要求2010年8月6日提交的美国临时申请号61/371,605的权益。
技术领域
本发明涉及来自遗传样品的靶向区域的多路复用的选择、扩增和检测。
背景技术
在下面的讨论中,将为了背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文所包含的任何内容不得被解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下证明根据可应用的法定条文本文引用的文章和方法无法构成现有技术的权利。
遗传异常导致许多病理,包括由染色体非整倍性引起的病理(例如,唐氏综合症)、特定基因中的种系突变(例如,镰状细胞性贫血)、和由体细胞突变引起的病理(例如,癌症)。用于确定这样的遗传异常现象的诊断方法已经变成用于识别特定疾病和紊乱,以及用于在疾病来源和处理选择上提供有价值的信息的标准的技术。
拷贝数变异(copy-mumber variation)是对应于某些染色体上缺失或扩增的相当大的基因组区域的基因组DNA改变。可以通过基因组重排如缺失、重复、倒位和易位引起CNV。拷贝数变异与多种形式的癌症(Cappuzzo F,Hirsch,等人(2005)97(9):643-655)、神经紊乱(Sebat,J.,等人(2007)Science 316(5823):445-9,包括孤独症(Sebat,J.,等人(2007)Science 316(5823):445-9),和精神分裂症(St Clair D(2008).Schizophr Bull35(1):9-12))相关。特定细胞群体中感兴趣的染色体或它的部分的拷贝数变异的检测可以是识别疾病或紊乱的遗传诊断或预后指标的强有力的工具。
拷贝数变异的检测也可以用于检测胎儿DNA中的染色体非整倍性。产前诊断测试的常规方法目前需要在11和14周妊娠之间利用绒毛膜绒毛取样(CVS)或在15周之后利用羊膜穿刺术,直接地从用于遗传分析的子宫去除胎儿细胞的样品。然而,这些侵入性程序携带大约1%的流产的风险(Mujezinovic和Alfirevic,Obstet Gynecol 2007;110,,687-694)。长期以来寻找一种非侵入性产前诊断的可靠的和方便的方法,以便减少这种流产的风险且允许更早测试。
单核苷酸多态性(SNP)是基因组的特定区域上的单核苷酸差异。当与参考基因组比较时,平均人类基因组通常具有超过三百万的SNP。SNP与多种疾病相关,包含癌症、心血管疾病、囊性纤维化病、和糖尿病。SNPs的检测可以是识别疾病或紊乱的遗传诊断或预后指示物的强有力的工具。经常可期望在相同的样品中检测很多不同的SNP。
重新测序是DNA序列检测的应用,经常在基因组的部分中。重新测序可以被应用于来自包括哺乳动物、其他动物种类、植物、细菌、病毒等等的任何来源的遗传样品的分析。重新测序可以用于很多应用,包括但不限于临床应用和环境应用。重新测序用于临床应用的一个应用是引起疾病的基因中DNA序列的确定。用于医学诊断或预后指示的基因重新测序的实例包括关于乳腺癌风险的BRCA1和BRCA2的重新测序。环境应用的实例是水源中特定病原体的检测。
因而,需要采用有效的、可重现的多路复用分析的筛选拷贝数变异、SNP,和重新测序的方法。本发明解决这种需要。
发明内容
提供发明内容,以便以简要形式介绍概念的选择,该概念在下面的具体实施方式中进一步详述。发明内容既不倾向于识别所要求保护的主题的关键的或基本的特征,也不倾向于用于限制所要求保护的主题的范畴。将从下面撰写的具体实施方式显然可见所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势,包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面。
本发明提供用于检测拷贝数变异、多态性、突变和重测序的分析系统和方法。本发明采用利用固定序列寡核苷酸且经由连接和/或延伸连接它们选择基因组区域的技术。在优选的方面中,这通过串联连接完成,也就是,两个或更多个非-相邻的固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸的连接,所述桥接寡核苷酸与固定序列寡核苷酸互补的感兴趣的核酸区域的部分之间的且直接临近该部分的区域互补。
在一个一般方面中,本发明提供用于检测遗传样品中感兴趣的核酸区域的分析系统,包括下列步骤:提供遗传样品;向所述遗传样品引入第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸,所述引入在允许所述固定序列寡核苷酸与感兴趣的核酸中的互补区域特异性杂交的条件下进行;在允许所述固定序列寡核苷酸与感兴趣的核酸中的互补序列特异性杂交的条件下,引入一个或更多个桥接寡核苷酸,其中所述一个或更多个桥接寡核苷酸与在所述第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的区域之间且与该区域直接相邻的核酸区域互补;连接杂交的寡核苷酸,以便产生与感兴趣的核酸区域互补的连续的连接产物;扩增所述连续的连接产物,以便产生具有核酸区域的序列的扩增产物;和检测和定量所述扩增产物,其中所述扩增产物的检测提供遗传样品中核酸区域的检测。任选地,分离和定量所述扩增产物,以便确定所述遗传样品中核酸区域的相对频率。
在另一个一般方面中,本发明提供用于检测遗传样品中的感兴趣的核酸区域的分析系统,包括下列步骤:提供遗传样品;向所述遗传样品引入第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸,所述引入在允许所述固定序列寡核苷酸与感兴趣的核酸中的互补区域特异性杂交的条件下进行;在允许桥接寡核苷酸与所述感兴趣的核酸特异性杂交的条件下,引入一个或更多个桥接寡核苷酸,所述一个或更多个桥接寡核苷酸与感兴趣的核酸在与第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的区域之间的的区域互补,其中所述桥接寡核苷酸的任一末端或两个末端上的至少一个或更多个碱基没有与所述固定序列寡核苷酸直接相邻;延伸所述一个或更多个桥接寡核苷酸,使得所述桥接寡核苷酸与所述固定序列寡核苷酸直接相邻;连接所杂交且延伸的寡核苷酸,以便产生连续的连接产物;扩增所述连续的连接产物,以便产生具有感兴趣的核酸区域的序列的扩增产物;和检测和定量所述扩增产物,其中所述扩增产物的检测提供遗传样品中核酸区域的检测。任选地,分离和定量所述扩增产物,以便确定所述遗传样品中核酸区域的相对频率。
样品中核酸的相对频率不仅可以用于确定那个具体的核酸区域的拷贝数变异,而且连同其他核酸和/或与其他核酸相比,它可以用于确定较大的基因组区域(包括染色体)的拷贝数变异。
优选地,分析系统中使用的固定序列寡核苷酸包括用于连续的连接产物的扩增的通用引物区域。可替换地,可以通过,例如,引入包括这样的通用引物序列的衔接子到连续的连接产物的末端,在杂交的固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸的连接之后,将通用引物序列添加到连续的连接产物上。
优选地,桥接寡核苷酸是较短的寡核苷酸,优选地在1-10个核苷酸之间和更优选地在3-7个核苷酸之间,且桥接寡核苷酸可以经设计用于提供桥接寡核苷酸的序列内的简并性,例如,桥接寡核苷酸被作为具有多种序列变异的完全的或部分的随机物提供,以便确保即便选定的核酸区域含有多态性残基时该选定的核酸区域的检测。可以基于可以存在于选定的核酸区域中的预计的多态性,确定桥接寡核苷酸的简并性。可替换地,反应中使用的桥接寡核苷酸的库(pool)可以提供桥接寡核苷酸的一个或更多个位置的简并性。在一个方面中,反应中使用的桥接寡核苷酸的库可以提供桥接寡核苷酸的每一个位置的简并性。在还有的另一个方面中,反应中使用的桥接分子的库可以提供桥接的寡核苷酸的每一个内部位置的简并性,同时与连接位点相邻的核苷酸在组内使用的桥接寡核苷酸的库中保持不变。在另一个方面中,桥接寡核苷酸长于10个核苷酸且优选地是18-30个核苷酸。在优选的方面中,使与感兴趣的核酸的区域互补的单个桥接寡核苷酸在与第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的区域之间杂交。在另一个方面中,使两个或更多个桥接寡核苷酸在固定序列寡核苷酸之间的区域内杂交,且优选地,桥接寡核苷酸与感兴趣的核苷酸上的相邻区域杂交。在这种情形下,在固定序列寡核苷酸和相邻的桥接寡核苷酸之间以及在相邻的桥接寡核苷酸之间发生连接。在另一个方面中,在一系列的桥接寡核苷酸之间存在一个或更多个碱基和/或在桥接寡核苷酸和固定序列寡核苷酸之间存在一个或更多个碱基。这些间隙可以在连接之前通过例如利用聚合酶和dNTP延伸。
有利的是,利用简并的桥接寡核苷酸省却对在采用分析系统的检测方法之前,预先确定选定的核酸区域的母亲和胎儿多态性含量(polymorphic content)的需要。
在本发明的一个方面中,在引入桥接寡核苷酸之前,第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸被引入遗传样品且与感兴趣的核酸的互补部分特异性地杂交。任选地,在固定序列寡核苷酸的特异性杂交之后,分离杂交的区域,以便去除反应中任何过量的未结合的寡核苷酸。
在另一个方面中,在引入固定序列寡核苷酸的同时将桥接寡核苷酸引入遗传样品,且允许它们都与感兴趣的核酸区域的连续的部分杂交。
在某些方面中,本发明的固定序列寡核苷酸包括一个或更多个指示物(indice)。这些指示物可以充当用于识别感兴趣的核酸区域、位点、或位点的具体的等位基因的替代序列。具体地,这些指示物可以充当用于检测感兴趣的核酸区域与阵列的杂交的替代检测序列。其他指示物可以用于将扩增产物与具体的样品相对应,或用于识别分析方法内的实验误差。在具体的分析中,利用作为扩增产物的真实序列的替代的一个或更多个指示物,识别和定量来自连续的连接产物的扩增产物。
在特定的分析系统中,第一固定序列寡核苷酸或第二固定序列寡核苷酸包括缔合特定的等位基因与那个互补的固定序列寡核苷酸的等位基因指示物。
在本发明的其他特定的方面中,固定序列寡核苷酸被用于基因组区域例如,对应于具体的位点或染色体的基因组区域,的比较杂交。
在本发明的某些方面中,分析系统采用两个指示物序列,所述两个指示物序列允许利用阵列杂交进行样品中具体的遗传区域的水平的直接比较。
在本发明的一般方面中,提供用于检测遗传样品中基因组区域的频率的变异的方法。这个方法包括下列步骤:提供母亲样品,引入至少两组的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸,以便与感兴趣的核酸区域中的互补区域特异性地杂交,其中每一组包括与光学可检测的标记物相缔合的寡核苷酸,且其中两组都包括选择性地结合到单个阵列特征上的区域;连接杂交的寡核苷酸,以便产生与感兴趣的核酸区域互补的连续的连接产物;将来自两组的所述连续的连接产物引入到包括与连续的连接产物互补的一个或更多个特征的阵列;和通过所述光学可检测的标记物的检测,检测来自第一组和第二组的所述连续的连接产物的杂交;其中所述阵列上所述光学可检测的标记物的相对频率指示所述遗传样品中感兴趣的核酸区域的频率变异的存在或不存在。
在本发明的另一个一般方面中,提供用于检测与遗传样品中第一染色体和第二染色体相对应的感兴趣的区域的方法。这个方法包括下列步骤:提供遗传样品,向所述遗传样品引入至少两组的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸,所述引入在允许所述组的固定序列寡核苷酸与感兴趣的核酸区域中的互补区域特异性杂交的条件下进行,其中第一组固定序列寡核苷酸与第一染色体上的基因组区域互补且第二组固定序列寡核苷酸与第二染色体上的基因组区域互补,并且其中每一组包括与光学可检测的标记物缔合的寡核苷酸,且其中两组都包括选择性地结合到单个阵列特征上的区域;连接杂交的寡核苷酸,以便产生与感兴趣的核酸区域互补的连续的连接产物;将来自两组的所述连续的连接产物引入到包括与所述连续的连接产物互补的一个或更多个特征的阵列;和通过光学可检测的标记物的检测,检测来自第一组和第二组的连续的连接产物与阵列的杂交;其中阵列上光学可检测的标记物的相对频率指示遗传样品中第一染色体和第二染色体的频率的变异的存在或不存在。
在某些特定的方面中,对染色体上感兴趣的一个到10,000个核酸区域实施方法,如感兴趣的两个至1,000个核酸区域或任何介于中间的范围。
在某些特定的方面中,连续的连接产物的杂交包括与结合到阵列的单独的寡核苷酸的杂交。
在某些方面中,通过遗传样品中感兴趣的核酸的预期比率的改变检测变异。在某些特定方面中,通过一组连续的连接产物与第二组连续的连接产物相比杂交的增加的或减少的水平,检测变化。
在本发明的另一个一般方面中,提供用于检测包括母体和胎儿二者的无细胞DNA的母体样品中感兴趣的核酸区域的分析系统。这个分析系统包括下列步骤:提供包括来自母体和胎儿来源的无细胞DNA的母体样品;向遗传样品引入第一非-相邻的固定序列寡核苷酸和第二非-相邻的固定序列寡核苷酸,所述引入在允许所述固定序列寡核苷酸与感兴趣的核酸中的互补区域特异性杂交的条件下进行;在允许桥接寡核苷酸与所述感兴趣的核酸中的互补区域特异性杂交的条件下,引入一个或更多个桥接寡核苷酸,其中一个或更多个桥接寡核苷酸与在与第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的区域之间且直接与所述区域相邻的核酸区域互补;连接杂交的寡核苷酸,以便产生与感兴趣的核酸区域互补的连续的连接产物;扩增所述连续的连接产物,以便产生具有核酸区域的序列的扩增产物;和检测和定量所述扩增产物;其中所述扩增产物的定量提供母体样品中核酸区域的相对频率。
样品中的核酸的相对频率不仅可以用于确定那个具体的核酸区域的拷贝数变异,而且连同其他核酸和/或与其他核酸相比,它可以用于确定较大的基因组区域的拷贝数变异,包括由于胎儿的非整倍性所致的母体和胎儿核酸区域之间的染色体不平衡。
本发明还提供可用于诸如本发明的那些的基于连接的核酸检测分析的组合物。因此,本发明提供用于感兴趣的核酸区域的基于连接的检测的寡核苷酸的组,所述寡核苷酸的组包括:第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸包括与核酸区域的第一部分的序列互补的序列、通用引物序列、和任选地一个或更多个指示物;第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸包括与核酸区域的第二部分的序列互补的序列和通用引物序列;和一个或更多个桥接寡核苷酸,所述一个或更多个桥接寡核苷酸与和第一寡核苷酸和第二寡核苷酸互补的核酸区域直接相邻且在所述核酸区域之间的区域互补。在某些方面中,寡核苷酸组包括具有识别感兴趣的核酸内不同的多态性的能力的两个或更多个桥接寡核苷酸。在其他方面中,桥接分子提供关于桥接寡核苷酸的每一个位置的简并性。在还有的其他方面中,桥接分子提供关于桥接寡核苷酸的每一个内部位置的简并性,同时与连接位点相邻的核苷酸在组内使用的桥接寡核苷酸的库中保持不变。
下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。
附图简述
图1图示关于本发明的基于连接的分析系统的第一一般示意图。
图2图示关于本发明的基于连接的分析系统的第二一般示意图。
图3图示用于检测两个或更多个感兴趣的区域的多路复用分析系统。
图4图示用于检测感兴趣的区域内的两个或更多个等位基因的第一多路复用分析系统。
图5图示用于检测感兴趣的区域内的两个或更多个等位基因的第二多路复用分析系统。
图6图示用于检测感兴趣的区域内的两个或更多个等位基因的第三多路复用分析系统。
图7图示用于检测感兴趣的区域内的两个或更多个等位基因的第四多路复用分析系统。
图8图示用于检测感兴趣的区域内的两个或更多个等位基因的第五多路复用分析系统。
图9图示在本发明的基于连接的分析系统内利用寡核苷酸延伸的分析系统的第一一般示意图。
图10图示在本发明的基于连接的分析系统内利用寡核苷酸延伸的分析系统的第二一般示意图。
图11图示利用单个固定序列寡核苷酸的分析系统。
图12图示利用与来自两个不同的染色体的基因座选择性杂交的寡核苷酸的第一比较杂交方案。
图13图示利用与一个基因座的不同的等位基因选择性杂交的寡核苷酸的第二比较杂交方案。
图14图示利用一个典型的分析形式获得的基因分型性能。
图15是图示分析系统确定母体样品中的胎儿DNA百分比的能力的图。
定义
本文使用的术语倾向于具有如本领域的技术人员理解的简单和普通的含义。下列定义倾向于帮助读者理解本发明,但是并非意味着改变或以其他方式限制这样的术语的含义,除非特别地指出。
术语“等位基因指示物”通常指的是对应于特定的SNP的一系列核苷酸。等位基因指示物可以含有允许检测一个或更多个碱基的缺失、置换或插入的另外的核苷酸。可以将指示物与任何其他指示物联合,以便产生提供用于两种性能(例如,样品-识别指示物、等位基因-基因座指示物)的信息的一个指示物。
术语“结合对”意指,利用共价和/或非共价结合特异性地彼此结合的任何两个分子,且其可以用于遗传物质与基质的附连。实例包括,但不限于,配体和它们的蛋白质结合配偶体,例如,生物素和抗生物素蛋白、生物素和链霉亲和素、抗体和它的具体的表位,诸如此类。
术语“染色体异常”指的是全部或部分的染色体的任何遗传变异。遗传变异可以包括但不限于任何拷贝数变异如重复或缺失、易位、倒位和突变。
术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的核酸分子(也就是,核苷酸的序列)。通常,互补的核苷酸是A与T(或A和U)、或C与G。两条单链RNA或DNA分子在最佳比对且具有适当的核苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸以至少大约90%至大约95%互补性配对,和更优选地从大约98%至大约100%互补性配对,和甚至更优选地以100%互补性配对时,被认为是大体上互补的。可替换地,当RNA或DNA链将在选择性杂交条件下与它的互补链杂交时,存在实质的互补性。选择性杂交条件包括,但不限于,严格的杂交条件。严格的杂交条件通常将包括少于大约1M,更通常地少于大约500mM和优选地少于大约200mM的盐浓度。杂交温度通常比解链温度(Tm)低至少大约2℃至大约6℃。
术语“校正指示物”指的是可以含有允许扩增、测序或其他实验误差的识别和校正的另外的核苷酸的指示物,所述其他实验误差包括测序期间,一个或更多个碱基的缺失、置换或插入的检测以及测序之外(如管聚物合成、扩增和任何其他方面的分析)可能发生的核苷酸改变。
如本文使用的,术语“诊断工具”指的是,为了在患者样品上实施诊断测试或分析,如,例如,在系统中,联合使用的本发明的任何组合物或分析。
术语“遗传样品”指的是包括生物体的遗传信息的全部或部分的任何样品,包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物和动物、和具体的哺乳动物。遗传样品内可以被测定的遗传信息包括基因组DNA(编码区和非编码区)、线粒体DNA、RNA、和来源于这些中的每一个的核酸产物。这样的核酸产物包括从mRNA产生的cDNA或为了增加用于分析的材料预扩增的产物。
术语“杂交”通常意指反应,通过其发生核酸的互补链的配对的反应。DNA通常是双链的,且当链分开时,它们将在适当的条件下再次杂交。可以在DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA之间形成杂交。可以在短的链和含有与该短的链互补的区域的长链之间形成杂交。也可以形成不完全的杂交,但是杂交越不完全,它们将越不稳定(且越不太可能形成)。
术语“识别指示物”通常指的是为了识别的目的,在寡核苷酸合成期间,被掺入到寡核苷酸内的一系列核苷酸。优选地,识别指示物序列长度是6个或更多个核苷酸。在优选的方面中,识别指示物足够长,从而具有利用靶序列独特地标记每一个分子的统计概率。例如,如果存在3000拷贝的具体的靶序列,那么存在大体上超过3000个识别指示物,使得,可能利用独特的识别指示物标记每一个拷贝的具体的靶序列。识别指示物可以含有另外的核苷酸,所述另外的核苷酸允许测序期间,包含一个或更多个碱基的缺失、置换或插入的检测的测序误差的识别和校正,以及可以发生在测序之外(如寡核苷酸合成、扩增和任何其他方面的分析)的核苷酸改变的识别和校正。可以将指示物与任何其他指示物联合,以便产生提供用于两种性能(例如,样品-识别指示物、等位基因-基因位点指示物)的信息的一个指示物。
术语“识别指示物”通常指的是被掺入到扩增过程的引物区域用于核酸区域的扩增产物的独特识别的一系列核苷酸。优选地,识别指示物序列长度是6个或更多个核苷酸。在优选的方面中,识别指示物足够长,从而具有利用靶序列独特地标记每一个分子的统计概率。例如,如果存在3000拷贝的具体的靶序列,那么存在大体上超过3000个识别指示物,使得,可能利用独特的识别指示物标记每一个拷贝的具体的靶序列。识别指示物可以含有另外的核苷酸,所述另外的核苷酸允许测序期间,包含一个或更多个碱基的缺失、置换或插入的检测的测序误差的识别和校正以及可以发生在测序之外(如寡核苷酸合成、扩增和任何其他方面的分析)的核苷酸改变的识别和校正。可以将指示物与任何其他指示物联合,以便产生提供用于两种性能(例如,样品-识别指示物、等位基因-基因位点指示物)的信息的一个指示物。
如本文使用的,术语“连接酶”通常指的是一类酶,DNA连接酶(通常T4DNA连接酶),其可以将DNA片段连接在一起。片段必须具有相互匹配的末端(两者都为平末端或具有相互匹配的粘性末端)且反应需要ATP。“连接”是两个DNA片段连接在一起的过程。
如本文使用的,术语“基因座”和“多个基因座”指的是基因组中已知位置的核酸区域。
术语“基因座指示物”通常指的是对应于特定的基因组基因座的一系列核苷酸。在优选的方面中,基因座指示物足够长以便独特地标记每一个靶序列区域。例如,如果方法利用192个靶序列区域,那么存在至少192个独特的基因座指示物,每一个独特地识别每一个靶区域。基因座指示物可以含有另外的核苷酸,所述另外的核苷酸允许测序期间,包括一个或更多个碱基的缺失、置换或插入的检测的测序误差的识别和校正以及可以发生在测序之外(如寡核苷酸合成、扩增和任何其他方面的分析)的核苷酸改变的识别和校正。可以将指示物与任何其他指示物联合,以便产生提供用于两种性能(例如,样品-识别指示物、等位基因-基因座指示物)的信息的一个指示物。
如本文使用的,术语“母体样品”指的是从怀孕的哺乳动物获得的任何样品,其包括胎儿和母体的无细胞DNA。优选地,用于本发明的母体样品通过相对非侵入的方式,例如,用于从受试者提取外周样品的静脉切开术或其他标准的技术来获得。
术语“解链温度”或Tm通常被解释为双链核酸分子的群体一半被解离成单链的温度。本领域熟知用于计算核酸的Tm的等式。如标准参考文献所示的,可以通过等式:Tm=81.5+16.6(log10[Na+])0.41(%[G+C])-675/n-1.0m计算而简单地估计Tm值,当核酸处于具有0.5或更少的阳离子浓度的水性溶液中时,(G+C)含量在30%和70%之间,n是碱基的数目,且m是碱基对错配的百分比(参见,例如,Sambrook J等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))。其他参考文献包含将结构的以及序列特征考虑到Tm的计算中的更加复杂的计算。
“微阵列”或“阵列”指的是具有表面,优选地但非专有地是平面的或大体上平面的表面的固相支撑物,其携带含有核酸的位点阵列,使得阵列的每一个位点包括基本上相同拷贝的或相同拷贝的寡核苷酸或多核苷酸,且被空间地限定并不与阵列的其他成员位点重叠;也就是,位点是空间上离散的。阵列或微阵列也可以包括具有表面的非平面可测定的结构如磁珠或孔。阵列的寡核苷酸或多核苷酸可以共价地结合到固体支撑物上,或可以非共价地结合。常规的微阵列技术在,例如,Schena,Ed.,Microarrays:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(2000)中评论。“阵列分析”、“通过阵列的分析”或“通过微阵列的分析”指的是利用微阵列的一个或更多个生物分子的分析,例如,序列分析。
如本文使用的,术语“寡核苷酸”(“oligonucleotides”或“oligos”)指的是天然的或修饰的核酸单体的直链寡核苷酸,所述天然的或修饰的核酸单体包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、它的异头物形式、肽核酸单体(PNA)、锁定核酸单体(LNA)、诸如此类,或它们的组合,所述直链寡核苷酸能够经由单体与单体相互作用的常规模式,如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型(reverse Hoogsteen)的碱基配对等等,特异性地结合到单链多核苷酸上。通常,通过磷酸二酯键或它的类似物连接单体,以便形成大小范围是从几个单体单元,例如,8-12个,到几十个单体单元,例如,100-200或更多,的寡核苷酸。可以通过以下方面制备适当的核酸分子:Beaucage和Carruthers描述的亚磷酰胺方法(Tetrahedron Lett.,22:1859-1862(1981))、或通过根据Matteucci等人的三酯方法(J.Am.Chem.Soc,103:3185(1981)),两者都以参考方式并入本文,或通过其他化学方法如利用商业自动化的寡核苷酸合成器。
如此处使用的,“核苷酸”指的是碱基-糖-磷酸组合。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单元。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP,或它们的衍生物。这样的衍生物包括,例如,[aS]dATP、7-去氮-dGTP和7-去氮-dATP,和对含有它们的核酸分子赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文使用的术语核苷酸也指的是双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)和它们的衍生物。双脱氧核苷三磷酸的例证的实例包括,但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。
根据本发明,“核苷酸”可以是未标记的或通过众所周知的技术可检测地标记。在很多综述中描述了荧光标记物和它们与寡核苷酸的附连,包括:Haugland,Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals,9th Ed.,Molecular Probes,Inc.,Eugene OR(2002);Keller and Manak,DNA Probes,2nd Ed.,Stockton Press,New York(1993);Eckstein,Ed.,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRLPress,Oxford(1991);Wetmur,Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology,26:227-259(1991);等等。在下列参考例子中公开了可应用于本发明的其他方法:Fung等人,美国专利号4,757,141;Hobbs,Jr.,等人,美国专利号5,151,507;Cruickshank,美国专利号5,091,519;Menchen等人,美国专利号5,188,934;Begot等人,美国专利号5,366,860;Lee等人,美国专利号5,847,162;Khanna等人,美国专利号4,318,846;Lee等人,美国专利号5,800,996;Lee等人,美国专利号5,066,580;Mathies等人,美国专利号5,688,648;等等。也可以利用量子点实施标记,如在下列专利和专利公布中公开的:美国专利号6,322,901;6,576,291;6,423,551;6,251,303;6,319,426;6,426,513;6,444,143;5,990,479;6,207,392;2002/0045045;和2003/0017264。可检测的标记物包括,例如,放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和酶标记物。核苷酸的荧光标记物可以包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、CASCADE(芘氧基三磺酸)、OREGON GREENTM(2’,7’-二氟荧光素)、TEXAS REDTM(磺基罗丹明101酸氯、花菁和5-(2’-氨乙基)萘胺-1-磺酸(EDANS)。荧光地标记的核苷酸的特定实例包括可从PerkinElmer,Foster City,Calif获得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP、和[dROX]ddTTP;可从Amersham,Arlington Heights,IL获得的FluroLink脱氧核苷酸、FluroLink Cy3-dCTP、FluroLinkCy5-dCTP、FluroLinkFluorX-dCTP、FluroLink Cy3-dUTP、和FluroLinkCy5-dUTP;可从Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN获得的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素12-UTP、和荧光素-15-2'-dATP;和可从Molecular Probes,Eugene,OR购买的染色体标记的核苷酸,BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、CASCADE(芘氧基三磺酸-7-UTP)、CASCADE(芘氧基三磺酸-7-dUTP)、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、OREGONGREENTM488-5-dUTP(2',7'-二氟荧光素-5-dUTP)、RHODAMINE GREENTM-5-UTP((5-{2-[4-(氨甲基)苯基]-5-(吡啶-4-基)-lH-i-5-UTP))、RHODAMINE GREENTM-5-dUTP((5-{2-[4-(氨甲基)苯基]-5-(吡啶-4-基)-lH-i-5-dUTP))、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS REDTM-5-UTP(磺基罗丹明101酸氯-5-UTP)、TEXAS REDTM-5-dUTP(磺基罗丹明101酸氯-5-dUTP)、和TEXAS REDTM-12-dUTP(磺基罗丹明101酸氯-12-dUTP)。
如本文使用的,术语“聚合酶”指的是利用另一个链作为模板,将单个核苷酸连接在一起形成长链的酶。存在两种一般类型的聚合酶-合成DNA的DNA聚合酶和合成RNA的RNA聚合酶。在这两种类别内,取决于什么类型核酸可以作为模板行使功能和形成什么类型的核酸,存在许多子类型的聚合酶。
如本文使用的,“聚合酶链式反应”或“PCR”指的是用于在体外,甚至在过量的非特异性DNA的存在下,复制靶DNA的特异性片段的技术。将引物添加到靶DNA上,其中引物利用核苷酸,和通常地,Taq聚合酶等等启动靶DNA的复制。通过循环温度,重复地使靶DNA变性和复制。即使与其他的随机DNA混合时,单个拷贝的靶DNA可以被扩增,以便获得数十亿的复制。聚合酶链式反应可以用于检测和测量非常少量的DNA和产生特定的DNA片段。在某些情况下,线性扩增方法可以被用作PCR的替代法。
如本文使用的,术语“多态性”指的是可以表示那个具体的基因座的基因座内的任何遗传改变或变异,包括但不限于单核苷酸多态性(SNP)、甲基化差异、短串联重复(STR)等等。
通常,“引物”是在如聚合酶链式反应的合成步骤中或在某些测序反应中使用的引物延伸技术中,用于,例如,引起DNA延伸、连接和/或合成的寡核苷酸。引物也可以用于杂交技术,作为提供核酸区域与捕获寡核苷酸的互补性的手段用于检测特定的核酸区域。
如本文使用的术语“研究工具”指的是用于本质上学术的或商业的科学询问的本发明的任何组合物或分析,该科学询问包括药物治疗剂和/或生物治疗剂的开发。本发明的研究工具并不倾向于是治疗性的或经受注册批准;而是,本发明的研究工具倾向于促进研究且帮助这样的开发活动,包含旨在产生支持注册申报的信息而进行的任何活动。
如本文使用的,术语“测序”通常指的是可以用于确定一个或更多个DNA分子中的核苷酸碱基的顺序的任何和所有的生物化学方法,所述核苷酸碱基包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。如本文使用的,术语“序列确定”意指利用本领域已知的任何测序的方法确定核酸中的顺序核苷酸碱基。
术语“样品指示物”通常指的是一系列独特的核苷酸(也就是,每一个样品指示物是独特的),且可以用于允许单个反应容器中的样品的多路复用,使得每一个样品可以基于它的样品指示物而识别。在优选的方面中,关于一组样品中的每一个样品,存在唯一的样品指示物,且在测序期间样品被聚集。例如,如果十二个样品被聚集到单个测序反应中,存在至少十二个独特的样品指示物,使得独特地标记每一个样品。样品指示物可以含有另外的核苷酸,其允许测序期间,包括一个或更多个碱基的缺失、置换或插入的检测的测序误差的识别和校正以及可以发生在测序之外(如寡核苷酸合成、扩增和任何其他方面的分析)的核苷酸改变的识别和校正。可以将指示物与任何其他指示物联合,以便产生提供用于两种性能(例如,样品-识别指示物、等位基因-基因座指示物)的信息的一个指示物。
发明详述
除非另外指出,本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述,这些都在本领域的技术人员的技术内。这样常规的技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、和利用标记物的杂交检测。适当的技术的具体的说明可以参考本文的实例。然而,当然,也可以使用其他等价的常规程序。可以在标准实验室手册中发现这样的常规技术和描述,如,Green,et al.,Eds.(1999),Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV);Weiner,Gabriel,Stephens,Eds.(2007),Genetic Variation:A Laboratory Manual;Dieffenbach,Dveksler,Eds.(2003),PCR Primer:A Laboratory Manual;Bowtell andSambrook(2003),DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual;Mount(2004),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis;Sambrook and Russell(2006),Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual;以及Sambrookand Russell(2002),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(所有都来自Cold SpringHarbor Laboratory Press);Stryer,L.(1995)Biochemistry(4th Ed.)W.H.Freeman,NewYork N.Y.;Gait,"Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach"1984,IRLPress,London;Nelson and Cox(2000),Lehninger;Principles of Biochemistry 3Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.;以及Berg et al.(2002)Biochemistry,5th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.,所有这些以引用方式包括在此。
应该注意,除非另外明确指出,如本文和所附的权利要求中使用的,单数形式“一种”、“一个”和“该”包含复数指代物。因而,例如,提及“一个等位基因”指的是具有多种序列变异的等位基因的一个或更多个拷贝,且提及“分析系统”包括对本领域的技术人员已知的等价步骤和方法的提及,等等。
除非另外定义,本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属于的领域的技术人员通常理解相同的意义。本文描述的所有的出版物为了描述和公开可以联合目前描述的发明使用的设备、配方和方法的目的,以引用方式并入。
在提供值的范围的地方,应该明白,每一个介于中间的值,在那个范围的上限和下限之间和那个规定的范围中的任何其他规定的或介于中间的值包括在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内,且也被包括在本发明内,受制于规定的范围中的任何特异性排除的限制。在规定的范围包含限制的一个或两个时,排除那些包括的限制的两个的范围也被包括在本发明内。
在下面的描述中,阐述许多具体细节,以便提供本发明的更彻底的理解。然而,本领域的技术人员将显而易见,可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下,实践本发明。在其他情况下,为了避免使本发明晦涩,没有描述已知的特征和本领域的技术人员熟知的程序。
一般发明
本发明提供识别遗传样品中核酸区域(包括基因座、基因座的组和较大的基因组区域,例如,染色体)的拷贝数变异、突变和多态性和/或选择遗传样品中用于重测序的遗传样品部分的分析系统。
在一个方面中,分析系统利用以下方法:从遗传样品中感兴趣的两个或更多基因组区域(例如,染色体或基因座)选择性地识别和/或分离选定的核酸区域,且允许基于来自遗传样品的两个或更多染色体的许多检测的核酸区域之间的比较或通过与来自相同的或不同的样品的一个或更多个参考染色体比较,确定具体的基因组区域的非典型的拷贝数。
更具体地,分析系统利用串联连接方法,包括利用与感兴趣的染色体或参考染色体上选定的核酸区域互补的固定序列的第一非相邻寡核苷酸和第二非相邻寡核苷酸,和与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间且与其直接相邻的区域互补的一个或更多个短的桥接寡核苷酸(也称为“夹板(splint)”寡核苷酸)。这些三个或更多个寡核苷酸与选定的感兴趣的核酸的杂交,之后是这些三个或更多寡核苷酸的连接为这个区域的进一步的扩增、检测和定量提供连续的模板。扩增的区域可以被直接地从扩增反应定量,或任选地被分离和识别,以便定量样品中选定的核酸区域的数目。
在特定的方面中,串联连接方法利用具有一组两个或更多个连续的、相邻的桥接寡核苷酸的固定序列寡核苷酸,所述桥接寡核苷酸与固定序列寡核苷酸互补的区域之间的核酸区域杂交。这些桥接寡核苷酸彼此相邻杂交且与固定序列寡核苷酸相邻杂交。在连接反应期间连接连续的桥接寡核苷酸和固定序列寡核苷酸以及连续的桥接寡核苷酸彼此,产生单个连续模板用于进一步的扩增和序列确定。
在本发明的其他方面中,分析系统利用结合到感兴趣的核酸区域内的非-相邻区域上的一组寡核苷酸,且引物延伸用于在串联连接步骤之前形成杂交的寡核苷酸的连续组。在这样的方面中,分析系统利用串联连接方法,该串联连接方法包括利用与感兴趣的染色体或参考染色体上选定的核酸区域互补的固定序列的第一非相邻寡核苷酸和第二非相邻寡核苷酸,和一个或更多个短的、桥接寡核苷酸,该桥接寡核苷酸与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间,但是与一个或另一个固定序列寡核苷酸没有直接相邻的区域互补。这些三个或更多个寡核苷酸与选定的感兴趣的核酸的杂交之后是利用dNTP和聚合酶的延伸反应以产生一组相邻杂交的寡核苷酸,以及相邻杂交的寡核苷酸的连接。延伸和连接的联合为这个区域的进一步的扩增、检测和定量提供连续的模板。扩增的区域可以直接地从扩增反应定量,或任选地被分离和识别,以便定量样品中许多选定的核酸区域。
在特定的方面中,串联连接方法利用具有一组两个或更多个顺序的但是非相邻的桥接寡核苷酸的固定序列寡核苷酸,所述桥接寡核苷酸与固定序列寡核苷酸互补的区域之间的核酸区域杂交。在连接反应期间连接固定序列寡核苷酸和桥架寡核苷酸之间和/或顺序的桥接寡核苷酸之间的“缺口(gap)”区域,产生单个连续的模板用于进一步的扩增和序列确定。
在本发明的优选的方面中,来自遗传样品的核酸利用例如将遗传物质附连到基底表面的结合对与基底缔合。简单地说,可以将结合对的第一成员(例如,生物素)与感兴趣的核酸缔合,并将所缔合的核酸附连到基底上,所述基底在其表面上包括结合对的第二成员(例如,抗生物素蛋白或链霉亲和素)。这在固定序列寡核苷酸和/或桥接寡核苷酸与感兴趣的核酸的特异性结合之后,去除任何未杂交的寡核苷酸中,是特别有用的。简单地说,附连的核酸可以与寡核苷酸杂交,且表面优选被处理以去除任何未杂交的寡核苷酸,处理通过例如洗涤或其他去除方法,这样的寡核苷酸的降解,如Willis等人,美国专利号7,700,323和6,858,412中讨论的。
如本领域的技术人员在阅读本说明书后显而易见的,存在许多可以用于经由结合对相互作用缔合核酸的方法。例如,许多方法可以用于利用生物素标记遗传样品的核酸,包括随机的光生物素酰化(photobiotinylation)、利用生物素的末端标记、利用生物素化核苷酸的复制和利用生物素-标记的引物的复制。
在优选的方面中,本发明的分析系统采用使用一组三个或更多个这样的寡核苷酸的多路复用反应用于每一个选定的核酸区域。在图1中图示这个一般方面。优选地,每一组寡核苷酸优选地含有两个固定序列的寡核苷酸101、103和一个或更多个桥接寡核苷酸113。每一个固定序列寡核苷酸包括与选定的核酸区域互补的区域105、107,和优选地通用引物序列109、111,也就是,与通用引物互补的寡核苷酸区域。这些通用引物序列109、111用于在杂交的固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸的连接之后扩增不同的选定的核酸区域。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸101、103的末端或靠近固定序列寡核苷酸101、103的末端,且因而在任何通用扩增方法的产物中保留核酸-特异性序列。可以通过确定产物的序列检测扩增产物,例如,通过序列确定或与例如阵列的杂交或基于珠的检测系统如LuminexTM基于珠的分析(Invitrogen,Carlsbad,CA)或BeadXpressTM分析(Illumina,San Diego,CA)。
在本发明的分析系统的一个方面中,将固定序列寡核苷酸101、103引入102到遗传样品100中且允许它们特异性结合到感兴趣的核酸区域115的互补部分上。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。然后,引入桥接寡核苷酸且允许其在第一101固定序列寡核苷酸与第二103固定序列寡核苷酸之间结合104到选定的核酸区域115的区域上。可替换地,可以同时地将桥接寡核苷酸引入到固定序列寡核苷酸上。连接106结合的寡核苷酸,以便产生跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。在连接之后,引入通用引物117、119,以便扩增108连接的模板区域,从而产生110包括感兴趣的核酸区域的序列的产物121。任选地分离、检测、和定量这些产物121,以便提供有关遗传样品中选定的核酸区域的存在和量的信息。优选地,通过产物的序列确定,且具体地对应于选定的核酸区域的产物的区域的序列确定,检测和定量产物。
用于本发明的分析系统中的每一个染色体分析的选定的核酸区域的数目可以从每分析的染色体2-20000个或更多个变化。在优选的方面中,靶向区域的数目在48个和480个之间。在另一个方面中,靶向区域的数目是至少100个。在另一个方面中,靶向区域的数目是至少400个。在另一个方面中,靶向区域的数目是至少1000个。
在某些方面中,桥接寡核苷酸可以包括每一个位置中具有简并性的寡核苷酸的混合物,这样,使用的随机物的混合物将与需要特定长度的桥接的多路复用分析中的所有的反应相配。在另一个方面中,桥接寡核苷酸可以是多种长度的,使得寡核苷酸的混合物将与需要特定长度的桥接寡核苷酸的多路复用分析中的具体的串联连接反应相配。
在还有的另一个方面中,桥接寡核苷酸可以具有局部简并性,且多路复用的串联连接反应限于需要由桥接寡核苷酸的简并性提供的特异性序列的那些。例如,一组串联连接反应可能仅需要桥接寡核苷酸中的A和C碱基,且仅利用A和C碱基合成的桥接寡核苷酸的混合物将被提供于多路复用分析中的这些具体的串联连接反应。
在还有的另一个方面中,设计桥接寡核苷酸序列,使得将在分析系统中多路复用在桥接区域中具有特定的特异性序列的那些分析。在一个实例中,桥接寡核苷酸是随机物,其中桥接寡核苷酸的所有的组合被合成。作为实例,在其中使用5-碱基寡核苷酸的情况中,独特的桥接寡核苷酸的数目将是4^5=1024。这将不依赖于靶向区域的数目,因为所有可能的桥接寡核苷酸将存在于反应中。
在另一个实例中,特异性地合成桥接寡核苷酸,以便匹配缺口中的序列。作为实例,在其中使用5-碱基寡核苷酸的情况中,合成的独特的寡核苷酸的数目将等于或小于靶向区域的数目。如果在两个或更多个靶向区域之间共享缺口序列,那么可以实现小于靶向区域数目的数目。在这个实例的一个方面中,可能有目的地选择靶向序列且特别是缺口序列,使得,在缺口序列中存在尽可能多的相同的重叠,最小化多路复用反应所必需的桥接寡核苷酸的数目。
在另一个方面中,设计桥接寡核苷酸的序列并选择核酸区域,使得所有选定的核酸区域在桥接寡核苷酸的每一个末端上共享相同的碱基。例如,可以选择选定的核酸和它们的缺口位置,使得所有的缺口在第一位置共享“A”碱基且在缺口的最后的位置共享“G”碱基。可以基于诸如研究的基因组、那个区域中的序列变异的可能性等等的因素利用第一碱基和最后的碱基的任何组合。在这个实例的具体的方面中,可以通过桥接寡核苷酸的内部位置上的碱基的随机简并性、第一位置和最后的位置上的特定添加,合成桥接寡核苷酸。在5-mer的情况中,将随机地提供第二、第三和第四位置,且将在最接近的位置上添加两个特定核苷酸。在这种情况下,独特的桥接寡核苷酸的数目将是4^3=64。
在人类基因组中,二核苷酸CG的频率远低于由各自的单核苷酸频率预期的频率。这显示利用桥接寡核苷酸的具体的混合物增强分析的特异性的机会。在这个方面中,可以选择具有5’G和3’C的桥接寡核苷酸。这种碱基选择允许每一个寡核苷酸在人类基因组中具有高的频率,但是使得两个桥接寡核苷酸彼此相邻杂交成为稀有的事件。然后,减少在分析中没有靶向的基因组的位置中连接多个寡核苷酸的可能性。
优选地,在杂交固定序列寡核苷酸之后,且在已经洗掉所有的未杂交的固定序列寡核苷酸的任选的去除之后,将桥接寡核苷酸添加到反应中。优选地,在桥接寡核苷酸的Tm附近最佳化杂交反应的条件,以便阻止没有与核酸区域完全互补的寡核苷酸的不正确的杂交。如果桥接寡核苷酸具有显著地低于固定序列寡核苷酸的Tm,那么优选地,添加夹板寡核苷酸作为连接反应的一部分。
利用短的寡核苷酸的优势是,只有当桥接寡核苷酸的所有的碱基匹配缺口序列时,才可能出现任一末端上的连接。短的桥接寡核苷酸的还有的优势是,必须的不同寡核苷酸的数目将少于靶向位点的数目,提高寡核苷酸有效浓度,以便允许更快发生完美匹配。较少的寡核苷酸在成本和质量控制中也具有优势。利用固定的第一碱基和最后碱基以及期间的随机碱基的优势包括为了较好的特异性,利用较长的桥接寡核苷酸,同时减少反应中总的桥接寡核苷酸的数目的能力。
本发明的分析系统中指示物的应用
在某些方面中,利用描述的技术直接地检测感兴趣的核酸的全部或部分。然而,在某些方面中,感兴趣的核酸与一个或更多个指示物相缔合,所述指示物识别被分析的选定的核酸区域或具体的样品。一个或更多个指示物的检测可充当选定的核酸区域的替代检测机制,或如果指示物和核酸区域它自身的序列二者被确定,充当具体选定的核酸区域的存在的证实。在利用包含指示物和特异性地与核酸区域杂交的序列区域二者的引物的扩增步骤期间,这些指示物优选地与选定的核酸相缔合。
在一个实例中,用于扩增选定的核酸区域的引物被设计为在选定的核酸区域引物区域和通用扩增区域之间提供基因座指示物。对于每一个选定的核酸区域来说基因座指示物是独特的且代表感兴趣的染色体或参考染色体上的基因座,这样,样品中的基因座指示物的定量为基因座和含有该基因座的具体的染色体提供定量数据。
在另一个方面中,用于扩增遗传样品待分析的选定的核酸区域的引物被设计为在选定的核酸区域引物区域和通用扩增区域之间提供随机指示物。在这样的方面中,存在足够数目的识别指示物,以便独特地识别样品中每一个选定的核酸区域。待分析的每一个核酸区域与独特的识别指示物缔合,使得识别指示物与选定的核酸区域独特地缔合。样品中识别指示物的定量为相缔合的选定的核酸区域和对应于选定的核酸区域的染色体提供定量数据。识别基因座也可以用于检测在来自样品的选定的核酸区域的初始分离的下游发生的任何扩增偏差(bias)。
在某些方面中,仅检测基因座指示物和/或识别指示物(如果存在)且用于定量样品中选定的核酸区域。在另一个方面中,完成每一个基因座指示物随着一个独特的识别指示物出现的的次数的计数,以便确定样品中选定的核酸区域的相对频率。
优选地,引物被设计为在与感兴趣的核酸互补的区域侧翼的引物的末端编码包含识别信息的指示物。指示物是引物内使用的非互补的但是独特的序列,以便提供与利用引物分离和/或扩增的选择性的核酸区域相关的信息。这样的优势是,可以获得有关选定的核酸区域的存在和数量的信息,而不需要确定它自身真实的序列,尽管在某些方面中,可能期望如此做。然而,通常,通过一个或更多个指示物的识别来识别和定量选定的核酸区域的能力将减少所需要测序的长度,因为基因座信息在分离的选定的核酸区域的3’或5’末端被捕获。应用指示物作为识别选定的核酸区域的替代也可以减少误差,因为较长的测序读段更易于引入误差。
除了基因座-特异性指示物和识别指示物之外,可向引物引入另外的指示物,以便帮助样品的多路复用。另外,可以向引物添加识别测序误差、允许高度多路复用的扩增技术或允许与另一个表面的杂交或连接或附连的指示物。这些指示物的顺序和放置,以及这些指示物的长度可以变化。
用于选定的核酸区域的识别和定量的引物可以与选定的核酸区域的5’互补的区域相缔合,与选定的核酸区域的5’互补的区域相缔合,或在某些扩增体制中,指示物可以存在于与选定的核酸区域互补的一组扩增引物的一个或两个上。引物可以用于多路复用样品内待分析的多个选定的核酸区域的分析,且可以在溶液内或在固体基质上应用,例如,在微阵列上或在珠上。这些引物可以用于线性复制或扩增,或它们可以产生环形构建体用于进一步分析。
因而,在某些方面中,固定序列寡核苷酸的一个或两个还含有指示物区域。这个指示物区域可以包括可以用于识别选定的核酸区域和/或分析系统中正在分析的样品的许多不同的序列。优选地,指示物区域对应于选定的核酸区域,这样,指示物区域的识别可以被用作用于选定的核酸区域的真实序列的检测的替代。任选地,指示物区域可以包括样品指示物,以便将寡核苷酸组对应于多路复用分析系统中的具体的遗传样品。
图2图示在用于选定的核酸区域的寡核苷酸组中,单个指示物区域221在第一固定序列寡核苷酸201上的应用。固定序列寡核苷酸201、203被引入202遗传样品200,且被允许特异性地结合到选定的核酸区域215上。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。然后,引入桥接寡核苷酸且允许其在第一201固定序列寡核苷酸和第二203固定序列寡核苷酸之间与选定的核酸区域215的区域杂交204。连接206结合的寡核苷酸,以便形成跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。在连接之后,引入通用引物217、219,以便扩增208连接的模板区域,从而产生210包括感兴趣的核酸区域的序列的产物223。任选地分离、检测和/或定量这些产物223,以便提供有关遗传样品中选定的核酸区域的存在和量的信息。优选地,通过指示物的序列确定检测和定量产物,因而避免对确定选定的核酸区域的真实序列的需要。然而,在其他方面中,可期望确定包括指示物和选定的核酸区域二者的序列的产物,例如,以便提供结果的内部证实,或在指示物提供样品信息且没有提供选定的核酸区域的信息时。在另一个方面中,指示物允许与阵列上的特征独特的杂交,这样的杂交引起序列的检测和定量。
在其中在遗传样品中,同时地检测两个或更多个不同的选定的核酸区域的多路复用分析设置中,指示物的应用是特别有用的。图3图示其中在单个串联反应分析中检测两个不同的选定的核酸区域的实例。向遗传样品引入302与两个不同的核酸区域315、331特异性杂交的两组固定序列寡核苷酸(301和303、323和325)且允许它们与各自的核酸区域杂交304。各组包括具有序列特异性区域305、327;通用引物区域309和指示物区域321、335的寡核苷酸301、323。所述组的另一固定序列寡核苷酸包括序列特异性区域307、329和通用引物区域311。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。向杂交的固定序列寡核苷酸/核酸区域引入桥接寡核苷酸313、333,且允许它们与这些区域杂交306。尽管作为两个不同的桥接寡核苷酸在图3中示出,事实上,相同的桥接寡核苷酸可适用于两种杂交事件,或它们可以是来自可以与多个串联连接事件一起使用的简并寡核苷酸的库的两个寡核苷酸。连接308结合的寡核苷酸,以便形成跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。在连接之后,引入通用引物317、319,以便扩增310连接的模板区域,从而产生包括感兴趣的核酸区域的序列的扩增产物337、339。任选地,分离、检测和/或定量这些产物337、339,以便提供有关遗传样品中选定的核酸区域的存在和量的信息。
在多路复用分析系统中,通过不同指示物的序列确定检测和定量产物,因而避免对确定选定的核酸区域的真实序列的需要。然而,在其他方面中,指示物可以是样品特异性指示物以及区域特异性指示物,且因而指示物不仅可以识别核酸区域,而且可以提供核酸区域和获得区域的遗传样品的信息。可替换地,可以检测产物的核酸区域,例如,以便提供结果的内部证实,或在指示物单独地提供样品信息且没有提供关于选定的核酸区域的信息时。
利用基于连接的分析系统的多态性区域的检测
在某些方面中,本发明的分析系统检测包括多态性的一个或更多个区域。这种方法主要不是设计以识别具体的等位基因,例如,母体对胎儿的等位基因,而是确保,对应于感兴趣的核酸区域的不同的等位基因都被包括在本发明的定量方法内。然而,在某些方面中,可以期望利用信息计数遗传样品中所有这样的核酸区域,以及利用有关特定的多态性的信息以,例如,计算母体样品内含有的胎儿DNA的量,或识别来自癌症患者的遗传样品中具有具体的突变的等位基因百分比。因而,本发明倾向于涵盖用于通过定量直接确定拷贝数变异的含SNP核酸区域的检测以及用于确保分析的整体效率的SNP的检测二者的机制。
因而,在本发明的具体的方面中,通过桥接寡核苷酸提供等位基因-辨别(allele-discrimination)。在这个方面中,桥接寡核苷酸位于SNP上。在这个方面中,优选地,多态性位于足以接近于连接反应的一个末端,以便提供等位基因特异性。
在等位基因检测的一个实例中,互补等位基因桥接寡核苷酸变体存在于相同的反应混合物,并且等位基因检测产生于通过连接的产物或它们的扩增产物的多态性进行的随后的测序。图4图示这个方面。
在图4中,在选定的核酸区域的检测中使用两个固定序列寡核苷酸401、403,和相应于感兴趣的核酸区域415、429中的两个可能的SNP的桥接寡核苷酸,和优选地在单个反应中检测区域。固定序列寡核苷酸的每一个包括与选定的核酸区域互补的区域405、407,和用于在选定的核酸区域从遗传样品的初始选择和/或分离之后,扩增不同的选定的核酸区域的通用引物序列409、411。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸401、403的最接近末端,且在任何通用扩增方法的产物中保留核酸-特异性序列。向遗传样品400引入402固定序列寡核苷酸401、403,且允许它们与选定的核酸区域415、429特异性地结合。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。引入相应于A/TSNP413或G/C SNP433的桥接寡核苷酸,且允许它们在第一401固定序列寡核苷酸和第二403固定序列寡核苷酸之间结合404到选定的核酸区域415、429的区域上。可替换地,可以与固定序列寡核苷酸同时引入桥接寡核苷酸413、433。
连接406结合的寡核苷酸,以便形成跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。在连接之后,引入通用引物417、419,以便扩增408连接的模板区域,从而产生410包括代表选定的核酸区域内的两个SNP的感兴趣的核酸区域的序列的产物421、423。通过产物,且尤其含有选定的核酸区域内的SNP的产物的区域,的序列确定检测和定量这些产物421、423。
在另一个实例中,等位基因检测产生于基因座指示物或等位基因指示物的测序,其中所述基因座指示物或等位基因指示物在固定序列核酸区域寡核苷酸的一个或两个中提供。基因座指示物和/或等位基因指示物嵌入用于含有多态性的选定的核酸区域的组中使用的第一固定序列寡核苷酸或第二固定序列寡核苷酸,且与特定的固定序列寡核苷酸或具体的桥接寡核苷酸一起使用,两者中的任一个可以经设计用于检测多态性。扩增产物中基因座指示物和/或等位基因指示物的检测允许存在于遗传样品中的特定等位基因的存在、量或不存在的检测,以及通过样品中检测的多态性区域的添加,计数区域的数目。下面更详细地描述可以如何执行这种检测的两个实例。
例如,在本发明的一个方面中,利用单个基因座指示物和不同的桥接寡核苷酸实施两个或更多个单独的反应,所述不同的桥接寡核苷酸对应于与桥接寡核苷酸互补的区域内的不同的多态性。反应差别在于桥接寡核苷酸,并且包括不同的桥接寡核苷酸的连接、扩增和检测反应在整个检测步骤仍然分开。可以通过添加来自包括具有不同的多态性序列的桥接寡核苷酸的单独反应的核酸区域的检测的计数数目,数学上利用基因座指示物,确定感兴趣的具体的核酸区域的总计数。
这个方面对于,例如,其中需要有关样品中的多态性频率的信息和总的基因座计数的信息的情况是有用的。因为分别地检测反应,每一个单独的反应的检测,可能仅需要一个指示物,尽管单独的等位基因指示物也可以用于单独的反应。
图5图示本发明的分析系统的一个这样的方面。在感兴趣的核酸区域的检测中使用两个固定序列寡核苷酸501、503和对应于选定的核酸区域515、525中的两个可能的SNP的桥接寡核苷酸。固定序列寡核苷酸的每一个包括与选定的核酸区域互补的区域。分析系统的连接、扩增和检测步骤发生在两个单独的反应中,第一反应利用第一桥接寡核苷酸513且第二反应利用第二桥接寡核苷酸533。两个反应都利用具有与等位基因特异性区域505、507互补的相同区域的相同的固定序列寡核苷酸501、503。单个基因座指示物521可以用于检测每一个反应中的扩增产物,使得不一定需要感兴趣的核酸的真实序列的序列确定,尽管仍然可以确定它们,以识别序列或提供序列的证实。通用引物序列509、511位于固定序列寡核苷酸501、503侧翼的任意末端上,且因而在任何通用扩增方法的产物中保存留核酸-特异性序列和指示物。向遗传样品500引入502固定序列寡核苷酸501、503,且允许它们特异性地结合到选定的核酸区域515、525。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。向每一个反应引入对应于A/T SNP 513或G/C SNP533的桥接寡核苷酸且允许它们在第一505固定序列寡核苷酸和第二507固定序列寡核苷酸之间结合504到选定的核酸区域515、525的区域上。可替换地,可以与固定序列寡核苷酸同时,将桥接寡核苷酸513、533引入样品。
连接506结合的寡核苷酸,以便产生跨感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。在连接之后,引入通用引物517、519,以便扩增508连接的模板区域,从而产生510包括代表选定的核酸区域内的两个SNP的感兴趣的核酸区域的序列的产物527、529。通过产物的序列确定,且具体地,结合基因座指示物与桥接寡核苷酸被添加到它的反应的知识,检测和定量这些产物527、529。可以通过遗传样品中检测的多态性区域的添加确定作为整体的核酸区域的计数。
本发明的不同的特定方面利用等位基因指示物识别包括不同的多态性等位基因以及确定感兴趣的核酸的计数。在多路复用反应中,可以将基因座指示物与等位基因指示物联合。在这个方面中,利用对应于与桥接寡寡核苷酸互补的区域中的不同的多态性的两个或更多个不同的桥接寡核苷酸实施两个或更多个单独的连接反应。反应的区别是桥接寡核苷酸,且每一个桥接寡核苷酸与包括识别那个具体的桥接寡核苷酸的等位基因指示物的固定序列寡核苷酸一起使用。在连接步骤之后,可以在扩增之前联合反应,因为优选地使用相同的通用引物,或在检测之前联合,因为不同的等位基因可以通过不同的等位基因特异性指示物的识别区别。等位基因也可以通过等位基因指示物的序列确定或可替换地从等位基因指示物的杂交区别,且核酸区域的总的计数可以通过已识别的等位基因区域的添加确定。
在图6中,使用两组固定序列寡核苷酸,该两组固定序列寡核苷酸基本上包括相同的序列特异性区域605、607,但是在组的固定序列寡核苷酸的一个上包括不同的指示物621、623。利用来自相同的遗传样品600的材料,但是在具有不同的等位基因特异性寡核苷酸组的单独的管内实施连接反应。在每一个连接反应中,在选定的核酸区域的检测中使用对应于选定的核酸区域中的两个可能的SNP的桥接寡核苷酸613、633。指示具体的多态性等位基因的两个等位基因指示物621、623可以用于检测扩增产物,使得不一定需要感兴趣的核酸的真实序列的序列确定,尽管仍然可以确定这些序列,以便识别序列和/或提供序列的证实。固定序列寡核苷酸的每一个包括与选定的核酸区域互补的区域605、607,和用于在选定的核酸区域从遗传样品的初始选择和/或分离之后,扩增不同的选定的核酸区域的通用引物序列609、611。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸601、603和623的末端并且在指示物和与感兴趣的核酸互补的区域的侧翼,因而在通用扩增方法的产物中保留核酸-特异性序列和等位基因指示物。向遗传样品600的等分试样引入602固定序列寡核苷酸601、603、623,且允许它们与选定的核酸区域615或625特异性结合。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。
引入对应于A/T SNP 613或G/C SNP633的桥接寡核苷酸且允许它们结合604到选定的核酸区域615或625在固定序列寡核苷酸的第一605核酸-互补区域和第二607核酸-互补区域之间的区域上。可替换地,可以与固定序列寡核苷酸同时,将桥接寡核苷酸613、633引入样品。在单个反应混合物中连接606结合的寡核苷酸,以便形成跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。
在连接之后,优选地合并单独的反应用于通用扩增和检测步骤。将通用引物617、619引入到联合的反应,以便扩增608连接的模板区域且产生610包括代表选定的核酸区域内的两种SNP的感兴趣的核酸区域的序列的产物627、629。通过产物的序列确定,通过等位基因指示物和/或含有选定的核酸区域中的SNP的产物的区域,检测和定量这些产物627,629。
优选地,通过等位基因指示物的序列确定检测和定量图6方法的产物,因而避免对确定选定的核酸区域的真实序列的需要。然而,在其他方面中,可期望确定包括指示物和选定的核酸区域二者的序列的产物,例如,以便提供结果的内部证实,或在其中指示物提供样品信息且没有提供选定的核酸区域的信息时。
与本发明的实验系统一起使用的指示物也可以用于识别与用于检测感兴趣的核酸的固定序列相缔合的多态性。因而,在另一个典型的分析系统中,等位基因指示物与等位基因特异性固定序列寡核苷酸相缔合,并且等位基因检测产生于等位基因指示物的测序或可替换地产生于核酸区域引物中提供的等位基因指示物的杂交。等位基因指示物嵌入含有多态性的选定的核酸区域的组中使用的等位基因特异性第一固定序列寡核苷酸或第二固定序列寡核苷酸。在特定的方面中,等位基因指示物存在于第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸上,以便检测固定序列区域内的两个或更多个多态性。这样的方面中使用的固定序列寡核苷酸的数目可以对应于选定的核酸区域评估的可能的等位基因的数目,且等位基因指示物的序列确定或杂交可以检测遗传样品的特定等位基因的存在、量或不存在。
图7图示本发明的这个方面。在图7中,使用三个固定序列寡核苷酸701、703和723。固定序列寡核苷酸的两个701、723是等位基因特异性的,包括与核酸区域中分别地包括,例如,A/T或G/C SNP的等位基因互补的区域。每一个固定等位基因特异性寡核苷酸701、723也包括相应的等位基因指示物721、731和通用引物序列709。第二固定序列寡核苷酸703具有另外的通用引物序列711,并且这些通用引物序列用于在核酸区域从遗传样品的初始选择和/或分离之后,扩增核酸区域。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸701、703、723的末端、在指示物和感兴趣的核酸区域的侧翼,且因而在任何通用扩增方法的产物中保留核酸-特异性序列和指示物。
向DNA样品700引入702固定序列寡核苷酸701、703、723且允许它们特异性地结合到选定的核酸区域715、725上。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。引入桥接寡核苷酸713且允许其结合704到与第一等位基因特异性固定序列寡核苷酸区域705和另一固定序列寡核苷酸区域707之间的区域互补的核酸715上或结合到与第二等位基因特异性固定序列寡核苷酸区域735和另一固定序列寡核苷酸区域707之间的区域互补的核酸725上。可替换地,可以与固定序列寡核苷酸的组同时,将桥接寡核苷酸713引入样品。
连接706结合的寡核苷酸,以便形成跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。只有在等位基因特异性末端匹配时,连接开始发生。在连接之后,引入通用引物717、719,以便扩增708连接的模板区域,从而产生710包括代表选定的核酸区域中的两个SNP的感兴趣的核酸区域的序列的产物727、729。通过产物的序列确定,且具体地,含有选定的核酸区域中的SNP的产物的区域,检测和定量这些产物727、729。可替换地,通过等位基因指示物与阵列上的不同的特征的杂交检测和定量产物727、729。在这个检测方法中,在通过利用荧光标记物的引物717或719扩增的通用扩增期间,将荧光标记物掺入产物727、729。重要的是,应该注意,连接706是等位基因特异性的。为了使连接等位基因特异性,指定等位基因的核苷酸(allele specifying nucleotide)必须接近连接的末端。通常,等位基因特异性核苷酸必须在连接的末端的5个核苷酸内。在优选的方面中,等位基因特异性核苷酸是末端碱基。
在另一个实例中,等位基因检测产生于基因座指示物与阵列的杂交。通过等位基因特异性标记步骤检测每一个等位基因,其中在通用扩增期间,利用光谱不同的荧光标记物标记每一个等位基因。图8图示本发明的这个方面。在图8中,使用三个固定序列寡核苷酸801、803和823。固定序列寡核苷酸的两个801、823是等位基因特异性的,包括匹配同一选定的核酸区域中的具体的等位基因的区域、相应的基因座指示物821和等位基因特异性通用引物序列809、839。匹配的固定序列寡核苷酸803具有另一个通用引物序列811。通用引物序列用于在选定的核酸区域与遗传样品的初始选择和/或分离之后,扩增不同的选定的核酸区域,和将标记物掺入区别每一个等位基因的扩增产物。通用引物序列位于固定序列寡核苷酸801、803、823的最接近末端,且因而在任何通用扩增方法的产物中保留核酸特异性序列和指示物。向DNA样品800引入802固定序列寡核苷酸801、803、823,且允许特异性地结合到选定的核酸区域815、825上。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。引入桥接寡核苷酸813且允许其在第一805固定序列寡核苷酸和第二807固定序列寡核苷酸之间和第一835固定序列寡核苷酸和第二807固定序列寡核苷酸之间结合804到选定的核酸区域815、825的区域上。可替换地,可以与固定序列寡核苷酸同时,将桥接寡核苷酸813引入样品。
连接806结合的寡核苷酸,以便产生跨与感兴趣的核酸区域互补且与感兴趣的核酸区域互补的连续的核酸。只有在等位基因特异性末端匹配时,连接开始发生。在连接之后,引入通用引物817、819、837,以便扩增808连接的模板区域,从而产生810包括代表选定的核酸区域中的两个SNP的感兴趣的核酸区域的序列的产物827、829。通用引物817和837具有光谱不同的荧光标记物,使得通过这些荧光标记物保留等位基因特异性信息。通过基因座指示物821与阵列的杂交和成像检测和定量这些产物827、829,以便确定荧光标记物的掺入。重要的是,应该注意,优选地,连接806是等位基因特异性的。为了使得连接是等位基因特异性的,指定等位基因的核苷酸必须靠近连接的末端。通常,等位基因特异性核苷酸必须在连接的末端的5个核苷酸内。在优选的方面中,等位基因特异性核苷酸是末端碱基。
在另一个方面中,等位基因指示物存在于第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸二者上,以便利用特定的等位基因的每一个固定序列寡核苷酸的对应的频率不同的荧光标记物检测两个末端上的多态性。固定序列寡核苷酸的数目对应于为选定的核酸区域评估的可能的等位基因的数目。在上述图和实例中,以两个不同的寡核苷酸表示固定序列寡核苷酸。在另一个方面中,固定序列寡核苷酸可以是末端相反的相同的寡核苷酸。
在上述描述的方面中,使用的桥接寡核苷酸与感兴趣的核酸的区域杂交,所述感兴趣的核酸的区域与固定序列寡核苷酸互补的区域相邻,使得当固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸特异性地杂交时,它们直接地彼此相邻用于连接。然而,在其他方面中,桥接寡核苷酸与与固定序列寡核苷酸的一个或两个互补的区域不直接相邻的区域杂交,并且在连接之前,需要一个或更多个寡核苷酸的延伸的中间步骤是必须的。
例如,如图9所示,优选地,每一组寡核苷酸含有固定序列的两个寡核苷酸901、903和一个或更多个桥接寡核苷酸913。固定序列寡核苷酸的每一个包括与选定的核酸区域互补的区域905、907,和优选地通用引物序列909、911,即,与通用引物互补的寡核苷酸区域。通用引物序列909、911位于固定序列寡核苷酸901、903的末端或在固定序列寡核苷酸901、903的末端附近,且因而在任何通用扩增方法的产物中保留核酸-特异性序列。向遗传样品900引入固定序列寡核苷酸901、903,且允许它们特异性地结合到感兴趣的核酸区域的互补部分915上。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。然后,引入桥接寡核苷酸且允许其在第一901固定序列寡核苷酸和第二903固定序列寡核苷酸之间结合904到选定的核酸区域915的区域上。可替换地,可以同时地将桥接寡核苷酸引入到固定序列寡核苷酸。在这个示例方面中,桥接寡核苷酸与直接地与第一固定序列寡核苷酸区域905相邻,但是与第二固定序列寡核苷酸的互补区域间隔一个或更多个核苷酸的区域杂交。在固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸的杂交之后,利用例如聚合酶和dNTP延伸906桥接寡核苷酸913,以便填补桥接寡核苷酸913和第二固定序列寡核苷酸903之间的缺口。在延伸之后,连接908结合的寡核苷酸,以便产生跨越感兴趣的核酸区域且与感兴趣的核酸区域915互补的连续的核酸。在连接之后,引入910通用引物917、919,以便扩增连接的模板区域,从而产生912包括感兴趣的核酸区域的序列的产物923。任选地,分离、检测和定量这些产物923,以便提供有关遗传样品中选定的核酸区域的存在和量的信息。优选地,通过识别指示物921的序列确定,或可替换地,扩增产物923内感兴趣的核酸915的序列确定检测和定量产物。
在另一个方面中,如图10所示,优选地,每一组寡核苷酸含有两个固定序列的寡核苷酸1013、1033和结合到感兴趣的核酸1015上的非相邻区域上的两个或更多个桥接寡核苷酸1013、1033。固定序列寡核苷酸的每一个包括与选定的核酸区域互补的区域1005、1007,和优选地,通用引物序列1009、1011,即,与通用引物互补的寡核苷酸区域。通用引物序列1009、1011位于固定序列寡核苷酸1001、1003的末端或固定序列寡核苷酸1001、1003的末端附近,且因而在任何通用扩增方法的产物中保留核酸-特异性序列。向遗传样品1000引入1002固定序列寡核苷酸1001、1003,且允许它们特异性结合到感兴趣的核酸区域1015的互补部分上。在杂交之后,优选地,将未杂交的固定序列寡核苷酸与剩余的遗传样品分离(没有显示)。
在图10中,引入两个单独的桥接寡核苷酸1013、1033且允许它们结合1004到在第一1001和第二1003固定序列寡核苷酸之间但是不与第一1001和第二1003固定序列寡核苷酸直接相邻的选定的核酸区域1015区域上。可替换地,可以将桥接寡核苷酸同时地引入到固定序列寡核苷酸。在这个示例方面中,第一桥接寡核苷酸1033与和第一固定序列寡核苷酸区域1005直接相邻,但是与第二桥接寡核苷酸1013的互补区域间隔一个或更多个核苷酸的区域杂交。第二桥接寡核苷酸1013也与第二固定序列寡核苷酸1007间隔一个或更多个核苷酸。在固定序列和桥接寡核苷酸的杂交之后,利用例如聚合酶和dNTP延伸1006桥接寡核苷酸1013、1033,以便填补桥接寡核苷酸之间的缺口和第二桥接寡核苷酸1013和第二固定序列寡核苷酸1003之间的缺口。在延伸之后,连接1008结合的寡核苷酸,以便产生跨越感兴趣的核酸区域1015且与感兴趣的核酸区域1015互补的连续的核酸。在连接之后,引入1010通用引物1017、1019,以便扩增连接的模板区域,从而产生1012包括感兴趣的核酸区域的序列的产物1023。任选地,分离、检测和定量这些产物1023,以便提供有关遗传样品中选定的核酸区域的存在和量的信息。优选地,通过识别指示物1021的序列确定,或可替换地,扩增产物1023内感兴趣的核酸1015的序列,确定检测和定量产物。
在特定的方面中,如在图11所示的方面中,单个固定序列寡核苷酸1101在两个末端上与选定的核酸区域1115互补。当这个单个固定序列寡核苷酸1101与选定的核酸区域1115杂交时,它形成末端被几个核苷酸分隔的前环形(pre-circle)寡核苷酸1103。然后,桥接寡核苷酸1113在前环形寡核苷酸1103的互补区域1105、1107之间结合,以便填补这个缺口。然后,利用桥接寡核苷酸1113将结合到遗传样品1115上的前环形寡核苷酸1103的寡核苷酸区域1105、1107连接在一起,形成完整的环。
然后,优选地,切割环形模板,并利用通用引物位点中的一个或更多个扩增。在特定的方面中,利用诸如Lizardi等人,美国专利号6,558,928公开的滚环式复制的技术,使用单个通用引物区域复制模板。在优选的方面中,如图11所示,这种固定寡核苷酸在环形模板上具有两个通用引发位点1109、1111,和任选地,在与选定的核酸区域互补的末端之间的一个或更多个指示物1121。优选地,切割位点1123存在于两个通用引发位点之间。一旦通过与桥接寡核苷酸1113连接而被环化,核酸酶就可以用于去除所有或大部分未环化的寡核苷酸。在未传递的寡核苷酸的去除之后,切割1106环化的寡核苷酸,保留和在某些方面中,暴露通用引发位点1109、1111。添加1108通用引物1117、1119并发生1110通用扩增,以便产生1112包括感兴趣的核酸区域的序列的产物1125。通过选定的核酸区域的序列确定或可替换地指示物,检测和定量产物1125,指示物避免了对确定选定的核酸区域的真实序列的需要。然而,在其他方面中,可期望确定包括指示物和选定的核酸区域的序列的产物,例如,以便提供结果的内部证实,或在其中指示物提供样品信息且没有提供选定的核酸区域的信息。如上述提到的,这个单个固定序列寡核苷酸方法可以用于图1-10的实例中的任意一个。
重测序
在具体的方面中,本发明的分析系统可以用于重测序复合核酸(complex nucleicacid)。已经发现串联连接方法异常地有效,且这种高效率允许方法被扩展到应用结合到感兴趣的核酸区域的多种寡核苷酸,优选地2-100个或甚至更多个。
在优选的方面中,桥接寡核苷酸将是短的,优选地长度在1-10个核苷酸之间,更优选地在2-7个核苷酸之间,甚至更优选地3-5个核苷酸之间,且串联连接反应中使用的桥接寡核苷酸的数目将是大约10-50个。在优选的方面中,桥接寡核苷酸长度将是5个碱基且将存在大约15-30个连接。
在一个实例中,可以选择桥接寡核苷酸,以便提供关于具体寡核苷酸长度的所有可能的序列变体的简并性,例如,5-mer的所有的序列变异。在多个连接之后,可以利用本文描述的通用扩增技术扩增连接的寡核苷酸,且扩增的产物的序列确定识别所代表(underlying)的序列。这种多种连接分析将提供同时地通过串联连接产物的通用扩增,和它们的核苷酸组合物的确定靶向基因组的多个阶段的能力。
通用扩增
在本发明的优选的方面中,使用通用扩增来扩增在固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸的杂交之后产生的连接产物。在多路复用分析系统中,优选地,通过利用本发明的分析系统分析的多种核酸区域的通用扩增完成这种扩增。通用引物序列被添加到连续的连接产物上,使得可以在单个通用扩增反应中扩增它们。优选地,在固定序列寡核苷酸中引入这些通用引物序列,尽管也可以在连接之后,将它们添加到连续的连接产物的最接近末端上。向固定序列寡核苷酸引入通用引物区域允许在分析之前或期间,例如,序列确定,所有的或部分选定的核酸的随后的控制的通用扩增。
可以在DNA扩增期间引入偏差和变异性(variance),如,在聚合酶链式反应(PCR)期间看到的。在其中多路复用扩增反应的情况中,存在基因座以不同的速率或效率扩增的可能。这一部分可能是由于多路复用反应中引物的变化,某些具有比其他更好的效率(也就是,杂交),或某些由于碱基组成在特殊的实验条件下更好地起作用,。基于引物和模板DNA的序列背景、缓冲液条件和其他条件,特定的基因座的每一组引物可以表现不同。
整体串联连接反应或串联连接反应的等分部分可以用于通用扩增。利用等分部分允许利用相同的或不同的条件(例如,聚合酶、缓冲液,诸如此类)从事不同的扩增反应,例如,以便确保没有由于实验条件非故意地引入偏差。另外,引物浓度的变化可以用于有效地限制序列特异性扩增循环的数目。
在某些方面中,分析系统中使用的引物的通用引物区域或衔接子经设计用于与利用一般引发机制同时地分析大量的核酸的常规的多路复用分析方法相配。这样的“通用”引发方法允许存在于遗传样品的核酸区域的数量的有效的,高容量分析,且允许这样的遗传样品内的核酸区域的存在的全面定量,用于非整倍性的确定。
这样的分析方法的实例包括,但不限于,用于同时地扩增和/或基因分型多个样品的多路复用方法,如在Oliphant等人,美国专利号7,582,420中描述的那些。
某些方面利用用于核酸序列的多路复用检测的耦合的反应,其中来自每一个工艺的早期阶段的寡核苷酸含有来自该工艺的后期阶段的寡核苷酸可以使用的序列。可以单独或联合使用用于扩增和/或检测样品中的核酸的示例工艺,包括但不限于下面描述的方法,每一个全部以参考方式并入此处。
在某些方面中,本发明的分析系统利用下列联合的选择性和通用扩增技术中的一个:(1)LDR耦合PCR;(2)初级PCR耦合第二PCR,第二PCR耦合LDR;和(3)初级PCR耦合第二PCR。本发明的这些方面的每一个在检测某些核酸特征中具有特别的适用性。然而,每一个需要利用用于核酸序列差异的多路复用检测的耦合的反应,其中来自每一个工艺的早期阶段的寡核苷酸含有可来自工艺的晚期阶段的寡核苷酸可以使用的序列。
Barany等人,美国专利号6,852,487、6,797,470、6,576,453、6,534,293、6,506,594、6,312,892、6,268,148、6,054,564、6,027,889、5,830,711、5,494,810描述用于检测多种核酸样品中核苷酸的特定序列的连接酶链式反应(LCR)分析的应用。
Barany等人,美国专利号7,807,431、7,455,965、7,429,453、7,364,858、7,358,048、7,332,285、7,320,865、7,312,039、7,244,831、7,198,894、7,166,434、7,097,980、7,083,917、7,014,994、6,949,370、6,852,487、6,797,470、6,576,453、6,534,293、6,506,594、6,312,892和6,268,148描述其中检测反应(“LDR”)与聚合酶链式反应(“PCR”)耦合用于核酸检测的连接酶链式反应的应用。
Barany等人,美国专利号7,556,924和6,858,412描述其中耦合的连接酶检测反应(“LDR”)和聚合酶链式反应(“PCR”)用于核酸检测的扣锁探针(padlock probe)(也称为“前环形探针”或“多-倒置探针(multi-inversion probe)”)的应用。
Barany等人,美国专利号7,807,431、7,709,201和7,198,814描述联合的核酸内切酶切割和连接反应用于核酸序列的检测的应用。
Willis等人,美国专利号7,700,323和6,858,412描述前环形探针在多路复用核酸扩增、检测和基因型分析中的应用。
Ronaghi等人,美国专利号7,622,281描述用于利用包括独特的引物和条码的衔接子,标记和扩增核酸的扩增技术。
除了多种扩增技术之外,序列确定的许多方法与本发明的分析系统相配。优选地,这样的方法包括“下一代”测序方法。用于序列确定的示例方法包括,但不限于,基于杂交的方法,如Drmanac,美国专利号6,864,052;6,309,824;和6,401,267;和Drmanac等人,美国专利公布2005/0191656中公开的,它们通过引用并入;通过合成方法的测序,例如,Nyren等人,美国专利号7,648,824、7,459,311和6,210,891;Balasubramanian,美国专利号7,232,656和6,833,246;Quake,美国专利号6,911,345;Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,100:414-419(2003);焦磷酸测序,如Ronaghi等人,美国专利号7,648,824、7,459,311、6,828,100和6,210,891中描述的;和基于连接的测序确定方法,例如,Drmanac等人,美国专利申请号20100105052和Church等人,美国专利号20070207482和20090018024。
可替换地,可以利用杂交技术选择和/或识别感兴趣的核酸区域。本领域已经充分研发了用于针对检测而进行多核苷酸杂交分析的方法。杂交分析程序和条件将取决于应用而变化且根据已知的一般结合方法选择,包括在下列中提到的那些:Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版Cold Spring Harbor,N.Y.,1989);Berger and Kimmel Methods in Enzymology,Vol.152,Guide to Molecular CloningTechniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1987);Young and Davis,P.N.A.S,80:1194(1983)。在美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、6,391,623中描述用于实施重复的和控制的杂交反应的方法和装置,它们通过引用并入本文。
在某些优选的方面中,本发明也构思了配体之间的杂交的信号检测。参见,美国专利号5,143,854;5,578,832;5,631,734;5,834,758;5,936,324;5,981,956;6,025,601;6,141,096;6,185,030;6,201,639;6,218,803;和6,225,625、美国专利申请60/364,731中和PCT申请PCT/US99/06097(公布为W099/47964),每一个的全部内容为所有的目的通过引用并入本文。
用于信号检测和强度数据处理的方法和装置公开于,例如,在美国专利号5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758、5,856,092、5,902,723、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639;6,218,803;和6,225,625、美国专利申请60/364,731中和在PCT申请PCT/US99/06097(公布为W099/47964),每一个的全部内容为所有的目的通过引用并入本文。
本发明的分析系统中指示物的应用
在某些方面中,利用描述的技术,例如,序列确定或杂交,直接地检测感兴趣的核酸的全部或部分的序列。然而,在某些方面中,感兴趣的核酸与识别被分析的选定的核酸区域或具体的样品的一个或更多个指示物缔合。如果确定指示物的序列和核酸区域它自身的序列,一个或更多个指示物的检测可以充当选定的核酸区域的替代检测机制,或作为具体的选定的核酸区域的存在的证实。在利用包括指示物和与核酸区域特异性杂交的序列区域的引物的扩增步骤期间,优选地,这些指示物与选定的核酸相缔合。
在一个实例中,设计用于扩增选定的核酸区域的引物,以便在选定的核酸区域引物区域和通用扩增区域之间提供基因座指示物。对于每一个选定的核酸区域,基因座指示物是独特的且代表感兴趣的染色体或参考染色体上的基因座,这样,样品中基因座指示物的定量提供关于基因座和含有基因座的具体的染色体的定量数据。
在另一个实例中,设计用于扩增选定的核酸区域的引物,以便在选定的核酸区域引物区域和通用扩增区域之间提供等位基因指示物。对于选定的核酸区域的具体的等位基因,等位基因指示物是独特的且代表感兴趣的染色体或参考染色体上存在的基因座变异,这样,样品中等位基因指示物的定量提供等位基因的定量数据并且具体的基因座的等位基因指示物的总和提供基因座和含有基因座的具体的染色体二者的定量数据。
在另一个方面中,设计用于扩增遗传样品待分析的选定的核酸区域的引物,以在选定的核酸区域引物区域和通用扩增区域之间提供识别指示物。在这样的方面中,存在足够数目的识别指示物,以便独特地识别样品中的每一个选定的核酸区域。待分析的每一个核酸区域与独特的识别指示物相缔合,使得识别指示物独特地与选定的核酸区域相缔合。样品中识别指示物的定量提供缔合的选定的核酸区域和对应于选定的核酸区域的染色体的定量数据。识别基因座也可以用于检测选定的核酸区域从样品的初始分离的下游发生的任何扩增偏差。
在某些方面中,仅基因座指示物和/或识别指示物(如果存在)被检测且被用于定量样品中选定的核酸区域。在另一个方面中,完成每一个基因座指示物随着一个独特的识别指示物出现的次数的计数,以便确定样品中选定的核酸区域的相对频率。
在某些方面中,代表从中分离核酸的样品的指示物被用于识别多路复用分析系统中核酸的来源。在这样的方面中,利用样品指示物独特地识别核酸。然后,在测序之前,可以将那些独特地识别的寡核苷酸与来自其他样品的核酸合并到单个反应容器内。在确定每一个样品的每一个靶向基因座的频率之前和在确定每一个样品是否存在染色体异常之前,首先通过每一个独特的样品指示物分离测序数据。对于检测,对样品指示物、基因座指示物,和识别指示物(如果存在)进行测序。
在利用指示物的本发明的方面中,优选地,设计包含指示物的固定序列寡核苷酸。可替换地,可以在初始扩增之后,将指示物和通用扩增序列添加到选择性扩增的核酸上。在任一情况中,优选地,指示物在核酸区域-特异性序列的上游但是通用引物的下游编码,使得它们在扩增后被保存,而且当利用通用引物用于序列确定时,需要使用较少的测序。
指示物是引物内使用的非互补的但是独特的序列,以便提供与利用引物分离和/或扩增的选择性核酸区域相关的信息。这点的优势是,可以获得有关选定的核酸区域的存在和量的信息,而不需要确定它自身真实序列,尽管在某些方面,可能期望如此做。然而,通常,通过一个或更多个指示物的识别来识别和定量选定的核酸区域的能力将减少所需要的测序的长度,因为基因座信息在分离的选定的核酸区域的3’或5’末端被捕获。应用指示物识别作为选定的核酸区域的识别的替代也可以减少误差,因为较长的测序读段更易于引入误差。
除了基因座指示物,等位基因指示物和识别指示物之外,可以向引物引入另外的指示物,以便帮助样品的多路复用。例如,识别实验误差(例如,在扩增或序列确定期间引入的误差)的校正指示物可以用于识别分析系统中实验程序和/或检测方法中潜在的差异。这些指示物的顺序和放置,以及这些指示物的长度可以变化,且可以以不同组合使用它们。
用于选定的核酸区域的识别和定量的引物可以与选定的核酸区域的5’互补的区域相缔合,或在某些扩增体制中,指示物可以存在于一组扩增引物的一个或两个上,所述一组扩增引物包含与选定的核酸区域的序列互补的序列。引物可以用于多路复用样品内待分析的多个选定的核酸区域的分析,且可以在溶液或在固体基质上使用,例如,在微阵列或在磁性珠上。这些引物可以用于线性复制或扩增,或它们可以产生环形构建体用于进一步分析。
用于识别基因座和等位基因的差异频率的比较杂交
在本发明的特定的方面中,本发明的实验系统采用两个指示物序列,其允许利用阵列杂交,进行样品中的具体的基因组区域的水平的直接比较。分析采用直接的分析测定,以便利用与样品内的两个或更多个基因组区域选择性杂交的标记的寡核苷酸选择感兴趣的特殊的基因座。与不同的区域选择性杂交的寡核苷酸被区别标记,使得可以识别与标记物相缔合的特定的基因座。优选地,标记物是光学可检测的标记物(例如,利用荧光标记物)。
第一固定寡核苷酸包括与阵列上的特征(通常地,与第一指示物互补的寡核苷酸)选择性杂交的序列和与感兴趣的区域选择性杂交的区域。第二固定寡核苷酸包括与选定数目的插入碱基相邻或在选定数目的插入碱基处与相同的感兴趣的区域选择性杂交的区域,和用于缔合寡核苷酸与标记物的区域。其中固定寡核苷酸结合到阵列上直接相邻的区域上,连接固定寡核苷酸,以便产生连续的连接产物,该连续的连接产物包括可以被引入到阵列的基因座-特异性或等位基因特异性标记物。在其中固定寡核苷酸的组没有结合到基因组区域内的直接相邻的区域的情况下,如先前的部分中讨论的,可以利用引物延伸封闭介于中间的区域,和/或可以使用在固定序列寡核苷酸之间杂交的一个或更多个桥接寡核苷酸。然后,连接这些,以便产生具有基因座特异性或等位基因特异性标记物的连续的连接产物。
在一个方面中,成对使用固定序列寡核苷酸的组,其中针对不同的染色体或基因座选择对的每一个成员。图12图示这样的实例:其中针对不同的染色体上的基因组区域选择对的每一组。两个不同的染色体的分析组在阵列上的单个杂交特征上竞争性地评价。针对两个不同的染色体上的基因组区域1202、1204选择两个固定寡核苷酸组1208、1210。每一组固定寡核苷酸与光学差异标记物1201、1203相缔合。与通用引物1205、1211互补的序列位于固定序列寡核苷酸的末端或靠近该末端。从固定寡核苷酸产生的两种连续的连接产物均包括与相同的阵列特征互补的序列1207。光学差异的连续的连接产物的杂交水平可被测量以提供第一染色体区域与第二染色体区域相比的相对量。
在另一个方面中,成对使用固定序列寡核苷酸的组,其中针具体的基因座的不同的等位基因选择对的每一个成员。图13图示这样的实例,其中针对相同的基因座的不同等位基因选择每一个对。两个不同的染色体的分析组在阵列上的单个杂交特征上竞争性地评价。针对基因座1302选择的两个固定寡核苷酸组1308、1310被用于产生连续的连接产物。每一组固定寡核苷酸与光学差异的标记1301、1303相缔合。与通用引物1305、1311互补的序列位于固定序列寡核苷酸的末端或靠近该末端。从固定寡核苷酸产生的两种连续的连接产物均包括与相同的阵列特征互补的序列1307。视觉差异的连续的连接产物的杂交的水平可以被测定以便提供第一等位基因与第二等位基因相比的相对量。
本领域的技术人员将显然可见,可在这样的比较杂交实验中使用多种不同的区域,包含单个染色体上不同的基因座特异性的序列,类似的但是在染色体之间多态性的基因座(例如,染色体X和Y的假-常染色体区域(pseudo-autosomal region)上的基因座)等等。
在特定的方面中,标准化连续的杂交产物的检测的水平,以便减少杂交中任何分析-特异性的或技术的变异。如果区域在样品中具有相同的相对丰度,预期来自相同的染色体的分析对和很多分析对的两个标记物的检测的预期的比率是1。一个区域(例如,来自第一染色体)的量的变异将引起预期的颜色比1的变异。预期更多丰富度染色体在分析对比较中具有更明亮的颜色。
其他试剂或风险因素的检测
考虑到本发明的分析系统的多路复用性质,在某些方面中,可能有益的是:利用分析检测可能对受试者的健康造成风险或影响关于受试者的治疗或预后结果的临床决策的其他核酸。这样的核酸可以包括但不限于疾病或风险的指标,如母体的等位基因、多态性、或已知呈现对母体或胎儿的健康风险的体细胞突变。这样的指标包括,但不限于,与Rh状态相关的基因;与疾病如糖尿病、高血脂、高胆固醇血症、血液病如镰刀细胞贫血症、血友病或地中海贫血、心脏病等等相关的突变或多态性;与急性或潜伏性感染相关的外源性核酸;与以下相关的体细胞突变或拷贝数变异:自身免疫疾病或恶性肿瘤(例如,乳腺癌)、或可以影响受试者的任何其他健康问题,且具体地,影响基于分析结果的成果,可用于治疗和/或预防受试者的健康风险的临床选择。
因此,因为本发明的优选的分析系统是高度地多路复用的且能够测定混合的样品内成百或甚至上千种核酸,在某些方面中,可期望针对混合的样品内的核酸标志物(例如,与遗传风险相关或识别感染生物体的存在或不存在的核酸)测定样品,。因此,在某些方面中,分析系统提供这种核酸的检测,以及用于混合的样品内拷贝数确定的核酸的检测。
例如,在感兴趣的某些混合的样品中,包括母体样品,来自患有自身免疫病的受试者的样品,和来自正经历化疗的患者的样品,由于受试者的免疫系统的改变,受试者的免疫抑制可以增加疾病的风险。混合的样品中外源性试剂的检测可以指示暴露于传染剂且被所述传染剂感染,且对于受试者被测试为是这样的传染剂测试阳性的传染性疾病,这个发现对患者护理或传染病的管理具有影响。
特定地,怀孕期间免疫力和生理学的改变可以使得孕妇更易受传染性疾病的影响或更严重地受到传染性疾病的影响。事实上,对于获得某些传染性疾病,如弓形体病、汉森病和李氏杆菌病,怀孕它本身可能就是风险因素。另外,对于孕妇或具有抑制的免疫系统的受试者,某些传染性疾病如流行性感冒和李斯特菌病可能具有更严重的临床进程、增加的并发症比率和更高的病理致死率。因此,传染性疾病试剂的识别可以允许用于怀孕期间母体疾病的更好的治疗,引起母体和胎儿两者的更好的整体成果。
另外,某些传染性试剂可以经由垂直传递传给胎儿,也就是,从母体到婴儿的感染的传播。这些感染可以存在于胎儿仍然在子宫内时,在产程和分娩期间,或在分娩之后(如在母乳喂养期间)。
因而,在某些优选的方面中,分析系统可以包含外源性序列的检测,例如,来自可能对胎儿或婴儿的健康和/或存活力具有不利影响的传染性生物体的序列,以便保护母体、胎儿和/或婴儿健康。
示例性感染可以经由垂直传递传播,并且可以利用本发明的分析方法测试,包括,但不限于先天性感染、产期感染和出生后的感染。
先天性感染在子宫内,通过跨胎盘传递而感染胎儿。很多感染性微生物可以引起先天性感染,导致胎儿发育的问题或甚至死亡。TORCH是更常见的先天性感染中的几个的首字母缩写。这些先天性感染是:弓形体病(toxoplasmosis)、其他感染(other infection)(例如,梅毒、乙型肝炎、柯萨奇病毒、EB病毒、水痘带状孢疹病毒(水痘)、和人类细小病毒B19(第五疾病))、风疹(rubella)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、和单纯孢疹病毒(herpes simplex virus)。
产期感染指的是在分娩其间随着婴儿通过被感染的产道移动或通过排泄物的污染物而出现的感染。这些感染可以包括,但是不限于,性-传播的疾病(例如,淋病、衣原体、单纯孢疹病毒、人乳头状瘤病毒,等等)CMV,和B组链球菌(GBS)。
在分娩之后,从母体到婴儿的感染传播被称为出生后感染。这些感染可以在母乳喂养期间通过母体的乳汁中出现的感染微生物传播。出生后感染的一些实例是CMV、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和GBS。
实施例
提出下列实施例,以便提供本领域的技术人员如何制备和使用本发明的完整的公开和描述,且并不倾向于限制发明人认为是他们的发明的范畴,也没有倾向于代表或暗示,下面的实验是所有的实验或仅是执行的实验。本领域的技术人员应该明白,可以在没有脱离本发明所广泛描述的精神或范畴的情况下,对具体方面中所示的发明作出许多变化和/或修饰。因此,所列出的方面在各个方面中被认为是说明性的而非限制性的。
作出了确保关于使用的数字(例如,量,温度,等等)的准确性的努力,但是应考虑某些实验误差和偏差。除非另外指出,份数是重量份数,分子量是重均分子量,温度是摄氏度,且压力在大气压上或接近大气压。
实施例1:本发明的分析系统的一般方面
测试许多分析形式,以便证明执行独立的基因座的选择性扩增和检测,从而利用高度地多路复用形式,证明大量(例如,96或更多)感兴趣的核酸区域的多路复用的基于连接的检测的能力。
以人类基因组序列为基础设计这些分析,并且每一个测定由测定中检测的每个选定的核酸区域两个固定序列寡核苷酸组成。第一寡核苷酸,与基因组区域的3’区域互补,包括以下的顺序(5’到3’)寡核苷酸元件:所有的分析共有的通用PCR引发序列:TACACCGGCGTTATGCGTCGAGAC(SEQ ID NO:l);选定的基因座特异性的九个核苷酸识别密码;9碱基基因座特异性序列或基因座/等位基因特异性序列,其充当第一SNP-独立组中的基因座密码和SNP-特异性的第二组中的基因座/等位基因密码;不同于基因组基因座中的对应碱基的杂交破坏核苷酸(hybridization breaking nucleotide);和与选定的基因组基因座互补的20-24bp序列。在其中在选定的基因组基因座的这个部分中检测SNP的情况中,等位基因特异性测定组由两个第一串联连接引物组成,每一个第一串联连接引物在SNP位置上具有不同的基因座/等位基因密码和不同的等位基因特异性碱基。为每一个选定的核酸设计这些第一寡核苷酸,以便在480个分析组中,在所有的测定上,提供具有两度变异(variation)的预计的均匀的Tm。
第二固定序列寡核苷酸,与基因组基因座的5’区域互补,包括下列顺序(5’到3’)元件:与基因组基因座中的5’区域互补的20-24b序列;不同于基因组基因座中的对应碱基的杂交破坏核苷酸;和分析组中,所有的第三寡核苷酸共有的通用PCR引发序列:ATTGCGGGGACCGATGATCGCGTC(SEQ ID NO:2)。在其中在选定的基因组基因座的这个部分中检测SNP的情况中,等位基因特异性测定组由两个串联连接引物组成,每一个在SNP位置上具有不同的基因座/等位基因密码和不同的等位基因特异性碱基。为每一个选定的核酸设计这些第二寡核苷酸,以便提供在480个分析组的所有的测定中,具有两度变异的预计的均匀的Tm,其是大体上与第一寡核苷酸组相同的Tm范围。
在某些测试方面中,使用一个或更多个桥接寡核苷酸,该桥接寡核苷酸与用于每一个选定的核酸区域的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的区域之间的基因组基因座序列互补。在特定的测试的方面中,多于一个桥接寡核苷酸用于跨越固定序列寡核苷酸之间的缺口,和任选地,一个或更多个寡核苷酸被设计用于识别序列中的一个或更多个SNP。分析系统中使用的桥接寡核苷酸的长度从5到36个碱基对变化。
利用常规的固相化学法合成串联连接形式中使用的所有的寡核苷酸。第一固定组的寡核苷酸和桥接寡核苷酸被合成为具有5’磷酸部分,以便能够与相邻的寡核苷酸的3’羟基末端连接。
实施例2:用于串联连接程序的DNA的制备
从Coriell细胞贮藏室(Camden,New Jersey)获得来自白种人男性(NA12801)或白种人女性(NA11995)的基因组DNA,且通过声剪接(Covaris,Woburn,MA)断裂成大约200bp的平均片段大小。
利用标准程序生物素化Coriell DNA。简单地说,通过在1.5ml微管中引起下列反应末端修复Covaris片段化的DNA:5ugDNA、~12μl10X T4连接酶缓冲液(Enzymatics,Beverly MA)、50U T4多核苷酸激酶(Enzymatics,Beverly MA),和H2O补至120μl。这在37℃孵育30分钟。利用10mM Tris 1mM EDTA pH8.5将DNA稀释到~0.5ng/ul的期望的最终浓度。
将5μlDNA放置在96-孔板的每一个孔内,且利用粘性密封器密封板且在250×g下旋转10秒钟。然后,将板在95℃孵育3分钟,并冷却到25℃,且再次在250×g下旋转10秒钟。在1.5ml微管中制备到下列的最终浓度的生物素化母体混合物:1×TdT缓冲液(Enzymatics,Beverly MA)、8U TdT(Enzymatics,Beverly MA)、250μM CoCl2、0.01nmol/μl生物素-16-dUTP(Roche,Nutley NJ),和H2O补至1.5ml。将15μl母体混合物等分到96孔板的每一个孔内,且利用粘性密封器密封板。将板在250×g下旋转10秒钟且在37℃孵育60分钟。在孵育之后,再次在250×g下将板旋转10秒钟,且将7.5μl沉淀混合物(1ng/μl葡聚糖蓝(Dextran Blue)、3mM NaOAC)添加到每一个孔内。
利用粘性板密封器密封板且利用IIKA板涡旋器在3000rpm下混合2分钟。将27.5μl异丙醇添加到每一个孔内,利用密封器粘性密封器密封板,且在3000rpm下涡旋5分钟。在3000×g下将板旋转20分钟,滗去上清液,且颠倒板,并在10×g下离心1分钟,到吸收纸(absorbent wipe)上。将板空气-干燥5分钟,并利用10μl 10mM Tris pH8.0,1mM EDTA重悬沉淀。
实施例3:利用串联连接的示例性分析形式
测试利用生物素化的DNA的许多串联连接分析形式,以阐释本发明的分析系统的概念证据,并证明利用一系列不同的分析形式执行大量独立的基因座的高度多路复用的、靶向的检测的能力。本发明的示例性分析系统被设计为包括遗传样品中每个基因座96个或更多个测定,且在其中检测SNP的情况中,分析形式利用192个或更多个单独的测定,每一个单独的测定利用遗传样品中每96个基因座不同的等位基因的检测。针对每一个分析形式描述的实例利用两个不同的固定序列寡核苷酸和/或桥接寡核苷酸的组(如实施例1描述的),取决于是否识别SNP包括针对选定的核酸区域的总计96个或192个询问反应。
第一示例性分析形式利用基因座特异性固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸,其中在第一固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸之间存在一个一碱基缺口,并且在桥接寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸之间存在第二一碱基缺口,两个缺口中的每一个包括两个不同的SNP。在这个形式中,DNA聚合酶用于掺入每一个SNP碱基,且连接酶用于密封因而形成的切口。SNP碱基辨别来源于通过聚合酶的碱基掺入的保真度,且在错误掺入的情况下,连接酶并不趋向于密封与错配的碱基相邻的切口。
第二示例性分析形式利用两个基因座特异性固定序列寡核苷酸而没有桥接寡核苷酸,其中在固定序列寡核苷酸之间存在-15-35碱基缺口,且其中缺口跨越一个或更多个SNP。在这个形式中,聚合酶用于掺入缺失的碱基,和连接酶用于密封因而形成的切口。SNP碱基辨别来源于通过聚合酶的碱基掺入的保真度,且在错误掺入的情况下,连接酶并不趋向于密封与错配的碱基相邻的切口。
第三示例性分析形式利用等位基因特异性第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸而没有桥接寡核苷酸,其中在第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸之间存在-15-35碱基缺口,且其中缺口跨越一个或更多个SNP。使用两个单独的等位基因特异性第一固定序列寡核苷酸和两个单独的等位基因特异性第二固定序列寡核苷酸。聚合酶用于掺入缺失的碱基,且连接酶用于密封因而形成的切口。SNP碱基辨别来源于杂交特异性,非-校正的聚合酶并不趋向于延伸在近3’末端处具有错配的退火的引物,且连接酶并不趋向于密封与错配的碱基相邻的切口。
第四示例性形式利用等位基因特异性固定序列寡核苷酸和基因座特异性桥接寡核苷酸。在这个形式中,两个单独的固定序列寡核苷酸与感兴趣的基因座的3’末端互补,第一个具有对靶向的SNP的一个等位基因特异性的3’碱基,且第二个具有对靶向的SNP的其他等位基因特异性的3’碱基。相似地,使用两个单独的第二固定序列寡核苷酸,第一个具有对第二靶向的SNP的一个等位基因特异性的5’碱基,和第二个具有对第二靶向的SNP的其他等位基因特异性的5’碱基。桥接寡核苷酸与第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的基因座区域直接相邻的区域互补,且因而在连接之前,不需要聚合酶。连接酶用于密封固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸之间的缺口。这个分析形式中的SNP碱基辨别来源于杂交特异性,且连接酶并不趋向于密封与错配的碱基相邻的切口。利用T4连接酶或Taq连接酶用于产生连续的模板测试这个示例性形式,且证明两种连接酶在如下面描述的反应中都是有效的。
第五示例性形式使用基因座特异性固定序列寡核苷酸,其与感兴趣的核酸上的相邻的区域互补,且因而,这些寡核苷酸的杂交没有产生缺口。在这个形式中,不需要聚合酶,且连接酶用于密封寡核苷酸之间的单个的切口。
第六示例性形式使用等位基因特异性固定序列寡核苷酸和基因座特异性桥接寡核苷酸,其中在与固定序列寡核苷酸互补的基因座区域之间存在五个碱基的短的碱基缺口。这个实例中的基因座特异性桥接寡核苷酸是与第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸互补的区域直接相邻的区域互补的5mer。在这个形式中,不需要聚合酶,且连接酶用于密封寡核苷酸之间的两个切口。
第七示例性形式使用基因座特异性固定序列寡核苷酸和基因座特异性桥接寡核苷酸,其中在与桥接寡核苷酸互补的区域中,存在含有SNP的五个碱基的较短的碱基缺口。杂交和连接反应中包括对应于可能的SNP的等位基因特异性桥接寡核苷酸。在这个形式中,不需要聚合酶,并且连接酶用于密封寡核苷酸之间的两个切口。这个分析形式中的SNP碱基辨别来源于杂交特异性且连接酶并不趋向于密封与错配的碱基相邻的切口。
第八示例性形式使用基因座-特异性固定序列寡核苷酸和两个相邻的基因座-特异性桥接寡核苷酸,其中在与第一和第二固定序列寡核苷酸互补的区域之间存在10碱基缺口。在连接反应中包括基因座-特异性桥接寡核苷酸,由于缺口需要两个连续的5mer来桥接该缺口。在这个形式中,不需要聚合酶,且连接酶用于密封寡核苷酸之间的三个切口。
对于上述描述的分析形式中的每一个,从如实施例2中阐述制备的寡核苷酸产生第一和第二基因座-或等位基因特异性固定寡核苷酸的组的等摩尔库(每个40nM)。另外,另外产生桥接寡核苷酸的单独的等摩尔库(每个20μM)用于基于选定的基因组基因座的序列的分析工艺。
将10μg链霉亲和素珠转移到96孔板的孔内,且去除上清液。将60μLBB 2缓冲液(100mM Tris pH8.0、10mM EDTA、500mM NaCl2、58%甲酰胺、0.17%Tween-80)、10μL 40nM固定序列寡核苷酸库(pool)和30μL实施例2中制备的生物素化的模板DNA添加到珠内。利用密封器粘性密封器密封板且在3000rpm下涡旋,直到珠被重悬。通过在70℃孵育5分钟,接着是缓慢冷却至室温,使寡核苷酸退火至模板DNA。
将板放置在升起的条形磁板上2分钟,以便将磁珠和缔合的DNA拉向孔的侧面。通过移液去除上清液,替换为50μL的60%BB2(水中v/v)。通过涡旋重悬珠,再次放置在磁体上,且去除上清液。利用50μL 60%BB2重复一次这种珠洗涤程序,且利用50μL洗涤缓冲液重复两次以上(10mM Tris pH8.0、1mM EDTA、50mM NaCl2)。
在由1×Taq连接酶缓冲液(Enzymatics,Beverly MA)、10U Taq连接酶,和2uM桥接寡核苷酸库(取决于分析形式)组成的37μl连接反应混合物重悬珠,且在37℃孵育1小时。适当时,且取决于分析形式,这个混合物中放入非-校正的热稳定聚合酶加上200nM每种dNTP。将平板放置在升起的条形磁板上2分钟,以便将磁珠和缔合的DNA拉向孔的侧面。通过移液去除上清液,且替换为50μL的洗涤缓冲液。通过涡旋,重悬珠,再次放置在磁体上,且去除上清液。重复洗涤程序一次。
为了从链霉亲和素珠洗脱产物,将30μl10mM Tris 1mM EDTA,pH8.0添加到96-孔板的每一个孔内。密封板,且在3000rpm下,利用IKA涡旋器混合2分钟,以便重悬珠。将平板在95℃孵育1分钟,并利用8-通道移液管吸走上清液。将来自每孔的25μl上清液转移到新的96-孔板内,用于通用扩增。
实施例4:串联连接的产物的通用扩增
利用与通用序列互补的通用PCR引物扩增聚合的且/或连接的核酸,其中通用序列存在于与感兴趣的核酸区域杂交的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸中。在每一个扩增反应中使用25μl实施例3的每一种反应混合物。50μL通用PCR反应由25μL洗脱的连接产物加上1×Pfusion缓冲液(Finnzymes,Finland)、1M三甲铵乙内酯、400nM每一种dNTP、1U Pfusion错误校正的热稳定DNA聚合酶,和下列引物对组成:
TAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGGCGTTATGCGTCGAGA(SEQ ID NO:3)和
TCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXAAACGACGCGATCATCGGTCCCCGCAA(SEQ ID NO:4),其中X代表在汇集(pooling)和测序之前,用于独特地识别单独的样品的96个不同的样品标签中的一个。利用BioRad TetradTM热循环仪,在严格条件下实施PCR。
汇集来自每一个样品的10μl通用PCR产物且利用AMPureTMSPRI珠(Beckman-Coulter,Danvers,MA)纯化汇集的PCR产物,并利用Quant-iTTMPicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,CA)定量。
实施例5:选定的基因座的检测和分析
在Illumina HiSeq 2000上,在载片的单个通道上进行每一个分析形式的纯化的PCR产物的测序。测序运行通常产生~100M原始读段,其中~85M(85%)映射到预期的分析结构。这转换成在实验中平均~885K读段/样品,和(利用96个基因座的实验的情况中)在96基因位点上,9.2K读段/复制/基因座。映射的读段被解析成复制/基因座/等位基因计数,且对于每一种条件,计算多种度量,包括:
产量:测序中查询的输入DNA的比例的度量,按照每基因座独特的读段的平均数(仅计算每复制/基因座独特的识别密码读段)除以输入DNA中含有的基因组等同物的总数计算。
80百分位基因座频率范围(80percentile locus frequency range):测序数据中基因座频率可变性的度量,理解为包含80%基因座的倍数范围。根据每基因座第90百分位总的读段除以每基因座第10百分位总的读段,在每基因座总的读段在所有的基因座上的分布上计算。
SNP误差率:SNP位置上的误差率的度量,和按照SNP位置上,含有不和谐的碱基的读段的比例计算。
这些结果总结于表1中:
表1:串联连接分析形式的结果总结
表1指示,利用桥接寡核苷酸的基因座特异性串联连接分析以高的产量(-10%)、高比例的来源于靶向基因座的产物(15%读段不含有预期的分析结构)、具有有限的基因座偏差(80%基因座落入~5-倍浓度范围),以及高的SNP准确度(0.2%SNP误差率)将模板NNA转化为靶向的产物。没有利用桥接寡核苷酸的基因座-特异性串联连接分析产生减少的产量和实质的基因座偏差,但是仍然产生高准确度的SNP基因分型数据。与利用T4和Taq两种连接酶的基因座-特异性分析相比,具有桥接寡核苷酸的等位基因特异性串联连接分析产生中间的产量,但是仍然产生有限的基因座偏差和高准确度SNP基因分型数据。没有桥接的等位基因特异性串联连接分析产生减少的产量和实质的基因座偏差,但是仍然产生高精确度SNP基因分型数据。
分析模式五和六显示,模板DNA可以高的产量(12-16%)、高比例的来源于靶向基因座的产物(-76%读段含有预期的分析结构)和具有有限的基因座偏差(80%基因座属于2-3-倍浓度范围)被转化为靶向的产物。图14图示利用分析模式七获得的基因分型性能,比较了单个样品中观察到的所有的多态性分析的两个等位基因的序列计数。注意纯和簇和杂合簇的明确的分离,以及在纯和簇中观察的低背景计数。
实施例6:利用串联连接的胎儿DNA百分比的确定
本发明的一个示例性分析系统被设计包括480个单独的测定,每一个利用母体样品中不同的基因座的检测。初始实例利用孕育男性胎儿的受试者的胎儿DNA百分比的确定,且因此,利用Y染色体上的基因座,以及含有不同于母体序列的父亲-遗传的胎儿SNP的基因座。
具体地,利用分析系统测定480个选定的核酸。480个选定的核酸包括:对应于染色体Y上的基因座的核酸的48个序列特异性测定、对应于染色体21上的基因座的核酸的192个序列-特异性测定、对应于染色体18上的基因座的选定的核酸的192个序列-特异性测定、和对应于染色体1-16上的多态性基因座的选定的核酸的144个序列-特异性测定。以人类基因组序列为基础设计这些分析,和每一个测定对分析测定中的每个选定的核酸使用三个寡核苷酸。
用于每一个测定的第一寡核苷酸与选定的基因组区域的3’区域互补,且包括下列的顺序(5’到3’)寡核苷酸元件:所有的分析共有的通用PCR引发序列:TACACCGGCGTTATGCGTCGAGAC(SEQ ID NO:l);包括九个核苷酸的选定的基因座特异性的识别密码;和与选定的基因组基因座互补的20-24bp序列。为每一个选定的核酸设计这个第一寡核苷酸,以便在480个分析组中的所有的测定上提供具有两度变异的预计的均匀的Tm。
用于每一个测定的第二寡核苷酸是与基因组基因座序列互补的桥接寡核苷酸,该基因组基因座序列与第一寡核苷酸互补的基因组区域直接相邻。基于感兴趣的选定的核酸,设计桥接寡核苷酸,以便允许利用总计12个寡核苷酸序列,其可以充当分析组中所有的480个测定的桥接寡核苷酸。
用于每一个测定的第三寡核苷酸与选定的基因组基因座的5’区域互补,包括下列的顺序(5’到3’)元件:与基因组基因座中的5’区域互补的20-24b序列;不同于基因组基因座中的对应的碱基的杂交破坏核苷酸;和分析组中所有第三寡核苷酸共有的通用PCR引发序列:ATTGCGGGGACCGATGATCGCGTC(SEQ ID NO:2)。为每一个选定的核酸设计第三寡核苷酸,以便在480个分析组中所有的测定上提供具有两度变异的预计的均匀的Tm,且Tm范围基本上与第一寡核苷酸组的Tm范围相同。
利用常规的固相化学法合成所有的寡核苷酸。第一桥接寡核苷酸和第二桥接寡核苷酸被合成为具有5’磷酸部分,以便能够连接到相邻的寡核苷酸的3’羟基末端。产生用于多路复用分析的所有的测定的第一寡核苷酸和第三寡核苷酸的组的等摩尔库,并产生所有桥接寡核苷酸的单独的等摩尔库,以便允许单独的杂交反应。
利用Dynal Silane病毒DNA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA),从5mL血浆分离基因组DNA。从37个女性中的每一个加工大约12ngDNA,这些女性包含7个未怀孕女性受试者、10个孕育男性的女性受试者和22个孕育女性的女性受试者。利用标准的程序生物素化DNA,且将生物素化DNA固定在涂覆有链霉亲和素的固体表面上,以便允许随后的分析步骤中基因组DNA的保留。
在严格的杂交条件下,对于每一个测定的序列,使固定的DNA与包括第一寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一库杂交。然后,从固体支撑物的表面洗掉库中未杂交的寡核苷酸,并在严格的杂交条件下,使固定的DNA与包括桥接寡核苷酸的库杂交。在桥接寡核苷酸被允许与固定的DNA杂交之后,从表面洗掉剩余的未结合的寡核苷酸并利用T4连接酶连接与选定的核酸区域结合的三个杂交的寡核苷酸,以便提供连续的DNA模板用于扩增。
利用误差校正的热稳定的DNA聚合酶,第一通用PCR引物TAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGGCGTTATGCGTCGAGA(SEQ ID NO:3)和第二通用PCR引物TCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXAAACGACGCGATCATCGGTCCCC GCAA(SEQ ID NO:4)从固体基质扩增连接的DNA,其中X代表在汇集和测序之前,用于独特地识别个体样品的96个不同的样品指示物中的一个。汇集来自上述描述的37个样品中的每一个的10μL通用PCR产物且利用AMPure SPRI珠(Beckman-Coulter,Danvers,MA)纯化汇集的PCR产物,并利用Quant-iTTMPicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,CA)定量。
在Illumina HiSeq 2000上,载片的单个通道上进行纯化的PCR产物的测序。测序运行产生384M原始读段,其中343M(89%)映射到预期基因组基因座,引起37样品上平均3.8M读段每样品,和480基因座上,8K读段每样品每基因座。映射的读段被解析为样品和基因座计数,且如下计算胎儿DNA百分比的两个单独的度量。
由染色体Y基因座检测的男性DNA百分比对应于来源于染色体Y基因座测定的读段的相对比例对来源于常染色体基因座测定的读段的相对比例,且按照(测试受试者中染色体Y读段的数/测试受试者中常染色体读段的数)/(男性对照受试者中读段的数/男性对照受试者中常染色体读段的数)计算。这种度量被用作利用染色体Y的相对读段的男性胎儿的情况中胎儿DNA百分比的测量。
通过多态性基因座检测的胎儿DNA百分比对应于在其中可以做出这样的区别的基因座上,来源于非-母体对母体等位基因的读段的比例。首先,对于每一个识别的基因座,具有最少的计数的等位基因(低频率等位基因)的读段的数目除以读段的总数,以便为每一个基因座提供小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)。然后,具有在0.075%和15%之间的MAF的基因座被识别为是提供信息的基因座。按照提供信息的基因座的小等位基因频率的平均值乘以二(也就是,按照2X 0.075%<MAF<15%时的的平均(MAF)发生率计算),计算样品的估计得胎儿DNA百分比。
图15证明来自这些计算的结果。如图15所示,利用上述描述的染色体Y度量(灰色圆圈)确定的男性基因座百分比可以将涉及男性胎儿的孕妇与涉及女性胎儿的孕妇(灰色方块)和未怀孕的样品(黑色圆圈)分开。另外,由多态性基因座度量所得的样品中百分比胎儿量的计算可以区别怀孕的样品与未怀孕的样品。最终,在关于从染色体Y获得的样品的胎儿DNA百分比估计和涉及男性胎儿的妊娠期的多态性基因座之间存在相互相关性。这种相关性持续存在至相当低的胎儿百分比值。
虽然通过很多不同形式的方面证明本发明,如与本发明的优选的方面有关详细地描述的,但是应该明白,本公开内容被认为是本发明的原理的例证且并不倾向于将本发明限于本文说明和描述的特定的方面。在没有脱离本发明的精神的情况下,本领域的技术人员可以作出许多变化。本发明的范围将通过附加的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题并不能被解释为限制本发明的范畴,因为它们的目的是能够使适当的机构,以及一般公众迅速地确定本发明的一般性质。在下面的权利要求中,除非使用术语“工具(means)”,本文记载的特征或元件均不应被依照35U.S.C.§112,工具-加-功能限定。
Claims (18)
1.至少第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸在制备用于检测遗传样品中的核酸区域的频率的变异的测定系统中的用途,所述遗传样品包括母亲来源和胎儿来源二者的核酸,其中当所述测定系统被使用时,包括下列步骤:
提供遗传样品;
向所述遗传样品引入所述至少第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸,所述引入在同时允许所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸与感兴趣的第一核酸区域中的互补区域特异性地杂交并且所述第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸与感兴趣的第二核酸区域中的互补区域特异性地杂交的相同条件下进行,其中每一组的第一固定序列寡核苷酸或第二固定序列寡核苷酸中的一个或两个包括通用引物区域,其中每一组的至少一个固定序列寡核苷酸包括与光学可检测的标记物相缔合的区域,并且所述光学可检测的标记物是荧光标记物,且其中来自每一组的至少一个固定序列寡核苷酸包括选择性、竞争性地结合到相同阵列特征上的区域;
连接每一组的杂交的固定序列寡核苷酸,以便产生与感兴趣的核酸区域互补的连续的连接产物;
将来自两组固定的序列寡核苷酸的连续的连接产物均引入到包括与所述连续的连接产物互补的一个或更多个所述相同阵列特征的阵列;和
通过检测所述光学可检测的标记物,检测来自所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及所述第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸的所述连续的连接产物与所述阵列的杂交;
其中所述阵列上所述光学可检测的标记物的相对频率指示所述遗传样品中所述感兴趣的第一核酸区域和所述感兴趣的第二核酸区域的频率的变异的存在或不存在,并且其中通过与来自所述第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸的连续的连接产物的杂交水平相比,来自所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸的连续的连接产物的增加或减少的杂交水平来检测所述变异。
2.根据权利要求1所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,还包括在引入到所述阵列之前,扩增所述连续的连接产物。
3.根据权利要求2所述的用途,其中所述通用引物区域被用于扩增所述连续的连接产物。
4.根据权利要求1所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,还包括为每一组固定序列寡核苷酸引入一个或更多个桥接寡核苷酸,所述引入在允许所述桥接寡核苷酸在每一组的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸之间与感兴趣的核酸区域中的互补区域杂交的条件下进行。
5.根据权利要求4所述的用途,其中在所述桥接寡核苷酸的引入之前,分离所述固定序列寡核苷酸与其所杂交的所述感兴趣的核酸区域的杂交产物。
6.根据权利要求4所述的用途,其中与所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及所述第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸同时引入所述一个或更多个桥接寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述的用途,其中所述连续的连接产物的杂交包括与包含所述阵列的特征的单独寡核苷酸的杂交。
8.根据权利要求1所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的基因组区域互补的至少十组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的基因组区域互补的至少十组固定序列寡核苷酸实施所述步骤。
9.根据权利要求8所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的基因组区域互补的至少100组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的基因组区域互补的至少100组固定序列寡核苷酸实施所述步骤。
10.根据权利要求9所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的基因组区域互补的至少200组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的基因组区域互补的至少200组固定序列寡核苷酸实施所述步骤。
11.根据权利要求10所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的基因组区域互补的至少500组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上基因组区域互补的至少500组固定序列寡核苷酸实施所述步骤。
12.根据权利要求2所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,在将所扩增的连续的连接产物引入至所述阵列之前,包括分离所述扩增的连续的连接产物的步骤。
13.至少第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸在制备用于检测遗传样品中的核酸区域的频率的变异的测定系统中的用途,所述遗传样品包括母亲来源和胎儿来源二者的核酸,其中当所述测定系统被使用时,包括下列步骤:
提供遗传样品;
向所述遗传样品引入至少第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸,所述引入在同时允许所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸与感兴趣的第一核酸区域中的互补区域特异性地杂交并且所述第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸与感兴趣的第二核酸区域中的互补区域特异性地杂交的相同条件下进行,其中每一组的至少一个固定序列寡核苷酸包括与光学可检测的标记物相缔合的区域,并且所述光学可检测的标记物是荧光标记物,且其中每一组的至少一个固定序列寡核苷酸包括选择性、竞争性地结合到相同阵列特征上的区域;
连接每一组的杂交的固定序列寡核苷酸,以产生与感兴趣的核酸区域互补的连续的连接产物;
从每组扩增所述连续的连接产物;
从每组分离所扩增的连续的连接产物;
将所分离的扩增的连续的连接产物引入至包含与所述扩增的连续的连接产物互补的一个或更多个所述相同阵列特征的阵列;和
通过检测所述光学可检测的标记物,检测来自所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸以及第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸的所述分离的扩增的连续的连接产物与所述阵列的杂交;
其中所述阵列上所述光学可检测的标记物的相对频率指示所述遗传样品中的感兴趣的核酸的频率的变异的存在或不存在,并且其中通过与来自所述第二组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸的连续的连接产物的杂交水平相比,来自所述第一组第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸的连续的连接产物的增加或减少的杂交水平来检测所述变异。
14.根据权利要求13所述的用途,其中每一组的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸中的一个或两者包含通用引物区域并且所述通用引物区域被用于扩增所述连续的连接产物。
15.根据权利要求13所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的遗传区域互补的至少10组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的遗传区域互补的至少10组固定序列寡核苷酸进行所述步骤。
16.根据权利要求15所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的遗传区域互补的至少100组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的遗传区域互补的至少100组固定序列寡核苷酸进行所述步骤。
17.根据权利要求16所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的遗传区域互补的至少400组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的遗传区域互补的至少400组固定序列寡核苷酸进行所述步骤。
18.根据权利要求17所述的用途,其中当所述测定系统被使用时,针对与第一染色体上的遗传区域互补的至少480组固定序列寡核苷酸和与第二染色体上的遗传区域互补的至少480组固定序列寡核苷酸进行所述步骤。
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Effective date of registration: 20210809 Address after: Basel, SUI Patentee after: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG Address before: California, USA Patentee before: ARIOSA DIAGNOSTICS, Inc. |
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