JP6793112B2 - 胎児コピー数変異の統計的尤度を提供するアッセイ方法および胎児染色体異数性の尤度決定のためのアッセイ方法 - Google Patents

胎児コピー数変異の統計的尤度を提供するアッセイ方法および胎児染色体異数性の尤度決定のためのアッセイ方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本国際ＰＣＴ出願は、２０１４年８月１日に出願された米国特許出願第１４／４５０，１４４号および２０１４年８月６日に出願された米国特許出願第１４／４５３，３９６号による利益を主張する。
本発明は、試料からの標的ゲノム領域の検出に関するものである。
以下の議論において、発明の背景と序論の目的のために、特定の文献と方法が記述される。本明細書に含まれる内容は、先行技術の「受け入れ」として解釈されない。本特許申請者は、適切であれば、ここで参照される文献と方法は、申請の根拠となる法律規定において先行技術を構成しないことを示威する権利を明確に保持する。
ゲノム異常は、染色体異数性（例：ダウン症）、特定ゲノムにおける生殖細胞系列変異（例：鎌状赤血球貧血）および体細胞突然変異が起因の病理（例：癌）を含む、広範な病理を説明する。ゲノム異常を判断する診断方法は、特定の疾病や障害を特定するための標準技術になってきており、また疾病原因および治療選択肢に関する貴重な情報も提供する。
コピー数変異（ＣＮＶ）は、削除または重複されているゲノムの特別領域（全染色体を含む）に対応するゲノムＤＮＡの変異である。ＣＮＶは、削除、重複、反転および転座などのゲノムの再配置によって起こり得る。ＣＮＶは、様々な種類の癌（非特許文献１）、自閉症を含む神経障害（非特許文献２）、並びに統合失調症（非特許文献３）に付随するとされてきた。
Ｃａｐｐｕｚｚｏ Ｆ，Ｈｉｒｓｃｈら、（２００５）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９７（９）：６４３−５５ Ｓｅｂａｔ，Ｊ．ら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６（５８２３）：４４５−９ Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ，Ｄ．，（２００８）Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｂｕｌｌ ３５（１）：９−１２
従って、効率的で反復性のあるアッセイおよび検出システムを使用する、コピー数変異に対するスクリーニング方法の必要性がある。
本概要は、概念の選択を簡潔な形式で紹介するために提供されており、下述の発明の詳細な説明で更に記述される。本概要は、特許請求される主題の主要なあるいは本質的な内容の特定を意図するものではなく、また特許請求される主題の範囲の限定に用いることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特質、詳細、実用および利点は、添付図において図示され、また不随する特許請求の範囲において定義される局面を含む、以下の詳細な記述から明らかである。
本発明は、コピー数変異（ＣＮＶ）、挿入、削除、転座、遺伝子多型、突然変異を含む、試料のゲノム特性を検出する方法を提供する。本発明は、２カ所以上の標的ゲノム領域から遺伝子座を照合する技術を使用しており、この技術は、照合する各遺伝子座に対して少なくとも２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを用い、かつ核酸連結を通じて直接的あるいは間接的に、これらの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを連結する。１カ所の選択されたゲノム領域において、異なる遺伝子座に由来する核酸連結生成物は、固体支持体上の１個以上の捕捉プローブに相補的な領域を含むよう設計された核酸捕捉領域を含む。捕捉領域は核酸連結生成物が、特定の標的ゲノム領域に起源をもつと識別する、１つ以上の検出可能な標識を含む。異なる標的ゲノム領域からの核酸連結生成物の識別は、核酸連結生成物の捕捉領域を固体支持体上の相補的捕捉プローブに結合することにより達成される。
ある特別な実施形態においては、本発明は、胎児染色体異数性の統計的尤度を提供するためのアッセイ方法を提供するものであり、該方法は、母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む母体試料を提供することと、捕捉領域を含む、シークエンスに特有なオリゴヌクレオチドを用いて第一標的ゲノム領域からの１個以上の遺伝子座を照合することと、捕捉領域を含む、シークエンス特有なオリゴヌクレオチドを用いて第二標的ゲノム領域からの１個以上の遺伝子座を照合することと、配列へのハイブリッド形成を通じて第一および第二標的ゲノム領域から分離され選択された遺伝子座を検出することと、シークエンス特有なオリゴヌクレオチドを用いて、第一および第二標的ゲノム領域とは異なる少なくとも１カ所の標的ゲノム領域から選択された多型遺伝子座を照合することと、分離され選択された多型遺伝子座を検出することと、母体試料中の胎児細胞フリーＤＮＡの割合を算出するために分離され選択された多型遺伝子座の計数合計を定量化することと、母体試料中の胎児細胞フリーＤＮＡの統計的尤度を算出することと、を含み、ここで第一標的ゲノム領域からの遺伝子座の相対頻度、第二標的ゲノム領域からの遺伝子座の相対頻度、並びに多型遺伝子座から定量化された計数が胎児染色体異数性の存在の統計的尤度を提供する。
他の特別な実施形態においては、本発明は、胎児染色体異数性の存在あるいは不在を決定するアッセイ方法を提供するものであり、該方法は、母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む母体試料を提供することと、捕捉領域を含む、シークエンス特有なオリゴヌクレオチドを用いて第一標的ゲノム領域からの１個以上の遺伝子座を照合することと、捕捉領域を含む、シークエンス特有なオリゴヌクレオチドを用いて第二標的ゲノム領域からの１個以上の遺伝子座を照合することと、配列へのハイブリッド形成を通じて第一および第二標的ゲノム領域からの遺伝子座を検出することと、第一および第二標的ゲノム領域の相対頻度を決定するために遺伝子座の計数合計を定量化することと、第一標的ゲノム領域からの遺伝子座の相対頻度と第二標的ゲノム領域からの遺伝子座の相対頻度を使用して、分離された遺伝子座の計数の期待値からの偏差に基づいて、母体試料中の胎児染色体異数性の存在あるいは不在を決定することと、を含む。特定の局面においては、計数の期待値からの偏差は、試料の代表母集団から決定される閾値レベルを使用して決定され、好ましくは、代表母集団は同様な母体年齢および／あるいは妊娠期間の患者から採取した試料を含む。
特別な局面においては、第一および第二ゲノム領域からの遺伝子座の照合は、ハイブリッド形成、そしてそれに続いて核酸連結を使用する。更に特別な局面においては、ハイブリッド形成および核酸連結のステップの後に増幅ステップを実施する。他の特別な局面においては、この増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用する普遍的増幅である。
好ましい局面においては、２カ所以上の異なるゲノム領域からの核酸連結生成物は、単一固体支持体を使い、捕捉プローブ、例えば、異なる標的領域を示すような多重捕捉領域に相補的な複数の捕捉プローブを含む配列を用いて特定される。２カ所以上の異なるゲノム領域に由来する核酸連結生成物のプールを配列に導入すると、同じ捕捉領域を有する核酸連結生成物は、配列上の相補的捕捉プローブに競合的にハイブリッド形成し、各ゲノム領域に由来する核酸連結生成物の相対頻度は、捕捉プローブに結合する検出された標識の数量に基づいて推定することが可能である。このようにして、標的ゲノム領域の相対頻度自体を決定することが可能である。各標的ゲノム領域の相対頻度は、各標的ゲノム領域からの選択された遺伝子座のそれぞれに対応する核酸連結生成物上の捕捉領域の、配列上の特定の既知の位置への結合を特定する、あるいは標的ゲノム領域に由来する核酸連結生成物の結合に続いて配列からの総蛍光量を推定することにより決定され得る。
ある好ましい実施形態においては、捕捉領域および捕捉プローブは特定標的ゲノム領域ヌクレオチドシークエンスを反映せず、その代わり、特定標的ゲノム領域に代用として機能する「設計された」シークエンスは反映するので、標的ゲノム領域に対応する核酸連結生成物のヌクレオチドシークエンスを直接決定する必要はない。核酸連結生成物上の捕捉領域を使用すると、配列上の捕捉プローブへの核酸連結生成物の結合が可能となり、標的ゲノム領域の実際のヌクレオチドシークエンスに対応する核酸連結生成物の一部を配列させることなく、核酸連結生成物に由来するより大きな標的ゲノム領域を示すことが可能となる。捕捉領域および捕捉プローブは設計されたシークエンスであるので、それらは「普遍」シークエンスと考えられ、つまり、これらの捕捉領域および捕捉プローブは、任意数の異なるアッセイ方法と共用可能であり、捕捉領域に付随する標的シークエンスのみが異なる。
一つの実施形態においては、本発明の配列は、すべて本質的に同じシークエンスを有する捕捉プローブを含む。別の実施形態においては、使用される配列は、本質的に同じシークエンスを有する捕捉プローブによって、２個〜数個の異なる特質を含む。該配列は、各特質が他の特質とは異なる核酸配列を構成する個々のシークエンスの特質に相補的であることにより個々の配列を識別するという周知技術において公知の配列とは対照的なものである。配列上の個々の特質において、１個または限定的な個数の相補的な捕捉プローブシークエンスを使用すると、配列が作成され、または核酸連結生成物上の捕捉領域と捕捉プローブとの結合親和性の差が原因で発生する、検出頻度の潜在的な疑わしい差を低減させるのに必要な生化学が簡単化され得る。
特定の実施形態においては、該配列は、２カ所以上の異なる標的ゲノム領域、単一標的ゲノム領域からの２個以上の異なる遺伝子座、あるいは選択された遺伝子座に由来する２個以上の対立遺伝子からの個々の核酸連結生成物を検出するために使用される２個以上の異なる捕捉プローブを含む。言い換えれば、異なるシークエンスの捕捉プローブは、単一標的ゲノム領域に由来する異なる遺伝子座、あるいは選択された遺伝子座に由来する異なる対立遺伝子に対応する核酸連結生成物の捕捉領域にハイブリッドを形成する。核酸連結生成物上の捕捉領域は、標的ゲノム領域や選択された遺伝子座を示す、あるいは核酸連結生成物の由来元である多型対立遺伝子を示す標識に付随する。
従って、本発明の好ましい実施形態においては、核酸連結生成物に導入される捕捉領域に相補的な捕捉プローブを用いて核酸連結生成物が特定されるが、標的ゲノム領域に相補的な特質へのハイブリッド形成により唯一対応する標的ゲノム領域は特定しない。ある実施形態においては、捕捉プローブは部分的には標的ゲノム領域に相補的であり、また核酸連結生成物の捕捉領域に部分的に相補的である。一つの好ましい実施形態においては、標的ゲノム領域に対応する核酸連結生成物を特定するために用いられる捕捉領域は、標的ゲノム領域の任意部分に相補的ではない。
核酸連結手順に続いて、捕捉領域を（例えば、アダプタの核酸連結を通じて）固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの核酸連結生成物の一端または両端に付着させることができるが、核酸連結以前に固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの一部として捕捉領域が好ましく導入される。
標的ゲノム領域に対応する核酸連結生成物を実際に決定することなしに標的ゲノム領域内の遺伝子座に由来する核酸連結生成物に付随する標識を定量化することにより、捕捉領域を用いる場合に標的ゲノム領域の定量化が達成可能であることが、本発明のハイブリッド形成アッセイ形式の別の特長である。このようにして、標的ゲノム領域に由来する核酸連結生成物の実際のヌクレオチドシークエンスの検出を必要せずに、標的ゲノム領域に由来する核酸連結生成物の頻度（従って、標的ゲノム領域自体の頻度）を推定することができる。
多数の好ましい実施形態においては、配列上で捕捉領域に結合する標識の定量化は、各標的ゲノム領域に由来する核酸連結生成物のレベルあるいは量の推定に必要な読み値のみであり、それは標的ゲノム領域の頻度推定に利用され得る。
核酸連結生成物を複数の異なる検出可能な標識および／あるいは捕捉領域に付随させることが本発明の利点である。異なる実験において、異なる標識および／あるいは捕捉領域を用いると、特に検出可能な標識や捕捉領域あるいは捕捉プローブを用いて頻度の任意の偏りを緩和することができる。
特定の実施形態においては、本発明は、試料中の第一および第二標的ゲノム領域の頻度を検出する方法を提供するものであり、該方法は：第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第一標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に相補的な領域への特異的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を導入することであって、ここで第一組の第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは捕捉領域と第一標識を含む、導入することと；第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に相補的な領域への特異的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を導入することであって、ここで第一組の第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは捕捉領域と第二標識を含む、導入することと；ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを核酸連結させ、遺伝子座に相補的な核酸連結生成物を生成することと；配列上の捕捉プローブの、核酸連結生成物の捕捉領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある捕捉プローブを含む配列に核酸連結生成物を導入することと；第一および第二標識を検出することと；第一および第二標識の想定頻度を定量化して第一および第二標的ゲノム領域の相対頻度を定量化することと、を含む。ある局面においては、核酸連結生成物の第一組および第二組の捕捉領域は異なる。他の局面においては、核酸連結生成物の第一組および第二組の捕捉領域は同じである。
好ましい局面においては、オリゴヌクレオチドの第一組および第二組の第一および第二捕捉領域は同じである。他の局面においては、少数の捕捉領域が第一および第二の両組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドで用いられる。他の局面においては、第一標的ゲノム領域に対応する第一捕捉領域は、第二標的ゲノム領域に対応する第二捕捉領域とは異なる。
他の好ましい実施形態においては、第一および第二標的ゲノム領域の照合に加え、２個以上の選択された多型遺伝子座に由来するＳＮＰを含む多型シークエンスが照合される。選択された多型遺伝子座は、第三組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを用いて照合され、対立遺伝子頻度が決定される。対立遺伝子頻度は、例えば、母体血清試料に存在する胎児核酸の割合を算出するため利用される。
特定の実施形態においては、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、標的ゲノム領域の遺伝子座に対して隣接してハイブリッド形成せず、その代わり、遺伝子座にハイブリッド形成された組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間の介入領域あるいは「間隙」を有する。この介入領域は、例えば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて充填して、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの１つの末端を延長し、それにより該末端をその組の他のハイブリッド形成された核酸塩基の末端に隣接させることができる。もう一つの実施形態においては、１組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間と隣接部を結合する１個以上の「間隙充填」あるいは「架橋」核酸塩基を用いて、介入領域を充填し得る。後者の場合、好ましくは核酸連結ステップでは、配列が検出可能となる単一捕捉領域を含む単一連続遺伝子座生成物にすべてのオリゴヌクレオチドを核酸連結させる。更に別の実施形態においては、架橋オリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰとポリメラーゼの組み合わせを用いて、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間の介入空間を充填することができる。
上記実施形態においては、選択された遺伝子座のそれぞれにおいて２カ所に分かれた領域にハイブリッド形成させるよう設計された２個の別々の固定核酸配列オリゴヌクレオチドを含む、１組の固定核酸塩基配列の核酸を使用する。しかしながら、ある実施形態においては、１組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、選択された遺伝子座に相補的ないずれかの末端での領域を有する単一プローブを含み得る。この単一プローブを遺伝子座にハイブリッド形成させると、プローブは円形状となり、遺伝子座上で隣接してハイブリッドが形成する場合と形成しない場合がある。そのような「プレサークル」プローブはまた、ポリメラーゼやｄＮＴＰ、あるいはそれらの組み合わせを用いてプローブの一端を延長することにより、プローブ末端間の間隙によってハイブリッド形成が可能であり、ここで間隙は、１個以上の架橋オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって充填可能である。
特定の局面においては、検出可能な標識は、各組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの一つにある捕捉領域に直接付随する、すなわち共有的あるいは非共有的に結合する。別の実施形態においては、核酸連結の後に、核酸連結生成物を例えば普遍増幅で増幅させ、検出可能な標識は、増幅のために使用されたプライマー内に含まれる捕捉領域に付随する。他の特別な局面においては、第一および第二標的ゲノム領域から孤立させた遺伝子座および選択された多型遺伝子座に由来する核酸連結生成物を、単一容器内で増幅する。他の局面においては、検出可能な標識は、核酸連結生成物、アンプリコンあるいはその切断生成物の相補的シークエンスにハイブリッド形成する核酸塩基に共有または非共有的に結合する。このような標識化されたオリゴヌクレオチドは、核酸連結生成物を捕捉プローブの配列に導入する前後で核酸連結生成物にハイブリッド形成させることが可能である。
本発明の他の実施形態においては、異なる標的ゲノム領域に対応する核酸連結生成物上の捕捉領域は異なる配列を含み、また少なくとも第一および第二標的ゲノム領域の比較頻度は、異なる捕捉領域に付随する異なる検出可能標識の使用に基づいて決定される。
特定の局面においては、試料中の標的ゲノム領域に由来する結合された核酸連結生成物からの結合された検出可能表標識の期待比を変更させることでコピー数変化を検出する。ある特別な局面においては、最初に選択された遺伝子座からの核酸連結生成物上の１組のハイブリッド形成レベルの増減を、次に選択された遺伝子座からの核酸連結生成物上の別の１組と比較することによって決定し、コピー数変化を検出する。
試料中の遺伝子座の相対頻度を用いて、小さな標的ゲノム領域に対するコピー数変異を決定することができるのみならず、他の遺伝子座との比較との共用および／あるいは比較により、遺伝子座の相対頻度を用いて、染色体の一部あるいは全部を含み、大きな標的ゲノム領域のコピー数変異も決定することができる。
本発明の別の一般的局面においては、試料中の第一および第二標的ゲノム領域の頻度を検出する方法が提供され、該方法は、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第一標的領域内の遺伝子座内の相補的な領域との特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を導入して、第一ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを作成することと；第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、遺伝子座内の相補的な領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を導入して、第二ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを作成することと；各組のハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを核酸連結させて、第一および第二標的ゲノム領域の遺伝子座に相補的な核酸連結生成物を生成することと、を含む。各組の少なくとも１個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、配列上の捕捉プローブに相補的なシークエンスを含む捕捉領域と、検出可能な標識に対する結合領域とを含む。核酸連結生成物は配列に導入され、該配列は、捕捉プローブの、核酸連結生成物の捕捉領域との特異的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある核酸連結生成物の捕捉領域に相補的な捕捉プローブを含む。検出可能な標識の、第一標的ゲノム領域からの遺伝子座に由来する核酸連結生成物上の捕捉領域の結合領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある配列に第一の検出可能標識を導入し、また検出可能な標的の、第二標的ゲノム領域からの遺伝子座に由来する核酸連結生成物上の捕捉領域の結合領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある配列に第二の検出可能標識を導入する。第一および第二検出可能標識が検出され定量化されて、試料中の第一および第二標的ゲノム領域の相対頻度が提供される。上述のように、一つの実施形態に関連して、第一および第二標的ゲノム領域を照合することに加え、本実施形態の局面は、２個以上の選択された多型遺伝子座からのＳＮＰを含む多型シークエンスを照合する。選択された多型遺伝子座は、第三組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを用いて照合され、対立遺伝子頻度が決定される。対立遺伝子頻度は、例えば、母体血清試料に存在する胎児核酸の割合を算出するため利用される。また、上述のように、本実施形態のある局面においては、２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに加えて「間隙充填」または「架橋」オリゴヌクレオチドを使用することができ、また本実施形態のある局面においては、該固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドあるいは架橋オリゴヌクレオチドは、以下に詳細に記述するように、対立遺伝子に特有である。
特別な局面においては、本発明のアッセイは、選択された多型遺伝子座に由来する低頻度対立遺伝子を識別し、ここで母体ＤＮＡは同型接合性、また非母体ＤＮＡは異型接合性であり、孤立し選択された多型遺伝子座に由来する低頻度対立遺伝子の総和を算出し、また孤立し選択された多型遺伝子座に由来する低頻度対立遺伝子の総和を使用し、母体試料中の胎児染色体異数性の統計的尤度を算出して第一および第二標的ゲノム領域に対する標的ゲノム領域頻度の統計的に有意な差を算出し、またここで、染色体頻度の統計的に有意な差は胎児染色体異数性の存在の統計的尤度を提供する。
本発明の別の一般的局面においては、試料中の第一および第二標的ゲノム領域の頻度を検出する方法が提供され、該方法は、試料を提供することと；第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第一標的ゲノム領域の第一遺伝子座内の相補的な領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を導入して、第一ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを作成することと；固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第二標的ゲノム領域の第二遺伝子座内の相補的領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を導入して、第二ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを作成することと、を含む。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組の少なくとも１個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、捕捉領域および第一検出可能標識に相補的な標識結合領域を含み、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組の少なくとも一つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、第一組と実質的に同じ捕捉領域および第二検出可能標識に相補的な標識結合領域を含む。第一組および第二組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは核酸連結されて、それぞれ第一および第二遺伝子座に相補的な領域を含み、かつ第一および第二検出可能標識で標識された第一および第二核酸連結生成物を形成する。第一および第二核酸連結生成物は、捕捉プローブの、核酸連結生成物の捕捉領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある捕捉プローブを含む配列に導入される。第一および第二標識が検出され定量化されて、第一および第二標識の相対頻度が決定され、従って試料中の第一および第二標的ゲノム領域の相対頻度が定量化される。
配列に核酸連結生成物と導入する前に、検出可能な標識を核酸連結生成物に導入することができる。別方法としては、核酸連結生成物のハイブリッド形成に続いて、配列に検出可能標識を導入し得る。
再び、特定の実施形態においては、この方法は更に、対象とする配列にハイブリッド形成された少なくとも１個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの延長を使用する。言い換えれば、ある実施形態においては、一つ以上の遺伝子座にハイブリッド形成する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは隣接ではハイブリッド形成せずに、「間隙」あるいは「介入」領域をそのまま残す場合がある。この介入領域は、例えばポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて充填し、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの１個の末端を延長し、該末端がその組の他のハイブリッド形成された核酸塩基の末端に隣接することができる。もう一つの実施形態においては、１組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間と隣接部を結合する１個以上の「間隙充填」あるいは「架橋」核酸塩基を用いて、介入領域を充填し得る。後者の場合、好ましくは核酸連結ステップでは、配列上で検出可能となる単一捕捉領域を含む単一連続遺伝子座生成物にすべての核酸塩基を核酸連結させる。また、架橋する、あるいは間隙を充填する核酸塩基およびｄＮＴＰとポリメラーゼは、間隙充填に使用することができる。加えて、ある実施形態においては、プレサークル、パドロックあるいは分子反転プローブを、１組中にある２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの代わりに使用することができる。
間隙充填あるいは架橋オリゴヌクレオチドを使用する場合は、架橋オリゴヌクレオチドは通常は短く、好ましくはヌクレオチド２〜３０個分の長さ、更に好ましくはヌクレオチド３〜２８個分の長さである。一つの局面においては、架橋オリゴヌクレオチドは多重あるいは全部位で縮退を提供することができ、例えば、一つの遺伝子座が１カ所以上の部位に多型ヌクレオチドを含む場合であっても、該遺伝子座を確実に検出するよう、該架橋オリゴヌクレオチドは、各種配列変動を有する完全あるいは部分ランダマーであり得る。架橋オリゴヌクレオチドの縮退は、遺伝子座に存在することがあると予想される多型性に基づいて設計することが可能である。別方法としては、もう一つの局面において、反応に使用される架橋オリゴヌクレオチドのプールは、遺伝子座の領域内に存在することがあると予想される多型性に基づいて、１カ所以上の部位を特に標的とする限定的縮退を与え得る。更に別の局面においては、反応に使用される架橋オリゴヌクレオチドのプールは、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを固定したまま有する核酸連結部に隣接するヌクレオチドを有する各内部部位に対し縮退を提供し得る。縮退した架橋オリゴヌクレオチドを用いると、本発明の検出方法を利用する前に選択された遺伝子座に対する母体および胎児多型含有物を事前決定する必要性がなくなる。
別の局面においては、架橋オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１０個分の長さより長く、好ましくはヌクレオチドの１８〜３０個分の長さである。好ましい局面においては、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに相補的な選択された遺伝子座間をハイブリッド形成させるよう設計された遺伝子座のそれぞれに相補的な単一の架橋オリゴヌクレオチドが存在する。別の局面においては、選択された遺伝子座のそれぞれで固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間をハイブリッド形成させるよう、２個以上の架橋核オリゴヌクレオチドが設計され、好ましくは架橋オリゴヌクレオチドは第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに隣接的にハイブリッド形成する。
２個の架橋オリゴヌクレオチドが存在する場合は、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドと第一架橋オリゴヌクレオチドとの間の核酸連結、第一および第二架橋オリゴヌクレオチド間の核酸連結、そして第二架橋核オリゴヌクレオチドと第二固定核酸塩基との間の核酸連結という、３つの核酸連結事象が遺伝子座のそれぞれで起こる。別の局面においては、架橋オリゴヌクレオチド間および／あるいは架橋オリゴヌクレオチドと固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドとの間に間隙が存在し得る。これらの間隙は核酸連結前に、例えば、ポリメラーゼやｄＮＴＰ用いてを延長することにより充填することができる。
本発明の一つの局面においては、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが試料に導入され、試料に架橋核酸塩基を導入する前に、遺伝子座の相補的部分に特異的にハイブリッド形成される。別の局面においては、架橋オリゴヌクレオチドが試料に導入され、それと同時に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一および第二組が試料に導入される。
本発明の別の一般的局面においては、混合試料中に異数性が存在あるいは不在することを決定する方法が提供され、該方法は、混合試料を提供することと；固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第一染色体の第一遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある混合試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を導入して、第一ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを生成させることであって、ここで固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組は第一捕捉領域と第一標識結合領域を含む、生成させることと；固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、第二染色体の第二遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある混合試料に第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を導入して、第二ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを生成させることであって、ここで固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組は第二捕捉領域と第二標識結合領域を含む、生成させることと；ハイブリッド形成済みオリゴヌクレオチドを核酸連結して、遺伝子座に相補的な核酸連結生成物を発生させることと；捕捉プローブの、該核酸連結生成物の第一および第二固捕捉領域への特異的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある捕捉プローブを含む配列に該核酸連結生成物を導入することと；第一標識オリゴヌクレオチドの標的認識領域の、第一標識結合領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある配列に第一標識オリゴヌクレオチドを導入することと；第二標識オリゴヌクレオチドの標的認識領域の、第二標識結合領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある配列に第二標識オリゴヌクレオチドを導入することと；第一および第二標識を検出することと；第一および第二標識の相対頻度を定量化し、従って混合試料中の第一および第二染色体（あるいはゲノム領域）の相対頻度を定量化することであって、ここで配列上の標識の相対頻度における統計的に有意な差は混合試料中の染色体異数性の存在あるいは不在を示す、定量化することと、を含む。
別方法の実施形態においては、「閾値」レベルを使用して、混合試料中の第一および第二染色体の相対頻度の偏差観測値に基づいて、胎児染色体異数性の存在あるいは不在を判断することができる。この閾値は、例えば、米国特許出願第２０１２／０１４９５８３号、第２０１３／０３２４４２０号、第２０１３／００２９８５２号および米国特許第８，５３２，９３６号において開示されたものなどの技術を用いて決定することが可能である。特定の局面においては、期待される計数からの偏差は、試料の代表母集団から決定される閾値レベルを使用して決定され、好ましくは、代表母集団は同様なリスク・プロフィルや母体年齢および／あるいは妊娠期間の患者からの試料を含む。
本発明の好ましい局面においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの追加前、追加中、あるいは追加後のいずれかに、試料ＤＮＡは固体支持体に結合される。本発明の好ましい局面においては、アッセイは、核酸連結生成物を発生させる前に、例えば洗浄あるいはエキソヌクレアーゼ消化によって、ハイブリッド形成しなかったオリゴヌクレオチドを除外するステップを使用する。他の好ましい局面においては、核酸連結に続くが、更なる処理前および／あるいは検出のための配列への導入前に、核酸連結生成物を分離させる。他の好ましい実施形態においては、核酸連結生成物は増幅され、好ましくはアンプリコンを形成するよう、普遍プライマーを使用する。他の好ましい実施形態においては、アンプリコンは続いて配列にハイブリッド形成される前に、切り込みを入れ、切断アンプリコンを形成する。核酸連結生成物の切断を含む実施形態においては、捕捉領域を含む切断領域は、好ましくは、捕捉領域部分を配列に導入する前に、切断生成物の残りの部分から分離されることが好ましい。
特定の局面においては、試料ＤＮＡ、核酸連結生成物および／あるいは増幅生成物は、当技術分野における従来技術を用いて分離される。例えば、ハイブリッド形成錯体（例：標的遺伝子座に結合する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド）、核酸連結生成物および／あるいは増幅生成物は、固体基板に付着させた後に、例えば、洗浄やエキソヌクレアーゼ消化といった分離ステップによって分離され得る。特別な例においては、これらを磁気ビーズへの付着を利用して分離することが可能である。他の特別な例においては、これらを結合担体を有する基板への付着を利用して分離することが可能であり、例えばオリゴヌクレオチドはビオチン化され、基板はアビジンあるいはストレプトアビジンを含む。プレサークルプローブを使用する局面においては、ハイブリッド形成錯体および／あるいは核酸連結生成物は、非円形プローブのヌクレアーゼ分解によって分離することができる。
本実施形態のある局面においては、第一および第二捕捉領域は同じヌクレオチド配列を有する。本実施形態の他の局面においては、第一および第二捕捉領域は異なるヌクレオチド配列を有する。また上述のように、他の実施形態に関連して、第一および第二標的ゲノム領域を照合することに加え、本実施形態の局面は、２個以上の選択された多型遺伝子座からのＳＮＰを含む多型配列を照合する。選択された多型遺伝子座は、例えば、第三組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを用いて照合され、対立遺伝子頻度が決定される。対立遺伝子頻度は、例えば、母体血清試料に存在する胎児核酸の割合を算出するため利用される。
上述のように、本実施形態のある局面においては、２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド以外に、延長核酸連結および／あるいは「架橋」オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。従って、本発明は、胎児染色体異数性の尤度を決定する方法を提供するものであり、該方法は、母体および胎児の細胞フリーＤＮＡを含む母体試料を提供するステップと、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの相補的領域の、遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料中の第一標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を導入するステップであって、ここで各組の２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは普遍プライマー部位および捕捉領域を含む、ステップと、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの相補的領域の、遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料中の第二標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を導入するステップであって、ここで各組の２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは普遍プライマー部位および捕捉領域を含む、ステップと、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの相補的領域の、遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料中の第一標的ゲノム領域とは異なる標的ゲノム領域内の遺伝子座の組に相補的な２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第三組を導入するステップであって、ここで各組の２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは普遍プライマー部位および捕捉領域を含む、ステップと、架橋オリゴヌクレオチドの、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間の遺伝子座内の相補的領域への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料に架橋オリゴヌクレオチドを導入するステップと、ハイブリッド形成済み第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドを核酸連結させて該遺伝子座に相補的な核酸連結生成物を発生させるステップと、核酸連結生成物を分離するステップと、分離された核酸連結生成物を普遍プライマー部位を使用して増幅するステップと、増幅された核酸連結生成物を配列に適用するステップであって、ここで該配列は核酸連結生成物上の捕捉領域に相補的な捕捉プローブを含む、ステップと、選択された多型遺伝子座のそれぞれに由来する各対立遺伝子の相対頻度を定量化して試料中の胎児細胞フリーＤＮＡの割合を決定するステップと、第一標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を定量化し、また第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を定量化するステップと、第一および第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度および胎児細胞フリーＤＮＡの割合を用いて胎児染色体異数性の存在あるいは不在の尤度を算出して、胎児染色体異数性の存在あるいは不在の尤度を決定するステップと、を含む。
本発明ははまた、胎児染色体異数性の尤度を決定する方法を提供するものであり、該方法は、母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む母体試料を提供するステップと、各固定核酸塩基の相補的領域の、遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料中の第一標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を導入するステップであって、ここで各組の２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは普遍プライマー部位および捕捉領域を含む、ステップと、各固定核酸塩基の相補的領域の、遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料中の第二標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を導入するステップであって、ここで各組の２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは普遍プライマー部位および捕捉領域を含む、ステップと、各固定核酸塩基の相補的領域の、遺伝子座への特異的なハイブリッド形成を可能とさせる条件下にある母体試料中の第一標的ゲノム領域とは異なる標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第三組を導入するステップであって、ここで各組の２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは普遍プライマー部位および捕捉領域を含む、ステップと、ｄＮＴＰｓおよびポリメラーゼを使用して、ハイブリッド形成済み固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１個を延長して隣接するハイブリッド形成済み核酸塩基を発生させるステップと、隣接するハイブリッド形成済みオリゴヌクレオチドを核酸連結させて、該遺伝子座に相補的な核酸連結生成物を発生させるステップと、核酸連結生成物を分離するステップと、普遍プライマー部位を使用して分離済み核酸連結生成物を増幅するステップと、増幅された核酸連結生成物を配列に適用するステップであって、ここで該配列は核酸連結生成物上の捕捉領域に相補的な捕捉プローブを含む、ステップと、選択された多型遺伝子座のそれぞれに由来する各対立遺伝子の相対頻度を定量化して試料中の胎児細胞フリーＤＮＡの割合を決定するステップと、第一標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を定量化し、また第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を定量化するステップと、第一および第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度および胎児細胞フリーＤＮＡの割合を用いて胎児染色体異数性の存在あるいは不在の尤度を算出して、胎児染色体異数性の存在あるいは不在の尤度を決定するステップと、を含む。
特定の局面においては、本発明は更に、胎児細胞フリーＤＮＡの割合に基づいて、第一および第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を比較し、また第一および第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を調節して、胎児染色体異数性の尤度を決定することと、を含む。特別な局面においては、各標的ゲノム領域に対して選択された遺伝子座のそれぞれの相対頻度が総和され、各染色体に対する総和が比較されて標的ゲノム領域比が計算される。
試料中の胎児細胞フリーＤＮＡの割合は、例えば、Ｙ−染色体上の非母体遺伝子座および／あるいは非母体遺伝子座は常染色体遺伝子座といった、１個以上の非母体拠出遺伝子座を検出することにより算出され得る。好ましい局面においては、非母体遺伝子座は、例えば、ＳＮＰあるいはメチル化差といった、母体遺伝子座と比較して一つ以上の遺伝的変異を含む。
特定の実施形態においては、捕捉領域および検出のための標識結合領域をそのままにしながら、核酸連結生成物が（例えば、制限エンドヌクレアーゼといった酵素切断機構を使用して）切断され、核酸連結生成物の大きさが縮小される。特定の局面においては、切断は普遍増幅後に起こる。
好ましい実施形態においては、ハイブリッド形成後、例えば、非結合オリゴヌクレオチドの洗浄あるいは酵素的分解ステップを通じて、遺伝子座および遺伝子座にハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが非結合固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドから分離されて、反応中の過剰な非結合オリゴヌクレオチドを除去する。
この方法で使用される固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一および第二組は、少なくとも１カ所の捕捉領域以外に、核酸連結生成物の増幅に使用され得る普遍プライマー領域を含むことが好ましい。別方法としては、例えば、普遍プライマー配列を含むアダプタの導入を通じて、核酸連結後に、核酸連結生成物の末端に普遍プライマー配列を加えることも可能である。
特定の局面においては、本発明の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、１個以上の指標を含む。これらの指標は、捕捉領域に加え、代理配列として、遺伝子座あるいは遺伝子座の特定の対立遺伝子の識別に役立たせることができる。特に、これらの指標は代理識別配列として、その核酸連結生成物またはそのアンプリコンの、配列へのハイブリッド形成の検出に役立たせることができる。特別な方法においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの各組中の第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを有する特別な対立遺伝子に付随する対立遺伝子指標を含む。
ある特別な局面においては、該方法は、各標的ゲノム領域に由来する少なくとも５０個の遺伝子座に対して実施され、好ましくは５０〜１００個の遺伝子座、より好ましくは１００〜２００個の遺伝子座、更に好ましくは、２００〜５００個の遺伝子座、更に好ましくは、５００〜１０００個の遺伝子座、更に好ましくは、１０００〜２０００個の遺伝子座、そして更に好ましくは、１カ所の標的ゲノム領域あるいはそこにある任意の介入領域に由来する、５０００〜１０，０００個の遺伝子座である。特定の局面においては、標的ゲノム領域に加えて、少なくとも５０個の多型遺伝子座が照合される。より好ましくは、５０〜１００個の選択された多型遺伝子座が照合され、更に好ましくは、全介入領域を含め、１００〜２００個の選択された多型遺伝子座が、更に好ましくは、２００〜５００個の選択された多型遺伝子座が、更に好ましくは、５００〜１０００個の選択された多型遺伝子座が、更に好ましくは、１０００〜２０００個の選択された多型遺伝子座が、更に好ましくは、２０００〜５０００個の選択された多型遺伝子座が、そして更に好ましくは、５０００〜１０，０００個の選択された多型遺伝子座が照合される。
他の局面においては、該アッセイ方法は、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、少なくとも５カ所の捕捉領域の検出するよう推定され、好ましくは、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、少なくとも１０カ所の捕捉領域、更に好ましくは、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、少なくとも２０カ所の捕捉領域、更に好ましくは、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、少なくとも５０カ所の捕捉領域、更に好ましくは、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、少なくとも１００カ所の捕捉領域、更に好ましくは、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、少なくとも２００カ所の捕捉領域である。ある実施形態においては、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、５０００カ所を超えない捕捉領域が各試料に対し検出される。他の実施形態においては、１カ所の標的ゲノム領域内の各遺伝子座に対応する、２０００カ所を超えない捕捉領域が各試料に対し検出される。
本発明のこれらの局面および他の特質と利点は以下で詳細に記述される。
図１は、本発明の一つの一般的局面を記述するフローチャートである。 図２は、遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法の実施形態を図示する。 図３は、遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法の別の実施形態を図示する。 図４は、遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法のもう一つの実施形態を図示する。 図５は、遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法の更にもう一つの実施形態を図示する。 図６は、遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法のもう一つの別の実施形態を図示する。 図７は、多型性を検出するために遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法のもう一つの別の実施形態を図示する。 図８は、多型性を検出するために遺伝子座のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法のもう一つの別の実施形態を図示する。 図９は、多型性を検出するために核酸領域のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法のもう一つの実施形態を図示する。 図１０は、架橋オリゴヌクレオチドおよび２重切断を用いた核酸領域のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法を図示する。 図１１は、多型性を検出するために、架橋核酸塩基および２重切断を用いた核酸領域のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法実施形態を図示する。 図１２は、単一切断事象および異なる標識化された普遍プライマーを使った結果、得られた核酸領域のハイブリッド形成検出を利用する、本発明の方法を図示する。 図１３は、図１２で示された方法の別方法であり、単一切断事象および異なる標識化された普遍プライマーを使った結果、得られた核酸領域のハイブリッド形成検出を利用する。 図１４は、配列および次世代シーケンシングのために、試料全体にわたるアッセイ変動分布を示す。
定義
本明細書で使用される用語は、当業者によって理解される、平易な通常の意味を有することを意図とする。次の定義は、読者が本発明を容易に理解することを意図とするが、特に断らない限り、そのような用語が異なる意味あるいは限定的意味を有することは意図しない。
用語「対立遺伝子指標」は、一般的に、特定のＳＮＰに対応する一連の核酸を意味する。対立遺伝子指標は、１個以上の塩基の削除、置換または挿入の検出を可能にする追加の核酸を含み得る。対立遺伝子指標は、他の任意の指標を組み合わせて、２つの特性を提供する１つの指標（例えば、試料識別指標対立遺伝子座指標）を作成することが可能である。
「配列」とは、好ましくは平面あるいは実質的に平面であるが、これらに限定されない表面を有する固相支持体のことであり、核酸を含む部位の配列担体であり、該配列の各部位は、オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドの実質的に同一あるいは同一複製を含み、空間的に画定され、配列の他の部位構成部分とは重複せず、言い換えれば、部位群は空間離散的である。配列あるいはマイクロアレイはまた、ビーズ形状あるいは井戸型といった表面を有する、非平坦な照合可能な構造を含み得る。配列のオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドは、固体支持体に共有結合あるいは非共有結合し得る。従来のマイクロアレイ技術は、例えば、Ｓｃｈｅｎａ編集、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（マイクロアレイ：実用的アプローチ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（２０００）に総括されている。「配列分析」、「配列による分析」あるいは「マイクロアレイによる分析」とは、例えば、配列を用いた１個以上の生体分子のシークエンス分析といった分析のことである。配列という用語は、配列した固体基板の任意の形式を示し、マイクロアレイ、配列されたビーズ、井戸内の分子配列、あるいは「液体」配列を含む。
用語「結合対」とは、共有結合および／非共有結合によって、お互いに結合している任意の２個の分子を意味し、遺伝子材料を基板に付着させるために利用することができる。例としては、例えば、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレポトアビジン、抗体とその特別な抗原決定基といった、結合基とそのタンパク質結合相手であるが、これらに限定されない。
用語「染色体異常」とは、染色体の全部あるいは一部に対する任意の遺伝子変異を意味する。遺伝子変異には重複、または削除、転座、反転および突然変異性といった、任意のコピー数変化を含み得るが、これらに限定されない。
用語「相補的」あるいは「相補性」とは、塩基対規則により関係付けられる核酸（即ちヌクレオチドのシークエンス）を意味する。相補的なヌクレオチドは一般的に、ＡとＴ（またはＡとＵ）、あるいはＣとＧである。１個の鎖のヌクレオチドが、適切なヌクレオチドと最適に整列している場合、適切なヌクレオチド挿入あるいは削除によって、少なくとも約９０％ないし約９５％の相補性で、より好ましくは約９８％ないし約１００％の相補性で、更に好ましくは１００％の相補性で対をなす場合、２個の単鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡ分子は実質的に相補的であるという。言い換えれば、ＲＭＡあるいはＤＮＡ鎖が選択的ハイブリッドの形成が可能な条件下でその補体とハイブリッドを形成する場合、実質的な相補性が存在する。選択的ハイブリッド形成条件には、緊縮ハイブリッド形成条件を含むが、これに限定されない。緊縮ハイブリッド形成条件は一般的に、約１Ｍ未満の塩濃度を含み、更に一般的には約５００ｍＭ未満であり、好ましくは２００ｍＭ未満である。ハイブリッド形成温度は一般的に、融解温度（Ｔｍ）より、少なくとも約２℃ないし約６℃低い。
本明細書で使用される用語「診断ツール」とは、患者試料で診断テストあるいは検出システムを実施するために、例えば、システム内で組み合わせて使用する、本発明の任意の構成物あるいはシステムを意味する。
用語「ハイブリッド形成」は一般的に、核酸の相補的鎖の対形成が起こる反応を意味する。ＤＮＡは通常は二重鎖であり、この鎖が分離すると、適切な条件下では再度ハイブリッドを形成する。ハイブリッドは、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡあるいはＲＮＡ−ＲＮＡ間で形成され得る。これらは、短鎖および短鎖に相補的な領域を含む長鎖の間で形成され得る。不完全ハイブリッドもまた形成し得るが、より不完全な程、安定性は低い（そして形成し難い）。
本明細書で使用されている用語「リガーゼ」は一般的に酵素のあるクラスであるＤＮＡリガーゼ（典型的にはＴ４ ＤＮＡリガーゼ）を意味し、複数のＤＮＡを連結することができる。これらのＤＮＡは、末端を有する必要があり、すなわち該末端の両方が平滑末端であり、あるいは相互適合性がある粘着末端を有する必要があり、反応はＡＴＰを必要とする。「核酸連結」とは、２個のＤＮＡを結合するプロセスである。
本明細書で使用されている用語「遺伝子座」および「遺伝子座群」は、染色体内の既知の核酸領域を意味する。
本明細書で使用されている用語「母体試料」は、胎児および母体細胞フリーＤＮＡの両方を含む、妊娠哺乳動物から採取した、任意の試料を意味する。好ましくは、本発明で使用する母体試料は、例えば、対象から抹消試料を抽出するための、放血その他の標準的技術である比較的非侵襲性手段を通じて得られる。
本明細書で使用されている用語「オリゴヌクレオチド」あるいは「オリゴ」は、天然あるいは変性核酸単量体を意味し、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチド、そのアノマー型、ペプチド核酸単量体（ＰＮＡ）、ロックド核酸単量体（ＬＮＡ）といったもの、あるいはそれらの組み合わせを意味し、ワトソン・クリック型塩基対形成や塩基積層、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型塩基対形成といった、単量体と単量体の相互作用の通常パターンによって単鎖ポリヌクレオチドに特に結合することができる。通常、単量体はリン酸ジエステル結合あるいはその類似物により結合され、単量体単位で、例えば、８〜１２ないし数百、例えば１００〜２００、あるいはそれ以上の範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。適切な核酸分子がＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１））により記述されたアミド亜リン酸法、あるいはＭａｔｔｅｕｃｃｉら、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１））によるトリエステル法（これら両方法は、参照により本明細書に組み込まれる）、あるいは商品化された自動オリゴヌクレオチド合成装置の使用といった他の化学方法によっても調合され得る。
本明細書で使用されている用語「ヌクレオチド」は、塩基−糖−リン酸塩の組み合わせを意味する。ヌクレオチドは、核酸シークエンス（ＤＮＡとＲＮＡ）の単量体単位である。ヌクレオチドという用語には、リボヌクレオシド三リン酸エステルＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、あるいはそれらの誘導体といったデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステルが含まれる。そのような誘導体には、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰと７−ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、およびこれらを含む核酸分子でのヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体を含む。本明細書で使用されているヌクレオチドという用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を意味する。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されている用語「ポリメラーゼ」は、別の鎖をテンプレートとして使用し個々のヌクレオチドを連結して、長鎖を形成する酵素を意味する。ポリメラーゼには２種類あり、それらはＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ、そしてＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼである。これらの２種類には、どの種類の核酸がテンプレートとして機能することができ、どの種類の核酸が形成されるかに応じて、多数のポリメラーゼの亜種が存在する。
本明細書で使用されている「ポリメラーゼ連鎖反応」あるいは「ＰＣＲ」とは、非特定ＤＮＡが過剰に存在する場合でも、生体内で特定の標的ＤＮＡを複製する技術を意味する。標的ＤＮＡにはプライマーが添加され、ここでプライマーは、ヌクレオチドと典型的にはＴａｑポリメラーゼなどを使用して標的ＤＮＡ複製を開始する。温度を循環させることにより、標的ＤＮＡは編成と複製を反復する。標的ＤＮＡの単一複製は、他の無作為のＤＮＡと混在していても増幅され、数十億個の複製物に増幅され得る。ポリメラーゼ連鎖反応を利用して、ごく少量のＤＮＡを検出測定し、カスタマイズされたＤＮＡ片を作成することが可能である。ある場合には、ＰＣＲの代わりに線形増幅方法が適用されることがある。
本明細書で使用されている用語「多型性」は、遺伝子座における遺伝変化あるいは変異を意味し、これは、一塩基多型（ＳＮＰ）、メチル化差、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）といった、特定の遺伝子座を示すことがあるが、これらには限定されない。
一般的に、「プライマー」は、例えばＤＮＡ延長、核酸連結、および／あるいはポリメラーゼ連鎖反応の合成やプライマー延長技術での合成といったステップにおける合成に抗原刺激を与えるために使用されるオリゴヌクレオチドである。プライマーはまた、ハイブリッド形成技術において、特定の核酸領域の検出のためにオリゴヌクレオチドを捕捉するよう、核酸領域の相補性を提供する手段として使用することができる。
本明細書で使用されている用語「研究ツール」とは、製薬学および／あるいは生物学治療学を含む、学術的あるいは産業的な科学探究のため利用される本発明のいかなる構成あるいはシステムをも意味する。本発明の研究ツールは、治療学あるいは規制からの認可を得る意図ではなく、むしろ、本発明の研究ツールは、規制上要求される申請を支持するための情報を得るために実施されるいかなる活動をも含む、研究の促進および開発の支援を意図する。
用語「試料」とは、ウイルス、バクテリア、カビ、植物および動物、特に哺乳類を含むがこれらには限定されない、生体の遺伝情報の全部または一部を含む任意の試料という意味である。遺伝学的試料内で照合することができる遺伝情報は、ゲノムＤＮＡ（コード領域と非コード領域の両方）、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらのそれぞれから派生する核酸生成物を含む。このような核酸生成物には、ｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡ、あるいは分析物質を増加させるための前増幅生成物が含まれる。
用語「標的ゲノム領域」とは、完全遺伝子、遺伝子内部領域、遺伝子座群または単一遺伝子座を含む、遺伝子の全部または一部を意味する。
発明の詳細な記述
本明細書に記述される技術を実施するには、特に断りのない場合は、有機化学、高分子技術、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および配列技術の従来技術および記述を応用できるが、これらは当業者には周知である。このような従来技術には、高分子配列合成、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成と核酸連結、並びに標識を用いたハイブリッド形成検出が含まれる。適切な技術の特定の説明には、本明細書の例を参照することができる。しかしながら、勿論、他の等価な従来手順もまた利用することもできる。このような従来手順およびそれらの記述は、以下の標準的な実験室説明書から見出すことができる。Ｇｒｅｅｎら編集、（１９９９），Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（ゲノムアッセイ：実験室説明書シリーズ）（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ編集、（２００７），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（遺伝子変異：実験室説明書）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編集、（２００３），ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（遺伝子変異：実験室説明書）；ＢｏｗｔｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（２００３）、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ；Ｍｏｕｎｔ（２００４），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（バイオインフォマティクス：シークエンスおよびゲノムアッセイ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ およびＲｕｓｓｅｌｌ（２００６）、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニングからの総合プロトコル：実験室説明書）、並びにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室説明書）（以上すべてＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 出版）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生化学）（４版）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．；Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（オリゴヌクレオチド合成：実用的アプローチ）”１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（レーニンジャー、生化学原理）、編集３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；並びに Ｂｅｒｇら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生化学）、編集５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、これらすべては、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および付記特許請求の範囲において使用されているように、特に断らない限り、単数形表現は複数形表現をも含むことに注意する。従って、例えば、「対立遺伝子」とは、各種シークエンス多様性を有する対立遺伝子の１つ以上のコピーを意味しており、「検出システム」とは、当業者に既知の等価なステップおよび方法を含むと解釈される、などである。
他に定義されない場合、本明細書で使用されている全科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解される意味と同義である。本明細書で言及されている全文献のすべては、本明細書に記述される本発明に使用され、または本発明と関連して使用され得る、装置、試薬、技術、方法論の記述と開示という目的を含むあらゆる目的のために参照により組み込まれる。
値範囲が提供される場合は、その範囲の上下限値間の介在値およびその説明された範囲において説明されるあるいは介在する値は、、本発明に含有されると理解される。これらのより小さい範囲の上下限値は、これらのより小さい範囲に独立して含まれ、かつ本発明に含有され得るが、記述された範囲内で特に排除される限界値に従うものとする。記述された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界値の両方のいずれかを除外した範囲も、本発明に含有される。
以下の記述においては、本発明のより完全な理解のために多数の特定詳細が規定されている。しかしながら、本発明は、これらの１つ以上の特別な詳細なしでも実現し得ることは、当業者には自明であろう。他の例においては、当業者には公知の機能や手順は、本発明を不明瞭にすることを回避するために記述されない。
発明一般
本発明は、アッセイ方法を提供して、核酸領域（遺伝子座、遺伝子座の組、並びに、例えば、染色体といった、より大きな標的ゲノム領域）のコピー数変化を識別し、該コピー数変化には、遺伝子試料での挿入、削除、転座、突然変異と多型性が含まれる。一つの局面においては、該アッセイ方法によって、指示核酸連結アッセイ、それに続く、配列に付着する標識化されたオリゴヌクレオチドの検出を用いた、試料中の２カ所以上の標的ゲノム領域に由来する遺伝子座が照合される。標識化されたオリゴヌクレオチドの定量化によって、試料中の特定の標的ゲノム領域に由来する検出された遺伝子座の個数同士の比較（例：単一染色体の２カ所以上の部分の比較や２個以上の異なる染色体同士の比較）、あるいは同一または異なる試料からの参照染色体との比較に基づいて、特定の標的ゲノム領域の異常なコピー数が決定される。
ある実施形態においては、該方法は、２カ所以上の標的ゲノム領域内の遺伝子座に選択的にハイブリッド形成する一組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを用いて、試料中の標的ゲノム領域の指示分析を使用する。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、直接的または間接的に核酸連結され、核酸連結生成物が得られる。第一標的ゲノム領域に付随した遺伝子座に対応する核酸連結生成物は、第一検出可能標識に付随し、また第二標的ゲノム領域に付随した遺伝子座に対応する核酸連結生成物は、第二検出可能標識に付随する。第一および第二検出可能標識が定量化されると、第一および第二標的ゲノム領域のそれぞれの相対頻度が決定され得る。本発明の特定の局面においては、該方法は、２カ所の標的ゲノム領域を識別するために用いられる、２つの異なる標識を使用する。本発明の他の局面においては、該方法は、３カ所の異なる標的ゲノム領域に対応する３つの異なる標識を使用する、などである。
該核酸連結生成物は、ハイブリッド形成、特に、該核酸連結生成物内に存在する捕捉領域に相補的な捕捉プローブの配列へのハイブリッド形成により検出される。特定の実施形態においては、該核酸連結生成物は、同一あるいは実質的に同様な捕捉プローブを有するという特質を含む「普遍配列」を用いて検出される。他の特定の実施形態においては、該配列は、共通するシークエンスを有する、２組以上の多重特質を含み、ここで各組は、例えば、１つの配列上の最大数百個の特質が実質的に同じシークエンスを有する配列であるような、異なるシークエンスを有する。いずれの場合においても、配列上の捕捉プローブは、核酸連結生成物の捕捉領域に相補的であり、遺伝子座あるいはその補体のシークエンスに相補的ではない。これらの配列を使用して、遺伝子座のシークエンスとは無関係に、任意の標識ゲノム領域に対する任意の遺伝子座を照合することが可能である。
該捕捉領域は好ましくは、試料中の遺伝子座を照合するために使用される固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド内の核酸連結生成物に導入される。ある好ましい実施形態においては、該捕捉領域は、使用された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で同じであるので、全遺伝子座に由来する核酸連結生成物あるいはアンプリコンやその切断生成物は、配列上の同じシークエンスの捕捉プローブに競合的にハイブリッド形成する。他の実施形態においては、該配列は、多数の異なる捕捉プローブにより構成され、異なる遺伝子座に由来する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組は異なる捕捉領域を含む。
図１は、本発明の例示的方法を図示する、フローチャート１００である。ステップ１０２において、試料が提供される。ステップ１０４において、標識結合領域を含む固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組が、該固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの、標的ゲノム領域内の遺伝子座へのハイブリッド形成を可能にさせる条件下にある試料に導入され、ステップ１０６においては、該オリゴヌクレオチドが該標的ゲノム領域にハイブリッド形成される。ステップ１０８においては、各組からの該ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは核酸連結され、核酸連結生成物が発生し、該生成物はステップ１１０において、核酸生成物に相補的なアンプリコンを生成する。ステップ１１２においては、該アンプリコンをハイブリッド形成配列に導入し、該配列上の捕捉プローブに競合的にハイブリッドを形成させる。ステップ１１４においては、標識化されたオリゴヌクレオチドの１組を該アンプリコンに導入し、該アンプリコン上の相補的シークエンスにハイブリッドを形成させる。選択肢として、該標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列上の捕捉プローブに核酸連結される（非表示）。ステップ１１６において、該標識が検出される。
各組のそれぞれの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、（図２に詳細に説明するように）選択された遺伝子座に相補的な領域を含む。各組の少なくとも１個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、更に捕捉領域を含み、この捕捉領域は、２カ所以上の標的ゲノム領域に照合するために使用された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのすべての組において同じであってもよく、あるいは２カ所以上の標的ゲノム領域に照合するために使用された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組の対において同じであってもよく、または個々の標的ゲノム領域に対して固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組の間で異なっていてもよい。加えて、実施形態に応じて、１組の１個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、検出可能標識あるいは、該検出可能標識を有する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに付随させるための標識結合領域を含む。特別な実施形態においては、該標識結合領域は、検出可能標識が付随する標識化されたオリゴヌクレオチドに相補的な領域であり得る。
ある実施形態においては、捕捉領域を含む各組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、該標識あるいは標識結合領域を含まず、言い換えれば、該組のもう一つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが標識あるいは標識結合領域を含む（例えば、図２、３と５〜８に示される例示的実施形態を見よ）；他の実施形態においては、各組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは捕捉領域を含み、また標識あるいは標識結合領域も含む（図４に示される例示的実施形態を見よ）。
ある特別な局面においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組は、第一標的ゲノム領域内の遺伝子座にハイブリッドを形成させるが、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組は、第二標的ゲノム領域内の遺伝子座にハイブリッドを形成させる。核酸連結し核酸連結生成物が発生した後、選択肢として該核酸連結生成物を普遍プライマーを用いて増幅してから、配列にハイブリッドを形成させる。他の実施形態においては、該増幅生成物は、切断され（例：制限エンドヌクレアーゼを用いて）、増幅生成物の一部は、ハイブリッド形成と検出のため、該配列に導入される。好ましい実施形態においては、標的ゲノム領域の照合に用いた固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの各組は、同じ標識あるいは標識結合領域を含む。言い換えれば、第一組のすべての固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが第一標識に付随し、第二組のすべての固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが第二標識に付随し、第三組のすべての固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが第三標識に付随する。
固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが直接標識化されると、核酸連結生成物、アンプリコンあるいはその切断生成物は、配列上の捕捉プローブにハイブリッドを形成させ、標識からの読み取りにより検出されることができる。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが、標識化されたオリゴヌクレオチド（「標識結合シークエンス」）に相補的な標識結合領域を代わりに含む場合は、標識化されたオリゴヌクレオチドは、検出前に核酸連結生成物あるいはアンプリコンに追加されなければならない。いずれの想定においても、標識は検出され定量化されて、各標識の相対頻度が決定される。各標識を定量化すると、各標的ゲノム領域の定量化が可能となる。
ある実施形態においては、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは実質的に同じ捕捉領域を含む。これらの実施形態においては、すべての標的ゲノム領域からのすべての遺伝子座に由来する核酸連結生成物は、配列上の捕捉プローブに相補的な同じ捕捉領域を共有するので、各標的ゲノム領域からの核酸連結生成物は競合的に普遍配列上の捕捉プローブにハイブリッド形成される。
他の実施形態においては、配列上の捕捉プローブは、異なる捕捉領域に相補的な多重シークエンスを含み、また該配列は、これらの異なる捕捉プローブを含む特質を含む。そのような実施形態のいくつかにおいては、各捕捉プローブは、特有の捕捉領域にハイブリッド形成され得る。他のそのような実施形態においては、異なるゲノム領域に由来する遺伝子座を表現する、２個以上の捕捉プローブは、単一捕捉領域にハイブリッドを形成させ得る。
他の実施形態においては、アッセイに応じて、同じまたは異なる標的ゲノム領域に由来する異なる遺伝子座を設定して、お互いに競合的にハイブリッドを形成させることができ、従って、同じ捕捉領域を含み、その一方で、同じまたは異なる標的ゲノム領域に由来する他の遺伝子座を設定し、お互いに競合的にハイブリッドを形成させることができる。
標的ゲノム領域は、染色体全体といった大きなゲノム領域であり得、あるいは単一染色体の部分領域または異なる染色体の部分領域で単一遺伝子座まで縮小されるような小さな領域でもあり得る。従って本発明は、染色体異数性や部分的染色体異数性、突然変異、ＳＮＰ、再配列、挿入および削除といったゲノム変異の検出に使用することができる。染色体全体が比較される場合は、第一ゲノム領域は、例えば、染色体２１とすると、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を用いて比較する、照合すべき全遺伝子座は染色体２１に由来することになる。
核酸連結アッセイにおいては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが選択された遺伝子座の最近接に結合する場合は、該固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは核酸連結され、標的ゲノム領域に特有な標識に付随する核酸連結生成物が得られる。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが遺伝子領域内の最近接には結合しない場合、すなわちハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間に間隙が存在する場合、プライマー延長および／あるいは一つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを用いて、この間隙を閉じることができる。オリゴヌクレオチドが直接、または延長操作もしくは架橋オリゴヌクレオチドの導入に続いて、連続的にハイブリッド形成されると、オリゴヌクレオチドは核酸連結され、標的ゲノム領域特有の標識が付随する核酸連結生成物が得られる。
ある特別な局面においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組は、第一染色体または第一標的ゲノム領域に選択的であり、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組は、異なる染色体または第二標的ゲノム領域に選択的である。図２は、標識化された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの各組が、異なる染色体上の遺伝子座にハイブリッド形成され、核酸連結生成物が捕捉プローブを含む配列上で競合的に評価される実施形態を示す。標識化された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの２組２０２、２０４が提供され、各組は、それぞれに選択された遺伝子座２１０、２１２に相補的であるシークエンスおよび標識２１４、２１６を含む第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド２０６、２０８を有し、また、それぞれに選択された遺伝子座２２２、２２４に相補的であるシークエンスおよび捕捉領域２２６、２２８を含む第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド２１８、２２０を有する。標識２１４、２１６は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのそれぞれの組に対して異なり、検出中に、第一標的ゲノム領域（この場合は第一染色体）と第二標的ゲノム領域（この場合は第二染色体）とを区別することができる。ステップ２３０においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組２０２、２０４が試料に導入され、２個の異なる染色体上の遺伝子座にハイブリッドを形成させる。ハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ２３６においては，固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが核酸連結され、捕捉領域２２６、２２８および標識２１４、２１６を含む核酸連結生成物２３８、２４０が得られる。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが遺伝子座内で隣接的にハイブリッド形成されているように図２に示されているが、間隙が存在し得、この間隙は、例えば、延長反応を使用して、あるいは固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で隣接的にハイブリッド形成する架橋オリゴヌクレオチドを使用して、充填することができる。ステップ２４２においては、核酸連結生成物２３８、２４０が、複数の捕捉プローブ２４６を含むハイブリッド形成配列２２４に導入され、ここで、核酸連結生成物２３８、２４０の捕捉領域２２６、２２８は、捕捉プローブ２４６に競合的にハイブリッド形成される。好ましい実施形態においては、２２６および２２８は実質的に同じシークエンスを有する。配列への核酸連結生成物のハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった核酸連結生成物が該配列から除外されることが好ましい（非表示）。次に、使用した標識種類に応じて適切な検出機構を使用して、標識２１４、２１６を検出することが可能であり、第一および第二染色体のそれぞれに対応する遺伝子座を定量化し、遺伝子試料中の染色体の存在と各染色体の量を決定することができる。
本発明に従えば、「ヌクレオチド」は標識化されない、あるいは公知技術により、検出可能に標識化され得る。蛍光標識およびそれらのオリゴヌクレオチドへの付着は、以下のような多数の文献に記述されている：Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（蛍光プローブおよび研究化学薬品ハンドブック）、編集９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ（２００２）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ（ＤＮＡプローブ）、編集２版、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（オリゴヌクレオチドと類似物：実用的アプローチ）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（生化学と分子化学の批判的総説）、２６：２２７−２５９（１９９１）；など。本発明に適用可能な他の方法論は、以下の参照例に開示されている：Ｆｕｎｇらの米国特許第４，７５７，１４１号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，１５１，５０７号；Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋの米国特許第５，０９１，５１９号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，１８８，９３４号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，３６６，８６０号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，８４７，１６２号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第４，３１８，８４６号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，８００，９９６号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，０６６，５８０号：Ｍａｔｈｉｅｓらの米国特許第５，６８８，６４８号；など。標識化はまた、以下の特許および特許刊行物で開示されたように、量子ドットを用いて実行することができる：米国特許第６，３２２，９０１号；第６，５７６，２９１号；第６，４２３，５５１号；第６，２５１，３０３号；第６，３１９，４２６号；第６，４２６，５１３号；第６，４４４，１４３号；第５，９９０，４７９号；第６，２０７，３９２号；第２００２／００４５０４５号；並びに第２００３／００１７２６４号。検出可能標識には、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が含まれる。ヌクレオチドの蛍光標識には、フルオレセイン、５−カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）（ピレニルルオキシトリスルホン酸）、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（商標）（２’，７’−ジフルオロフルオロセイン），ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（商標）（スルホローダミン１０１酸塩化物）、シアニンおよび５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が含まれ得るが、これらに限定されない。蛍光標識の特別例には、［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および米国カリフォルニア州フォスターシティー所在Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製の［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；米国イリノイ州アーリントンハイツ所在Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＤｅｏｘｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＦｌｕｏｒＸ−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ；米国インディアナ州インディアナポリス所在Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製 のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１５−ｄＡＴＰ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチル−ローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０−９−ｄＡＴＰ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄｄＵＴＰ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰ、および Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１５−２’−ｄＡＴＰ；および米国オレゴン州ユージーン所在Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製の染色体標識化されたヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）−７−ＵＴＰ（ピレニルオキシトリスルホン酸−７−ＵＴＰ），ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）−７−ｄＵＴＰ（ピレニルオキシトリスルホン酸−７−ｄＵＴＰ）、フルオロセイン−１２−ＵＴＰ、フルオロセイン−１２−ｄＵＴＰ、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（商標）４８８−５−ｄＵＴＰ（２’，７’−ジフルオロフルオロセイン−５−ｄＵＴＰ）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ＵＴＰ（（５−｛２−［４−（アミノメチル）フェニル］−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ｉ−５−ＵＴＰ））、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ｄＵＴＰ（（５−｛２−［４−（アミノメチル）フェニル］−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ｉ−５−ｄＵＴＰ））、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（商標）−５−ＵＴＰ（スルホローダミン１０１酸塩化物−５−ＵＴＰ）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（商標）−５−ｄＵＴＰ（スルホローダミン１０１酸塩化物−５−ｄＵＴＰ）、およびＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（商標）−１２−ｄＵＴＰ（スルホローダミン１０１酸塩化物−１２−ｄＵＴＰ）が含まれる。
本発明の特定の局面においては、試料に固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組を追加する前に、試料からの核酸を、例えば、ビオチンやストレプトアビジンといった結合対を用いて基板に付随させ、基板表面に遺伝子物質を付着させる、あるいは直接共有結合付着させる。簡潔に述べれば、結合対の第一構成部（例：ビオチン）は試料からの核酸に付随可能であり、また該核酸は、基板表面上の結合対の第二構成部（例：アビジンやストレプトアビジン）を介して基板に付着する。試料からの核酸の付着は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に続いて、ハイブリッドを形成しなかったオリゴヌクレオチドの除去および／あるいは遺伝子座へのオリゴヌクレオチドの架橋に役立ち得る。簡潔に述べれば、試料からの核酸をして固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成させてから、次にハイブリッド形成錯体を基板に結合させることができる。別方法としては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成以前あるいは同時に、試料からの核酸を固体支持体に付着させることができる。いずれかの方法で、ハイブリッド形成と核酸の固体支持体への付着に続いて、あるいはハイブリッド形成させたオリゴヌクレオチドの核酸連結生成に続いて、例えば、洗浄や、Ｗｉｌｌｉｓらの米国特許第７，７００，３２３号と第６，８５８，４１２号に記述されているようなオリゴヌクレオチドの分解といった他の除去方法によって支持体表面を処理して、ハイブリッド形成されなかったあるいは核酸連結されなかったオリゴヌクレオチドを除去してもよい。２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが同じプローブ上にあり、核酸連結が１個の円形状となったプローブという結果になる場合には、オリゴヌクレオチドの分解は好ましい局面である。次に、エクソヌクレアーゼを使用して、過剰なプローブや試料ＤＮＡを含む、非円形化した核酸を分解することができる。
核酸を結合対に付随させるために使用することができる方法が多数存在する。例えば、ランダム光ビオチン標識化、ビオチンによる末端標識化、ビオチン標識化された核酸による複製、ビオチン標識化されたプライマーによる複製を含む、多数の方法をビオチンによる核酸標識化に使用することができる。
本発明においては、各染色体に対してアッセイされた遺伝子座の個数は、アッセイされた標的ゲノム領域に当たり２〜２０，０００以上であり得る。好ましい局面においては、標的ゲノム領域当たりの遺伝子座の個数は、４８〜１０００である。別の局面においては、標的ゲノム領域当たりの遺伝子座の個数は、少なくとも１００である。別の局面においては、標的ゲノム領域当たりの遺伝子座の個数は、少なくとも４００である。別の局面においては、標的ゲノム領域当たりの遺伝子座の個数は、１０００未満である。別の局面においては、標的ゲノム領域当たりの遺伝子座の個数は、少なくとも５００であるが２０００以下である。
図２に示される実施形態は、検出可能標識に直接結合した固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを使用するが、その代わり、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドやアンプリコンあるいはその切断されたアンプリコン（下述）の核酸連結生成物へハイブリッド形成された、分離され標識化されたオリゴヌクレオチドにより、１個の標識が提供されてもよい。選択肢としては、標識化されたオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブに核酸連結され、それに続いて固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドやアンプリコンや切断されたアンプリコンにハイブリッド形成される。図３は、本発明の一つの実施形態を示し、ここで固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが、対象とする遺伝子座にハイブリッド形成され、核酸連結され、増幅され、標識化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成とその標識の検出の前に、１個の配列に導入される。図３に示される方法においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド３０２、３０４が提供され、ここで、これらの組はそれぞれ、選択された遺伝子座３１０、３１２に相補的なシークエンス、標識結合領域３１４、３１６、そして普遍プライマー領域３１８、３２０を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチ３０６、３０８；並びに選択された遺伝子座３２６、３２８に相補的なシークエンス、捕捉領域３３０、３３２、そして普遍プライマー領域３３４、３３６を含む、第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド３２２、３２４を含む。多くの実施形態においては、該捕捉領域３３０、３３２は、実質的に同じシークエンスであり、両方とも、１個の配列上の同じ捕捉プローブにハイブリッド形成される。標識結合領域３１４、３１６は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組３０２、３０４のそれぞれに対し異なるシークエンスを含み、各標的ゲノム領域に対する遺伝子座に付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にするが、その一方で、核酸連結生成物の、１個の配列上の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能にさせるためには、捕捉領域３３０、３３２は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組３０２、３０４の両方に対し同じである。ステップ３３８においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組３０２、３０４が試料に導入され、異なるゲノム領域の遺伝子座３４０、３４２へのイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが遺伝子試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。
ステップ３４４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組３０２、３０４は核酸連結され、核酸連結生成物３４６、３４８が得られる。ステップ３５８においては、普遍プライマー領域３１８、３３４、３２０、３３６にそれぞれ結合する普遍プライマー３５０、３５２、３５４、３５６が核酸連結生成物３４６、３４８に導入され、また、捕捉領域３６４、３６６および標識結合領域３６８、３７０をそれぞれ含むアンプリコン３６０、３６２を生成する。ある好ましい実施形態においては、３５０と３５４は、実質的に同じシークエンスを有し、このシークエンスは３１８と３２０の両方に相補的であり、また、３５２と３５６は、実質的に同じシークエンスを有し、このシークエンスは３３４と３３６の両方に相補的である。アンプリコンが、複数の捕捉プローブ３７４を含むハイブリッド形成配列３７２に導入され、ここで、アンプリコン３６０、３６２の捕捉領域３６４、３６６は、捕捉プローブ３７４に競合的にハイブリッド形成される。ステップ３７８においては、標識化されたオリゴヌクレオチド３８０、３８２が配列３７２に導入され、ここでアンプリコン３６０、３６２の標識結合領域３６８、３７０は、標識化されたオリゴヌクレオチド３８０、３８２の標的認識領域３８４、３８６にハイブリッド形成される。選択肢として、該標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列上の捕捉プローブに核酸連結される（非表示）。標識化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に続いて、ハイブリッドを形成しなかった標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列から分離されることが好ましい（非表示）。該標識が次に検出され、また標的ゲノム領域のそれぞれに対応する遺伝子座が定量化され、試料中の各標的ゲノム領域の存在と個数に関する情報を提供することができる。
図３に示されるような特定の実施形態においては、核酸連結生成物、またはアンプリコンもしくは切断アンプリコンが配列とハイブリッド形成した後に、標識化されたオリゴヌクレオチドは、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド、またはアンプリコンもしくはその切断アンプリコンとハイブリッド形成する。他の特定の実施形態においては、標識化されたオリゴヌクレオチドは、配列とのハイブリッド形成前に、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド、またはアンプリコンもしくはその切断アンプリコンとハイブリッド形成する。
核酸連結生成物やそのアンプリコンのハイブリッド形成を促進するために、配列とのハイブリッド形成前に、核酸連結生成物やアンプリコンの大きさを縮小させることができる。特定の実施形態においては、核酸連結生成物を（例えば、制限エンドヌクレアーゼといった酵素切断機構を用いて）切断して、検出するべき核酸連結生成物の大きさを縮小し、例えば捕捉領域と、検出に利用可能な標識結合領域とをそのままにする。切断された核酸連結生成物や切断されたアンプリコンの検出は、核酸連結生成物全体の検出の代わりとして役立つ。
核酸連結生成物やアンプリコンおよび／あるいは標識化された核酸連結生成物の大きさを縮小すると、例えば、ハイブリッド形成運動学が改善し、また立体阻害を減少させることにより、該配列上への結合を促進することが可能である。特定の実施形態においては、核酸連結生成物の大きさの縮小は、制限酵素を用いて核酸連結生成物またはアンプリコンを切断することにより達成される。例えば、特定の実施形態においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの各組内の１個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは捕捉領域あるいは標識結合領域に近接する（あるいは、実施形態に応じて、その相補的シークエンスに対応する）制限酵素認識部位を含む。ハイブリッド形成と検出に利用可能な標識や標識結合領域および捕捉領域をそのままにして、制限酵素認識部位で核酸連結生成物を切断するために制限酵素を使用することができる。制限酵素認識部位は、捕捉領域、従って切断後の検出に利用可能な標識結合領域もそのままにするような任意部位であり得る。例えば、制限酵素認識部位は、捕捉領域や標識結合領域の最近接、あるいは捕捉領域や標識結合領域のいずれかから塩基数個に相当する距離内に位置し得る。標識化されたオリゴヌクレオチドの核酸連結生成物やアンプリコンとのハイブリッド形成前に、切断されることが好ましい。特定の他の局面においては、検出のための配列へのハイブリッド形成後に切断が起こる。
図４は、本発明の特別な実施形態を示しており、ここで核酸連結生成物が配列とのハイブリッド形成前に切断される。図４に示される方法においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド４０２、４０４が提供される。各組は、遺伝子座４１０、４１２に相補的なシークエンス、標識結合領域４１４、４１６、捕捉領域４１８、４２０、普遍プライマー領域４２２、４２４、および制限酵素認識部位領域４２６、４２８を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド４０６、４０８を含む。標識結合領域４１４、４１６は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド４０２、４０４の各組に対し異なるシークエンスを含み、各標的ゲノム領域に対する遺伝子座に付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にするが、その一方で、ハイブリッド形成配列の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能させるためには、この実施形態における捕捉領域４１８、４２０は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド４０２、４０４の両組に対し同じである。制限酵素認識部位４２６、４２８は、実施形態に応じて、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド４０２、４０４の両組に対し同じである、あるいは各組に対し異なり得る。
ステップ４４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組４０２、４０４が試料に導入され、選択された遺伝子座４４４、４４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成および／あるいは核酸連結に続いて、ハイブリッド形成しなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ４４８においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組４０２、４０４は核酸連結され、核酸連結生成物４５０、４５２が得られる。ステップ４５４においては、普遍プライマー領域４２２、４３８、４２４、４４０にそれぞれ結合する普遍プライマー４５６、４５８、４６０、４６２が核酸連結生成物４５０、４５２に導入されて、標識結合領域４７２、４７４、捕捉領域４６８、４７０および制限酵素認識部位４７６、４７８をそれぞれ含むアンプリコン４６４、４６６を生成する。ステップ４８０においては、制限酵素認識部位４７６、４７８のそれぞれに結合する制限酵素がアンプリコン４６４、４６６に導入され、標識結合領域４７２、４７４および捕捉領域４６８、４７０を含む切断アンプリコン４８２、４８４をそのままにして、アンプリコンを切断する。またステップ４８０においては、核酸連結生成物４８２、４８４が、複数の捕捉プローブ４８８を含むハイブリッド形成配列４８６に導入され、ここで、切断アンプリコン４８２、４８４の捕捉領域４６８、４７０は、捕捉プローブ４８８に競合的にハイブリッドを形成する。ステップ４９２においては、標識化されたオリゴヌクレオチド４９２、４９４が配列４８６に導入され、ここでアンプリコン４８２、４８４それぞれの標識結合領域４７２、４７４は、標識化されたオリゴヌクレオチド４９２、４９４の標的認識領域４９６、４９７とハイブリッドを形成する。標識化されたオリゴヌクレオチドと切断アンプリコンとのハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列から分離されることが好ましい（非表示）。標識化されたオリゴヌクレオチド４９２、４９４の標識４９８、４９９が次に検出され得、標的ゲノム領域のそれぞれに対応する切断アンプリコンが定量化されて、試料中の標的ゲノム領域の存在と個数に関する情報を提供することができる。図４においては、標識化されたオリゴヌクレオチドの４９２、４９４は捕捉領域４８８に隣接し、従って、標識化されたオリゴヌクレオチド４９２、４９４は捕捉プローブ４８８に核酸連結されて、例えば、結合安定性が増大し得る。次に、切断アンプリコン４８２、４８４が洗浄により配列から排除され得る。
図５は、本発明のもう一つの特別な実施形態を示しており、ここで核酸連結生成物が配列とのハイブリッド形成前に切断される。図５に示される方法においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド５０２、５０４が提供される。各組は、遺伝子座５１０、５１２に相補的なシークエンス、標識結合領域５１４、５１６、捕捉領域５１８、５２０、普遍プライマー領域５２２、５２４および制限酵素認識部位領域５２６、５２８を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド５０６、５０８を含む。標識結合領域５１４、５１６は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド５０２、５０４の各組に対し異なるシークエンスを含み、異なる標的ゲノム領域のそれぞれに付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にするが、その一方で、１個のハイブリッド形成配列の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能にさせるためには、この実施形態における捕捉領域５１８、５２０は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド５０２、５０４の両組に対し同じである。制限酵素認識部位５２６、５２８は、実施形態に応じて、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド５０２、５０４の両組に対し同じ、あるいは各組に対し異なり得る。
ステップ５４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組５０２、５０４が試料に導入され、遺伝子座５４４、５４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ５４８においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組５０２、５０４は核酸連結され、核酸連結生成物５５０、５５２が得られる。ステップ５５４においては、普遍プライマー領域５５６、５５８、５６０、５６２にそれぞれ結合する普遍プライマー５２２、５３８、５２４、５４０が核酸連結生成物５５０、５５２に導入されて、標識結合領域５７２、５７４、捕捉領域５６８、５７０および制限酵素認識部位５７６、５７８をそれぞれ含むアンプリコン５６４、５６６を生成する。ステップ５８０においては、制限酵素認識部位５７６、５７８のそれぞれに結合する制限酵素がアンプリコン５６４、５６６に導入され、また、標識結合領域５７２、５７４および捕捉領域５６８、５７０を含む切断アンプリコン５８２、５８４をそのままにして、アンプリコンを切断する。切断生成物５８０がそれらの各標識５８２、５８４に結合し、複数の捕捉プローブ５８８を含むハイブリッド形成配列５８６に導入され、ここで、切断アンプリコンの捕捉領域５６８、５７０は、捕捉プローブ５９０に競合的にハイブリッド形成する。
本発明の本実施形態の特定の局面において（また図４に関連して図示および議論されたように）、標識化されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成配列の捕捉プローブに核酸連結され、結合安定が増大し得る。本実施形態には、標識化されたオリゴヌクレオチドおよび捕捉プローブの並置が要求される。捕捉プローブ、切断核酸連結生成物、および標識化されたオリゴヌクレオチドを構成して、標識化されたオリゴヌクレオチドと捕捉プローブがお互いに隣接してハイブリッド形成され得る、または標識化されたオリゴヌクレオチドと捕捉プローブが延長され得る、あるいは本明細書で記述されているように、間隙充填されたオリゴヌクレオチドを使用することができるようになる。
コピー数変異の検出
上述のように、本発明は、試料中の標的ゲノム領域（比較的短いゲノム領域、より大きいゲノム領域、染色体の内部領域および染色体）のコピー数変化、突然変異、多型性を特定する方法を提供する。本発明は、母体および胎児ＤＮＡの両方を含む母体試料中の胎児染色体異数性を特定するのに特に強力な方法を提供する。
本発明の方法はまた、複数染色体上の複数遺伝子座を分析し、並びに特定の染色体に由来する遺伝子座の頻度を平均するために使用することができる。頻度の正規化あるいは標準化は、１個以上の標的シークエンスに対して実行され得る。
ある局面においては、本発明の方法は、例えば、１つの標識の全般的信号を検出してから、ある染色体上の遺伝子座の総和を別の染色体上の遺伝子座の総和と比較することにより、母体血清試料といった混合試料中の両対象の各染色体上の遺伝子座の頻度を合計するために使用することによって、染色体異常が存在するかを判断することが可能である。別方法としては、各染色体上の遺伝子座の一部を分析して、染色体異常が存在するかを判断することが可能である。同一染色体からの領域あるいは異なる染色体からの領域間でこれを比較することができる。
遺伝子座の頻度決定に使用するデータを使用して、実験誤差が原因で生じた、あるいは特定の試料中で原因不明の遺伝的偏りが原因でレベルが昇降した外れ値データを排除するができる。一例においては、総和に使用したデータから、１つ以上の試料中で特に上昇した頻度を有するＤＮＡ領域は排除し得る。別の例においては、総和に使用したデータから、１つ以上の試料中で遺伝子座が特に低含有量であると見出された場合は、それを排除し得る。
遺伝子座の一部はランダムに選択することができるが、染色体異常が存在するかを判断するために統計的に有意な結果を得られる程度に十分な個数でなければならない。混合試料中および異なる配列で遺伝子座の異なる部分を多重分析することにより、より大きいな統計検定力を得ることができる。例えば、染色体２１に対し遺伝子座が１００個、染色体１８に対し遺伝子座が１０個存在する場合、異なる配列上の各染色体に対し１００個より少ない遺伝子座を評価する、一連の分析を実行することができる。この例においては、標的シークエンスは選択的には排除されない。
特定の染色体で検出可能な異なる遺伝子座の個数は、母体試料中の胎児遺伝子座の一般的再現、母体試料中の胎児遺伝子座の一般的再現の劣化率、試料調整方法といった要因を含む、様々な要因に依存し得る。
直列核酸連結アッセイ
特定の局面においては、本発明の方法は、例えば、対象とする染色体あるいは参照染色体といった標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド、並びに第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの間でかつ隣接する遺伝子座の領域に相補的な、１個以上の短い架橋オリゴヌクレオチド（「スプリント」オリゴヌクレオチドあるいは「間隙」オリゴヌクレオチド、「間隙充填」オリゴヌクレオチドとも呼ばれる）を使用することを含む直列核酸連結方法を利用する。選択された遺伝子座上にハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間でのこれらのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成、その後のこれらのオリゴヌクレオチドの核酸連結による核酸連結生成物が提供され、この生成物が必要に応じて増幅のテンプレートとなる。核酸連結が起こるために、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドや架橋オリゴヌクレオチドと選択された遺伝子座の間に、両方の核酸連結部位で完全な相補性が存在する必要があるので、重複核酸連結アッセイは、単一オリゴヌクレオチド・プローブの使用、あるいは２個のみの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの使用よりも分別的である。
好ましい局面においては、直列核酸連結方法での固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で隣接的にハイブリッド形成される、単一の架橋オリゴヌクレオチドが使用される。別方法として、ある局面においては、直列核酸連結方法は、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域間で核酸領域内で隣接してハイブリッド形成される、１組の２個以上の架橋オリゴヌクレオチドを有する２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組を用いる。これらの架橋オリゴヌクレオチドはお互いに隣接し、また固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドにも隣接してハイブリッド形成される。これら２個の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドおよび２個の架橋オリゴヌクレオチドは、核酸連結反応中に核酸連結し、結果として単一の核酸連結生成物が得られ、これが増幅のテンプレートとして、究極的には検出用テンプレートの役割を果たす。
本発明の他の局面においては、該方法は選択された遺伝子座内の非隣接領域に結合する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組を利用しており、また、核酸連結ステップ前に固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの隣接する組を得るためにプライマー延長が利用される。別方法としては、該方法は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組、１個以上の架橋オリゴヌクレオチドと１個以上のハイブリッド形成済みオリゴヌクレオチドの延長を利用することができる。延長と核酸連結を組み合わせると、増幅用テンプレートそしてその後検出と定量化にも有用な核酸連結生成物が提供される。
好ましい局面においては、本発明の方法は、選択された遺伝子座のそれぞれに対して３個以上のオリゴヌクレオチドによる多重反応を利用する。この一般的局面は、図６に示され、ここでは２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド６０２、６０４が提供される。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの各組６０２、６０４は、それぞれが、対象核酸領域６１０、６１２に相補的なシークエンスを含む第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド６０６、６０８、標識結合領域６１４、６１６と普遍プライマー領域６１８、６２０、並びに、それぞれが、対象核酸領域６２６、６２８に相補的なシークエンスを含む第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド６２２、６２４、捕捉領域６３０、６３２と普遍プライマー領域６３４、６３６を含む。ステップ６３８においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組６０２、６０４が試料に導入され、標的ゲノム領域内の遺伝子座の相補的部分６４０、６４２に特異的にハイブリッド形成される。ハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが遺伝子試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの別方法としての除去は、以下の核酸連結ステップ後の遺伝子試料の残りの部分からの分離であり得る。ステップ６４４においては、架橋オリゴヌクレオチドの組６４６、６４８は、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド６０６、６０８と第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド６２２、６２４との間の遺伝子座の領域に導入され、そこに特異的にハイブリッド形成することが可能になる。別方法としては、架橋オリゴヌクレオチド６４６、６４８が固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに同時に導入することができる。
ステップ６５０においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組６０２、６０４および架橋オリゴヌクレオチド６３０、６３２が核酸連結され、遺伝子座６４０、６４２に相補的な核酸連結生成物６５２、６５４を得る。またステップ６５０においては、普遍プライマー領域６１８、６３４、６２０、６３６にそれぞれ結合する普遍プライマー６５８、６６０、６６２、６６４が核酸連結生成物６５２、６５４に導入され、また、核酸連結生成物を増幅して、標識結合領域６６６、６６８および捕捉領域６６２、６６４を含むアンプリコン６７８、６８０を生成する。特定の好ましい実施形態においては、普遍プライマー６５８と６６２は、実質的に同じシークエンスを有し、このシークエンスは６１８と６２０の両方に相補的であり、また、普遍プライマー６６０と６６４は、実質的に同じシークエンスを有し、このシークエンスは６３４と６３６の両方に相補的である。アンプリコン６７８、６８０が、複数の捕捉プローブ６７２を含むハイブリッド形成配列６７０に導入され、ここで、アンプリコン６５８、６６０の捕捉領域６６２、６６４は、捕捉プローブ６７２上で標的捕捉領域６７４に競合的にハイブリッド形成される。ステップ６７６においては、標識化されたオリゴヌクレオチド６８８、６９０の標的認識領域６８２、６８４は、アンプリコン６７８、６８０の標識結合領域６６６、６６８に特異定にハイブリッド形成される。標識化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列から除外されることが好ましい（非表示）。次に、標識化されたオリゴヌクレオチド６８８、６９０の標識６８６、６８８が検出され、また該遺伝子座が選択肢として定量化され、遺伝子試料中の各ゲノム領域の存在と個数に関する情報を提供することができる。
特定の局面においては、該架橋オリゴヌクレオチドは、各部位で縮退を有するオリゴヌクレオチドの混合物より成り得、従って、そのような架橋オリゴヌクレオチドの混合物は、与えられた長さの架橋が要求される多重アッセイにおける全反応と和合性がある。一例においては、該架橋オリゴヌクレオチドはランダマーであり、ここで架橋オリゴヌクレオチドのすべての組み合わせが合成される。一例として、５−塩基オリゴヌクレオチドが使用される場合は、一義的な架橋オリゴヌクレオチドの個数は、４＾５＝１０２４になるであろう。すべての可能な架橋オリゴヌクレオチドが反応に存在するであろうから、この値は標的領域の個数とは独立である。別の局面においては、該架橋オリゴヌクレオチドは様々な長さとなることができるので、オリゴヌクレオチドの混合物は、異なる長さの架橋オリゴヌクレオチドを必要とする核酸連結反応とは和合性がある。
更に別の局面においては、架橋オリゴヌクレオチドは、特別な部位（即ち公知の多型性部位）で縮退を有し、また直列核酸連結反応は、該多型性部位で提供される特別なシークエンスを必要とするものに限定され得る。
別例においては、架橋オリゴヌクレオチドは、間隙内のシークエンスに一致するよう特別に合成される。一例として、５−塩基オリゴヌクレオチドが使用される場合は、アッセイで提供される一義的なオリゴヌクレオチドの個数は、遺伝子座の個数以下であろう。間隙シークエンスにが２個以上の遺伝子座間で共有される場合は、架橋オリゴヌクレオチドの個数は遺伝子座の個数より少なくなり得る。この例の一つの局面においては、意図的に遺伝子座を選択し、そして特別な間隙シークエンスを取れば、該間隙シークエンス内で可能な限り多数の同一の重複が存在し、多重反応に必要な架橋オリゴヌクレオチドの個数を最小化することができる。
別の局面においては、架橋オリゴヌクレオチドの各末端で、すべての遺伝子座が同じ塩基（群）を共有するよう、架橋オリゴヌクレオチドのシークエンスが設計され、遺伝子座が選択される。例えば、すべての間隙が最初の部位で１個の「Ａ」塩基が共有され、間隙の最後の部位で１個の「Ｇ」塩基が共有されるように遺伝子座とそれらの間隙を選択することができる。調査したゲノム、その領域でのシークエンス変化の尤度といった要因に基づいて、最初と最後の塩基の任意の組み合わせを利用することができる。この例の特別な局面においては、架橋オリゴヌクレオチドは、架橋オリゴヌクレオチドの最初と最後の部位に特別なヌクレオチドを有しながら、架橋オリゴヌクレオチドの内部部位での塩基のランダム縮退により合成されることが可能である。５−塩基長の場合、第二、三、四部位は縮退しており、架橋ヌクレオチド末端での特別なヌクレオチドは固定されるであろう。この場合、一義の架橋オリゴヌクレオチドの個数は、４＾３＝６４となるであろう。
ヒトゲノムにおいては、ジヌクレオチドＣＧの頻度は、そのどれのモノヌクレオチドによる期待値よりかなり小さい。これは、架橋オリゴヌクレオチドの特定の混合物を用いたアッセイの特殊性を向上させる機会を示している。この局面においては、架橋オリゴヌクレオチドを５個のＧと３個のＣを有するように選択することが可能である。このように塩基を選択することより、各オリゴヌクレオチドがヒトゲノムでの頻度は高いが２個の架橋オリゴヌクレオチドがお互いに隣接してハイブリッド形成する事象は希少にすることが可能である。従って、複数のオリゴヌクレオチドが、アッセイでは標的ではないゲノムの部位で核酸連結される確率は減少する。
特定の局面においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組のハイブリッド形成後に架橋オリゴヌクレオチドが反応に追加され、続いて、選択肢として、ハイブリッド形成されていない固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドをすべて除去する。ハイブリッド形成反応条件は好ましくは、核酸領域に完全には相補的ではないオリゴヌクレオチドの誤差が著しいハイブリッドの形成を防ぐために、架橋オリゴヌクレオチドのＴｍ付近で最適化される。架橋オリゴヌクレオチドのＴｍが固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドより顕著に低い場合は、好ましくは、架橋オリゴヌクレオチドがリガーゼ反応の一部として追加される。
短い架橋オリゴヌクレオチドを使用する利点は、架橋オリゴヌクレオチドの全塩基が間隙シークエンスと一致する場合のみ、いずれかの末端での核酸連結が起こる可能性が高いことである。短い架橋オリゴヌクレオチドを使用する更なる利点は、必要な異なる架橋オリゴヌクレオチドの個数は遺伝子座の個数より少なく、オリゴヌクレオチドの有効濃度を増加させて完全一致を迅速に起こさせることである。架橋オリゴヌクレオチドの個数がより少ないと、コスト節約と品質管理上の利点が提供される。固定された最初と最後の塩基とその間でのランダム塩基を使用する利点には、反応中の総架橋オリゴヌクレオチドの個数を低減させながらも、より長い架橋オリゴヌクレオチドをより特異的に使用する能力が含まれる。
多型性の検出
ある局面においては、本発明の方法は多型性を含む１カ所以上の標的ゲノム領域を検出する。ある実施形態においては、この方法論は、例えば、母体対胎児といった特定の対立遺伝子の識別のために設計される必要はないが、むしろ標的ゲノム領域内の遺伝子座に対応する異なる対立遺伝子が本発明の定量化方法に確実に含まれるように設計される。しかしながら、特定の局面においては、標的ゲノム領域内の対立遺伝子をすべて計数し、並びに、例えば、母体試料中に含まれる胎児ＤＮＡの量計算、あるいは癌患者から採取した遺伝子試料中の特定の突然変異を有する対立遺伝子の割合の特定、といった対立遺伝子情報を共に使用することが望ましい場合がある。従って、本発明の方法は、定量化を通じてコピー数変異を直接決定するためのＳＮＰ含有遺伝子座の検出、並びに該アッセイの全般的効率を確実にするためのＳＮＰの検出の両機構を抱合することを意図する。
それ故、本発明の特定の局面においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドあるいは遺伝子座の検出のために用いられる架橋オリゴヌクレオチドを通じて、対立遺伝子分別が提供される。そのような実施形態においては、標識結合領域は、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドあるいは第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのいずれかに埋め込まれた対立遺伝子指標として役立ち得る。ある特別な局面においては、対立遺伝子指標（例：標識結合領域）は、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの両方に存在し、遺伝子座内で２つ以上の多型性が検出される。そのような局面において使用される固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの個数は、選択された遺伝子座を照合される対立遺伝子の個数に対応し得、対立遺伝子指標に付随する標識の検出は、遺伝子試料中の特定の対立遺伝子の存在と量、または不在を検出し得る。
図７は、配列への競合ハイブリッド形成を用いて多型性が検出されるという、本発明の一つの局面を示す。図７においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７０２、７０４が提供され、ここで、各組の第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７０６、７０８は対象遺伝子座７１０、７１２に相補的であり、例えば、それぞれＡ／ＴまたはＧ／Ｃ ＳＮＰおよび標識７１４、７１６を含む。第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７２２、７２４は、選択された遺伝子座７２６、７２８に相補的なシークエンス、および捕捉領域７３０、７３２を含む。ある実施形態においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７０６は、ＳＮＰ７１８と７２０および標識７１４と７１６を除いて、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７０８と同じであり、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７２２は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド７２４と同じである。言い換えれば、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間での差異は、照合されたＳＮＰであり、ＳＮＰに対応する標識である。ステップ７３４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組７０２、７０４は、試料に導入され、ＳＮＰ７４０、７４２を含む対象遺伝子座７３６、７３８への特異的なハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成あるいは核酸連結に続いて、ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが、遺伝子試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ７４４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組７０２、７０４は核酸連結され、核酸連結生成物７４６、７４８が得られる。この実施形態においては、対立遺伝子の特有のヌクレオチドが核酸連結部位に近い限り、核酸連結は対立遺伝子に特有であることに留意することが重要である。典型的には。対立遺伝子特有のヌクレオチドは、核酸連結末端の５個のヌクレオチド範囲内でなければならないが、しかしながら、好ましい局面においては、対立遺伝子特有のヌクレオチドは終端塩基である。
ステップ７５０においては、核酸連結生成物７４６、７４８が、複数の捕捉プローブ７５４を含むハイブリッド形成配列７５２に導入され、ここで、核酸連結生成物７４６、７４８の捕捉領域７３０、７３２は、捕捉プローブ７５４に競合的にハイブリッド形成される。核酸連結生成物のハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった核酸連結生成物が、遺伝子試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。標識７１４、７１６を次に検出することができ、また標的ゲノム領域のそれぞれに対応する遺伝子座に特有な対立遺伝子が定量化され、遺伝子試料中の各対立遺伝子と標的ゲノム領域の存在と個数に関する情報が提供される。
別の実施形態においては、対立遺伝子特有のヌクレオチドは、第一および第二固定核酸塩基配列ヌクレオチドに配置され、架橋オリゴヌクレオチドを使用して連結生成物を得る。図８は、本発明のこの局面を示す。図、８において、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド８０２、８０４が提供され、ここで固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの両組は、同じ選択された遺伝子座での異なるＳＮＰを照合するように構成される。各組の第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド８０６、８０８は、例えば、それぞれＡ／ＴまたはＧ／Ｃ ＳＮＰを含む選択された遺伝子座８１０、８１２に相補的な１個のシークエンス、標識結合領域８１４、８１６、そして普遍プライマー領域に８１８、８２０を含み、また第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド８２６、８２８は、それぞれ選択された遺伝子座８３０、８３２に相補的な１個のシークエンス、捕捉領域８３４、８３６、そして普遍プライマー領域に８３８、８４０を含む。多型アッセイにおいては、第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド８２６と８２８は実質的に同じシークエンスを有し、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド８０６と８０８は、ＳＮＰ部位および標識結合領域８１４、８１６を除いて、実質的に同じシークエンスを有する。ステップ８４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組８０２、８０４は、試料に導入され、ＳＮＰ ８４８、８５０を含む遺伝子座８４４、８４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが遺伝子試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。
ステップ８５２においては、１組の架橋オリゴヌクレオチド８５４、８５６が試料に導入され、各組の第一および第二固定核酸塩基配列ヌクレオチド間の遺伝子座８４４、８４６へのハイブリッド形成を可能にする。好ましい実施形態においては、８５４および８５６は実質的に同じシークエンスを有する。ステップ８５８においては、ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成された架橋オリゴヌクレオチドが核酸連結され、核酸連結生成物８６０、８６２が得られる。ステップ８６４においては、普遍プライマー領域８１８、８３８、８２０、８４０にそれぞれ結合する普遍プライマー８６６、８６８、８７０、８７２が核酸連結生成物８６０、８６２に導入され、また、核酸連結生成物８６０、８６２が増幅され、標識結合領域８８２、８８４および捕捉領域８７８、８８０を含むアンプリコン８７４、８７６を生成する。該アンプリコンが、複数の捕捉プローブ８８８を含むハイブリッド形成配列８８６に導入され、ここで、アンプリコン８７４、８７６の捕捉領域８７８、８８０は、捕捉プローブ８８８に競合的にハイブリッド形成する。ステップ８９２においては、標識化されたオリゴヌクレオチド８９４、８９５の標的認識領域８９６、８９７の、アンプリコン８７４、８７６の標識結合領域８８２、８８４への選択的なハイブリッド形成を可能にさせる条件下で、標識化されたオリゴヌクレオチド８９４、８９５を配列８８６に導入する。標識化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列から除外されることが好ましい（非表示）。次に、標識８９８、８９９が検出され、また標的ゲノム領域のそれぞれに対応する遺伝子座に対応する対立遺伝子が定量化され、遺伝子試料中の遺伝子座および標的ゲノム領域における対立遺伝子の存在と個数に関する情報を提供することができる。
本発明の特定の局面においては、架橋オリゴヌクレオチドを通じて、対立遺伝子分別が提供される。この局面においては、該架橋オリゴヌクレオチドはＳＮＰの上に位置し、好ましくは、対立遺伝子に特有であるために、核酸連結部位の末端の１つに十分近い。
一つの例においては、両対立遺伝子の架橋オリゴヌクレオチド変異が同じ反応混合物中に存在し、続く付随標識のハイブリッド形成配列へのハイブリッド形成により対立遺伝子が検出される。図９は、この局面を示す。
図９において、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド９０２、９０４が提供され、ここで固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの両組は、同じ選択された遺伝子座を照合するように構成され、また標識結合領域を除いて両組は同じである。この実施形態においては、架橋オリゴヌクレオチドはＳＮＰを照合し、核酸連結ステップが起こった後まで少なくとも２個の容器で該アッセイを実施する必要がある。各組にある第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド９０６、９０８は、遺伝子座９１０、９１２に相補的なシークエンス、捕捉領域を９１４、９１６、そして普遍プライマー領域９１８、９２０を含む。各組にある第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド９２２、９２４は、遺伝子座９２６、９２８に相補的なシークエンス、標識結合領域９３０、９３２、そして普遍プライマー領域９３４、９３６を含む。ステップ９３８においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド９０２、９０４の組が、各組９０２、９０４の、遺伝子座９４０、９４２への特異的なハイブリッド形成を可能するという条件下で試料に導入され、ここで選択された遺伝子座はＳＮＰ ９４４、９４６を含む。第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に続いて（あるいは核酸連結に続いて）、ハイブリッド形成しなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドがゲノム試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ９４８においては、Ａ／Ｔ ＳＮＰまたはＧ／Ｃ ＳＮＰに対応する架橋オリゴヌクレオチド９５０、９５２が導入され、第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間の遺伝子座９４０、９４２の領域への結合を可能にする。別方法としては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドと同時に架橋オリゴヌクレオチドを試料に導入することができる。
ステップ９５４においては、ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドと架橋オリゴヌクレオチドが核酸連結され、核酸連結生成物９５６、９５８が得られる。この時点では、選択肢として、これら２つの別個のアッセイを１つの容器に組み合わせることができるが、必ずしも必要ではない。ステップ９６０においては、普遍プライマー領域９１８、９３４、９２０、９３６にそれぞれ結合する普遍プライマー９６２、９６４、９６６、９６８が核酸連結生成物９５６、９５８に導入され、また、核酸連結生成物９５６、９５８を増幅して、標識結合領域９８０、９８２および捕捉領域９７４、９７６をそれぞれ含むアンプリコン９７０、９７２を生成する。アンプリコン９７０、９７２が、複数の捕捉プローブ９８６を含むハイブリッド形成配列９８４に導入され、ここで、アンプリコン９７０、９７２の捕捉領域９７４、９７６は、捕捉プローブ９８６に競合的にハイブリッド形成される。ステップ９９０においては、標識化されたオリゴヌクレオチド９９２、９９４が配列９８４に導入され、ここで標識化されたオリゴヌクレオチド９９２、９９４の標的認識領域９９６、９９７は、アンプリコン９７０、９７２の標的結合領域９８０、９８２にハイブリッド形成する。標識化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に続いて、ハイブリッド形成されなかった標識化されたオリゴヌクレオチドが該配列から除外されることが好ましい（非表示）。次に、標識９９８、９９９が検出され、また標的ゲノム領域のそれぞれに対応する遺伝子座、そして遺伝子座に対応する対立遺伝子が定量化され、試料中の各対立遺伝子と標的ゲノム領域の存在と個数に関する情報を提供することができる。
追加的実施形態
図１０は、本発明のもう一つの特別な実施形態を示しており、ここで架橋オリゴヌクレオチドが用いられ、核酸連結生成物が配列とのハイブリッド形成前に２重切断される。図１０に示される方法においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１００２、１００４が提供される。各組は、遺伝子座１０４４に相補的なシークエンス１０１０、１０１２、標識結合領域１０１８、１０２０、捕捉領域１０１４、１０１６、普遍プライマー領域１０２２、１０２４、制限酵素認識部位１０７２、１０７４、１０７６、１０７８を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１００６、１００８を含む。標識結合領域１０１８、１０２０は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１００２、１００４の各組に対し異なるシークエンスを含み、異なる標的ゲノム領域のそれぞれに付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にするが、その一方で、１個の配列の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能にさせるためには、この実施形態における捕捉領域１０１４、１０１６は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１００２、１００４の両組に対し同じである。実施形態に依存して、制限酵素認識部位１０７２、１０７４、１０７６、１０７８は、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド上の切断部位の両方に対して同じであり得、かつ／あるいは固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの異なる組１００２、１００４に対して同じであり得る。また、各組には第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１０３０、１０３２が存在し、ここで第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子座１０４６に相補的なシークエンス１０３４、１０３６および普遍プライマー領域１０３８、１０４０を含む。
ステップ１０４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組１００２、１００４が試料に導入され、遺伝子座１０４４、１０４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成（あるいは別方法としての核酸連結）に続いて、ハイブリッド形成しなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ１０４８においては、架橋オリゴヌクレオチド１０２６、１０２８が各組に追加され、ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で隣接的にハイブリッド形成する。ステップ１０５４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組は核酸連結され、核酸連結生成物１０５０、１０５２が得られる。ステップ１０５４においては、普遍プライマー領域１０２２、１０３８、１０２４、１０４０にそれぞれ結合する普遍プライマー１０５６、１０５８、１０６０、１０６２が核酸連結生成物１０５０、１０５２に導入され、また、標識結合領域１０１８、１０２０、捕捉領域１０１４、１０１６および制限酵素認識部位１０７２、１０７４、１０７６、１０７８を含むアンプリコン１０６４、１０６６を生成する。ステップ１０７０においては、１個以上の制限酵素が該アンプリコン１０６４、１０６６に導入され、該アンプリコンは２重切断されて、標識結合領域１０１８、１０２０および捕捉領域１０１４、１０１６を含む切断アンプリコンを生成する。該切断生成物が、複数の捕捉プローブ１０８８を含むハイブリッド形成配列１０８６に導入され、ここで、該切断アンプリコンの捕捉領域１０１４、１０１６は、捕捉プローブ１０９０に競合的にハイブリッド形成される。ハイブリッド形成された捕捉領域１０８８は次に、標識化されたオリゴヌクレオチド１０８２、１０８４に導入され、これらが切断生成物上の相補的シークエンスに結合して検出される。
図１１は、本発明のもう一つの特別な実施形態を示しており、ここで架橋オリゴヌクレオチドが用いられ、同じ遺伝子座内の異なる対立遺伝子を識別するのに使用され、核酸連結生成物が配列とのハイブリッド形成前に２重切断される。図１１に示される方法においては、可能な多型性を有する単一遺伝子座に対して、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの２組１１０２、１１０４が提供される。各組は、選択された遺伝子座１１１０、１１１２の一つの対立遺伝子に相補的なシークエンス、標識結合領域１１１８、１１２０、捕捉領域１１１４、１１１６、普遍プライマー領域１１２２、１１２４、制限酵素認識部位領域１１２６、１１２８を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１１０６、１１０８を含む。標識結合領域１１１８、１１２０は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１１０２、１１０４の組に対し異なるシークエンスを含み、異なる対立遺伝子のそれぞれに付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にさせるが、その一方で、１個のハイブリッド形成配列の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能にさせるためには、この実施形態における捕捉領域１１１４、１１１６は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１１０２、１１０４の両組に対し同じである。実施形態に依存して、制限酵素認識部位１１２６、１１２８は、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド上の切断部位の両方に対して同じであり得、かつ／あるいは固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの異なる組１１０２、１１０４に対して同じであり得る。また、各組には第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１１３０、１０３２が存在し、ここで第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのそれぞれは、選択された遺伝子座１１３４、１１３６に相補的なシークエンスおよび普遍プライマー領域１１３８、１１４０を含む。
ステップ１１４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組１１０２、１１０４が試料に導入され、選択された遺伝子座１１４４、１１４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成（あるいは別方法としての核酸連結）に続いて、ハイブリッド形成しなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ１１４８においては、架橋オリゴヌクレオチド１１２６、１１２８が各組に追加され、ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で隣接的にハイブリッドを形成する。ステップ１１５４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組は核酸連結され、核酸連結生成物１１５０、１１５２が得られる。ステップ１１５４においては、普遍プライマー領域１１２２、１１３８、１１２４、１１４０にそれぞれ結合する普遍プライマー１１５６、１１５８、１１６０、１１６２が核酸連結生成物１１５０、１１５２に導入され、また、標識結合領域１１１８、１１２０、捕捉領域１１１４、１１１６および制限酵素認識部位１１７２、１１７４、１１７６、１１７８を含むアンプリコン１１６４、１１６６を生成する。ステップ１１７０においては、１個以上の制限酵素が該アンプリコン１１６４、１１６６に導入され、該アンプリコンは２重切断されて、標識結合領域１１１８、１１２０および捕捉領域１１１４、１１１６を含む切断アンプリコンを生成する。該切断生成物が、複数の捕捉プローブ１１８８を含むハイブリッド形成配列１１８６に導入され、ここで、該切断アンプリコンの捕捉領域１１１８、１１２０は、捕捉プローブ１１９０に競合的にハイブリッド形成される。ハイブリッド形成された捕捉領域１１８８は次に、標識化されたオリゴヌクレオチド１１８２、１１８４に導入され、これらが切断生成物上の相補的シークエンスに結合して検出され、遺伝子座の異なる対立遺伝子を区別する。
図１２は、本発明のもう一つの特別な実施形態を示しており、ここで架橋オリゴヌクレオチドが使用され、核酸連結生成物が配列とのハイブリッド形成前に切断される。この実施形態においては、核酸連結生成物を増幅するために使用されるプライマーが異なる仕方で標識化される。図１２に示される方法においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの１２０２、１２０４が提供される。各組は、遺伝子座１２１０、１２１２に相補的なシークエンス、プライマー結合領域の１２１８、１２２４（これらは異なる）、捕捉領域１２１４、１２２０、制限酵素認識部位領域１２２６、１２２８を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１２０６、１２０８を含む。プライマー結合領域１２１８、１２２４は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１２０２、１２０４の組に対し異なるシークエンスを含み、異なる標的ゲノム領域のそれぞれに付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にさせるが、その一方で、１個のハイブリッド形成配列の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能させるためには、この実施形態における捕捉領域１２１４、１２０４は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１２０２、１２０４の両組に対し同じである。実施形態に依存して、制限酵素認識部位１２２６、１２２８は、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド上の切断部位の両方に対して同じであり得、かつ／あるいは固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの異なる組１３０２、１３０４に対して同じであり得る。また、各組には第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１２３０、１２３２が存在し、ここで各第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子座１２３４、１２３６に相補的なシークエンスおよびプライマー領域１２３８、１２４０を含む。
ステップ１２４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組１２０２、１２０４が試料に導入され、遺伝子座１２４４、１２４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成（あるいは別方法としての核酸連結）に続いて、ハイブリッド形成しなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ１２４８においては、架橋オリゴヌクレオチド１２２６、１２２８が各組に追加され、ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で隣接的にハイブリッド形成する。ステップ１２５４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組は核酸連結され、核酸連結生成物１２５０、１２５２が得られる。ステップ１２５４においては、プライマー領域１２１８、１２３８、１２２４、１２４０にそれぞれ結合するプライマー１２５６、１２５８、１２６０、１２６２が核酸連結生成物１２５０、１２５２に導入され、また、プライマー結合領域１２７８、１２８４、捕捉領域１２７６、１２８０および制限酵素認識部位１２７２、１２７４をそれぞれ含むアンプリコン１２６４、１２６６を生成する。プライマー１２５６および１２６０は区別されて標識化されるので、アンプリコンが配列にハイブリッド形成されると、異なる遺伝子座間で区別が可能になる。ステップ１２７０においては、１個以上の制限酵素が該アンプリコン１２６４、１２６６に導入され、該アンプリコンは２切断されて、プライマー結合領域１２７８、１２８４および捕捉領域１２７６、１２８０を含む切断アンプリコンを生成する。該切断アンプリコンが、ステップ１２９０で複数の捕捉プローブ１２８８を含む１個のハイブリッド形成配列１２８６に導入され、ここで、切断アンプリコンの捕捉領域１２７６、１２８０は、捕捉プローブ１２８８に競合的にハイブリッド形成される。
図１３は、本発明のもう一つの特別な実施形態を示しており、ここで架橋オリゴヌクレオチドが使用され、核酸連結生成物が配列とのハイブリッド形成前に切断される。図１３は、図１２のそれに非常に類似する実施形態を示す。この実施形態においては、核酸連結生成物を増幅するために使用されるプライマーが異なる仕方で標識化される。図１３に示される方法においては、２組の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの１３０２、１３０４が提供される。各組は、遺伝子座１３１０、１３１２に相補的なシークエンス、プライマー結合領域１３１８、１３２４（これらは異なる）、捕捉領域１３１４、１３２０（これらは同じ）、制限酵素認識部位領域１３２６、１３２８を含む、第一固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１３０６、１３０８を含む。プライマー結合領域１３１８、１３２４は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組１３０２、１３０４対し異なるシークエンスを含み、異なる標的ゲノム領域のそれぞれに付随する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの差分標識化を可能にするが、その一方で、１個の配列の捕捉特質に対する競合的ハイブリッド形成を可能にさせるためには、この実施形態における捕捉領域１３１４、５２０は、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１３０２、１３０４の両組に対し同じである。実施形態に依存して、制限酵素認識部位１３２６、１３２８は、各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド上の切断部位の両方に対して同じであり得、かつ／あるいは固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの異なる組１３０２、１３０４に対して同じであり得る。また、各組には第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド１３３０、１３３２が存在し、ここで各第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、遺伝子座１３３４、１３２６に相補的なシークエンスおよびプライマー領域１３３８、１３４０を含む。
ステップ１３４２においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組１３０２、１３０４が試料に導入され、遺伝子座１３４４、１３４６へのハイブリッド形成を可能にさせる。ハイブリッド形成（あるいは別方法としての核酸連結）に続いて、ハイブリッド形成しなかった固定核酸塩基配オリゴヌクレオチドが試料の残りの部分から分離されることが好ましい（非表示）。ステップ１３４８においては、架橋オリゴヌクレオチド１３２６、１３２８が各組に追加され、ハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド間で隣接的にハイブリッドを形成する。ステップ１３５４においては、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの組は核酸連結され、核酸連結生成物１３５０、１３５２が得られる。ステップ１３５４においては、プライマー領域１３１８、１３３８、１３２４、１３４０にそれぞれ結合するプライマー１３５６、１３５８、１３６０、１３６２が核酸連結生成物１３５０、１３５２に導入され、また、プライマー結合領域１３７８、１３８４、捕捉領域１３７６、１３８０および制限酵素認識部位１３７２、１３７４をそれぞれ含むアンプリコン１３６４、１３６６を生成する。プライマー１３５６および１３６０は区別されて標識化されるので、アンプリコンが配列にハイブリッド形成されると、異なる遺伝子座間で区別が可能になる。ステップ１３７０においては、１個以上の制限酵素が該アンプリコン１３６４、１３６６に導入され、該アンプリコンは２重切断されて、プライマー結合領域１３７８、１３８４および捕捉領域１３７６、１３８０を含む切断アンプリコンを生成する。該切断アンプリコンが、ステップ１３９０で複数の捕捉プローブ１３８８を含む１個のハイブリッド形成配列１３８６に導入され、ここで、切断アンプリコンの捕捉領域１３７６、１３８０は、捕捉プローブ１３８８に競合的にハイブリッド形成される。
図１０〜１３の実施形態においては、配列に導入された切断アンプリコンは、標的ゲノム領域のどの部分あるいはそれに相補的なシークエンスを含まない。捕捉領域は、異なる標的ゲノム領域に付随して使用され、また標識化されたオリゴヌクレオチドは領域間を区別するために使用される。このようにして、切断アンプリコンは共通捕捉プローブに相補的にハイブリッド形成し、また標的ゲノム領域の定量化は、配列に結合した切断生成物に対応する検出された標識により決定される。
前述のように、図２〜１３に示された本発明の実施形態は、各遺伝子座あるいは対立遺伝子を照合するために使用される２個の別々の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを示す。しかしながら、ある局面においては、プレサークルプローブを含む遺伝子座に相補的な、２個以上の非隣接固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを含む単一プローブを使用することができる。そのようなプレサークルプローブは、例えば、米国特許第５，８５４，０３３号および第６，３１６，２２９号においてＬｉｚａｒｄｉにより記述されており、例えば、プローブ内の制限エンドヌクレアーゼに対する部位を含む、配列にハイブリッド形成させる前に線形化することができる。
普遍的増幅
本発明の特定の局面においては、ハイブリッド形成および直接的あるいは延長や架橋オリゴヌクレオチドの導入に続く、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの核酸連結に続いて核酸連結生成物を増幅するために普遍増幅が使用される。多重アッセイシステムにおいては、増幅は好ましくは、各組の第一および第二固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチド上の普遍プライマー領域にハイブリッド形成する普遍プライマーを用いる普遍増幅を通じて行われる。固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに由来する該普遍プライマー領域は核酸連結生成物の一部をなし、ここで、該核酸連結生成物は次に、単一の普遍増幅反応において増幅され得る。これら普遍プライマーシークエンスは、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを通じて導入されるが、それらはまた、核酸連結を通じて核酸連結生成物の近接端にも追加され得る。普遍プライマー領域を固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドに導入すると、それに続き、配列ハイブリッド形成前に核酸連結生成物の全部または一部の制御された普遍増幅が可能になる。この増幅プロセスから生成されるアンプリコンは、検出するため、配列に導入する前に直接使用されあるいは更に処理することができる。特別な実施形態においては、該アンプリコンが切断され、ハイブリッド形成と検出のため、捕捉領域を含む部分が配列に導入される。高分子連鎖反応（ＰＣＲ）中にも見られるような、バイアスと変動性がＤＮＡ増幅中に導入され得る。増幅反応が多重である場合、遺伝子座が異なる割合あるいは効率で増幅される潜在性がある。与えられた遺伝子座に対するプライマーの組は、プライマーの配列構成およびテンプレートＤＮＡ、緩衝条件、並びにその他の条件に従って振る舞いが異なることがある。特定の局面においては、該方法において使用される普遍プライマー領域は、多数の核酸を同時に分析するための一般的プライミング機構を利用する従来の多重アッセイ方法と互換性があるように設計される。そのような「普遍」プライミング方法は、遺伝子試料中に存在する核酸領域に対する、効率的な大量の定量分析を可能とさせ、また該試料中の核酸領域の存在の総合的定量化を可能にする。
核酸連結反応のすべてあるいは連結反応の切断量を普遍増幅に使用することができる。切断量を用いると、同じまたは異なる条件（例：ポリメラーゼ、緩衝液など）を使用して並列増幅させ、例えば、実験条件が原因で不本意にバイアスが導入されないようにすることが可能になる。加えて、プライマー濃度の変動を利用して、シークエンス個数特有の増幅サイクルを効果的に制限することができる。多重アッセイ方法の例には、Ｏｌｉｐｈａｎｔらの米国特許第７，５８２，４２０号で開示された内容が含まれるが、これには限定されない。
本明細書において詳述されているように、本発明の多数の方法は、多重検出のための連結反応を利用し、ここで多重ステップの早期段階からのオリゴヌクレオチドは、プロセスの後段階で使用可能なシークエンスを含む。試料中の核酸の増幅および／あるいは検出に対し、以下に記述される、この分野で知られているプロセスを単独あるいは組み合わせて使用することができるが、これらには限定されない。特定の局面においては、本発明の方法は、次の組み合わせた選択的かつ普遍的増幅技術の一つを利用する：（１）ＰＣＲに連結されたＬＤＲ；（２）ＬＤＲに連結された二次ＰＣＲに連結された一次ＰＣＲ；（３）二次ＰＣＲに連結された一次ＰＣＲ。これらの技術の組み合わせのそれぞれは、プロセス中の早期段階からのプローブ領域を利用し、この領域をプロセスの後段階でのプライマーシークエンスとして使用することが可能である。
Ｂａｒａｎｙらの米国特許第６，８５２，４８７号、第６，７９７，４７０号、第６，５７６，４５３号、第６，５３４，２９３号、第６，５０６，５９４号、第６，３１２，８９２号、第６，２６８，１４８号、第６，０５４，５６４号、第６，０２７，８８９号、第５，８３０，７１１号、第５，４９４，８１０号が、各種核酸試料中のヌクレオチドの特定のシークエンスの検出のためのリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイの使用を記述する。
Ｂａｒａｎｙらの米国特許第７，８０７，４３１号、第７，４５５，９６５号、第７，４２９，４５３号、第７，３６４，８５８号、第７，３５８，０４８号、第７，３３２，２８５号、第７，３２０，８６５号、第７，３１２，０３９号、第７，２４４，８３１号、第７，１９８，８９４号、第７，１６６，４３４号、第７，０９７，９８０号、第７，０８３，９１７号、第７，０１４，９９４号、第６，９４９，３７０号、第６，８５２，４８７号、第６，７９７，４７０号、第６，５７６，４５３号、第６，５３４，２９３号、第６，５０６，５９４号、第６，３１２，８９２号、第６，２６８，１４８号が、核酸検出のための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に連結された検出反応によるリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）を記述する。
Ｂａｒａｎｙらの米国特許第７，５５６，９２４号および第６，８５８，４１２号は、核酸検出のための連結リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた、パドロックプローブ（「プレサークルプローブ」あるいは「多重反転プローブ」とも呼ばれる）の使用を記述する。
Ｂａｒａｎｙらの米国特許第７，８０７，４３１号、第７，７０９，２０１号、７，１９８，８１４号は、核酸シークエンスの検出のための、組み合わされたエンドヌクリアーゼ切断と核酸連結反応の使用を記述する。
Ｗｉｌｌｉｓらの米国特許第７，７００，３２３号および第６，８５８，４１２号は、多重核酸増幅と検出、ゲノタイピングにおけるプレサークルプローブの使用を記述する。
Ｒｏｎａｇｈｉらの米国特許第７，６２２，２８１号は、特有のプライマーとバーコードを含むアダプタを使用する核酸の標識化と増幅のための増幅技術を記述する。
対象とする核酸領域は、ハイブリッド形成技術と配列を用いて特定される。検出のためのポリヌクレオチドハイブリッド形成方法は、当技術分野で十分開発され公知である。ハイブリッド形成アッセイの手順と条件は、応用によって変わり、以下の参照文献を含む、一般的結合方法に従って選択される：Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験手引き）（編集２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学におけるＢｅｒｇｅｒおよび Ｋｉｍｍｅｌ方法），Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（分子クローニング技術のガイド）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）；Ｙｏｕｎｇおよび Ｄａｖｉｓ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）。反復され制御されたハイブリッド形成反応を実行させるための方法および装置は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，８７４，２１９号、第６，０４５，９９６号、および第６，３８６，７４９号、第６，３９１，６２３号に記述されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態においては、配列は溶液中で多重基板より成り、例えば、米国特許出願第２０１４００５７２６９号および米国特許出願第２０１４００４２３６６号、米国特許出願第２０１４００２４５５０号に教えられている。
本発明はまた、特定の好ましい局面においては、リガンド間ハイブリッド形成の信号検出も意図する。これについては、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８３４，７５８号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号および第６，２２５，６２５号、また米国特許出願第６０／３６４，７３１号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として刊行）を参照せよ。
信号検出および強度データの処理のための方法と装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５４７，８３９号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８００，９９２号、第５，８３４，７５８号；第５，８５６，０９２号、第５，９０２，７２３号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０９０，５５５号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号；第６，２１８，８０３号；および第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号とＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として刊行）に開示されている。
特定の局面においては、単一試料に由来する核酸連結生成物の捕捉領域あるいはそのアンプリコンは、特定の試料に由来する核酸連結生成物を識別する指標シークエンスを含む。該配列の特質は、異なる試料の指標シークエンスに相補的なシークエンスを含む捕捉プローブを含み、特定の試料に由来する遺伝子座の識別を可能にする。
母体試料中の胎児ＤＮＡ部分の推定
母体試料中の胎児ＤＮＡの割合は、胎児比率が染色体投与量の期待される統計的存在に関する重要な情報を提供するので、本発明のリクス算定の一部として使用され得る。期待される統計的存在からの偏差は、胎児染色体異数性、特に特定の染色体の胎児三染色体や単染色体を示唆し得る。
母体試料中の胎児ＤＮＡの割合を推定するための、この分野で周知のいかなる方法も使用することができ、これには胎児が男性の場合はＹシークエンスの定量化あるいはエピジェネティク・マーカーの観察が含まれる（例えば、Ｃｈｉｍら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０２：１４７５３−５８（２００５）を参照せよ）。リクス算定の１要素として胎児部分の割合を用いることは、母体試料中の胎児ＤＮＡのレベルが低い状況においては特に有益である。更に、システムが信頼できる分析を実施できないような低い胎児ＤＮＡの割合の場合では、胎児ＤＮＡの割合に関する知識を用いて、試料で追加的分析の実施を想定し、その結果を判断するよう使用することができる。他の局面においては、母体試料中の胎児ＤＮＡ割合の決定は、胎児染色体異数性の確実性のレベルあるいは検定力にも影響し得る。
次の方法は、母体試料中の胎児含有物の総割合の決定を記述するが、この割合はまた、染色体に基づいて染色体上でも決定することができる。例えば、胎児染色体２１の頻度情報を胎児染色体１８と比較して決定することができる。別の例においては、２個以上の染色体を胎児割合検出に使用することができ、例えば、染色体１と２の遺伝子座の頻度を使用することができる。る。特定の局面においては、胎児割合を決定するために使用される染色体は、可能な異数性のために照合された染色体である。他の局面においては、胎児割合を決定するために使用される染色体は、特に、可能な異数性のために照合された染色体ではない。
胎児からのＤＮＡは、その遺伝子座の約５０％が母親に由来し、その遺伝子座の約５０％が父親に由来する。どの遺伝子座が非母体源（情報価値のある遺伝子座）に由来して胎児に寄与するかを決定すると、母体試料中の胎児ＤＮＡの割合を推定することが可能になり、従って、対象とする染色体に対する染色体投与量における統計的に有意な差を算定することが可能になる。
ある局面においては、非母体多型性の決定は、標的ＳＮＰおよび／あるいは突然変異分析を通じて達成され、母体試料中の胎児ＤＮＡの割合を推定することができ、このプロセスは特に、本発明の配列分析に採用することができる。母体試料中の胎児細胞フリーＤＮＡの割合は、母体あるいは父性遺伝子型の事前知識なしで多重ＳＮＰ検出を用いて定量化することができる。この局面においては、各領域に既知のＳＮＰを有する、２カ所以上の選択された多型性核酸領域が使用される。好ましい局面においては、選択された多型性核酸領域は、例えば、染色体２１、１８、１３といった、多型性ではないような常染色体上に位置する。母体試料（例：血漿）から選択された多型性核酸領域が増幅される。好ましい局面においては、増幅は普遍的であり、好ましい実施形態においては、染色体異数性を決定するために使用された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの核酸連結生成物を使い、選択された多型性核酸領域が単一容器内で単一反応中で増幅される。母体試料中の選択された多型性核酸領域の各対立遺伝子が決定され定量化される。好ましい局面においては、そのような決定と定量化に高処理能力のシークエンシングが使用される。
遺伝子座が従って特定され、ここで母体および非母体遺伝子型は異なり、例えば、母体遺伝子型は同型接合性であり、非母体遺伝子型は異型接合性である。この情報量の多い遺伝子座の特定は、特に選択された核酸領域に対し、一つの対立遺伝子の高頻度（＞８０％）かつ他の対立遺伝子の低頻度（＜２０％ないし＞０．１５％）を観測することによって達成される。多重遺伝子座を使用すると、遺伝子座間での対立遺伝子の存在量測定における変動量が低減するので、特に利点がある。この要件を満たす遺伝子座の全部あるいは一部が使用され、統計分析を通じて胎児寄与が決定される。一つの局面においては、胎児寄与が、２カ所以上の遺伝子座に由来する低頻度対立遺伝子の総和を求め、高頻度対立遺伝子の総和で割ってから２を掛けることによって決定される。
多数の対立遺伝子に対しては、母体と非母体のシークエンスが同型接合性であり同一であり得、従って、この情報が母体および非母体ＤＮＡ間を区別しないため、母体試料中の胎児ＤＮＡの割合を推定する上では有益ではない。本発明は対立遺伝子情報を使用し、ここでは、胎児ＤＮＡの割合の計算において、非母体と母体のＤＮＡ（例：母体対立遺伝子とは異なる少なくとも１個の対立遺伝子を含む母体対立遺伝子）間に区別可能な差異が存在する。それ故、母体と非母体のＤＮＡに対して同じである対立遺伝子領域に関連するデータは、分析には選択されず、あるいは有益なデータをマスクしないように、胎児ＤＮＡの割合を推定する前に関連データから除外される。母体血漿中の胎児ＤＮＡを定量化するために追加された例示的プロセスが、例えば、Ｃｈｕら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．，３０：１２２６−２９（２０１０）に見られ、参照により本明細書に組み込まれる。
データ分析
胎児細胞フリーＤＮＡの割合が算定されると、このデータは染色体異数性検出の方法と組み合わされて、胎児が染色体異数性を含み得る尤度を決定することが可能になる。一つの局面においては、ランダムＤＮＡ片の分析を利用する染色体異数性検出方法が使用され、これは、例えば、Ｑｕａｋｅ、ＵＳＳＮ第１１／７０１，６８６号；およびＳｈｏｅｍａｋｅｒら、ＵＳＳＮ第１２／２３０，６２８号に記述される。好ましい局面においては、選択された核酸領域の分析を利用する染色体異数性検出方法が使用される。この局面においては、試料に対する胎児細胞フリーＤＮＡの割合が計算される。その試料に対する染色体比、正規母集団に対する染色体比、および正規母集団に対する染色体比の変動は、本明細書に記述されるように決定される。別方法としては、計算された染色体比は、染色体が正常な試料に対する期待値と異数性のある試料に対する期待値を使用する。次に、試料に対し計算された染色体比は、これらの期待値と比較される。
一つの好ましい局面においては、胎児ＤＮＡの割合が同様な正常試料から正規母集団に対する染色体比とその変動が決定される。胎児細胞フリーＤＮＡの割合を有するＤＮＡ試料に対して期待される異数性染色体比が、異数性染色体からの割合寄与を追加することにより算定される。次に、試料に対する染色体比が、正規母集団に対する染色体比と比較され、また期待される異数性染色体比と比較されて、試料が正常あるいは異数体のどちらに近く、統計的確率がどちらかであるかが、染色体比の変動を使って統計的に決定され得る。
好ましい局面においては、母体試料の選択された領域が、胎児ＤＮＡ量並びに２個以上の染色体に由来する非多型性領域の推定のための両領域を含み、単一反応での胎児染色体異数性を検出する。胎児ＤＮＡを用いて遺伝子異常の存在あるいは不在を判断するのに役立たせ、バイアスのある結果を得ることはないために、単一反応によって、アッセイシステムでの各種ステップで混入する可能性のある汚染やバイアスのリスクが最小化される。
他の局面においては、胎児ＤＮＡ量の推定並びに胎児染色体異常の検出の両方に選択された核酸領域または領域群を使用し得る。選択された核酸領域に対する対立遺伝子を使用して胎児ＤＮＡ量を推定することができ、次に、これら同一の選択された核酸領域を使用して、対立遺伝子情報を無視して胎児染色体異常を検出することができる。胎児ＤＮＡ量と染色体異常の検出の両方に対して同一の選択された核酸領域を使用して、実験誤差や汚染が原因で発生する任意のバイアスの最小化に更に役立ち得る。
一つの実施形態においては、胎児性別には無関係に、母体試料中の胎児からの寄与量が、常染色体性ＳＮＰを使って測定される（Ｓｐａｒｋｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ ＆ Ｇｙｎ．，２０６：３１９．ｅ１−９（２０１２）を見よ）。父性遺伝の知識とは無関係に非母体対立遺伝子が方法実行中に特定されるので、使用されるプロセスには父性遺伝子型の前知識は不要である。二項分布を用いた最大尤度推定を適用して、各母体試料中のいくつかの情報量の多い遺伝子座にわたる推定胎児核酸寄与量を算定することができる。使用される胎児核酸寄与量の計算プロセスは、例えば、米国特許第２０１３／００２４１２７号に記述されている。胎児寄与量の決定に使用された多型性領域は、染色体１〜１２からであり得、好ましくは血液型抗原を標的とはしない。試験染色体が三染色体であり、統計的試験を把握できる場合に、期待される応答強度を定義するために多型性アッセイからの胎児寄与率の推定が使用される。試験からの統計量には、試料が二染色体の場合の期待比率からの偏差の目安および試料が三染色体の場合の期待比率からの偏差の目安という、２つの成分から成り得る。各成分は、観測比率を期待比率と比較し、観測値の偏差で割る、ウォルド統計量である（例：Ｈａｒｒｅｌｌ，Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（回帰モデル戦略），（２００１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、セクション９．２．２および１０．５）。
統計量Ｗｊを使用して、試料ｊが二染色体の場合に期待値からの偏差を測定することができ、次式で定義される：
ここで、ｐｊとｐ０は、Ｚ統計によって記述される最適上限として定義され、また
は、対象とする与えられた染色体の観測比率表現の標準偏差である。標準偏差は、パラメータ表示のブートストラップ・サンプリングを使用して、対象染色体の平均計数および標準誤差に基づいたｐｊ比率の分布を作成し得る。第二の統計量は、
であり、ｐ０を参照比率で調整された胎児分率
で置き換え、次式で定義される：
ここで、
は、試料ｊの胎児分率、
は、以前と同様、参照比率である。この調整により、胎児が三染色体の場合に試験染色体の増加表現を説明する。多数の遺伝子座にわたる計数偏差が試験染色体に対する非多型性アッセイを用いた自然の結果として測定されるので、期待比率の分散に典型的に要求されるように、すべての推定値は初期データの組で計算され、プロセス変動を制御するための外部参照試料あるいは正規化調整された履歴情報は必要ない。
使用した最終統計値は
であった。概念的には、二染色体期待および三染色体期待からの偏差は同時に評価され、単一統計量にまとめられる。これら２個の指示値を組み合わせる利点は特に、二染色体からの偏差は高いであろうが、特定の胎児寄与量レベルで三染色体に対して期待される偏差までは到達し得ないことである。この場合、
成分は負値であり、効果的に二染色体からの偏差を打ち消すようになる。
は、二染色体と三染色体とである機会が等しいことを示した。
本発明のプロセスのコンピュータによる実現
例示的な実施形態に従えば、コンピュータが、胎児に由来する比率を計算するソフトウェア部を実行し、この情報をゲノム領域および／あるいは染色体の投与量の値に適用する。一つの実施形態においては、該コンピュータは、パーソナルコンピュータを含み得るが、該コンピュータは、少なくとも１個のプロセッサと記憶装置を含む任意の種類の機械を含み得る。
ソフトウェア部の出力は、ゲノム領域および／あるいは遺伝子が投与量異常を示す確率値を有する報告を含む。好ましい局面においては、この報告は領域あるいは染色体が２つのコピー数（例：二染色体）を有する尤度値のオッズ比であり、領域あるいは染色体がより多いコピー数（例：三染色体）あるいは少ないコピー数（例：単染色体）を有する尤度値である。報告は、印字された紙面、あるいはモニターに表示および／あるいは電子メール、ＦＴＰ、テキスト文メッセージ、サーバ上での掲示などを通じてユーザに電子的に通信され得る電子媒体であってもよい。
本発明の正規化プロセスは、ソフトウェアとして実現されるものとして示されるが、それはまた、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせでも実現され得る。加えて、正規化のための該ソフトウェアは、同じあるいは異なるコンピュータで作動する多重構成要素として実現可能である。
該サーバおよびコンピュータの両方は、プロセッサ、入力装置（例：キーボード、印刷装置、音声命令用のマイクロホン、ボタン、タッチスクリーンなど）、そして出力装置（例：表示画面、スピーカなど）を含む、典型的な計算装置のハードウェア構成要素を含み得る。該サーバおよびコンピュータは、コンピュータ読み取り可能媒体、例えば、プロセッサにより実行されると開示された機能を実現するコンピュータ命令を含む、記憶装置や保存装置（例：フラッシュメモリ、ハードドライブ、光学ディスクドライブ、磁気ディスクドライブなど）を含み得る。該サーバおよびコンピュータは更に、情報通信のために、有線あるいは無線ネットワーク情報通信インタフェースを含み得る。
次の実施例は、本発明の作成と使用の完全な開示と説明を当業者に提供するために示すものであり、本発明の発明者が発明とみなす範囲を限定する意図ではなく、以下の実験が実施したすべての実験であり、またはこれらのみであることを表現し意味するものではない。広範に記述された本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特別な局面に示した本発明に多数の変更および／または改変を為し得ることが当業者によって認識されるであろう。本発明は従って、あらゆる面において説明的なものであり、制限するものではないと考えるべきである。
使用された数値（例：量、温度など）を確実に正確にする努力が払われたが、実験誤差あるいは偏差は考慮に入れるべきである。特に断らない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧またはそれに近い値である。
実施例１：対象
全部で８７８件の母体静脈血試料が三染色体性状態の以下の分類を用いて分析された：６９１件が二染色体性、１８件が三染色体１３、３７件が三染色体１８、および１３２件が三染色体２１であった。血液試料は、少なくとも年齢１８歳の妊婦で１０〜３４週間の懐胎の単体妊娠者から入手した。三染色体分類は、試験したすべての試料に対し事前決定されており、４８６件の試料がＡｒｉｏｓａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（米国カルフォリニア州サンノゼ所在）製のＨａｒｍｏｎｙ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｔｅｓｔ（ハーモニー出生前テスト）を用いて試験され、羊水検査核型分類あるいは三染色体が疑われた場合は出生後の新生児検査とそれに続く核型検査のいずれかを受けた患者から３９６件の試料が採取された。
実施例２：試料調製
試料調製および分析は、Ｓｐａｒｋｓら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．，２０７（５）：３７４．ｅ１−６（２０１２）の記述に従って実施した。細胞フリーＤＮＡを各患者の血漿から純化し、ＤＡＮＳＲ（商標）（選択領域のデジタル分析）アッセイ生成物（例：直列核酸連結生成物）を染色体１３、１８、２１上の遺伝子座から得た。この分析に対しては、染色体１３、１８、２１のそれぞれ上の８６４カ所のゲノム領域に対応する、固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドの組を使用して、核酸連結アッセイを実施した。ＤＮＡ試料を固体支持体に付着し、ハイブリッド形成されなかったオリゴヌクレオチドは核酸連結前に除去した。加えて、染色体１〜１２上の５７６カ所の多型部位に対応する固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドの組を使用する核酸連結アッセイを開発して、各試料中の胎児ｃｆＤＮＡの分率を評価した。各試料から得られた核酸連結アッセイ生成物の一部を普遍プライマーを使い増幅し、配列させ、核酸連結アッセイ生成物の残りの部分は、カスタム生成されたＤＮＡ配列にハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成前に、アンプリコンを切断した。これらの部分は同一生成物を含んでいた。
実施例３：アッセイを用いた核酸連結生成物の定量化
ＤＡＮＳＲアッセイの生成物を特に定量するために、カスタムＤＮＡ配列が、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（米国カルフォルニア州サンタクララ所在）により製造された。ＤＮＡ配列がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＴｉｔａｎ（登録商標）多重チャネル装置上にイメージ化された。単一のカスタムＤＮＡ配列上での各患者試料のアッセイを実施した。ＤＮＡ配列が生成され、３８４件の相互接続された組でプロセスされた。次世代シークエンシングデータが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（踏力商標）２５００（米国カルフォルニア州サンディエゴ）を使用して生成された。ＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ試薬（米国カルフォルニア州サンディエゴ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎ上にクラスターを発生させた。平均して、アッセイ毎に１１０４のシークエンシング計数を得た。
実施例４：データ分析
ＦＯＲＴＥ（商標）（Ｆｅｔａｌ−Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｔｒｉｓｏｍｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）と命名された以前に発表されたアルゴリズムを使用して、リスクスコアを割り当てた（例えば、Ｓｐａｒｋｓら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．，２０７（５）：３７４．ｅ１−６（２０１２）を見よ）。染色体１３、１８、２１上での非多型性核酸連結アッセイを使用して、これらの染色体のそれぞれに関する染色体比率を決定した。胎児分率を確実に知るために、多型性核酸連結アッセイを使用した。アッセイ変動性が、シークエンス計数（シークエンシング）あるいは強度（ＤＮＡ配列）の変動係数（ＣＶ）として定義され、ここで低アッセイ変動が好ましい。胎児分率変動性が、測定された胎児分率の相対標準誤差として定義された。
実施例５：結果
三染色体リスクに対するアッセイを実施した８７８件の血漿試料は、核酸連結アッセイがおよびハイブリッド形成による検出を使用して、配列ベースのリスクスコアと三染色体状態との間で完全に一致した。これとは対照的に、シークエンスベースのリスクスコアと三染色体状態との間の一致は、９９．６％であった。シークエンシングによって、以前のＮＩＰＴスクリーンにおいて低いリスクスコアを受けた２件の試料に対し、高いリスクスコアが報告された。これらのデータは、三染色体リスクスコアが配列ベースの分析により正確に得られたことを示威するものである。
加えて、配列データはアッセイ変動性を約半分に減少させる。アッセイ変動性の減少として測定された正確性は、シークエンスベースの分析と比較して、配列ベースの分析で向上した。配列シークエンス検出に対する中央値アッセイによって、次世代シークエンシングベースの検出と比較してほぼ２倍の改善（（０．０５１対０．０９９；ｐ値＜０．０００１）が示された。（図１４を見よ）。ヒストグラムの棒は、アッセイ変動性の特定範囲（ｘ軸）を共有する核酸連結アッセイの個数（ｙ軸）を示す。配列データは濃灰色でプロットされ、シークエンシングデータは白色でプロットされている。２個の母集団のデータが重複する場合は、棒は薄灰色で示される。配列ベースの定量化された核酸連結生成物は有意に低いアッセイ変動性を有しており、ここで低いアッセイ変動性が望ましい。
アッセイを活用して、胎児分率変動性を更に低減することが可能である。血漿中の胎児ＤＮＡ分率は、試験の正確度に影響を及ぼす。本発明の方法は、極めて敏感な結果を低い擬陽性率で提供するよう、ＦＯＲＴＥアルゴリズムを用いて、胎児分率を測定し、報告し、強化する：（Ｓｐａｒｋｓら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．，２０６（４）：３１９．ｅ１−９（２０１２））胎児分率を算定するＦＯＲＴＥは、配列ベースおよびシークエンシングベースの分析データ間で非常に再現性がある（Ｒ＾２＞０．９９）。配列は多重シークエンシングよりもより多数の核酸連結アッセイを同時に測定することができるので、配列ベースの分析を用いた胎児分率の推定値はより正確であり、中央値相対誤差が０．０２１と比較し０．０１３となる。
本実施例において提示されたデータは、データ変動性の２つの主要源が、次世代シークエンシングと比較して配列の方が低くなることを示す：１）多型アッセイを使用して測定された胎児分率の変動（胎児分率変動）および２）試料全体にわたる非多型アッセイの変動（アッセイ変動）。より多数の多型アッセイを含めることにより、配列ベースの核酸連結生成物父系試験が計画され、より低い胎児分率変動が提供されるので精度が向上する。アッセイ変動を下げることで、低胎児分率試料で観測される、より小さい変化などの、より小さい染色体異数変化を測定することが可能となる。得られたデータは、配列プラットホームが信頼性のある染色体異数照合を可能にすることを示威する。更に、配列イメージ化は迅速なプロセスであり、試料定量化の完成時間は、試料当たり１分間未満に短縮される。これらの実施例で使用された特別な検出システム（ＧＥＮＥＴＩＴＡＮ（商標）マルチチャンネル装置）は、機械時間当たり＞９０個の配列をイメージ化することができる。これとは対照的に、試料がレーン当たり９６件の試料のグループでまとめられている場合であっても、ＨＩＳＥＱ（商標）２５００シークエンシングシステムは機械時間当たり１５件の試料の処理能力を有する。この機械時間および複雑な機構の低減は、配列シークエンス検出が使用される場合の設備投資額の直接低減につながる。
シークエンスベースの分析は、利用可能なシークエンス容量の経済的で効率良い使用を達成するための試料複合化を強化する。しかしながら、正規化なしには、単一試料によってフローセル中でシークエンス読み値の大部分が消費されてしまう可能性があり、このような場合は、残りの試料で三染色体のリスクを決定するのに利用可能な読み値が低減することがある。試料を正確に複合するには、入力されたＤＮＡの数量を正規化するための労力とコストがかかるプロセスが必要である。最近の研究で報告されたように、試料入力を均等にするよう務めた場合であっても、１２部の反応に対し試料当たり、中央値読み値の４倍の変動が観測された（Ｊｅｎｓｅｎら、ＰＬｏＳ ＯＮｅ，８（３）：ｅ５７３８１（Ｊｕｌ ２０１４）。配列ベースのＮＩＰＴ手法には試料複合化は不要である。その代わり、各試料は単一配列に個別にハイブリッド形成される。プロセスの処理能力は、便利な高処理能力で取り扱えるように、例えば、３８４個の配列が単一のマルチ配列プレートに物理的に接続されることで向上する。各試料は個別に取り扱われるので、時間が節約され、コストが低減される。
本発明の好ましい局面に関連して詳細に記述されたように、本発明は多数の異なる形の局面で満たされるが、本開示内容は、発明の原理の例示として考慮されるべきであり、本発明を本明細書に図示され記述されている特別な局面に限定するものではないことが理解される。当業者によって、本発明の趣旨から逸脱することなく多彩なバリエーションが考案され得る。本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲およびそれらの等価内容によって測られるであろう。要約および題名は、それらの目的が適切な当局並びに一般大衆の、本発明の一般的性質の迅速な判断を可能にすることであるため、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。以下の特許請求の範囲において、用語「手段」が使用されない限り、ここで列挙される特質あるいは要素のいずれも、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２，¶６に従ったミーンズ・プラス・ファンクション限定と解釈されるべきではない。

Claims (18)

  1. 胎児コピー数変異の統計的尤度を提供するアッセイ方法であって：
    母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む、母体の血清または血漿である母体試料に、あるいは、前記母体試料からの胎児細胞フリーＤＮＡに、第一標的ゲノム領域に由来する少なくとも２つの非多型遺伝子座を照合するために、少なくとも２つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを含む第一組を、少なくとも２組導入する工程であって、ここで前記第一組の各々における固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、それぞれ前記第一標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な領域を含み、前記第一組の各々における固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの１つは、捕捉領域、第一の標識化されたオリゴヌクレオチドを結合させるための第一標識結合領域、および、前記捕捉領域と前記第一標識結合領域とを挟む２つの制限酵素認識部位を含む工程と；
    母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む前記母体試料に、あるいは、前記母体試料からの胎児細胞フリーＤＮＡに、第二標的ゲノム領域に由来する少なくとも２つの非多型遺伝子座を照合するために、少なくとも２つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを含む第二組を、少なくとも２組導入する工程であって、ここで前記第二組の各々における固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、それぞれ前記第二標的ゲノム領域内の遺伝子座に相補的な領域を含み、前記第二組の各々における固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの１つは、捕捉領域、第二の標識化されたオリゴヌクレオチドを結合させるための第二標識結合領域、および、前記捕捉領域と前記第二標識結合領域とを挟む２つの制限酵素認識部位を含み、前記第二組の各々における前記捕捉領域は、前記第一組の少なくとも１つにおける前記捕捉領域と実質的に同じである工程と；
    前記固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを核酸連結する工程と；
    核酸連結された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを増幅してアンプリコンを生成する工程と；
    前記アンプリコンを前記制限酵素認識部位で切断して、前記捕捉領域と前記第一標識結合領域または前記第二標識結合領域とを含む切断アンプリコンを生成する工程と；
    前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する切断アンプリコンを、前記切断アンプリコンの捕捉領域の、捕捉領域に相補的な捕捉プローブを含む配列へのハイブリッド形成、および、前記第一および第二標識結合領域への前記第一および第二の標識化されたオリゴヌクレオチドの結合を通じて検出する工程であって、ここで前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する切断アンプリコンは、前記捕捉領域に相補的な捕捉プローブに競合的にハイブリッド形成する工程と；
    前記第一および第二標識結合領域を検出することにより、前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する照合された非多型遺伝子座の相対頻度を決定するために、前記切断アンプリコンの捕捉領域を定量化する工程と；
    前記第一および第二標識結合領域の相対頻度に基づき、前記第一および第二標的ゲノム領域の相対頻度を推定する工程と；
    母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む前記母体試料に、あるいは、前記母体試料からの胎児細胞フリーＤＮＡに、前記第一および第二標的ゲノム領域とは異なる少なくとも１つの標的ゲノム領域に由来する少なくとも２つの多型遺伝子座の各対立遺伝子を照合するために、少なくとも２つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを含む第三組を、少なくとも２組導入する工程であって、前記第三組の各々における前記少なくとも２つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、それぞれ１つの多型遺伝子座に特異的であり、前記第三組の各々における前記少なくとも２つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドのうちの１つは、その多型遺伝子座の１つの対立遺伝子に相補的な配列、その多型遺伝子座に特異的な捕捉領域、第三の標識化されたオリゴヌクレオチドを結合させるための対立遺伝子特異的な標識結合領域、および前記捕捉領域と前記対立遺伝子特異的な標識結合領域とを挟む２つの制限酵素認識部位を含む工程と；
    前記多型遺伝子座に特異的な固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを核酸連結する工程と；
    アンプリコン生成のために、前記多型遺伝子座に特異的な、核酸連結された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを増幅する工程と；
    前記捕捉領域と前記対立遺伝子特異的な標識結合領域とを含む切断アンプリコンを作成するために、前記多型遺伝子座に特異的なアンプリコンを前記制限酵素認識部位で切断する工程と；
    前記配列上の捕捉プローブへの前記切断アンプリコンの捕捉領域の競合的ハイブリッド形成、および、前記対立遺伝子特異的な標識結合領域への前記第三の標識化されたオリゴヌクレオチドの結合を通じて、前記多型遺伝子座に由来する切断アンプリコンを検出する工程と；
    前記母体試料に存在する胎児ＤＮＡの割合を決定するために、前記切断アンプリコン上の各対立遺伝子について、前記対立遺伝子特異的な標識結合領域を検出することにより、前記多型遺伝子座の対立遺伝子を定量化する工程と；
    前記定量化された対立遺伝子から前記胎児ＤＮＡの割合を決定する工程と；
    前記母体試料中の前記第一および第二標的ゲノム領域の推定相対頻度と前記胎児ＤＮＡの割合とを用いて、前記母体試料中の胎児コピー数変異の統計的尤度を算定する工程と、を含む、アッセイ方法。
  2. 前記第一および第二標的ゲノム領域内の非多型遺伝子座のそれぞれの照合のために、（ａ）３つ以上の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが使用されるか、（ｂ）各多型遺伝子座のそれぞれの照合のために、３つ以上の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドが使用されるか、または（ａ）および（ｂ）の両方である、請求項１に記載のアッセイ方法。
  3. 前記増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する普遍増幅を含む、請求項１または２に記載のアッセイ方法。
  4. 更に：
    母体ＤＮＡが同型接合性であり、胎児ＤＮＡが異型接合性である多型遺伝子座の定量化された対立遺伝子に由来する低頻度対立遺伝子を特定する工程と；
    前記胎児ＤＮＡの割合を決定するために、多型遺伝子座に由来する前記低頻度対立遺伝子を使用する工程と、を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  5. 前記第一標的ゲノム領域は染色体上にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  6. 前記第二標的ゲノム領域は染色体上にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  7. 前記第一標的ゲノム領域は、部分的染色体領域である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  8. 前記第二標的ゲノム領域は、部分的染色体領域である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  9. 前記固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの前記第一、第二、および対立遺伝子特異的な標識結合領域は、それぞれ、前記第一、第二、および第三の標識化されたオリゴヌクレオチドに相補的なシークエンスを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  10. 前記多型遺伝子座は常染色体遺伝子座である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  11. 前記照合は更に、架橋オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  12. 胎児染色体異数性の尤度決定のためのアッセイ方法であって：
    母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む、母体の血清または血漿である母体試料に、あるいは、前記母体試料からの胎児細胞フリーＤＮＡに、第一標的ゲノム領域内の非多型遺伝子座の組に相補的な２つ以上の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第一組を少なくとも２組、前記非多型遺伝子座への各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの相補的領域の特異的なハイブリッド形成を可能にする条件下で導入するステップであって、ここで第一組の各々における少なくとも１つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、普遍プライマー部位、捕捉領域、第一の標識化されたオリゴヌクレオチドを結合させるための第一標識結合領域、および、前記捕捉領域と前記第一標識結合領域とを挟む２つの制限酵素認識部位を含む、ステップと；
    母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む前記母体試料に、あるいは、前記母体試料からの胎児細胞フリーＤＮＡに、第二標的ゲノム領域内の非多型遺伝子座の組に相補的な２つ以上の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第二組を少なくとも２組、前記非多型遺伝子座への各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの相補的領域の特異的なハイブリッド形成を可能にする条件下で導入するステップであって、ここで第二組の各々における少なくとも１つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、普遍プライマー部位、捕捉領域、第二の標識化されたオリゴヌクレオチドを結合させるための第二標識結合領域、および、前記捕捉領域と前記第二標識結合領域とを挟む２つの制限酵素認識部位を含み、前記第二組の各々における前記捕捉領域は、前記第一組の少なくとも１つにおける前記捕捉領域と実質的に同じである、ステップと；
    母体および胎児細胞フリーＤＮＡを含む前記母体試料に、あるいは、前記母体試料からの胎児細胞フリーＤＮＡに、少なくとも２つの多型遺伝子座の各対立遺伝子を照合するために、２つ以上の固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの第三組を少なくとも２組、多型遺伝子座への各固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの相補的領域の特異的なハイブリッド形成を可能にする条件下で導入するステップであって、ここで第三組の各々における少なくとも１つの固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドは、普遍プライマー部位、前記多型遺伝子座における１つの対立遺伝子に相補的な核酸塩基配列、第三の標識化されたオリゴヌクレオチドを結合させるための対立遺伝子特異的な標識結合領域、捕捉領域、および、前記対立遺伝子特異的な標識結合領域と前記捕捉領域とを挟む２つの制限酵素認識部位を含み、各多型遺伝子座に対する捕捉領域は、その他の多型遺伝子座それぞれに対する捕捉領域と異なり、また前記第一および第二組の捕捉領域とも異なる、ステップと；
    固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの前記第一、第二、および第三組を、前記第一および第二標的ゲノム領域、並びに前記多型遺伝子座にハイブリッド形成させるステップと；
    固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの隣接的ハイブリッド形成のために、前記第一、第二、および第三組の少なくとも１つのハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを延長するステップと；
    核酸連結生成物を得るために、前記第一、第二、および第三組に由来する隣接的にハイブリッド形成された固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドを核酸連結するステップと；
    アンプリコン生成のために、普遍プライマー部位を用いて核酸連結生成物を増幅するステップと；
    前記アンプリコンを前記制限酵素認識部位で切断して、前記第一標識結合領域、前記第二標識結合領域、または前記対立遺伝子特異的な標識結合領域と前記捕捉領域とを含む切断アンプリコンを生成するステップと；
    切断アンプリコンを配列に適用するステップであって、ここで前記配列は、前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する切断アンプリコン上の捕捉領域に相補的な捕捉プローブを含み、かつ前記配列は、各多型遺伝子座に由来する切断アンプリコン上の捕捉領域に相補的な捕捉プローブを含む、ステップと；
    前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する切断アンプリコンの捕捉領域を、前記配列上の捕捉プローブにハイブリッド形成させるステップと；
    前記多型遺伝子座に由来する切断アンプリコンの捕捉領域を、前記配列上の捕捉プローブにハイブリッド形成させるステップと；
    第一、第二、および対立遺伝子特異的な標識結合領域に、第一、第二、および第三の標識化されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ結合させることにより、ハイブリッド形成された切断アンプリコンを検出するステップと；
    胎児細胞フリーＤＮＡの割合を決定するために、切断アンプリコン上の各対立遺伝子について前記対立遺伝子特異的な標識結合領域を検出することにより、前記多型遺伝子座に由来する各対立遺伝子の相対頻度を定量化するステップと；
    胎児細胞フリーＤＮＡの割合を決定するステップと；
    第一および第二標識結合領域を検出することにより、前記第一標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンの相対頻度、および前記第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンの相対頻度を定量化するステップと；
    前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンの相対頻度および前記胎児細胞フリーＤＮＡの割合を用いて胎児染色体異数性の尤度を算定するステップと、を含む、アッセイ方法。
  13. 更に：
    母体ＤＮＡが同型接合性であり、胎児ＤＮＡが異型接合性である多型遺伝子座の定量化された対立遺伝子に由来する低頻度対立遺伝子を特定するステップと；
    前記胎児細胞フリーＤＮＡの割合を決定するために、多型遺伝子座に由来する前記低頻度対立遺伝子を使用するステップと、を含む、請求項１２に記載のアッセイ方法。
  14. 更に、前記第一および第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンの相対頻度を比較し、胎児細胞フリーＤＮＡの割合に基づいて胎児染色体異数性の尤度を調整するステップを含む、請求項１２または１３に記載のアッセイ方法。
  15. 前記第一標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンの相対頻度の総和が取られ、前記第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンの相対頻度の総和が取られ、前記第一標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンからの総和が前記第二標的ゲノム領域に由来する遺伝子座に対応する切断アンプリコンからの総和と比較され、標的ゲノム領域比を計算する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  16. 多型遺伝子座は常染色体遺伝子座である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  17. 前記第一および第二標的ゲノム領域の遺伝子座に由来する切断アンプリコンおよび多型遺伝子座に由来する切断アンプリコンが単一容器内で増幅される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  18. 前記固定核酸塩基配列オリゴヌクレオチドの前記第一、第二、および対立遺伝子特異的な標識結合領域は、それぞれ、前記第一、第二、および第三の標識化されたオリゴヌクレオチドに相補的なシークエンスを含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
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