CN1930303B - 染色体异常的产前诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

染色体异常是造成大量出生缺陷(包括精神发育迟缓)的主要原因。本发明涉及基于对母亲血样的分析，无创性快速产前诊断染色体异常的方法。本发明利用母亲和胎儿之间DNA的差异，例如其甲基化状态的差异，作为富集母体血浆样本中的胎儿DNA的方法。本发明所述方法可以用来检测染色体DNA缺失和重复。在优选的实施方案中，所述方法用于诊断染色体非整倍性及相关疾病，例如唐氏综合征和特纳综合征。

Description

染色体异常的产前诊断试剂盒
相关申请的交叉引用 
依据美国法典第35章第119(e)条，本申请要求2003年10月8日申请的美国临时申请号60/509,775的权益，该临时申请的内容通过引用全部结合到本文中。 
发明领域
本发明涉及染色体异常的无创性产前诊断方法。本发明的方法可以用来检测染色体DNA缺失和重复。在优选的实施方案中，所述方法用于诊断染色体非整倍性及相关疾病，例如唐氏综合征(Down′s Syndrome)和特纳综合征(Turner′s Syndrome)。本发明还提供鉴定甲基多态性探针的方法，所述甲基多态性探针可用于检测胎儿染色体异常。 
发明背景 
染色体异常是造成大量先天缺陷(包括精神发育迟缓)的主要原因。异常一般表现为染色体DNA重复和缺失，以及染色体非整倍性，后者指的是完整的染色体的异常存在或缺失。当生物体具有少于或多于正常二倍体的染色体数量时，就会产生大量异常特征并引起多种综合征。唐氏综合征，亦称21三体综合征，是染色体非整倍性最常见的例子，包括一条额外的21号染色体。其它常见的染色体非整倍性有13三体综合征、18三体综合征、特纳综合征和克兰费尔特综合征(Klinefelter′s Syndrome)。 
对于染色体异常产前检测的选择主要限于有创性方法，这些方法会有致使胎儿丢去的风险，虽小但的确有一些。最常用的检测异常的方法是羊膜穿刺术。然而，由于羊膜穿刺术是有创性方法， 因此通常只用于高龄产妇，因为高龄产妇的胎儿出现染色体异常的风险有所增加。因此，建立用于胎儿染色体异常诊断的无创性方法非常有益，这些方法可以使众多的准妈妈受益。美国专利号4,874,693中已经描述了这样一种无创性方法，该专利公开了通过监测母亲的人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平，检测胎盘机能障碍以显示染色体异常的方法。然而，虽然这种方法是无创性的并且能够用来筛选所有年龄段的准妈妈，但它不能作为具体染色体异常存在的诊断方法，也不能作为具体染色体异常存在的保证。 
现有的产前诊断方法除了取样步骤是有创性的，操作也耗时费力。例如，吉姆萨(Geisma)染色法是最广为使用的技术，这种方法要求实验时，细胞处于细胞分裂中期或者正在分裂。每对染色体要染上特征性的明带谱或暗带谱。采用这种方法，所有的染色体能够被一一区分并容易展现任何结构上的或数量上的异常性质。吉姆萨染色法不是总能检测出精细的染色体重排。如果怀疑染色体重排，但用这种方法检测不到，进一步的详细分析可以使用荧光原位杂交(FISH)或图谱核型分析(SKY)进行。用吉姆萨染色法，测试结果需要一到两周。 
SKY就是用不同探针(染料颜色)对每个中期染色体染色的技术。因为每个染色体特异性探针都会发射自身所特有的荧光波长，因此能够容易地观察到结构重排，并能够容易地鉴定所涉及的染色体。由于SKY要求细胞是处于细胞分裂中期的细胞，因此结果需要一到两周。 
FISH就是用荧光探针(染料)与特异性个别染色体或染色体的某些区结合或杂交的技术。受到影响的染色体或染色体区发荧光或是发出信号，可以通过荧光显微镜目测分析它们的存在或缺失。FISH通常用于鉴定具体的染色体重排或快速诊断出异常染色体存在的数量。对于异常染色体数量，FISH是目前最快的诊断异常染色体数量的方法。速度较快是因为分析用的细胞不必是处于细胞分裂中 期的细胞。因此，一般2到3天就可以知道测试结果。 
因此，本领域需要无创性的产前诊断方法，这些方法能够快速而准确地帮助确定染色体畸变的存在和类型。 
发明概述 
本发明描述了用于染色体异常例如染色体非整倍性的无创性产前诊断方法，所述方法可以快速地做出准确的结果。本发明方法使用的是得自孕妇的血浆样本。已经显示出，除了母体血浆中有较小百分比的胎儿细胞外，母体样本还含有较小百分比的胎儿DNA。 
常染色体具有一个母亲遗传的等位基因(A，如下表所示)和一个来自父亲的等位基因(B，如下表所示)。有一种情况，其中胎儿DNA占母体血浆样本中存在的总DNA的约2％，胎儿等位基因的存在状况描述如下： 
  母体DNA(98％)  胎儿DNA (2％)  B％
母性遗传的等位基因的三体 AA  AAB  2/202
正常 AA  AB  2/200
因此，由于正常与三体之间的B％的差异仅仅是(2/200-2/202)即0.01％，因此这种差异太小了，即便采用现有最好的定量方法也难以发现。 
在检测样本中的等位基因之前，通过相对地富集母体血浆样本中的胎儿DNA数量，本发明就解决了这个难题。本发明利用母体和胎儿之间DNA中的差异，例如，DNA甲基化状态中的差异，富集母体血浆中的胎儿DNA以便准确地检测样本中的胎儿等位基因。因此，可以将母体DNA大体上缩减、掩蔽或完全破坏，样本余留的大部分DNA就是胎儿的了。可以用一种或多种酶选择性破坏母体DNA，例如甲基化敏感酶，这类酶可以选择性消化这个区域周围的母体核酸，稍后用来检测等位基因频率。然后使用靠近所选择的 染色体区的多态性标记，测定胎儿DNA的等位基因频率。与对照样本比较，等位基因频率的差异表明存在染色体异常。 
在一个实施方案中，提供了检测染色体异常的方法，该方法包括：a)获取孕妇血浆样本，b)任选地从所述血浆样本中分离DNA，c)用酶(例如甲基敏感酶)消化DNA，该甲基敏感酶选择性消化母体DNA或胎儿DNA，d)利用选择性消化以获得富集了胎儿DNA或母体DNA的DNA样本，e)用靠近所选胎儿DNA区的多态性标记测定母源或父源等位基因频率，f)将步骤e)的父源或母源等位基因频率与对照DNA样本进行比较，其中等位基因频率的差异表明存在染色体异常。优选，考虑到多态性差异，应当用一组正常DNA和/或异常DNA与推定异常DNA进行比较。 
因此，如果通过消化将母体DNA完全破坏，那么就能够检测到胎儿等位基因频率，如下表所示： 
  血浆样本中的母体DNA(已消化，0％)  胎儿DNA(100％含 于血浆样本中)  B％
母性遗传的等位基因的三体 AA  AAB  1/3(或33.3％)
正常 AA  AB  1/2(或50％)
因为相对富集了母体血浆样本中的胎儿DNA，所以现在几乎是采用任何核酸检测方法都可以准确地检测出等位基因频率。母体血浆样本中的母源等位基因与父源等位基因之比因此仅仅反映出胎儿中的等位基因比率。因此，如果样本中有两个以上的母源等位基因，那么这个比率将明显地不同于正常时的1/2。 
可以利用胎儿DNA和母体DNA之间的任何差异，例如利用Y染色体特异性DNA和端粒长度。母体和胎儿之间DNA的差异可以用已知的方法来测定。在差异是差异甲基化的情况下，甲基敏感酶消化未甲基化的母体DNA，而胎儿里的DNA是甲基化的，反之亦然。例如，当胎儿DNA区是甲基化的，那么将甲基敏感酶用来 消化未甲基化的母体DNA。消化后只留下胎儿甲基化DNA片段，因此就富集了胎儿DNA。然后将靠近差异甲基化DNA区或在差异甲基化DNA区内的多态性标记用作检测母体血浆样本中的母源或父源DNA频率的标记。将母源DNA和父源DNA的等位基因频率和得自无染色体异常健康个体的基因组DNA中通常观察得到的等位基因频率进行比较。这样，就可以检测出任何染色体异常。因为能够同时检测出一个或多个等位基因，因此可从同一样本中同时筛选出多种染色体异常。或者说，只消化甲基化DNA的酶可以用来富集在胎儿中是未甲基化的而在母亲中是甲基化的DNA。本发明的方法适于检测染色体DNA重复或染色体DNA缺失，以及检测染色体非整倍性。 
尽管优选首先要大体上完全破坏母源等位基因时，但是这就没有必要。本发明也提供一种方法，该方法中如果母体DNA没有被完全破坏，就要一个或多个最好不是双份的染色体作对照等位基因。情况如下： 
  母体DNA  胎儿DNA  B(或D)％ 100％消化 B(或D)％98％消化
三体 AA  AAB  33.3％ 20％
非-非整倍性 CC  CD  50％ 25％
表中，等位基因B和等位基因D是胎儿DNA中的父性遗传等位基因。 
或者，在首次消化后，胎儿DNA可以被进一步扩增。因此，本发明提供一种方法，该方法中在首次消化母体DNA后，采用选择性地扩增胎儿DNA的扩增方法扩增样本。或者说，样本中存有差异，例如母体DNA和胎儿DNA之间的甲基化差异。扩增后的样本因而被再次消化，并因此可以得到更大百分比的胎儿DNA。当然，如果需要，可以进行一次以上的消化/扩增程序。扩增步骤可以与对 照等位基因的检测一起进行。 
因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包括扩增程序以富集胎儿DNA。一方面，扩增方法包括a)获取孕妇血浆样本并任选从所述样本中分离DNA，b)用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶消化所分离的DNA，c)分离步骤b未消化的DNA，d)扩增步骤c未消化的DNA，同时用DNA甲基化酶使新生的半甲基化DNA甲基化，e)使用只消化未甲基化DNA的酶消化步骤c已扩增的DNA，f)使用例如靠近胎儿甲基化DNA区的多态性标记，测定母源或父源等位基因频率，g)将步骤f的父源或母源等位基因频率与对照DNA样本进行比较，其中差异等位基因频率表明有染色体异常。 
在又一个实施方案中，本发明提供了诊断21三体(唐氏综合征)的方法。该方法包括：a)获取孕妇血浆样本，b)任选地从所述血浆样本中分离出DNA，c)用只消化母体DNA或胎儿DNA的酶例如甲基敏感酶消化DNA，d)使用靠近所选21号染色体的胎儿DNA区的多态性标记测定父源等位基因频率，e)将步骤d的父源等位基因频率与对照DNA样本进行比较，其中如果父源等位基因频率小于对照样本的等位基因频率，就表明有唐氏综合征。 
在又一个实施方案中，本发明提供检测母体血浆样本中的染色体非整倍性的试剂盒，其中所述试剂盒包括一种或多种酶以及引物，其中这类酶特异性消化孕妇血浆样本中的母体DNA，而引物用来检测已富集的胎儿DNA中的多态性标记的父源和母源等位基因频率，以便于检测染色体缺失、染色体插入或染色体非整倍性。这种试剂盒也包括容器、酶(例如聚合酶)和缓冲液，以便于从母体血浆样本中分离出核酸、扩增标记以检测等位基因频率。这种试剂盒也可以包括标准DNA或对照DNA，例如从怀有健康胎儿的孕妇血浆中分离的DNA，和/或从怀有染色体异常例如21号、13号和/或18号染色体三体胎儿的孕妇血浆样本中分离的DNA样本。 
用于产前诊断染色体异常的试剂盒优选包括至少一种甲基 化敏感酶；至少一对核酸扩增引物，该核酸扩增引物能够退火并因此扩增位点侧翼区，该位点包含至少一个位于母体血浆中存在的胎儿DNA和母体DNA的差异甲基化区内的多态基因座；至少一种引物或探针，以便检测至少一个多态基因座中的等位基因；和说明书手册，指导使用者进行下述步骤：获取孕妇血浆样本，用甲基化敏感酶选择性消化所述血浆样本中的核酸以富集样本中的胎儿核酸，用扩增引物进行核酸扩增，检测已富集了胎儿核酸样本中的等位基因，解释结果，如果基因座中两个不同的等位基因的比率偏离了等位基因以等量存在的对照，就表明该胎儿患染色体异常。 
这种试剂盒还包括对照核酸组，其中对照核酸组包括从怀有已知的染色体异常胎儿的孕妇中分离的核酸和从怀有无染色体异常胎儿的孕妇中分离的核酸。 
这种试剂盒也还包括至少一对扩增引物和检测引物或探针的内部对照，其中所述引物和/或探针选自在母体血浆中存在的胎儿DNA和母体DNA中被差异甲基化的但存在于重复和缺失罕见的染色体上的核酸区，以便提供内部对照。 
发明详述 
本发明提供胎儿染色体异常的检测方法。 
本文所用的术语“染色体异常”是指有DNA缺失或重复的染色体以及染色体非整倍性。该术语也包括把染色体外序列易位到其它染色体上。 
本文所用的术语“染色体非整倍性”是指染色体的异常存在(超倍性)或异常不存在(亚倍性)。 
本文所用的术语“多态性标记”是指显示个体间的DNA序列中可遗传变异的基因组DNA区段。这类标记包括但不限于单核苷酸多态性(SNP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复(STR)例如二核苷酸重复、三核苷酸重复或四核苷酸重复等等。本发明的 多态性标记可特别用于把已富集的胎儿核酸样本中的母源等位基因和父源等位基因区别开。 
本文所用的术语“甲基多态性标记”是指靠近胎儿DNA和母体DNA的差异甲基化DNA区的多态性标记。术语靠近是指标记的位置距差异甲基化核苷酸1-3000碱基对，优选1000碱基对，更优选100碱基对，还更优选50碱基对。 
本文所用的术语“母源等位基因频率”是指母源等位基因与总的等位基因(包括父源等位基因和母源等位基因)的比率，用百分比表示。术语“父源等位基因频率”是指父源等位基因与总的等位基因(包括父源等位基因和母源等位基因)的比率，用百分比表示。 
本文所用的术语“对照DNA样本”或“标准DNA样本”是指从没有染色体异常的健康个体中获得的基因组DNA。优选，对照DNA样本是从怀有无染色体异常健康胎儿的孕妇的血浆中获得的。优选使用一组对照样本。在已知某些染色体异常的情况下，也可以有一些有特定疾病或病症的标准物。因此，举例来说，为了筛选孕妇母体血浆中的三种不同染色体非整倍性，优选使用一组对照DNA，该对照DNA是从已知怀有例如13号、18号或21号染色体三体胎儿的母亲的血浆中分离的DNA以及从怀有无染色体异常胎儿的母亲的血浆中分离的DNA。 
本发明描述了采用得自母体血浆中的胎儿DNA诊断染色体异常的无创性方法。妊娠早期或晚期的母体血浆中，胎儿DNA约占总DNA的2-6％。从理论上说，在正常的胎儿中，一半的胎儿DNA来自父性遗传组分。 
一俟怀孕就可以采用本发明的方法。优选，在受孕后六周或更长时间里获取样本。优选受孕后6周和12周之间。 
分析母体血浆中的胎儿DNA所提出的技术特征在于，要能够把胎儿DNA和共同存在的背景母体DNA区别开。本发明的方法利用这种差异，例如从胎儿DNA和母体DNA之间观察到的差异 甲基化，来富集母体血浆DNA样本中占相对较小百分比的胎儿DNA。所述方法的无创性特点与产前诊断的常规方法相比有较大的优势，常规方法例如羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛取样和脐带穿刺术，这些方法都伴随着虽小但的确有胎儿丢去的风险。同样，由于所述方法不取决于处于任何特定细胞期的胎儿细胞，因此所述方法提供了测定染色体异常存在和染色体异常性质的快速检测方法。 
可以采用本领域技术人员已知的任何方法，从怀孕母亲的血液、血浆或血清中分离DNA。标准DNA分离方法描述于例如(Sambrook等，Molecular Biology：A laboratory Approach，Cold SpringHarbor，N.Y.1989；Ausubel等，Current protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，Y，1995)。分离血浆DNA的优选方法描述于Chiu等2001，Clin.Chem.47：1607-1613，该文献通过引用全部结合到本文中。其它合适的方法包括例如TRI REAGENT
Figure 048361004_0
BD(Molecular ResearchCenter，Inc.，Cincinnati，OH)，这是从例如血浆中分离DNA的试剂。TRIREAGENT BD和一步法描述于例如美国专利第4,843,155号和第5,346,994号。 
按照本发明的方法，通过用一种或多种选择性切割母体DNA部分的酶消化血浆DNA，就可以富集得自预期母亲的血浆DNA样本中的胎儿DNA。例如，用只在甲基化的DNA识别位点上切割的酶来消化血浆DNA，或者用只在未甲基化的DNA识别位点上切割的酶来消化血浆DNA。用只切割未甲基化DNA识别位点的酶消化，就可以富集胎儿DNA中甲基化的DNA序列而非母体DNA中未甲基化的DNA序列。或者，用只切割甲基化DNA识别位点的酶消化，就可以富集胎儿DNA中未甲基化的DNA序列而非母体DNA中甲基化的DNA序列。任何能够选择性切割母体DNA区而不能切割相应的胎儿DNA区的酶都适用于本发明。 
例如，CG(或CpG)岛是一段短序列，如果是这中间的DNA，那么CG序列频率高于其它区域。在基因的启动子区中经常发现CpG 岛。当基因是无活性基因时，多数CpG岛甲基化程度较高，当基因是活性基因即已翻译的基因时，多数CpG岛甲基化程度较低或未甲基化。因此，不同细胞类型的甲基化模式不同且随着发育而改变。因为胎儿DNA和母体DNA可能来自不同的细胞类型和不同的发育阶段，因此就能容易地鉴定差异甲基化的区域并且用于富集母体血浆样本中相对数量的胎儿DNA。 
本文所用的术语“甲基敏感”酶是DNA限制性内切核酸酶，这种酶的活性取决于它们的DNA识别位点的甲基化状态。例如，有些甲基敏感酶仅在未甲基化DNA识别序列上的位点切割。因此，未甲基化DNA样本会被切成比甲基化DNA样本更小的片段。同样，过度甲基化DNA不会被切割。相反，有些甲基敏感酶仅在甲基化的DNA识别序列上切割。本文所用的术语“切割”、“切”和“消化”可互换使用。 
在本发明的方法中，适用的消化未甲基化DNA的甲基敏感酶包括但不限于HpaII、HhaI、MaeII、BstUI和AciI。优选使用的酶是HpaII，它只切割未甲基化序列CCGG。也可以使用两种或两种以上只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶的组合。合适的只消化甲基化DNA的酶包括但不限于DpnI，它在识别序列GATC上切割，还有McrBC，它属于AAA+蛋白家族，切割含有修饰胞嘧啶的DNA并在识别位点5′...PumC(N40-3000)PumC...3′(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA)上切割。 
本领域技术人员通晓用所选限制酶切割特定位点上的DNA的切割方法和程序。例如很多限制酶的供应商提供了用特异性限制酶切割的DNA序列的条件和类型的信息，他们包括New EnglandBioLabs、Pro-Mega Biochems、Boehringer-Mannheim等等。Sambrook等(参见Sambrook等，Molecular Biology：A laboratory Approach，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)提供了有关限制酶和其它酶的使用方法的一般性描述。在本发明的方法中，优选酶的应用条件是能够切割母体 DNA的效率约95％至100％，优选效率约98％至100％。 
检测差异甲基化DNA区内不同等位基因的甲基多态性探针和标记的鉴定
本发明利用胎儿DNA和母体DNA中的差异来富集母体血浆样本中的月台儿DNA。 
在一个实施方案中，本发明利用差异甲基化。在哺乳动物细胞中，甲基化在基因表达中起着重要的作用。例如，基因(通常是启动子和第一外显子区)在基因表达了的细胞里经常是没有甲基化的，而在基因没有表达的细胞里是甲基化的。由于母体血浆样本中的胎儿DNA和母体DNA常常来自不同的细胞类型和/或不同的发育阶段，所以可鉴定出差异甲基化的区域。然后将代表差异甲基化区的DNA片段测序，筛选可以用作母源或父源的等位DNA“标记”的多态性标记。在公共数据库例如NCBI中，或者通过对差异甲基化基因组区进行测序，就可以发现位于特异基因组区的多态性标记。然后通过评价母体血浆样本中的母源或父源等位基因频率，其中胎儿DNA已按照本发明的方法富集，可将已鉴定的甲基多态性标记用作染色体异常的诊断标记。如果母源等位基因或父源等位基因的比率不是约1/2，则说明多态性标记已定位的特定染色体区不是重复就是缺失。 
可以用任何本领域已知的方法鉴定差异甲基化区，从而制备对应于那些区的探针和/或引物。差异甲基化区的各种鉴定方法描述于例如美国专利号5,871,917、5,436,142及美国专利申请第US20020155451A1号、第US20030022215A1号和第US20030099997号，这些专利的内容通过引用全部结合到本文中。 
为了鉴定不同胎儿细胞和不同胎儿发育阶段中的差异甲基化区，可以用本领域技术人员通晓的核酸分离方法，从绒毛膜绒毛样本、羊水样本或流产胎儿获取的样本中分离出胎儿核酸。 
与母体DNA对比，如何鉴定胎儿DNA中差异甲基化区的实例如下。 
美国专利号5,871,917中描述了一种典型的方法。这种方法用不切割甲基化DNA的CNG特异性限制酶，在CpNpG序列切割试验DNA(例如胎儿DNA)和对照DNA(例如母体DNA)，检测差异甲基化。这种方法用一次或多次DNA扩增联同扣除杂交法一起鉴定差异甲基化的DNA或突变的DNA的区段。因此，该方法可以选择性地鉴定胎儿基因组甲基化不足或过度甲基化的区域。就是在那些区域里，可以容易地鉴定任何多态性，例如SNP、STR或RFLP，这些多态性可以用于检测胎儿DNA已富集的母体血浆样本中的母源等位基因和父源等位基因的等位基因频率。 
具体地说，分离母体DNA，并将其与从胎儿分离的DNA进行比较。将母体DNA样本和胎儿DNA样本分别用只在没有甲基化的CNG位点上切割的甲基敏感酶进行切割。将样本用第二种酶进行进一步切割，这种酶将DNA切割成适合DNA扩增和扣除杂交的大小和复杂度。优选，第二种酶切割DNA生成末端，这些末端与甲基敏感酶生成的粘端既不同源又不互补(complimentary)。切割后，将一组衔接头连接到由不切割甲基化DNA的CNG特异性限制酶生成的粘端上。选择衔接头是为了把它们连接到由甲基敏感酶切割的DNA的CG丰富末端，而不是连接到由第二种酶切割的片段的末端。衔接头不仅选来连接到由甲基敏感酶切割的DNA末端，同时也是用于DNA扩增中的引物识别位点上的理想大小和DNA序列。只有那些有衔接头因而可用甲基敏感酶切割的片段，方能用衔接头序列引物在PCR反应中进行扩增。 
将两个样本分别扩增。扩增后，通过用甲基敏感酶切割，将第一组衔接头从已扩增的片段的末端除去。这样就保留了片段原来的末端。 
将第二组衔接头连接到已扩增的母体DNA上，而不是连 接到已扩增的胎儿DNA上。选择与第一组衔接头没有相同序列的第二组衔接头，以便它们只连接到由甲基敏感酶切割的DNA末端。第二组衔接头也给用于扩增的引物提供了理想的识别位点。 
在DNA扩增后，用标准方法至少进行一次扣除/杂交。结果是选择了母体DNA中独特的未甲基化的DNA片段，这个DNA片段可以用作探针来检测胎儿基因组中的甲基化识别位点。 
具体地说，如美国专利号5,871,917中描述，将母体DNA和过量的胎儿DNA混合。然后用与第二个衔接头末端杂交的引物，通过体外DNA扩增方法扩增扣除杂交混合物。因此，只有带第二个衔接头末端的母体DNA片段会被扩增。任何与胎儿DNA杂交了的母体DNA不会被扩增。将过量的母体DNA用于促进杂交体形成，所述杂交体通常在胎儿样本和母体样本中都能发现。结果是分离到未甲基化的母体DNA片段，这些片段是胎儿DNA中独特甲基化的。这些片段用本领域已知的标准方法进行分离。 
可进行DNA印迹杂交来证实所分离的片段检测差异甲基化区。母体和胎儿的基因组DNA可用甲基敏感酶进行切割，特定位点的甲基化不足或过度甲基化，可以通过观察样本间用限制酶切割的DNA片段的大小或强度是否相同进行检测。这可以通过电泳分析或将探针与母体DNA样本和胎儿DNA样本杂交并观察两个杂交复合物的大小和/或强度是否相同或不同来进行。本领域技术人员通晓详细的凝胶电泳和核酸杂交技术的方法学，例如在Sambrook等，Molecular Biology：A laboratory Approach，Cold Spring Harbor，N.Y.1989中可找到实验方案。 
然后用这些片段序列可筛选区分父源等位基因或母源等位基因的多态性标记，如本文所述这些标记可用作甲基多态性探针。用上述技术所分离的探针具有至少14个核苷酸至约200个核苷酸。 
以上方法中使用的合适的限制酶的实例包括但不限于BsiSI、Hin2I、MseI、Sau3A、RsaI、TspEI、MaeI、NiaIII、DpnI等 等。优选的甲基敏感酶是Hpa II，该酶在非甲基化的CCGG序列上而不是在外胞嘧啶已被甲基化的CCGG序列上识别和切割。 
差异甲基化也可以用描述于美国专利申请号2003009997中的方法进行评价，该专利公开了检测方法，该方法利用不是使未甲基化DNA降解就是使甲基化DNA降解的酶，检测两种来源DNA间差异甲基化的存在。例如可以用只切割未甲基化DNA的甲基敏感酶的混合物例如HpaII、HhaI、MaeI、BstUI和AciI，处理基因组母体DNA以便使未甲基化DNA降解。然后用使甲基化DNA降解的酶例如McrBC(New England Biolabs，Inc.)，处理基因组胎儿DNA。然后通过扣除杂交法可以选择性提取胎儿DNA和母体DNA间差异甲基化的序列。 
或者，母体DNA和胎儿DNA间差异甲基化的评价可以通过二硫化物处理，随后或是通过1)测序，或是通过2)碱基特异性裂解后进行质谱分析，描述于von Wintzingerode等，2002，PNAS，99：7039-44，该文献通过引用全部结合到本文中。 
为了作为探针用，将已鉴定的甲基多态性标记用本领域已知的任何方法进行标记，例如掺入与“报道分子”连接的核苷酸。 
本文所用的“报道分子”是提供分析鉴定信号的分子，所提供的信号可检测杂交探针。检测可以是定性检测或是定量检测。通常使用的报道分子包括荧光团、酶、生物素、化学发光分子、生物发光分子、洋地黄毒苷、亲和素、链霉亲和素或放射性同位素。通常使用的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶和β-半乳糖苷酶等等。可以将酶与亲和素或链霉亲和素缀合以便和生物素化探针一起使用。同样，也可将探针与亲和素或链霉亲和素缀合以便和生物素化酶一起使用。和这些酶一起使用的底物，通常选择相应的酶水解会产生可检测到的颜色变化。例如对硝基苯磷酸适合和碱性磷酸酶报道分子一起使用；对于辣根过氧化物酶，通常使用1，2-苯二胺、5-氨基水杨酸或联甲苯胺。可以用技术人员已知的任何方法 把报道分子掺入到DNA探针中，例如用切口平移、引物延伸、随机寡核苷酸引发，通过3′或5′末端标记或通过其它方法(参见例如Sambrook等，Molecular Biology：A laboratory Approach，Cold SpringHarbor，N.Y.1989)。 
或者，对已鉴定的甲基多态性标记不必进行标记，就可以用来定量测定等位基因频率，利用描述于Ding C.和Cantor C.R.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3059-64中的质谱分析技术，该文献通过引用全部结合到本文中。 
母源和父源等位基因频率的比较
按照本发明的方法，使用母体血浆DNA来诊断染色体异常的存在，可首先用选择性切割母体DNA的酶，例如用对DNA甲基化状态敏感的酶，消化血浆DNA来富集胎儿DNA。多态性标记，例如本文描述的靠近差异甲基化胎儿DNA区或在该区内的甲基多态性标记，可以用于测定父源等位基因或母源等位基因的等位基因频率。将所测的等位基因频率与对照DNA样本(例如从无染色体异常的个体中获取的基因组DNA)中存在的等位基因频率进行比较。优选对照DNA是从怀有健康胎儿的孕妇的血浆中分离的。 
等位基因频率的差异表明该胎儿DNA中存在染色体异常。因此，在正常的样本中，其中几乎全部的母体DNA已被消化，在任何已知的基因座中，母源等位基因和父源等位基因的比率约为1/2或者是母源等位基因和父源等位基因各占50％。如果由于存在了特异等位基因区的部分或完整的染色体重复或缺失，而使任何基因座重复或缺失，那么这个比率将不同于50％∶50％。染色体异常可能是DNA缺失或重复，这包括了用多态性探针检测到的DNA序列。缺失或重复会导致染色体非整倍性(有或没有完整的染色体)，或者说它会导致染色体内的缺失或重复。可以用本领域技术人员已知的任何方法证实染色体非整倍性。证实染色体非整倍性的优选方法是羊膜穿刺术， 随后用荧光原位杂交(FISH)，用吉姆萨染色法的传统核型分析或用图谱核型分析(SKY)，这些都是本领域技术人员通晓的方法。 
区域内具有例如母体DNA和胎儿DNA间差异甲基化状态的任何多态性标记，或者任何其它优选是母体DNA和胎儿DNA间的外遗传基因信息差异，均可用来检测母体血浆中的胎儿DNA的母源和父源的等位基因频率。因此，差异甲基化区一经确定，技术人员便可容易借助数据库，从中挑选出位于差异甲基化DNA区内的一个，优选不止一个SNP或其它的多态性标记。或者，测定一些个体该区的序列可揭示出新的有用的核酸多态性。 
本领域技术人员通晓测定等位基因频率的方法。使用检测差异DNA区的多态性探针，就可以通过任一这类方法测定等位基因频率。例如，可以将定量标记掺入甲基多态性探针中，该多态性探针能特异地检测母源DNA或是父源DNA。然后将探针同DNA样本杂交例如用DNA印迹法并定量。适合这种方法的优选标记是放射性同位素和可以通过光密度测定法定量的荧光标记。 
在消化了血浆样本中的母体核酸后，优选用PCR扩增存在于已富集的胎儿核酸样本中的母源等位基因和父源等位基因。然后用下述各种不同的扩增方法(包括不同的引物延伸方法)测定等位基因比率。在聚合酶链式反应(PCR)和用质谱法检测引物延伸产物后，优选用引物延伸反应进行分析。本发明一个优选的用质谱分析技术测定等位基因频率的方法描述于Ding C.和Cantor C.R.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3059-64。质量阵列系统基于引物延伸产物的衬质辅助激光解吸与电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)分析(Tang，K.等，Proc Natl Acad Sci USA 96，10016-10020(1999))。 
或者，可用诸如以下的方法进行检测：电泳方法(包括毛细管电泳)、变性高效液相层析(D-HPLC)、侵入物
Figure 048361004_1
分析(Third WaveTechnologies，Inc.，Madison，Wis.)、热测序技术(Pyrosequencing，Inc.，Westborough，MA)或固相小量测序(美国专利号6,013,431， Suomalainen等，Mol.Biotechnol.Jun；15(2)：123-31，2000)。 
等位基因频率是以母源等位基因和父源等位基因分别占总等位基因(母源等位基因加上父源等位基因)的比例形式给出。因为等位频率是一种比率关系，因此可用不同或是相同的用于检测胎儿DNA的等位基因频率的探针，来测定对照DNA样本的母源或父源等位基因频率。 
优选，在同一反应中可以分析2、3、4、5-10或者甚至超过10个多态基因座。用几种多态性标记库(pool)，可以在不知道父源等位基因的情况下进行这种分析，还可以鉴定至少一种信息标记，即基因座，其中胎儿样本中两个等位基因不同，即遗传自父亲的等位基因不同于自母亲遗传的等位基因。优选，沿着所需的染色体例如21号、13号和18号染色体的不同部位选择这些标记。 
或者，首先在母体DNA和胎儿DNA差异甲基化的染色体区中选择多态性标记，用这些标记对母源和父源的基因座进行基因型分型以确定信息基因座，并且只选择等位基因有差别的那些标记，用以测定胎儿DNA样本中的等位基因频率。 
在此，母源等位基因或父源等位基因的等位基因频率差异是指至少3％的差异，优选至少10％的差异，更优选至少15％的差异。优选，血浆DNA样本中，其中母体DNA已经基本上被完全消化，母源等位基因和父源等位基因的正常等位基因比率是50％的母源等位基因和50％的父源等位基因。如果任何已知基因座的这个等位基因比率有所改变，那么胎儿等位基因所在的染色体区就可能有重复或缺失。 
在本发明的一个实施方案中，实施扩增步骤进一步富集母体血浆样本中的胎儿DNA。扩增是在通过酶促消化富集血浆DNA中的胎儿DNA之后及在检测等位基因频率/比率之前进行。扩增可以通过本领域已知的任何方法(例如聚合酶链式反应(PCR)或滚环扩增)，用退火至选择的胎儿DNA区的引物进行。选择可以退火至待 扩增的序列的寡核苷酸引物。优选，扩增是用滚环方法进行的，该方法可使扩增反应和酶促甲基化步骤结合，其中经过扩增后，胎儿和/或余留母体DNA的甲基化状态仍然保存。优选，扩增步骤后，用另一个酶促消化步骤进一步除去样本中的任何余留母体DNA。 
本文描述的用于PCT、滚环扩增和引物延伸反应的寡核苷酸引物，可以用本领域众所周知的方法进行合成，包括例如磷酸三酯法(参见Narang，S.A.等，1979，Meth.Enzymol.，68：90；和美国专利号4,356,270)、磷酸二酯法(Brown等，1979，Meth.Enzymol.，68：109)和亚磷酰胺法(Beaucage，1993，Meth.Mol.Biol.，20：33)。这些参考文献中的每个文献都通过引用全部结合到本文中。 
或者，可以掩蔽母体DNA和/或选择性扩增胎儿DNA以增加样本中的胎儿DNA数量从而检测胎儿DNA中的等位基因比率。 
一方面，本发明提供产前诊断胎儿染色体异常的方法。该方法包括下述步骤：a)获取孕妇血浆/血液/血清样本，并从所述样本中分离出DNA，b)用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶消化所分离的DNA，c)分离步骤b)中未消化的DNA，d)扩增步骤c)中未消化的DNA，同时用DNA甲基化酶使新生半甲基化DNA甲基化，e)用只消化未甲基化DNA的甲基化敏感酶消化步骤d)扩增的DNA，f)用靠近未甲基化胎儿DNA区的多态性标记测定父源或母源等位基因频率；g)将步骤f)的父源或母源等位基因频率或比率与对照DNA样本进行比较，其中等位基因频率的差异表明该胎儿患染色体异常。 
母体DNA样本的第一次消化富集了甲基化的胎儿DNA。扩增步骤通过扩增再次富集了胎儿DNA，并进一步保持了胎儿DNA的甲基化状态。 
将扩增步骤和DNA甲基化酶结合使用，所述DNA甲基化酶对于半甲基化DNA有特异性(例如Dnmtl)以使新生半甲基化DNA甲基化。由于在第一次消化时，都富集了甲基化的胎儿DNA，因此在扩增过程中，甲基化酶仅会使胎儿DNA甲基化而不会使母体DNA 甲基化。在扩增过程中，产生了甲基化的胎儿DNA和任何背景未甲基化的母体DNA。因此，用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶再次消化扩增后的DNA样本。这样的扩增程序是胎儿DNA富集的第二阶段。 
在一个优选的实施方案中，使用的是滚环扩增(RCA)。滚环扩增是一种产生多拷贝序列的等温扩增方法。在体内的滚环DNA复制中，DNA聚合酶在环状模板上延伸引物(Komberg，A.和Baker，T.A.DNA Replication，W.H.Freeman，New York，1991)，所得产物由模板互补序列串联连接的拷贝组成。RCA是一种适用于体外DNA扩增的方法(Fire，A.和Si-Qun Xu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92：4641-4645；Lui，D.等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118：1587-1594；Lizardi，P.M.等，Nature Genetics，1998，19：225-232；Kool的美国专利第5,714,320号)。RCA技术包括线性RCA(LRCA)在本领域众所周知。任何这类RCA技术都可用于本发明。 
本发明的方法适合诊断胎儿染色体异常，例如检测染色体缺失、重复和/或非整倍性。 
本文所描述方法的优势在于，用得自母亲的血浆/血液/血清DNA就可以检测染色体异常，所述血浆/血液/血清中只含有较小百分比的胎儿细胞，因此也只含有较小百分比的胎儿DNA。本发明提供通过特异性消化母体DNA来富集胎儿DNA的方法，并提供一种容易的无创性方法来获取胎儿DNA样本，并用来筛选孕妇所怀胎儿的染色体异常。 
此外，因为所述方法不取决于染色体的目视检查，所以就不必须培养胎儿细胞和/或使胎儿细胞的细胞周期同步，因此使对时间敏感的产前诊断的筛选迅速。 
所述方法尤其可用于但不限于诊断染色体非整倍性，例如唐氏综合征、特纳综合征、13三体综合征、18三体综合征和克兰费尔特综合征。 
唐氏综合征的特征为存在3拷贝21号染色体而不是单拷贝21号染色体，通常称之为21三体综合征。所有21三体综合征病例中的3-4％是由于罗伯逊易位(Robertsonia Translocation)而引起。在这种情况下，个别的染色体上发生两处断裂，通常是在第14号和第21号染色体。由于遗传物质的重排以致于一些第14号染色体被额外的第21号染色体取代。因此当染色体的数量保持正常时，就会三份复制第21号染色体物质。那么这些患儿中的一些也许只有三份重复的部分第21号染色体而不是一条完整的染色体，这种情况称作部分21三体。额外的DNA产生了唐氏综合征的身体特征和智力特征，包括头型小而头枕部扁平；斜眼；眼角处赘皮；小耳、小鼻和小嘴，身材矮小；小手和小脚；不同程度的智力残疾。 
13三体和18三体分别是指一条额外的13号或18号染色体。13三体综合征，亦称巴多综合征(Patua′s Syndrome)，其特征为出生时体重轻。在婴儿早期会经常出现呼吸中断(窒息、呼吸暂停)，精神发育迟缓通常较严重。很多受累患者出现耳聋。前额倾斜的中等小头(脑过小、小头畸形)，呈现出头顶骨间较宽的接缝和空隙。常见的是大体解剖发现脑部组织有缺陷，特别是前脑没有完全分裂(前脑无裂畸形)。在几乎50％的病例中都会发现索状组织突出及其脊膜通过椎管中的缺损(脊髓脊膜突出)。 
眼睛通常很小(小眼)、虹膜组织缺损(眼组织先天性缺损)、视网膜发育不完善(视网膜发育不良)较常见。眶上缘很浅，腭裂通常是斜的。多数病例都出现唇裂、腭裂，或者唇裂和腭裂同时出现。耳朵形状异常，位置异常偏低。 
18三体综合征，亦称爱德华兹综合征(Edward syndrome)导致婴儿偏瘦，虚弱。患者发育不良，进食困难。18三体综合征引起头型小，头后部(枕部)突出。耳位异常偏低。异常小嘴及小颚，胸骨较短。出生时，这些婴儿即便是足月出生也显得较小，哭声低弱。对声音反应低下，怀孕史可发现胎动较少。18三体婴儿中大约90％ 都有心脏缺陷。患者握拳姿势特殊，手指很难完全伸展。通常会出现关节挛缩，胳膊和腿弯曲不松驰。因脚的形状可将其称作“摇椅平底足(rocker bottom)”。18三体婴儿也许会有脊对裂(占病例的6％)、眼疾(占病例的10％)、唇裂和腭裂(多数病例)和听力丧失(多数病例)。也常见进食困难、生长缓慢、癫痫发作(第一年里约占病例的30％)、高血压、肾病和脊柱侧凸(脊柱弯曲)。男婴中，睾丸未下降到阴囊内。 
特纳综合征(Turner syndrome)，亦称X单体综合征，通常是由于丢失一条X染色体所致。活产新生儿中的发病率为1/3000。这种综合征的主要特征为身材矮小，颈蹼，无第二性征或第二性征发育不全，无月经初潮，主动脉缩窄(狭窄)，眼和骨异常。由于相关异常，通常该病在出生时就可诊断出，或者是当青春期无月经初潮或月经初潮推迟及正常第二性征延迟发育时做出诊断。本文描述的方法能够在出生前诊断出该病。 
克兰费尔特综合征(Klinefelter syndrome)，是指多一条额外的性染色体的男性，XXY核型代替了通常的男性XY核型。该综合征的特征为男性有女性型乳房，面部和身体毛发稀少，小睾丸，精子缺乏。虽然患者无智力障碍，但是多数XXY男性有一定程度的语言能力不足。 
本发明的方法提供诊断染色体异常和相关综合征的无创性方法。 
下面将参考以下的实施例进一步说明本发明。应该理解的是，以下实施例仅仅是说明性的，在本发明的范围内可以对细节进行修改。 
实施例 
下文是说明用母体血浆DNA诊断唐氏综合征的步骤的实例。这个方法适用于任何染色体非整倍性或染色体DNA重复。 
在唐氏综合征中，胎儿有三个21号染色体。90％的21三 体病例中，胎儿从母亲那里获得两个21号染色体并从父亲那里获得一个21号染色体。如下检测额外的21号染色体DNA。 
筛选21号染色体中有差异甲基化的DNA区，即胎儿DNA中甲基化的而母体DNA中没有甲基化的DNA区(主要是外周血细胞)。 
已经证实，紧靠差异甲基化DNA区的多态性标记可以用作母源DNA和父源DNA的标记。 
血浆样本得自孕妇，而DNA自样本中分离。 
用只切割未甲基化DNA序列CCGG的甲基化敏感酶(例如Hpa II)处理所分离的血浆DNA。将酶用来消化未甲基化的母体DNA，留下的仅是甲基化的胎儿DNA片段。或者，也可以使用只切割甲基化DNA的酶(例如Dpn I，这种酶识别序列GATC)，随后的步骤作相应调整。 
可以观察到21三体中的父源等位基因频率和正常个体中的父源等位基因频率之间的显著性差异(见下表)。表中，等位基因A是母源特有的，而等位基因B是父源特有的。 
在下表中，如果父源等位基因频率小于对照的，就表明有唐氏综合征。 
  母体DNA  胎儿DNA  父源等位基因频率
21三体 AA  AAB  1/3或33.3％
对照样本 AA  AB  1/2或50％
可以用本领域已知的方法例如羊膜穿刺术，证实染色体异常应归于由一条额外的21号染色体代表的染色体非整倍性。 
如果酶的消化效率低于100％，仍会观察到等位基因频率的差异，但不是16.7％的差异(如表中说明)，观察到的差异可能是在5-10％的范围之间，因此优选，将对照基因座(正常个体中的C/D等位基因或非-非整倍性基因座，见下表)用来提供对照。下表对此作了说 明： 
  母体DNA  胎儿DNA  B(或D)％ 100％消化 B(或D)％98％消化
21三体 AA  AAB  33.3％ 20％
非-非整倍性 CC  CD  50％ 25％
在没有100％消化的情况下，为了进一步富集胎儿DNA，上述方法也可以结合附加的扩增方案。假定使用在胎儿DNA中是甲基化的而在母体DNA中是没有甲基化的DNA区。 
多数母体DNA要用上述的甲基化敏感酶进行消化。这是富集胎儿DNA的第一个步骤。 
然后通过等温机理(例如滚环扩增)扩增母体DNA和胎儿DNA。同时，使用对半甲基化DNA有特异性的DNA甲基化酶(例如Dnmtl)使新生半甲基化DNA甲基化。由于最初只有胎儿DNA是甲基化的，因此甲基化酶将只能使扩增过程中的胎儿DNA甲基化。结果，就产生了甲基化的胎儿DNA和未甲基化DNA。 
然后再用消化未甲基化母体DNA的甲基化敏感酶(例如HpaII)，消化经扩增的样本。这是富集胎儿DNA的第二个步骤。这个步骤后，留下的绝大多数DNA就都是胎儿DNA了。在将来测定DNA数量时，这就等同于100％Hpa II消化。 
本文描述的所有参考文献都通过引用结合到本文中。 

Claims (4)

1.一种用于产前诊断染色体异常的试剂盒，所述试剂盒包括甲基化敏感酶；至少一对核酸扩增引物，该核酸扩增引物能够退火并因此扩增位点侧翼区，该位点包含至少一个多态基因座，该多态基因座在母体血浆中存在的胎儿DNA和母体DNA中差异甲基化区内；至少一种引物或探针，以便检测至少一个多态基因座中的等位基因；和说明书手册，指导使用者进行下述步骤：获取孕妇血浆样本，用甲基化敏感酶选择性消化所述血浆样本中存在的核酸以富集样本中的胎儿核酸，用扩增引物进行核酸扩增，检测已富集了胎儿核酸的样本中存在的等位基因，解释结果，如果基因座中两个不同的等位基因的比率偏离了等位基因以等量存在的对照，就表明该胎儿患染色体异常。
2.权利要求1的试剂盒，所述试剂盒还包括一组对照核酸，其中所述对照包括从怀有携带了已知的染色体异常的胎儿的孕妇中分离的核酸和从怀有无染色体异常的胎儿的孕妇中分离的核酸。
3.权利要求2的试剂盒，所述试剂盒还包括至少一对扩增引物和检测引物或探针的内部对照，其中所述引物和/或探针选自在母体血浆中存在的胎儿DNA和母体DNA中被差异甲基化的但存在于重复和缺失罕见的染色体上的核酸区，以便提供内部对照。
4.权利要求2的试剂盒，其中所述产前诊断是为了诊断13号、18号或21号染色体重复，而内部对照位于任何其它的不是13号、18号或21号染色体的常染色体上。
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