DE4100279A1 - Verfahren zum unterscheiden von genen durch fluoreszenzermittlung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unter­ scheiden von Genen, insbesondere ein solches zum Unterschei­ den von Genen durch Fluoreszenzmarkierungen.

Eine herkömmliche Gendiagnose ist das Verfahren des Restrik­ tionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism). Eine genaue Beschreibung die­ ser Diagnose ist z. B. in Bunseki (= Analyse) Nr. 7, 1986, 462-468 gegeben. Bei diesem Verfahren wird ein zu analysie­ rendes Gen mit einem Enzym zerschnitten und mit Hilfe des Agarosegels elektrophoretisch aufgetrennt. Dann wird sein Muster auf einem Filter festgehalten. Das Filter wird in eine Lösung mit einer DNA-Probe getaucht, die mit einem ra­ dioaktiven Isotop markiert ist und eine besondere Sequenz aufweist, so daß die Probe mit DNA-Fragmenten hybridisiert werden kann, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu derjenigen der Probe ist. Die DNA-Probe wird mit einem be­ sonderen Band der DNA-Fragmente hybridisiert, die in einen leiterähnlichen Zustand aufgetrennt wurden. Ein Film wird am Filter angebracht, um das Muster des DNA-Bandes zu fixieren, an das die DNA-Probe hybridisiert wird. Wenn ein besonderes Enzym zum Zerschneiden der maßgeblichen DNA und einer beson­ deren DNA-Probe verwendet wird, ist es möglich, ein Muster (Fingerabdruck) zu erhalten, das für ein Individuum spezi­ fisch ist. Außerdem ist es möglich, Information über eine Erbkrankheit zu gewinnen. Für gewöhnlich wird dieses RFLP- Verfahren ausgeführt, indem leiterähnliche Muster verwendet werden, die durch eindimensionale Elektrophorese gewonnen wurden. Es wurden jedoch auch Versuche ausgeführt, das In­ formationsvolumen dadurch zu erhöhen, daß zweidimensionale Elektrophorese eingesetzt wird. Dies ist im einzelnen von A. G. Uitterlinden et al. in Proceedings of National Academy of Science 86, 2742 (1989) beschrieben.

Statt Radioisotopen als Markierstoffen wurden auch Fluores­ zenzstoffe beim RFLP-Verfahren verwendet, wie dies in Geno­ mics 4, 129 (1989) im einzelnen beschrieben ist. Bei diesem Versuch wird die Fluoreszenzmarkierungsfarbe mit dem Typ des zum Schneiden verwendeten Restriktionsenzyms geändert. Die DNA-Fragmente werden gleichzeitig auf einem Wanderungsstrei­ fen voneinander getrennt und in Echtzeit gemessen.

Die Diagnosegenauigkeit mit dem RFLP-Verfahren hängt von der Möglichkeit ab, inwieweit die Anzahl zu analysierender DNA- Bänder erhöht werden kann. Eindimensionale Elektrophorese hat den Nachteil, daß sie unzureichende Information liefert, da beim Versuch, viele durch mehr als ein Enzym geschnittene Fragmente zu erzeugen, um viele Bänder zu erhalten, es nicht möglich ist, diese vielen Bänder voneinander zu trennen und demgemäß nur verschmierte Muster erhalten werden. Dieselbe Art von Problemen tritt auf, wenn Echtzeit-Fluoreszenzer­ mittlung verwendet wird, wie in Genomics 4, 129 (1989) be­ schrieben. Das bei diesem Verfahren verwendete Gerät ist da­ zu in der Lage, DNA-Fragmente mit derselben DNA-Basensequenz als Fragmente mit 400 Basen und 401 Basen voneinander zu un­ terscheiden. Die DNA-Fragmente können jedoch nicht voneinan­ der getrennt werden, wenn sich die Basensequenzen voneinan­ der unterscheiden, da die Molekulargewichte derselben häufig ziemlich voneinander verschieden sind. Darüber hinaus be­ steht die Schwierigkeit, daß die Trennung um so schwieriger wird, je länger eine Base ist, die ein Fragment aufweist, so daß es nicht möglich ist, dieses Verfahren als RFLP-Verfah­ ren einzusetzen, um Proben mit Fragmenten mit großer Basen­ länge mit hoher Genauigkeit voneinander zu unterscheiden.

Andererseits erlaubt es die zweidimensionale Elektrophorese, mehr Bänder zu analysieren, jedoch ist es bei diesem Verfah­ ren erforderlich, ein Autoradiogramm für jede Probe zu un­ tersuchen. Darüber hinaus ist es schwierig, Homologie und Unterschiede festzustellen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzermittlung anzuge­ ben, mit dem es möglich ist, genaue Daten nach dem RFLP-Ver­ fahren zu gewinnen, um die oben genannten Schwierigkeiten zu überwinden.

Die Erfindung ist durch die Merkmale von Anspruch 1 gegeben. Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausgestaltungen sind Gegen­ stand abhängiger Ansprüche.

Als unterschiedliche Gene, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzer­ mittlung voneinander unterschieden werden können, werden z. B. Gene von unterschiedlichen Individuen verwendet, um diese Individuen voneinander unterscheiden zu können, oder Gene, von denen einige normal und andere so ausgebildet sind, daß sie vermutlich eine genbedingte Krankheit verur­ sachen, um dadurch Erbkrankheiten zu erforschen, oder Gene von einem lndividuum.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Trennen von DNA- Fragmenten ein- oder mehrdimensionale Gelelektrophorese ver­ wenden.

Als Vorrichtung, die sich zum optischen Ermitteln von Diffe­ renzen von Trennmustern von DNA-Fragmenten eignet, verwenden Ausführungsbeispiele der Erfindung einen Echtzeit-Fluores­ zenzdetektor, der einzelne Linien erkennt, oder einen ein- oder zweidimensionalen Gelleser. Beim genannten optischen Ermitteln von Unterschieden in Trennmustern werden die zu untersuchenden DNA-Fragmente optisch so untersucht, wie sie in einer Mischung vorliegen, wodurch von allen DNA-Fragmen­ ten Fluoreszenz gleichzeitig an derselben Stelle abgestrahlt wird. Das Fluoreszenzlicht wird dann durch Wellenlängenab­ tastung ausgewertet, und dadurch erfolgt das Vergleichen der Muster. Dieser Ablauf zeichnet sich durch hohe Genauigkeit und einfache Ausführbarkeit aus.

Als Kombinationen eines Fluoreszenzstoffs und eines Anre­ gungslasers, die beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar sind, sind z. B. folgende Kombinationen möglich: FITC, des­ sen Isomeres und ein 488-nm-Argonlaser; TRITC, Texasrot und ein 515-nm-Argonlaser (oder ein 535-nm-YAG-Laser); der Phtha­ locyanin-Al-Komplex (Al-Pc), dessen Isomeres und ein 633-nm- He-Ne-Laser (oder ein 670-nm-Halbleiterlaser).

Dadurch, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren markierte DNA- Fragmente von mehr als einem Gen, die spezifisch markiert sind, in einer Mischung geschnitten, getrennt und dann op­ tisch zum Auswerten von Unterschieden in Trennmustern unter­ sucht werden, ist es möglich, Unterschiede in den Spektren und zwischen zweidimensionalen Elektrophoresemustern genau zu erfassen, die zu den genannten markierten DNA-Fragmenten für mehr als ein Gen gehören. Dadurch können mit hohem Wir­ kungsgrad und hoher Genauigkeit unterschiedliche Abschnitte auf entsprechenden Genfragmenten festgestellt werden, selbst wenn die Bänder in den Elektrophoresemustern der Gene der Standardprobe oder der zu untersuchenden Gene nur unzurei­ chend voneinander getrennt sind.

In den Figuren zeigt

Fig. 1 eine schematische Zeichnung zum Erläutern des Prin­ zips des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Zusammenstellung von Funktionsgruppen, wie sie bei erfindungsgemäßen Verfah­ ren verwendet werden.

Anhand von Fig. 1 wird im folgenden prinzipiell ein erfin­ dungsgemäßes Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzermittlung beschrieben. Ein Standardprobengen 1 und ein zu untersuchendes Gen 2 (wobei es sich jeweils um mehr als ein Gen handeln kann) werden mit einem geeigneten Restriktionsenzym zerschnitten (üblicherweise ein Schneid­ enzym wie NoT-I). Die aus dem Standardprobengen erhaltene Gruppe von DNA-Fragmenten wird durch einen ersten Fluores­ zenzstoff (F1) markiert. Genauer gesprochen wird ein mit F1 markiertes Oligonukleotid durch Ligation eingefügt, oder ein mit F1 markiertes Desoxinukleotid wird durch Kettenerweite­ rungsreaktion um die Schnittstellen in der oben genannten DNA-Fragmentgruppe eingefügt. Darüber hinaus wird die Gruppe der DNA-Fragemente von dem zu untersuchenden Gen mit einem zweiten Fluoreszenzstoff (F2) auf dieselbe Weise wie vorste­ hend angegeben markiert. Dabei werden die Längen der zwei miteinander zu vergleichenden DNA-Fragmente mit einem Agens, wie einem Linker, so eingestellt, daß ihre Nassen dieselben sind. Dann werden die DNA-Fragmente der markierten Standard­ probengene und die markierten zu untersuchenden Gene ge­ mischt und anschließend mit einem Enzym (wie einem 4-Basen- Schneidenzym), so wie sie in der Mischung 3 vorliegen, ge­ schnitten. Schließlich werden sie einem Trennablauf durch Elektrophorese unterworfen, wobei sie sich immer noch in der Mischung befinden. Einige der DNA-Fragmente, die dieselbe Folge aufweisen, erreichen den Ermittlungsabschnitt, indem sie beinahe aufeinanderliegen. Es wird dann die Emission vom ersten Fluoreszenzstoff in den DNA-Fragmenten 4 des Stan­ dardprobengens und die Emission vom zweiten Fluoreszenzstoff in den DNA-Fragmenten 5 vom zu untersuchenden Gen getrennt voneinander empfangen, wobei der Verstärkungsfaktor des Ver­ stärkers im Emissionsempfänger so eingestellt wird, daß die Signale gleiche Intensität aufweisen. Ein Differenzsignal entsteht demgemäß nur dann, wenn eines der DNA-Fragmente aus dem Standardprobengen sich von einem Fragment aus dem zu un­ tersuchenden Gen unterscheidet. Durch Ermitteln von Diffe­ renzen zwischen den zwei Signalen ist es demgemäß mit gutem Wirkungsgrad zuverlässig möglich, ein zu untersuchendes Gen von einem Standardprobengen zu unterscheiden.

Beispiel

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nun unter Bezug­ nahme auf die Figuren genauer erläutert.

Beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 wird als Standardpro­ bengen 1 ein Gen einer gesunden Person verwendet. Als zu un­ tersuchendes Gen 2 wird ein solches eines Patienten mit einer Erbkrankheit verwendet. Diese Gene werden zunächst je­ weils durch dasselbe Restriktionsenzym NoT-I zerschnitten, um aus jedem Gen eine Gruppe von DNA-Fragmenten zu erhalten. Dann wird die Fluoreszenz der Fragmente gemessen, und es er­ folgt eine Einstellung in solcher Weise, daß sich die Fluo­ reszenzintensitäten von den zu vergleichenden DNA-Fragment­ gruppen wenig voneinander unterscheiden, so daß quasi die Masse derselben in etwa zur Übereinstimmung gebracht wird.

Die DNA-Fragmentgruppe vom Standardprobengen wird mit dem Fluoreszenzstoff 1 (F1) markiert, der eine Peakwellenlänge von 680-nm von Al-Pc, d. h. vom Phthalocyanin-Aluminium- Komplex aufweist. Getrennt davon wird die DNA-Fragmentgruppe des zu untersuchenden Gens mit dem Fluoreszenzstoff 2 (F2) markiert, der eine Peakwellenlänge von 710 nm eines Al-Pc- Isomeren aufweist.

Die markierten DNA-Fragmente werden mit einer DNA-Kettener­ weiterungsreaktion bearbeitet, was durch eine DNA-Polymerase mit fluoreszenzstoffmarkierten Desoxinukleotiden oder durch Einführen von mit den Fluoreszenzstoffen, Al-Pc markierten Oligonukleotiden erfolgt, mit einer Ligationsreaktion in dem durch das Enzym zerschnittenen Abschnitt.

Der Anteil der vorstehend genannten fluoreszenzstoffmarkier­ ten Desoxinukleotide oder Oligonukleotide, der nicht rea­ giert hat, wird dadurch entfernt, daß mit Ethanolausfällung die sachdienliche Substanz ausgefällt wird und die Lösung mit dem Teil, der nicht reagiert hat, verworfen wird. Eine Meßprobe 3 wird dadurch erhalten, daß die markierte DNA- Fragmentgruppe des Standardprobengens und diejenige des zu untersuchenden Gens gemischt werden und dabei die Mengen der beiden Probenlösungen so eingestellt werden, daß dann, wenn die von den markierten DNA-Fragmenten emittierte Fluores­ zenzstrahlung mit der jeweiligen Wellenlänge gemessen wird, beide Fragmentgruppen im wesentlichen dieselbe Fluoreszenz­ intensität liefern.

Während die genannte zu messende Probe 3 noch als Mischung vorliegt, jedoch in den Zustand einer Basizität von 60 mM versetzt, werden die DNA-Fragmente durch ein Restriktions­ enzym Hae III, wie ein 4-Basen-Schneidenzym, in kleinere Fragmente zerschnitten.

Mit Hilfe eines Elektrophoresegerätes für Ermittlung mehr­ farbiger Fluoreszenz, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, wird die Fluoreszenz für die Mischung aus der DNA-Fragmentgruppe 4 des Standardprobengens und der Gruppe 5 des zu untersu­ chenden Gens gemessen, welche beiden Gruppen durch das oben genannte Zerschneiden mit dem Enzym erhalten wurden. Diese Mischung der DNA-Fragmentgruppe des Standardprobengens und der Gruppe des zu untersuchenden Gens wird mit einem Dosie­ rer 8 auf eine 0,3 mm dicke Trenn-Gelplatte 9 aus Polyacryl­ amid an einer vorgegebenen Stelle aufgetropft, und sie wird dann dem Einfluß von Elektrophorese unterworfen, damit die mit F1 markierte DNA-Fragmentgruppe des Standardprobengens und die mit F2 markierte Gruppe des zu untersuchenden Gens, die beide in der genannten Mischung vorliegen, entsprechend ihrer Molekulargewichte voneinander getrennt werden können. Beim Ausführungsbeispiel wird die Fluoreszenz in Echtzeit während der Trennung durch Elektrophorese gemessen. Konkret wird hierzu ein Laserstrahl 12 verwendet, der von einem He-Ne-Laser 10 mit 10 mW Leistung, hergestellt von Nippon Denki Kabushiki-Kaisha, ausgestrahlt wird und durch einen Spiegel 11 auf eine Stelle etwa 25 cm vom Startpunkt der Elektrophorese entfernt auf eine Seite der oben genannten Gelplatte gelenkt wird. Ein Fluoreszenzstrahl, wie er emit­ tiert wird, wenn ein fluoreszenzstoffmarkiertes DNA-Fragment den Laserstrahl kreuzt, wird durch ein Bildteilerprisma 13 und ein Bandpaßfilter 14 gelenkt und von einem Emissionsem­ pfänger 15 empfangen, der als zweidimensionaler Detektor oder als Sensor für zwei Fluoreszenzlinien wirkt. Ein Über­ wachungsgerät 19 nimmt das Bild des Fluoreszenzstrahls mit zwei Linien auf, wobei die eine Linie der Markierung F1 der genannten DNA-Fragmentgruppe des Standardprobengens und die andere der Markierung F2 des genannten DNA-Fragments vom zu untersuchenden Gen entspricht. Das Bandpaßfilter 14 zum Aus­ filtern von Licht unterschiedlicher Wellenlängen, wie es an der Lichtaustrittsseite des Bildteilerprismas 13 angebracht ist, erlaubt es, die Emissionen von den zwei genannten Fluo­ reszenzstoffmarkierungen F1 und F2 getrennt zu erfassen. Das Ergebnis dieser getrennten Erfassung wird über eine Anzeige 18 ausgegeben.

Wie in Fig. 1 dargestellt, liefern DNA-Fragmentgruppen vom Standardprobengen und vom zu untersuchenden Gen, die sich nicht voneinander unterscheiden, keine unterschiedlichen Spektren. Andere Fragmente, die sich unterscheiden, führen jedoch zu Differenzspektren, die durch positive oder nega­ tive Signale repräsentiert sind. Auf diese Weise wird Infor­ mation für den Unterschied zwischen den oben genannten bei­ den Genen erhalten. Wenn es erforderlich ist, das Molekular­ gewicht der Probe genau zu bestimmen, wird wie folgt vorge­ gangen. Es wird eine Molekulargewichtsmarkier-DNA mit einem Fluoreszenzstoff F3 markiert, der sich von F1 und F2 unter­ scheidet. Das Bildteilerprisma wird so ausgebildet, daß es drei Lichtaustrittsseiten aufweist. Das Fluoreszenzlicht von F3 wird durch ein Bandpaßfilter geschickt, die Fluoreszenz­ strahlung wird empfangen, und sie wird dazu verwendet, ein Bezugssignal zum Auffinden des Molekulargewichts zu liefern. Durch Erhöhen der Anzahl aufgespalteter Bilder ist es auch möglich, gleichzeitig mehrere Proben zu untersuchen.

In Fig. 1 bezeichnet ein Bezugszeichen 6 das Spektrum einer DNA-Fragmentgruppe von einem Standardprobengen, und ein Be­ zugszeichen 7 bezeichnet das entsprechende Spektrum für eine DNA-Fragmentgruppe eines zu untersuchenden Gens. In Fig. 2 bezeichnet ein Bezugszeichen 16 eine Steuerung und ein Be­ zugszeichen 17 einen Computer.

Beim oben beschriebenen Ausführungsbeispiel wird ein Laser­ strahl auf eine Seitenfläche der Gelanordnung in einem Meß­ abschnitt gerichtet, und Fluoreszenz wird durch einen zwei­ dimensionalen Detektor empfangen. Es kann jedoch auch ein Laserstrahl auf die Front der Gelanordnung gerichtet werden und so gesteuert werden, daß er die Einstrahlfläche abra­ stert. Die Fluoreszenz wird durch mindestens zwei Photover­ vielfacher empfangen, die mit einem Filter ausgestattet sind.

Statt Echtzeitmessung ist es auch möglich, nach der Elektro­ phorese einen Laserstrahl auf die Gelplatte zu richten, um ein zweidimensionales Bild zum Erhalten von Daten aufzuneh­ men, oder die Gelplatte mit einem Liniensensor abzurastern, um Daten zu erhalten, oder eine Gelvorrichtung mit einer Lampe zu bestrahlen, um Musterinformation zu gewinnen.

Da beim erfindungsgemäßen Verfahren mehrere miteinander zu vergleichende DNA-Fragmente in einer Mischung durch ein En­ zym zerschnitten werden und einer Fluoreszenzmessung unter­ worfen werden, um Unterschiede in Mustern zwischen verschie­ denen einander entsprechenden DNA-Fragmenten festzustellen, ist es möglich, Störsignale zu eliminieren, wie sie beim Messen durch Unterschiede beim Schneiden oder bei der Elek­ trophorese des mehr als einen zu unterscheidenden Fragments bedingt sind. Dadurch kann mit gutem Wirkungsgrad und hoher Genauigkeit der Unterschied zwischen Genen unabhängig von großer Ähnlichkeit zwischen ihren DNA-Basen-Folgen festge­ stellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren weist daher hohen Wirkungsgrad zum Vergleichen von DNA-Fragmenten aus Genen von Patienten mit einer bestimmten Erbkrankheit von Fragmenten aus Genen gesunder Personen auf, was es ermög­ licht, den Abschnitt in einem Gen einzugrenzen, der die gen­ bedingte Krankheit verursacht. Darüber hinaus ist es mit diesem Verfahren auch möglich, eine DNA-Fragmentgruppe mit bekannter Basenlänge als Standard zu verwenden und die Grup­ pe zusammen mit einer DNA-Fragmentgruppe eines zu untersu­ chenden Gens in einem Zustand, in dem beide gemischt sind, wandern zu lassen und die Tatsache zu nutzen, daß DNA-Frag­ mente mit derselben Basenlänge übereinander liegen. Dadurch ist es möglich, die Basenlänge der DNA eines zu untersuchen­ den Gens genau festzustellen.

Das Verfahren läßt sich nicht nur zum Unterscheiden zweier Gene in unterschiedlichen Personen verwenden, sondern auch zum Unterscheiden von mehr als zwei Genen, wozu es lediglich erforderlich ist, mehr Stoffe zur Farbmarkierung zu verwen­ den.

Claims (6)

1. Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluores­ zenzermittlung, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• i) Zerschneiden mehrerer voneinander zu unterscheidender Gene (1, 2) mit demselben Enzym;
• ii) Markieren jedes der in Schritt (i) erhaltenen DNA- Fragmente mit einem Fluoreszenzstoff (F1, F2), der jeweils einem der mehreren Gene zugeordnet ist;
• iii) Herstellen einer Mischung (3) der in Schritt (ii) be­ arbeiteten DNA-Fragmente;
• iv) Zerschneiden der DNA-Fragmente, so wie sie in der Mi­ schung vorliegen, mit einem Enzym;
• v) Voneinandertrennen der DNA-Fragmente (4, 5), die in Schritt (iv) bearbeitet wurden und noch miteinander gemischt sind; und
• vi) optisches Feststellen von Unterschieden in den ge­ trennten Mustern (6, 7) der voneinander getrennten DNA-Frag­ mente, um voneinander die Gene zu unterscheiden, die aus den DNA-Fragmenten bestanden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mehreren voneinander zu unterscheidenden Gene (1, 2) von unterschiedlichen Personen herrühren.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Fragmente durch ein- oder mehr­ dimensionale Gelelektrophorese voneinander getrennt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das optische Ermitteln mit Hilfe eines Echtzeit-Fluoreszenzdetektors ausgeführt wird, der Fluores­ zenzlinien erfassen kann.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zum optischen Ermitteln ein ein- oder zweidimensionaler Gelleser verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Ermitteln dadurch ausge­ führt wird, daß Fluoreszenzlicht, das zur selben Zeit vom selben Ort ausgestrahlt wird, nach der Wellenlänge ausge­ wertet wird.