DE102015111329B4

DE102015111329B4 - Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen oder Chromosomen eines Genoms in einer Probe

Info

Publication number: DE102015111329B4
Application number: DE102015111329.5A
Authority: DE
Inventors: Bernd-Peter Ernst; Jörg Schrader
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2035-07-14
Also published as: EP3322822A1; WO2017009338A1; DE102015111329A1

Abstract

Zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Chromosomen eines Genoms, von dem DNS in einer Probe (1) stammt, wird in einem gemeinsamen Verstärkungsschritt (4) mindestens ein spezifischer Abschnitt der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome verstärkt. Der mindestens eine verstärkte spezifische Abschnitt der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome wird mit einem Lumineszenzmarker (7) markiert. Die verstärkten spezifischen Abschnitte (8) der DNS von den verschiedenen Chromosomen werden durch Elektrophorese (9) getrennt. Eine Lichtmenge (12) von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker (7) wird für die DNS von jedem der verschiedenen Chromosome getrennt gemessen (11) und die relative Häufigkeit der verschiedenen Chromosome des Genoms wird aus Verhältnissen der für die DNS von jedem der verschiedenen Chromosome getrennt gemessenen Lichtmengen (12) bestimmt (15).

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von denen DNS in einer Probe stammt. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1.
Die Feststellung der relativen Häufigkeit von verschiedenen Chromosomen eines Genoms kann beispielsweise dazu verwendet werden, Trisomien zu erkennen. Die Feststellung der relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen eines Genoms kann beispielsweise dazu verwendet werden, bestimmte Mutationen des Genoms aufzuzeigen.
STAND DER TECHNIK
Aus der EP 0 994 963 B2 ist es bekannt, dass sich in dem von Blutzellen freien Blutplasma, das von einer Blutprobe einer Schwangeren abgetrennt werden kann, neben apoptotischer DNS der Schwangeren auch apoptotische DNS des Fötus findet. So kann beispielsweise das Geschlecht des Fötus bestimmt werden, indem die in dem Blutplasma enthaltene apoptotische DNS auf das Vorhandensein von Abschnitten der DNS untersucht wird, die nur im Y-Chromosom vorkommen und damit für das Vorhandensein des Y-Chromosoms im Genom des Fötus spezifisch sind. Weiterhin ist es aus der EP 0 994 963 B2 bekannt, dass die apoptotische DNS mit quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PKR) auf die relative Häufigkeit der Chromosome des Fötus gegenüber den Chromosomen der Schwangeren untersucht werden kann, um beispielsweise eine Trisomie 21 bei dem Fötus zu erkennen, weil bei einem Fötus mit Aneuploidie gegenüber einem Fötus mit Euploidie eine erhöhte relative Konzentration an fötaler DNS auftritt und Trisomie 21 die häufigste Form von Aneuploidie ist.
Außerdem ist es bekannt, die apoptotische DNS in einer Blutplasmaprobe einer Schwangeren durch quantitative PKR in einem Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 auf die relative Häufigkeit der mit der größten Wahrscheinlichkeit von einer Trisomie betroffenen Chromosome 13, 18 und 21 des menschlichen Genoms zu untersuchen. Bei einer solchen quantitativen PKR wird die absolute Anzahl der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der Chromosome 13, 18 und 21 bestimmt. Wenn dabei eine signifikante Erhöhung der relativen Häufigkeit bei einem dieser Chromosome auftritt, liegt eine Trisomie 13, 18 bzw. 21 bei dem Fötus vor. Ausgehend von einem Anteil der fötalen DNS an der gesamten apoptotischen DNS in dem Blutplasma der Mutter von 10 % ist im Falle einer Trisomie des Fötus die relative Häufigkeit des betroffenen Chromosoms um 5 % erhöht, weil es nicht nur 0,9 mal 2 mal von der Mutter vorliegt und 0,1 mal 2 mal von dem Fötus, d. h. insgesamt 20 mal, sondern 0,9 mal 2 mal von der Mutter und 0,1 mal 3 mal von dem Fötus, d. h. insgesamt 21 mal. Bei der quantitativen PKR muss dieser Unterschied von 5 % in der relativen Häufigkeit der Chromosome bei der Untersuchung auf Trisomie des Fötus sicher aufgelöst werden. Hierzu müssen alle bei der Bestimmung der absoluten Anzahl der einzelnen PKR-Produkte, d. h. der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome, auftretenden Fehler ausreichend reduziert werden. Die für eine solche quantitative PKR benötigten speziellen Mikrotiter-Platten sind sehr kostspielig und bedürfen zur quantitativen Auswertung spezieller Vorrichtungen.
Bei der Durchführung eines sogenannten Vaterschaftstests wird DNS aus einer geeigneten Probe von dem Kind getrennt, aber parallel zu DNS aus einer geeigneten Probe von dem potentiellen Vater einer PKR unterworfen, um Abschnitte der DNS zu verstärken, die von Mensch zu Mensch variieren. In der Regel handelt es sich dabei um Bereiche der DNS, in denen unterschiedlich häufige Wiederholungen bestimmter Sequenzen von Basenpaaren auftreten, d. h. von sogenannten Short Tandem Repeats (STR), wobei die Anzahl der Wiederholungen von Mensch zu Mensch variiert. Bereits bei der PKR werden die verstärkten Abschnitte mit einem Lumineszenzmarker gekoppelt. Nach der PKR werden die verstärkten Abschnitte der DNS einer Elektrophorese unterworfen. Dabei finden sich die verstärkten Abschnitte nach Laufstrecken bei der Elektrophorese, die von der genauen Anzahl der Wiederholungen der Sequenz von Basenpaaren abhängen. Dadurch ergeben sich bei der Registrierung des Fluoreszenzlichts von den Lumineszenzmarkern je nach Erbgut unterschiedliche Linienmuster. Wenn die Linien in dem Linienmuster des Vaters mit einer signifikanten Häufigkeit auch in dem Linienmuster des Kindes auftreten, ist der Vaterschaftsnachweis erbracht.
DIEGO-ALVAREZ, D. [u.a.]: Application of quantitative fluorescent PCR with short tandem repeat markers to the study of aneuploidies in spontaneous miscarriages. Hum. Reprod. (2005) 20 (5) 1235–43 beschreiben die Anwendung von quantitativer fluoreszenter PKR mit STR-Markern zur Untersuchung von Aneuploidien bei spontanen Fehlgeburten. Verschiedene, für bestimmte Chromosome, darunter die Chromosome 13, 18 und 21 des humanen Genoms spezifische Abschnitte der DNS aus einer Probe von dem abgegangenen Fötus werden mit quantitativer PKR verstärkt und fluoreszent markiert. Dann werden die verstärkten Abschnitte durch Elektrophorese getrennt, wobei auch die verstärkten Abschnitte mit unterschiedlich langen STR aufgetrennt werden. Eine Trisomie wird dann dadurch erkannt, dass entweder drei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 1:1:1 detektiert werden, die für drei verschiedene Erbinformationen stehen, oder zwei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 2:1, die für zwei in Hinblick auf die STR-Länge verschiedene Erbinformationen stehen, von denen die eine doppelt so häufig vorkommt wie die andere.
SAADI, A.V. [u.a.]: Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) for Prenatal Diagnosis of Chromosomal Aneuploidies. Int. J. Hum. Genet. (2010) 10 (1–3) 121—129 beschreiben die Anwendung von quantitative Fluoreszenz-PKR zur pränatalen Diagnostik von chromosomalen Aneuploidien. Auch dabei werden verschiedene, für bestimmte Chromosome, darunter die Chromosome 13, 18 und 21 des humanen Genoms spezifische Abschnitte der DNS aus fötalen Zellen mit quantitativer PKR verstärkt und fluoreszent markiert. Dann werden die verstärkten Abschnitte durch Kapillargelelektrophorese aufgetrennt, wobei auch die verstärkten Abschnitte mit unterschiedlich langen STR aufgetrennt werden. Eine Trisomie wird auch hier dadurch erkannt, dass entweder drei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 1:1:1 oder zwei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 2:1 detektiert werden.
Cytochrom P450 ist ein Enzym in der Leber, das bereits 1958 gefunden wurde und in Anwesenheit reduzierender Stoffe ein UV-Absorptionsmaximum bei 450 nm aufweist, welches ihm seinen Namen gab. Das Enzym Cytochrom P450 ist durch das Gen P450 CYP2D6 auf dem Chromosom 22 des humanen Genoms codiert, wobei das Gen P450 CYP2D6 bei verschiedenen Personen in unterschiedlicher Anzahl und Form vorliegt. Wenn ein oder zwei voll aktive Allele des Gens auf dem Chromosom 22 vorliegen, werden CYP2D6 Substrate (Pharmaka etc.) in der Leber normal abgebaut. Man nennt die entsprechenden Personen Extensive Metabolizer (EM). Liegen zwei mutierte, inaktive Allele dieses Enzymes auf Chromosom 22 vor, werden CYP2P6 Substrate in der Leber kaum abgebaut. Man nennt die entsprechenden Personen Poor Metabolizer (PM). Liegen heterozygot ein defizientes und ein eingeschränkt funktionales Allel vor, werden CYP2P6 Substrate in der Leber reduziert abgebaut. Man nennt die entsprechenden Personen Intermedite Metabolizer (IM). Liegt eine Genmultiplikation des Gens P450 CYP2P6 in Form von bis zu 12 Extrakopien vor, nennt man die betroffenen Personen Ultrarapid Metabolizer (UM), weil sie zu stark erhöhten Stoffwechselleistungen fähig sind. Die verschiedenen Metabolizer-Typen sind bislang nicht durch ein einfaches Verfahren unterscheidbar.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufzuzeigen, mit dem ohne Durchführung einer aufwändigen quantitativen PKR die relative Häufigkeit von Genen und/oder Chromosomen in einer Probe mit ausreichender Genauigkeit bestimmt werden kann, so dass zum Beispiel eine Trisomie eines Fötus anhand der apoptotischen DNS von dem Fötus in einer Blutplasmaprobe seiner Mutter erkannt werden kann.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von denen DNS in einer Probe stammt, wird in einem gemeinsamen Verstärkungsschritt mindestens ein spezifischer Abschnitt der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt. Der mindestens eine verstärkte spezifische Abschnitt der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome wird mit einem Lumineszenzmarker markiert. Dieses Markieren kann in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt, grundsätzlich aber auch später erfolgen. Die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen werden durch Elektrophorese getrennt. Dies impliziert, dass die spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen, die verstärkt werden, so festgelegt werden, dass ihre Trennung durch Elektrophorese möglich ist. Eine Lichtmenge von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker wird für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessen. Aus Verhältnissen der für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lichtmengen wird dann die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms bestimmt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird kein Lumineszenzlicht von einzelnen Kopien der spezifischen Abschnitte der DNS detektiert. Vielmehr wird das Lumineszenzlicht für die sich bei der Elektrophorese jeweils in einem Band oder einer Linie bewegenden Kopien kumulativ als Lichtmenge gemessen. Diese Lichtmenge entspricht einer bestimmten Menge der spezifischen Abschnitte der DNS von dem jeweiligen Gen oder Chromosom. Bei ausreichender Anzahl der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen kann bereits aus diesem Ergebnis auf eine relative Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms rückgeschlossen werden, um beispielsweise das Geschlecht eines Fötus aus einer Blutplasmaprobe seiner Mutter zu bestimmen. Es versteht sich, dass dazu die relative Häufigkeit des Y-Chromosoms gegenüber dem X-Chromosom und/oder einem anderen Chromosom in der Blutplasmaprobe zu bestimmten ist. Die bis hierher beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch schon ausreichend sein, um das Vorliegen einer Trisomie bei dem Fötus zu erkennen. Hierzu kann es jedoch hilfreich sein, weitere Schritte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen, wie sie im Folgenden beschrieben werden.
Die bis hierher beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind grundsätzlich ausreichend, um das Vorliegen einer Genmultiplikation eines Gens bei einem Genom zu erkennen, von dem die DNS in der untersuchten Probe stammt. Ebenso kann der Umfang der Genmultiplikation gegenüber mindestens einem anderen Gen, das als Maßstab dient, analysiert werden.
Die bis hierher beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen grundsätzlich denjenigen, wie sie auch bei der Durchführung eines bekannten und etablierten Vaterschaftstests zur Anwendung kommen. Unterschiede bestehen jedoch dahingehend, dass die bei dem gemeinsamen Verstärkungsschritt verstärkten Abschnitte der DNS spezifische Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen sind. Das heißt, es handelt sich um Abschnitte, die das Vorhandensein des jeweiligen Gens und/oder Chromosoms im Ursprungsmaterial der DNS anzeigen, und zwar möglichst unabhängig von der spezifischen Erbinformation des in der Probe enthaltenen Gens und/oder Chromosoms. Ein weiterer Unterschied zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem bekannten Vaterschaftstest besteht darin, dass eine quantitative Auswertung des für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt erfassten Lumineszenzlichts erfolgt und daraus auf die Konzentration der entsprechenden DNS und damit der zugehörigen Chromosome in der Probe geschlossen wird, und nicht nur auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein entsprechender DNS in der Probe. Trotz dieser wesentlichen Unterschiede können grundsätzlich dieselben Ausrüstungen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung wie für den bekannten und etablierten Vaterschaftstest verwendet werden. Anzupassen an das erfindungsgemäße Verfahren sind jedoch die Substanzen, die bei dem gemeinsamen Verstärkungsschritt die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome festlegen. Außerdem ist die Auswertung auf die erfassten Lichtmengen zu konzentrieren. Zudem ist es sinnvoll, eine Eichung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf die Verknüpfung der gemessenen Lichtmenge des Lumineszenzlichts von dem Lumineszenzmarker für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit dem Vorhandensein einer bestimmten Menge von Abschnitten der DNS von dem jeweiligen Gen und/oder Chromosom in der Probe vorzunehmen. Durch die grundsätzliche Übereinstimmung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem bekannten und etablierten Vaterschaftstest kann zudem auf den für diesen Vaterschaftstest vorhandenen Zulassungen aufgebaut werden, was die Zulassung des erfindungsgemäßen Verfahrens erleichtert.
Die Trennung der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen kann insbesondere durch bekannte Verfahren der Gel- oder Kapillarelektrophorese erfolgen. Hierbei handelt es sich um etablierte Techniken, für deren Anwendung ausgereifte Laborgeräte zur Verfügung stehen.
Die spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome können insbesondere in einer gemeinsamen PKR verstärkt werden. Unmittelbar bei dieser PKR können die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS mit dem Lumineszenzmarker markiert werden. Für die PKR sind auf die zu verstärkenden spezifischen Abschnitte der DNS und den Lumineszenzmarker abgestimmte Primer auszuwählen. Wie dies zu geschehen hat, gehört zum Fachwissen eines Fachmanns auf dem Gebiet genetischer Tests.
Die PKR kann eine Anzahl der Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome zwischen 15 und 30 mal verdoppeln. Bei einer 20-fachen Verdopplung werden von einem in der Probe vorhandenen Abschnitt der DNS 1 Millionen Kopien erstellt. Auch wenn diese Kopien nicht vollständig bei dem Messen der Lichtmenge von dem Lumineszenzmarker des entsprechenden Abschnitts der DNS vorhanden sind, weil z. B. nur ein Teil des Produkts der PKR der Elektrophorese zum Trennen der DNS-Abschnitte von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen unterworfen wird, ermöglicht diese große Anzahl der Kopien eine genaue Zuordnung der gemessenen Lichtmenge zu einer bestimmten Anzahl des jeweiligen Abschnitts der DNS in der Probe. Bei der PKR ist jedoch zu vermeiden, dass es zu einer Sättigung kommt, so dass bestimmte Abschnitte der DNS von den verschiedenen Chromosomen bei den letzten Zyklen der PKR nicht mehr vollständig dupliziert werden, wodurch die Korrelation zwischen der gemessenen Lichtmenge und der tatsächlichen Anzahl der Abschnitte der DNS in der Probe verloren geht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen mit demselben Lumineszenzfarbstoff markiert werden, weil die Trennung der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen durch die Elektrophorese erfolgt. Hierdurch wird auch das Messen der Lichtmenge von dem Lumineszenzfarbstoff vereinfacht und eine unmittelbare Vergleichbarkeit der gemessenen Lichtmengen erreicht. Grundsätzlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aber auch mehrere verschiedene Lumineszenzfarbstoffe verwendet werden.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt mehrere nicht überlappende spezifische Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt werden, kann hierdurch die in Bezug auf die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome gemessene Lichtmenge vervielfältigt werden. Dazu ist dann jeder der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit einem Lumineszenzmarker zu markieren; alle verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS sind durch die Gelelektrophorese zu trennen; für jeden der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS ist getrennt eine Lichtmenge von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker zu messen; und vor dem Schritt des Bestimmens der relativen Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome sind die für die mehreren spezifischen Abschnitte der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome zu addieren. Auf diese Weise wird der Fehler, der zwischen dem Verhältnis der Lichtmengen und der interessierenden relativen Häufigkeit der Gene und/oder Chromosome gegeben ist, wesentlich verringert. Indem die in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt verstärkten Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome nicht miteinander überlappen, werden die einzelnen Abschnitte unabhängig voneinander verstärkt und entsprechen mehreren, aber unter genau denselben Randbedingungen erfolgenden Durchführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf dieselbe Probe.
Vorzugsweise ist die Anzahl von spezifischen Abschnitten der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome, die in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt verstärkt werden, gleich. Diese gleiche Anzahl kann konkret in einem Bereich von 3 bis 40 liegen, wobei die obere Grenze durch die in der Elektrophorese maximal trennbare Anzahl von unterschiedlich langen Abschnitten und bei Genen auch durch die maximale Anzahl von überhaupt möglichen unterschiedlichen nicht überlappenden Abschnitten bestimmt wird. Wenn beispielsweise 40 Abschnitte der DNS von drei verschiedenen Chromosomen verstärkt werden, also insgesamt 120 verschiedene Abschnitte durch die Elektrophorese getrennt werden müssen, liegen die verschiedenen Abschnitte nur noch wenige Basenpaare nebeneinander. Günstig erweist sich eine Zahl von etwa 10 spezifischen Abschnitten der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome. Damit resultieren bei drei verschiedenen Chromosomen 30 verschiedene Abschnitte, die durch etablierte PKR problemlos gleichzeitig verstärkt und durch etablierte Elektrophorese einfach getrennt werden können.
Vorzugsweise unterscheiden sich alle spezifischen Abschnitte der DNS um mindestens 4, besser 7 oder 10 Basenpaare in ihrer Länge, um eine einfache Trennbarkeit der Abschnitte bei der Elektrophorese zu ermöglichen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den spezifischen Abschnitten der DNS, die verstärkt werden, um lebenswichtige Abschnitte der DNS, d. h. um Abschnitte der DNS die bei jedem Genom, wenn das jeweilige Individuum lebensfähig ist, identisch vorhanden sind. Dies impliziert, dass die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS jeweils eine feste Länge aufweisen und entsprechend bei der Elektrophorese nach bestimmten Laufstrecken zu finden sind.
Um den statistischen Fehler bei der Zuordnung des Verhältnisses der gemessenen Lichtmenge zu der interessierenden relativen Häufigkeit der Gene und/oder Chromosome in der Probe zu reduzieren, können auch die Schritte des Trennens, des Markierens und des Messens für mehrere Teilprodukte des gemeinsamen Verstärkungsschritts getrennt durchgeführt werden und vor dem Schritt des Bestimmens die für die mehreren Teilproduktmengen gemessenen Lichtmengen für die DNS von jeweils demselben der verschiedenen Gene und/oder Chromosome addiert werden. Auch hierdurch erhöhen sich die Lichtmengen und reduziert sich der Fehler wie bei mehreren verstärkten Abschnitten der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome. Allerdings erfolgen die Schritte des Trennens und des Messens für die verschiedenen Teilprodukte nicht unter genau denselben Bedingungen, und der Gesamtaufwand für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht sich um die zusätzlichen parallel durchgeführten Schritte des Trennens und Messens.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die Bestimmung des Verhältnisses von Chromosomen anhand von apoptotischer DNS in einer Blutplasmaprobe geeignet, um aus der Analyse des Blutplasmas einer Schwangeren auf Trisomie bei dem Fötus zu schließen. Entsprechend umfassen die verschiedenen Chromosome, deren relative Häufigkeit bestimmt wird, das Chromosom 13 und/oder das Chromosom 18 und/oder das Chromosom 21 des humanen Genoms. Trisomie 13, 18 und 21 sind die häufigsten Formen von Trisomie beim Menschen, und sie treten nicht gleichzeitig auf. Aus der Bestimmung des relativen Verhältnisses der Chromosome 13, 18 und 21 kann daher darauf geschlossen werden, ob bei dem Fötus Trisomie 13, 18 oder 21 vorliegt, weil dann die relative Häufigkeit des entsprechenden Chromosoms signifikant erhöht ist. Bei einem relativen Anteil der apoptotischen DNS des Fötus an der Gesamt-DNS von 10 % ist im Falle einer Trisomie die relative Häufigkeit des betroffenen Chromosoms gegenüber den anderen Chromosomen um 5 % erhöht. Das erfindungsgemäße Verfahren ist problemlos so durchführbar, dass die relative Häufigkeit der verschiedenen Chromosome des Genoms mit einer höheren Genauigkeit als 5 % bestimmt wird. Problemlos erreichbar ist eine Genauigkeit von 2 % oder noch besser. So kann auch bei einem geringeren Anteil der apoptotischen DNS des Fötus an der insgesamt in der Blutplasmaprobe enthaltenen apoptotischen DNS als 10 % eine Trisomie des Fötus zuverlässig erkannt werden.
Um die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu maximieren, können die für die verschiedenen spezifischen Abschnitte der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen des Lumineszenzlichts vor dem Schritt des Bestimmens der interessierenden relativen Häufigkeit der Gene und/oder Chromosome mit Normierungsfaktoren multipliziert werden, die unterschiedliche Verstärkungen, Trennungen, Markierungen und/oder Messungen ausgleichen. Diese Normierungsfaktoren können einfach ermittelt werden, indem Proben mit bekannten Mengen der spezifischen Abschnitte der DNS dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden.
Wenn mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die relative Häufigkeit eines Gens bestimmt wird, das in einer aktiven und/oder einer inaktiven Variante vorliegen kann, dann kann die relative Häufigkeit des Gens in seiner aktiven Variante und/oder in seiner inaktiven Variante bei dem Genom anhand der DNS in der Probe untersucht werden. Dazu sind die zu verstärkenden Abschnitte der DNS spezifisch für die jeweils interessierende Variante der DNS auszubilden. Als Vergleichsmaßstab dient dabei sinnvoller Weise mindestens ein lebenswichtiges Gen, bei dem keine Genmultiplikation auftritt. So ist, wenn ein Abschnitt der DNS verstärkt wird, der für ein funktionales Allel des Gens P450 CYP2D6 spezifisch ist, die von dem markierten verstärkten Abschnitt gemessene Lichtmenge je nach Metabolizer-Typ nullmal, 0,5-mal, genauso oder n-mal so groß wie diejenige von dem markierten verstärkten Abschnitt des als Vergleichsmaßstab dienenden Gens.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Lumineszenzmarker die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Lumineszenzmarker, zwei Lumineszenzmarker oder mehr Lumineszenzmarker verwendet werden. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 ist ein Ablaufdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens; und
2 zeigt das Ergebnis einer Gelelektrophorese und einer Messung von Lichtmengen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nach 1.
FIGURENBESCHREIBUNG
Das in 1 gezeigte Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die relative Häufigkeit verschiedener interessierender Chromosome eines Genoms untersucht wird, geht von einer Blutprobe 1 aus. In einem Schritt Trennen 2 werden insbesondere Blutzellen von der Blutprobe 1 abgetrennt, und es wird eine nur noch apoptotische DNS enthaltende Blutplasmaprobe 3 erhalten. In einer PKR 4 wird die Blutplasmaprobe zusammen mit Polymerase 5, Primern 6 und Lumineszenzfarbstoff 7 thermischen Zyklen ausgesetzt, um eine Polymerasekettenreaktion zur Verstärkung spezifischer Abschnitte der DNS der verschiedenen interessierenden Chromosome auszulösen. Dies geschieht typischerweise in einem sogenannten Thermozykler. Bei geeigneter Ausbildung der Primer 6 markiert der der PKR 4 zugesetzte Lumineszenzfarbstoff 7 die verstärkten Abschnitte der DNS. Das derart gewonnene PKR-Produkt 8 wird einer Elektrophorese 9 unterworfen, um die verschiedenen Abschnitte der DNS, die in der PKR 4 verstärkt wurden, zu trennen. Es versteht sich, dass dazu die Primer 6 so abzustimmen sind, dass die verstärkten Abschnitte unterschiedlich lang sind und entsprechend bei der Elektrophorese 9 unterschiedlich schnell und damit unterschiedlich weit wandern. Anschließend werden in einem Schritt Messen 11 Lichtmengen von dem Lumineszenzmarker 7 für die einzelnen durch die Elektrophorese 9 getrennten DNS-Abschnitte 10 gemessen. Es versteht sich, dass die Lichtmengen von dem Lumineszenzfarbstoff für gleiche Zeiten für die getrennten DNS-Abschnitte 10 und unter gleichen Bedingungen gemessen werden. Zumindest erfolgt das Lichtmengenmessen unter definierten Bedingungen, die einen Rückschluss auf die Anzahl der in der Blutplasmaprobe 3 enthaltenen Abschnitte der DNS zulassen. Die von dem Messen 11 erhaltenen Lichtmengen 12 werden in einem Schritt Normieren 13 bezüglich der unterschiedlichen Verstärkungen in der PKR 4, Trennungen in der Elektrophorese 9 und Messungen bei dem Messen 11 durch Multiplikation mit Normierungsfaktoren normiert. Aus einem Verhältnis von Summen der normierten Lichtmengen 14 für die DNS von jedem der verschiedenen Chromosome wird dann in einem Schritt Bestimmen 15 die relative Häufigkeit dieser Chromosome bestimmt.
2 zeigt oben schematisch die als Ergebnis der Elektrophorese 9 gemäß 1 getrennten DNS-Abschnitte 10. Die verschiedenen DNS-Abschnitte sind unter Einfluss eines elektrischen Felds abhängig von ihrer Länge in Basenpaaren bp einen unterschiedlich weiten Weg s in einem Gel 16 gewandert. Dabei handelt es sich bei den getrennten DNS-Abschnitten 10 um jeweils vier nicht überlappende Abschnitte der Chromosome 13, 18 und 21 mit gleichen Unterschieden ihrer Länge in Basenpaaren bp und entsprechend gleichen Abständen Δ s in dem Gel 16. Unten in 2 sind die Lichtmengen L an Lumineszenzlicht von den einzelnen getrennten DNS-Abschnitten 13-1 bis 21-4 in derselben Reihenfolge der DNS-Abschnitte aufgetragen, wie sie in dem Gel 16 auftreten. Alle Lichtmengen L sind im Wesentlichen gleich. Die Summe der Lichtmengen von den vier Abschnitten 21-1 bis 21-4 des Chromosoms 21 ist jedoch um 5 % größer als die Summen der Lichtmengen von den DNS-Abschnitten 13-1 bis 13-4 und 18-1 bis 18-4. Konkret ist die Summe der Lichtmenge von den Abschnitten der DNS des Chromosoms 21 um 5 % höher als die Summe der Lichtmengen L des Lumineszenzlichts von den Abschnitten der DNS der beiden anderen Chromosomen 13 und 18. Dies entspricht dem Vorliegen einer Trisomie 21 bei einem Fötus, wenn die Blutprobe 1 gemäß 1 von seiner Mutter genommen wurde und seine apoptotische DNS 10 % der gesamten apoptotischen DNS in der Blutplasmaprobe 3 gemäß 1 ausmacht. Bei einer Trisomie 13 oder 18 ist entsprechend die Lichtmenge von den Abschnitten der DNS und dem Chromosom 13 bzw. 18 erhöht. Wenn keine Trisomie 13, 18 oder 21 vorliegt, sind die Summen der Lichtmengen der Abschnitte der DNS von allen drei Chromosomen gleich.
Ausführungsbeispiele und Materialien
Primer 6 und Lumineszenzfarbstoff 7:
Alle Primer 6 sind zwischen 15 und 35 Basen lang, im Idealfall 18 bis 20 Basen. Für jeden zu verstärkenden Abschnitt der DNS wird entweder der forward Primer oder der reverse Primer am 5´-Ende mit dem Lumineszenzfarbstoff 7, vorzugsweise einem isomerenreinen Lumineszenzfarbstoff durch kovalente Bindung gekoppelt. Als Lumineszenzfarbstoff eignen sich zum Beispiel die bekannten Lumineszenzfarbstoffe Alexa 350, Alexa 488, AMCA, ATTO 390, Fluorescein (5-Isomer), 6-FAM, 6-TET, 6-HEX, JOE, NBD, Rhodamine 6G, Rhodamine Green, Rhodamine Red, TAMRA, ROX und Texas Red.
PKR 4:
Alle Reagenzien und Geräte sind von Life Technologies GmbH, Darmstadt erhältlich, soweit im Folgenden nichts anderes angegeben ist.
200 ng DNA, 200 µM dNTPs (1 µl 10mM dNTPs/ 50µl), 1–5 µl 10 × Puffer, 2–10 µl Primer Mastermix (mit je 0,1 bis 20 pmol/µl forward und reverse Primer im Verhältnis (1:1) für jedes PKR-Produkt, Primerkonzentration in der PKR 0,1 µM bis 20 µM) und 5 units / 50 µl AmpliTaq Gold werden mit Reinstwasser auf 10–50 µl aufgefüllt. Gut geeignet ist ein Ansatzvolumen von 12,5 µl, das 1,25 µl 10 × Goldstar-Pufferlösung und 0,2 µl (1 unit) Ampli Taq Gold Polymerase enthält. Es wird folgendes PKR-Protokoll in einem Sensoquest Labcycler (Sensoquest GmbH, Göttingen) angewendet:
Eingangs zur Aktivierung der Taq-Polymerase:

95 °C 11 für 1 Minute
96 °C für 2 Minuten
dann
94 °C für 1 Minute
60 °C für 1 Minute
70 °C für 1,5 Minuten
für 10 Zyklen,
dann
90 °C für 1 Minute
60 °C für 1 Minute
70 °C für 1,5 Minuten
für 10 bis 22 Zyklen,
dann
60 °C für 30 Minuten
4 °C Haltetemperatur

Nach der PKR wird das PKR-Produkt denaturiert. Hierzu werden 12 µl Formamid, 0,8 µl Standard (ROX 500) und 1–10 µl Produktlösung zusammen pipettiert (am besten geeignet sind 1–2 µl) und in einem Thermocycler für 2 min auf 94 °C erhitzt. Danach werden die Proben für 5 min auf 4 °C gekühlt und anschließend in einem GeneMapper_50_POP-7 nach den Vorgaben des Herstellers durch Elektrophorese aufgetrennt und die entstandenen Fragmente durch GeneMapper ID Software und GeneScan Software unter den vorgegebenen Bedingungen des Herstellers quantifiziert und analysiert. Die Datenaufnahme erfolgt durch die Software des Herstellers, und auch die Prozess-Schritte erfolgen nach den Angaben des Herstellers. Die Software zählt die Lichtmengen von dem Lumineszenzfarbstoff und bildet die Fläche unter den zu den verschiedenen getrennten verstärkten Abschnitte zugehörigen Peaks als Integral ab. Die Software GeneMapper und GeneScan lässt es zu, dass diese integrierten Lichtmengen-Daten in Excel-Tabellen exportiert werden, um sie weiter auszuwerten.
Zu den verwendbaren Sequenzern zählen die folgenden ABI-Produkte:

Applied Biosystems 3130 or 3130 xl Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 3.0 Section 5.A GeneMapper ID Software, Version 3.2 GeneScan Software and Windows^®
Operating Systems ABI PRISM 3100 or 3100-Avant Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 2.0 Section 5.A ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 1.0.1 or 1.1 Section 5.B ABI P
Applied Biosystems 3730 or 3730 xl Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 3.0 Section 5.A GeneMapper ID Software, Version 1.3 GeneScan Software and Windows^®

Bezugszeichenliste

1: Blutprobe
2: Trennen
3: Blutplasmaprobe
4: PKR
5: Polymerase
6: Prima
7: Lumineszenzfarbstoff
8: PKR-Produkt
9: Elektrophorese
10: getrennte DNS-Abschnitte
11: Messen
12: Lichtmengen
13-1: Abschnitt der DNS von Chromosom 13
13-2: Abschnitt der DNS von Chromosom 13
13-3: Abschnitt der DNS von Chromosom 13
13-4: Abschnitt der DNS von Chromosom 13
14: normierte Lichtmengen
15: Bestimmen
16: Gel
17: Normieren
18-1: Abschnitt der DNS von Chromosom 18
18-2: Abschnitt der DNS von Chromosom 18
18-3: Abschnitt der DNS von Chromosom 18
18-4: Abschnitt der DNS von Chromosom 18
21-1: Abschnitt der DNS von Chromosom 21
21-2: Abschnitt der DNS von Chromosom 21
21-3: Abschnitt der DNS von Chromosom 21
21-4: Abschnitt der DNS von Chromosom 21
bp: Basenpaar
s: Weg
L: Lichtmenge

Claims

Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von dem DNS in einer Probe stammt, – wobei die verschiedenen Gene ein Gen, bei dem eine interessierende Genmultiplikation auftreten kann, und ein Gen, bei dem keine Genmultiplikation auftritt, umfassen und/oder die verschiedenen Chromosome das Chromosom 13 und/oder das Chromosom 18 und/oder das Chromosom 21 des humanen Genoms umfassen, – wobei in einem gemeinsamen Verstärkungsschritt mindestens ein spezifischer Abschnitt (13-1 bis 21-14) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt wird, wobei die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS jeweils eine feste Länge aufweisen, – wobei der mindestens eine verstärkte spezifische Abschnitt (13-1 bis 21-4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit einem Lumineszenzmarker (7) markiert wird, – wobei Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker (7) für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt erfasst wird und – wobei die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms aus dem für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lumineszenzlicht bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, – dass die verstärkten spezifischen Abschnitte (18-1 bis 21-4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen durch Elektrophorese (9) getrennt werden; – dass eine Lichtmenge (12) des Lumineszenzlichts von dem Lumineszenzmarker (7) für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessen wird und – dass die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms aus Verhältnissen der für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lichtmengen (12) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen durch Gel- oder Kapillarelektrophorese getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in einer gemeinsamen PKR (4) die spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt und die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS mit dem Lumineszenzmarker (7) markiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die PKR eine Anzahl der spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome zwischen 15-mal und 30-mal verdoppelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen mit demselben Lumineszenzfarbstoff (7) markiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, – dass in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt mehrere nicht überlappende spezifische Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt werden, – wobei jeder der verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit einem Lumineszenzmarker (7) markiert wird, – wobei alle verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS durch die Elektrophorese (9) getrennt werden, – wobei eine Lichtmenge (12) von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker (7) für jeden der verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS getrennt gemessen wird und – wobei vor dem Schritt des Bestimmens (15) die für die mehreren spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen (12) für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome addiert werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt eine gleiche Anzahl von spezifischen Abschnitten (13-1 bis 21-4 der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die gleiche Anzahl von spezifischen Abschnitten (13-1 bis 21-4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome in einem Bereich von 3 bis 40 oder von 5 bis 30 oder von 8 bis 15 liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich alle spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS um mindestens 4, 7 oder 10 Basenpaare (bp) in ihrer Länge unterscheiden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Abschnitten (13-1 bis 21-4) der DNS lebenswichtige Abschnitte der DNS sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, – dass die Schritte des Trennens und des Messens (11) für mehrere Teilproduktmengen des gemeinsamen Verstärkungsschritts getrennt durchgeführt werden, – wobei vor dem Schritt des Bestimmens (15) die für die mehreren Teilproduktmengen gemessenen Lichtmengen (12) für die DNS von jeweils demselben der verschiedenen Gene und/oder Chromosome addiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS apoptotische DNS und die Probe eine Blutplasmaprobe (3) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Chromosome das Chromosom 13, das Chromosom 18 und das Chromosom 21 des humanen Genoms sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms mit einer Genauigkeit besser als 5 % bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt des Bestimmens die für verschiedene spezifische Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen des Lumineszenzlichts mit unterschiedliche Verstärkungen, Trennungen, Markierungen und/oder Messungen ausgleichenden Normierungsfaktoren multipliziert werden.