DD147002A1

DD147002A1 - Einrichtung zur untersuchung von lumineszenzeigenschaften der mikroobjekte

Info

Publication number: DD147002A1
Application number: DD21659079A
Authority: DD
Inventors: Valery N Karnaukhov; Valery A Yashin; Vladimir I Kulakov; Vasily M Vershinin; Vladimir V Dudarev
Original assignee: Inst Biologicheskoi Fiz
Priority date: 1978-11-01
Filing date: 1979-10-31
Publication date: 1981-03-11
Also published as: FR2441190B1; DE2944019C2; GB2039031A; JPS5574448A; GB2039031B; SU938936A1; FR2441190A1; DE2944019A1

Abstract

Die Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten enthaelt ein Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch sich ein Mikroskop befindet. Im Strahlengang der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts, die unter Einwirkung der Strahlung der Anregungsquelle entsteht, liegt eine Lichtzerlegungsplatte mit einem Interferenzbelag, die die kurzwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung zu einem Kanal fuer die Registrierung der entsprechenden Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung reflektiert und die langwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung zu einem anderen Kanal fuer die Registrierung dieser Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung hindurchlaeszt. Weiterhin enthaelt die Einrichtung hintereinander eine Einheit zur Erfassung des Verhaeltnisses von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung, deren Eingaenge an die Ausgaenge der fuer die Registrierung der entsprechenden Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung vorgesehenen Kanaele angeschlossen sind, einen Verhaeltnisgroeszendiskriminator von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung, dessen Ausgangssignal die Information ueber das Vorhandensein eines veraenderten Mikroobjekts traegt, eine Steuereinheit und einen Elektromotor, der mit dem Objekttisch des Lumineszenzmikroskops verbunden ist.

Description

Berlin, 24. 3- 1980 56 402/17

Einrichtung zur Untersuchung von Luinineszenzeigenschaften von Mikroobjekten *

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Geräte zur Spektralanalyse von Mikroobjekten, insbesondere auf Einrichtungen zur Untersuchung von Luminesζenzeigenschaften von Mikroobjekten.

Die Erfindung kann bei wissenschaftlichen und angewandten Untersuchungen in der Biologie, Chemie, Physik und Medizin, besonders auf den Gebieten der Onkologie, der Hämatologie, der Immunologie, der Toxikologie, der Epidemiologie sowie bei Kontrolluntersuchungen der Wirkung von Arzneimitteln, in der Mikrobiologie und der mikrobiologischen Industrie, beim Umweltschutz, bei Analysen von Pulvern und Mikrokristallen benutzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen ^Lösungen

Weitgehend bekannte Einrichtungen zur Registrierung und Un- tersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten - Mikrospektrofluorometer - (vgl. z. B. Olson R. A. "Rapid scanning microspectrofluorometer", Rev.Scient. Instrum., v. 31 j p· 844; 1%0) enthalten ein Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch ein Jlikroobjekt" angeordnet wird, sowie einen Monochromator, auf dessen Eingangsspalt eine vom Lumineszenzmikroskop vergrößerte Lumineszenzabbildung des Mikroobjekts projiziert wird« Hinter dem Ausgangsspalt des Monochromators befindet sich im Wege der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung ein als fotoelektrischer Vervielfacher ausgeführter lichtempfänger, der das Lichtsignal in elektrischen Strom umwandelt, welcher dem Eingang eines Schreibers zugeführt

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wird. Bei Einschaltung der Ablenkvorrichtung des Monochromators wird im Schreiber das Lumineszenzspektrum des im Gesichtsfeld des Mikroskops liegenden Mikroobjekts registriert. Das Lumineszenzspektrura jedes Mikroobjekts weist in der Regel ausreichend kennzeichnende Merkmale auf. Dieses Spektrum kann man dazu benutzen, unter einer Vielzahl von Mikroobjekten solche zu finden, die sich durch ihre Spektralkennwerte und folglich durch ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften von allen übrigen Mikroobjekten unterscheiden. Bei Beginn eines Vorgangs, dessen frühes Entwicklungsstadium man'erkennen will, ist die Zahl von veränderten Mikroobjekten gegenüber der Gesamtzahl von Mikroobjekten im Muster sehr gering und verhält sich zu dieser Gesamtzahl wie ungefähr 1 : 1000 oder 1 : 10000. Die verhältnismäßig lange Dauer der Registrierung und der Analyse von Lumineszenzspektren jedes Mikroobjekts des Musters und die sich ergebende Notwendigkeit, die Lumineszenzspektren von Hunderten und Tausenden der Mikroobjekte zu registrieren und zu analysieren, bevor ein verändertes Mikroobjekt gefunden wird, erfordern für diese Suche eines veränderten Mikroobjekts bei Benutzung des beschriebenen Mikrospektrofluorometers mehrere zehn Stunden.

Von den- Einrichtungen zur Untersuchung der Lumines'zenzeigenschaften von Mikroobjekten sind auch Zweiwellen- und Zweistrahl -Mikrofluorometer weitgehend bekannt (vgl. z. B. Papajan G.V/., Joffe W.A., Winogradowa W.N., Barski I.J«, "Zweistrahl-lmpuls-Mikrospektrofluorometer mit Ziffernablesung", Zytologie, v_e16, Nr. 3. S. 355«..357, 1974), mit deren. Hilfe nicht das ganze Mikroobjekt-Lumineszenzspektrum, sondern nur die Intensität der Lumineszenz in zwei vorher gewählten, charakteristischen Wellenlängenbereichen des Mikroobjekt~Lumineszenzspektrums registriert werden kann.

Diese zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von

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Mikroobjekten.bestimmte Einrichtung enthält ein Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch ein Mikroobjekt angeordnet wird, das unter der Einwirkung der Strahlung einer Anregungsstrahl imgsquelle luminesziert. Im Wege der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung ist eine Lichtzerlegungsplatte mit einem Interferenzbelag angeordnet« Diese mit dem Interferenzbelag überzogene Lichtzerlegungsplatte reflektiert die kurzwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung zu einem Kanal für die Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikrο- · objekt-Lumineszenzstrahlung und läßt die langwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung zu einem anderen zur Registrierung dieser Komponente vorgesehenen Kanal hindurch. Jeder dieser Kanäle zur Registrierung der entsprechenden Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung enthält im Wege der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung ein entsprechendes Lichtfilter, das die Strahlung in einem schmalen Spektralbereich durchläßt, sowie einen fotoelektronischen Vervielfacher, an dessen Ausgang ein elektronischer Verstärker liegt. Die Ausgänge der elektronischen Verstärker der zur Registrierung der entsprechenden Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung vorgesehenen Kanäle sind an ein Digitalvoltmeter angeschlossen, .mit dessen Hilfe das Verhältnis von Intensitäten der Mikroobjekt-·Lumineszenz in zwei vorher gewählten charakteristischen Wellenlängenintervallen (Abschnitten) des Ivlikroobjekt-Lumineszenzspektrums gemessen wird· Als charakteristische Intervalle der Wellenlängen des Mikrooboekt-Lumineszenzspektrums gelten solche Bereiche, in denen eine Änderung der Lumineszenzintensität auf eine Änderung von biologischen oder physikalisch-chemischen Eigenschaften des Mikroobjekts hinweist.

Die ganze für die Mikroobjektanalyse mit.dieser Einrichtung erforderliche Zeit beträgt einige Stunden, weil die Lumineszenzkennwerte von Hunderten und_ Tausenden der Mikroobjekte dos Untersüchungsmusters registriert und" miteinander verglichen'

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werden müssen, bevor ein Mikroobjekt gefunden wird, das sich durch seine Lumineszenzkennwerte von den anderen unterscheidet und visuell sowie mit Hilfe von Geräten näher untersucht werden soll« Als Mikroobjekte können organische oder pflanzliche Gewebezellen, Mikroorganismen, ZellenanSammlungen sowie kleine Teilchen nichtorganischen Ursprungs in einem Muster auftreten, das eine auf ebene Fläche aufgetragene, z.B. auf einem Objektglas liegende Schicht darstellt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung bezweckt die. Entwicklung einer zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften der Mikroobjekte bestimmten Einrichtung, die es ermöglicht, die Zeit für das Erkennen eines veränderten I.iikroobjekts zu verkürzen, das einer näheren visuellen und geratetechnischen Untersuchung unterzogen werden muß.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikro objekt en zu schaffen, deren schaltungstechnische Lösung eine wesentliche Verringerung des Zeitaufwandes für das Erkennen eines veränderten Mikroobjekts gewährleistet, welches visuell und mit Hilfe von Geräten näher untersucht werden muß.

Dies wird dadurch erreicht, daß in der Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten mit einem Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch ein Ivlikroobjekt liegt, und im Wege der durch die Strahlung einer Anregungsstrahl ungs quelle hervorgerufenen Lumineszenzstrahlung des Mikroobjektes eine Lichtzerlegungsplatte mit Interferenzbelag angeordnet ist, um'die kurzwellige Komponente der Mikro-

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objekt-Lumineszenzstrahlung zu einem Kanal für die Registrierung der entsprechenden Komponente der Mikroobjekt-Lurnineszenzstrahlung zu reflektieren und die langwellige Komponente der Mikroobjekt»-Lumineszenzstrahlung zu einem anderen Kanal für die Registrierung der entsprechenden Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung hindurchzulassen, erfindungsgemäß folgende, in Reihe geschaltete Baueinheiten zusätzlich verwendet werden: eine Einheit zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Iviikroobjekt-Lumineszenzstrahlung, die mit ihren Eingängen an die Ausgänge der Kanäle zur Registrierung von entsprechenden Komponenten der Ivlikroobjekt-Lumineszenzstrahlung angeschlossen ist; ein Verhältnisgrö'ßendiskriminator für die Komponenten der Ivlikroobjekt-Lumineszenzstrahlung, dessen Ausgangssignal die Information über das Vorhandensein eines veränderten Mikroobjekts trägt, sowie eine Steuereinheit und ein mit dem Objekttisch des Lumineszenzmikroskops verbundener Elektromotor.

Kleinere Abmessungen der Einrichtung werden erreicht, indem die Einheit zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Mikroobjekt-Luiaineszenzstrahlung erfindungsgemäß als Elektronenstrahlröhre ausgeführt wird, bei der die Horizontalablenkplatten mit dem Ausgang eines Kanals zur Registrierung der entsprechenden Komponente der Llikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und die Vertikalablenkplatten mit dem Ausgang des anderen Kanals zur Registrierung der entsprechenden Komponente der Llikroobjekt-Luiuineszenzstrahlung verbunden wer- den.

Zur Erleichterung der Umstellung der Einrichtung zwecks Untersuchung von verschiedenartigen iaikroobjekten in einem breiten Bereich von angewandten Aufgaben wird erfindungsgemäß zweckmäßig für die Anreguiigsstrahlungsquelle. eine Quelle mit modulierter Strahlung und veränderlicher Frequenz benutzt

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und der Verhältnisgrößendiskriminator für die Komponenten der Mikroobjekt-Lmiiineszenzstrahlung als fotoelektrischer Geber ausgeführt, der am Schirm der Elektronenstrahlröhre verschoben werden kann und in einem Punkt befestigt wird, der beim Überqueren dieses Punktes durch eine dem Verhältnis von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung entsprechende leuchtende Linie die Grenze der Lokalisation von veränderten Ivlikro objekt en bestimmt«

Zur Vereinfachung der Bedienung der Einrichtung ist es erfindungsgemäß zweckmäßig, den Verhältnisgrößendiskriminator für die Komponenten der Kikroobjekt-Lumineszenzstrahlung mit einer am Schirm der Elektronenstrahlröhre angeordneten Maske zu versehen, deren Konfiguration die Grenze der Lokalisation von veränderten Mikroobjekten bestimmt, sowie mit einem fotoelek— trischen Geber auszustatten, der im Wege des vorn Schirm der Elektronenstrahlröhre emittierten Lichtstromes angeordnet wird.

Zwecks Erhaltung von statistischen Daten aller Mikroobjekte des Musters ist es erfindungsgemäß von Vorteil, in der Einrichtung einen elektronischen Signalteiler zusätzlich zu verwenden, dessen Eingänge an die Ausgänge der Kanäle zur Registrierung der entsprechenden Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung angeschlossen werden, sowie einen mit dem Signalteiler in Reihe geschalteten Impulsamplitudenana- ' lysator einzusetzen.

Zur Ermittlung des Verhältnisses der Anzahl von veränderten Mikroobjekten zur Gesamtzahl von Iviikroobjekten im Untersuchung smust er ist die Einrichtung erfindungsgemäß mit drei Impulszählern zusätzlich ausgestattet, von denen zwei Impulszähler an die Ausgänge der Kanäle zur Registrierung der entsprechenden Komponenten der Ivlikroob j ekt-Lumineszenzstrahlung

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angeschlossen werden und der dritte Impulszähler an den Ausgang des Verhältnisgrößendiskriminators für die Komponenten der Mikroobjekt-Luinineszenzstrahlung geschaltet wird.

Durch die vorgeschlagene Einrichtung ist die-Möglichkeit gegeben, ein einzelnes verändertes Lind näher zu untersuchendes Mikroobjekt unter Hunderten und Tausenden von anderen nichtveränderten Mikroobjekten des Küsters bedeutend schneller zu erkennen. Die vorgeschlagene Einrichtung weist außerdem verhältnismäßig kleine Abmessungen und ein geringeres Gewicht auf<- Sie zeichnet sich auch durch niedrige Herstellungs- und Betriebskosten aus.

Ausiührungsbei spiel

Die Erfindung wird nachstehend ausführlich in Form von Ausführungsbeispielen sowie anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Hierbei zeigen

Fig. 1: ein Blockschaltbild der Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten;

Pig. 2: ein Punktionsschaltbild der Einheit zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Mikroobjekt-Luminesζenzstrahlung und des Verhältnisgrößendiskriminators von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung;

Fig. 3: ein Punktionsschaltbild einer anderen Ausführungs-

variante der Einheit zur Erfassung d.es Verhältnisses von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und des Verhältnisgrößendiskriminators von Komponenten der Ilikroobjekt-Lumineszenzstrahlung;

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Pig· 4: ein Blockschaltbild der anderen Variante der erfindungsgemäß ausgeführten Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten;

Pig« 5: Bewegungsbahnen des am Schirm der Elektronenstrahlröhre abgebildeten Leuchtflecks bei einer normalen veränderten Zelle (ausgezogene Linie) und einer Krebszelle (Strichlinie)·

Die vorgeschlagene Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten ist mit einem Lumineszenzmikroskop 1 (Fig« 1) ausgestattet* Das Lumineszenzmikroskop besteht aus einer Anregungsstrahlungsquelle 2, in deren Strahlungsweg eine Kollektorlinse 3 zur Sammlung der Strahlung der Anregungsquelle 2 und weiter hintereinander ein zur Herauslösung der Strahlung der Anregungsquelle 2 in einem schmalen Bereich bestimmtes Lichtfilter 4» eine Feldblende 5 zur Begrenzung des Gesichtsfeldes des Mikroskops 1 sowie eine Lichtzerlegungsplatte 6 mit einem Interferenzbelag angeordnet sind* Im Wege der an der Oberfläche der Lichtzerlegungsplatte 6 mit Interferenzbelag reflektierten Strahlung befinden sich ein Mikroobjekt 7 und ein .Mikroobjekt 8, das in dem auf dem Objekttisch 9 des Mikroskops 1 befestigten Muster enthalten ist« Das Mikroobjekt 7 dient zur Konzentration der anregenden Lumineszenzstrahlung auf dem Mikroobjekt 8 und zur Sammlung der Lumineszenzstrahlung dieses Mikroobjektes 8· Im Strahlengang der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8, die unter Einwirkung der Strahlung der Anregungsquelle 2 entsteht, befindet sich, hinter der Lichtzerlegungsplatte 6 in der Richtung dieser Lumineszenzstrahlung ein Spiegel 10· Im Strahlengang der an der Oberfläche des Spiegels 10 reflektierten Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung liegt ein Okular 11, das eine vergrößerte Lumineszenzabbildung des Mikroobjektes 8 erzeugt, wobei die Maße dieser Abbildung durch die Abmessungen der Feldblende 5 bestimmt v/erden· Im Gange der Strahlung ist

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zwischen dem Okular 11 und dem Auge des Forschers ein Lichtfilter 12 angeordnet, das die vom Lichtfilter 4 herausgelöste reflektierte Strahlung der Anregungsquelle 2 auslöscht. Bei Herausführung des Spiegels 10 aus dem Strahlengang der Lumineszenzstrahlung liegt im Wege der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 3 eine mit Interferenzbelag versehene Lichtzerlegungsplatte 13, die die kurzwellige Komponente der Mikroob j ekt--Lumineszenzstrahlung zum Kanal 14 für die Registrierung dieser kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung reflektiert und die langwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung des MikroObjekts 8 zum Kanal 15 für die Registrierung dieser langwelligen Komponente der IJikroobjekt-Lumineszenzstrahlung hindurchläßt. Der für die Registrierung der kurzwelligen Komponente der Hikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmte Kanal 14 enthält im Strahlengang der von der Oberfläche der Lichtzerlegungsplatte 13 reflektierten Lumi—. neszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 hintereinander ein schmalbandiges Lichtfilter 16 und einen fotoelektronischen Vervielfacher 17, dessen Ausgang mit dem Eingang eines Regelverstärkers 18 verbunden ist. In dem zur Registrierung der langwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmten Kanal 15 liegen im Gange der Lumineszenzstrahlung des Mikroob'jekts 8 ebenfalls ein schmalbandiges Lichtfilter 19 und. dahinter ein Fotovervielfacher 20, dessen Ausgang mit dem Eingang eines Regelverstärke.rs 21 verbunden ist. ·

Die Ausgänge der Verstärker 18 und 21, die zu den für die Registrierung der entsprechenden Komponenten der Ivlikroobjekt-Lumineszenzstrahlung vorgesehenen Kanälen 14 und 15 gehören, sind mit den Eingängen einer Einheit 22 zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Eikroobjekt-Lumineszenzstrahlung verbunden. Der Ausgang dieser Einheit 22 liegt am Eingang eines Verhältnisgrößendiskriminators 23 von Komponenten der I.iikroobjekt-Lruninessenzstrahlung.

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Das Ausgangssignal dieses Verhältnisgrößendiskriminators 23 trägt die Information über das Vorhandensein eines veränderten Mikroobjekts in dem von der Feldblende 5 begrenzten Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1. Der Ausgang des Verhältnisgrößendiskriminators 23 ist mit dem Eingang einer Steuereinheit 24 verbunden. Am Ausgang dieser Steuereinheit 23 liegt ein Elektromotor 25$ der mit dem Objekttisch 9 des Lumineszenzmikroskops 1 mechanisch verbunden ist. . '

Die Einheit 22 zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Mikroobjelct-Lumineszenzstrahlung stellt eine Elektronenstrahlröhre 26 (Pig. 2) dar, bei der Horizontalablenkplatten 27 mit dem Ausgang des Verstärkers 18 im Kanal 14 sur Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und die Vertikalablenkplatten 28 mit dem Ausgang des Verstärkers 21 im Kanal 15 zur Registrierung der langwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung verbunden sind. Der Verhältnisgrößendiskriminator 23 von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung ist als fotoelektrischer Geber 29 ausgeführt, der am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 mit Hilfe einer schmalen Platte 31 befestigt ist, wobei die letztere einen Längsschlitz 32 zur Verschiebung des fotoelektrischen Gebers 29 längs dieser Platte 31. aufweist. Die Platte 31 ist an einer Achse 33 befestigt und kann um diese Achse 33 mitsamt dem fotoelektrischen Geber 29 parallel zum Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 geschwenkt werden. Die auf diese Weise mit Hilfe der Bauelemente 29, 30, 31, 32, 33 ausgeführte Polarkoordinaten-Vorrichtung ermöglicht die Einstellung des fotoelektrischen Gebers 29 über einem beliebigen vorher gewählten Punkt des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26. Die Lumineszenzstrahlung des Eikroob.jekts 8 (Pig. 1) ist amplitudenmoduliert, da die Anregungsstrahlungsquelle 2 eine Quelle mit amplitudenmodulierter Strahlung darstellt, wobei die Modulation mittels

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entsprechender Speisung der Anregungsstrahlungsquelle 2 mit Wechselstrom erfolgt·

Die Modulation der die Lumineszenzerregung bewirkenden Strahlung kann auch mit Hilfe einer mechanischen-Verschlussblende erfolgen, die im Strahlengang der Lumineszenzerregungsstrahlung zwischen der Anregungsquelle 2 und der Lichtzerlegungsplatte 6 eingebaut wird, wobei die Anregungsstrahlungsquelle 2 mit Gleichstrom gespeist wird.

Infolge der Amplitudenmodulation der Lumineszenzstrahlung des Hikroobjekts 8 wird jedes Hikroobjekt am Schirm 30 (Pig. 2) der Elektronenstrahlröhre 26 als leuchtende Linie 34 dargestellt, deren auf die Horizontalachse bezogener IJeigungswinkeltangens der Größe des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 zur kurzwelligen Komponente der Kikroobjekt-Lumineszenzstrahlung proportional ist. Die llikroobjekte 8, die sich voneinander durch die Größe des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lurainesζenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente unterscheiden, werden als leuchtende Linien 34, 34», 34'^f mit verschiedenen Neigungswinkeln zur Horizontalachse dargestellt. Deswegen bestimmt der Befestigungspunkt des fotoelektrischen Gebers 29 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 die Grenze der Lokalisation eines veränderten Mikroobjekts 8 beim Überqueren dieses Punktes durch die leuchtende Linie 34·

Das Mikroobjekt kann auf dem Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre durch eine leuchtende Linie 34 auch in dem Falle dargestellt werden, wenn die Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 mittels der amplitudenmodulierten Lumineszenzerregungsstrahlung nicht in der Amplitude moduliert wird. In diesem Falle, also wenn zur Erregung, der Lumineszenz des

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Mikrootgekts 8 eine nichtmodulierte Strahlung benutzt wird, kann die leuchtende Linie 34 auf dem Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 mittels der Modulation von Verstärkungsfaktoren der Verstärker 18 und 21 oder der fotoelektronischen Vervielfacher 17 und 20 erzeugt v/erden.

Eine Vereinfachung der Bedienung der Einrichtung kann bei einer anderen .Ausführungsvariante des Verhältnisgrößendiskriminators 23· von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung erreicht v/erden. Bei dieser Variante enthält der Verhältnisgrößendiskriminator 23 einen fotoelektrischen Geber 35 (Fig* 3)j der im Strahlengang des vom Schirm 30 der Elektronenröhre 26 emittierten Lichtstromes angeordnet wird, sowie eine am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 angeordnete Maske 36, die aus einem im Bereich der Spektralempfindlichkeit des fotoelektrischen Gebers 35 undurchlässigen Werkstoff gefertigt wird. Bei derartiger Ausführung des Verhältnisgrößendiskriminators 23 wird die Anregungsstrahlungsquelle (Pig. 1) des Luraineszenzmikroskops 1 mit Gleichstrom gespeist (die Gleichstromquelle ist in der Zeichnung nicht gezeigt). Dabei wird jedes Mikroobjekt 8 am Schirm 30 (Pig. 3) der Elektronenstrahlröhre 26 als Leuchtfleck 37 dargestellt, dessen Koordinaten durch das Verhältnis der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmt werden. Die sich durch dieses Verhältnis unterscheidenden Mikroobjekte 8 werdenals Leuchtflecke 37» 37^f, 37'^f abgebildet, die an verschiedenen Stellen des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26 liegen. Die Grenzen der Maske 36 bestimmen dabei die Lokalisationsgrenze der veränderten Mikroobjekte.

.Die Steuereinheit 24 (Pig. 4), die in der vorgeschlagenen Einrichtung zur Untersuchung von Luiiiineszenzeigenschaften der Mikroobjekte benutzt wird, enthält einen für elektrische Signale bestimmten Regelverstärker 38, dessen Eingang an den

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Ausgang des Verhältnisgrößendiskriminators 23 angeschlossen ist. Der Ausgang des elektrischen Signalverstärkers 38 . liegt am invertierenden Eingang eines Schmitt-Triggers 39,

In der erfindungsgemäß ausgeführten Einrichtung wird eine allgemein bekannte Schaltungsvariante des Schmitt-Triggers benutzt (vgl· z. B. Analog integrated circuits. Devices circuits, Systems and Applications· I.A. Connelley (ed) John Wiley and Sons Publ., Hew-York - London ~ Sydney - Toronto, 1975)..

Der nichtinvertierende Eingang des Schmitt-Triggers 39 ist über einen Widerstand 40 mit seinem Ausgang und über einen anderen Widerstand 41 mit dem Schleifer 42 eines Potentiometers 43 verbunden, das an den Minuspol 44 und an den Pluspol 45 einer nicht gezeigten Speisequelle des Schmitt-Triggers 39 angeschlossen ist. Der Schleifer 42 wird mit dem Minuspol 44 der nicht gezeigten Speisequelle über einen normal geöffneten Stopknopf 46 und mit dem Pluspol 45 dieser Speisequelle über einen normal offenen Startknopf 47 verbunden. Parallel zum Knopf 47 liegt ein Ausschalter 43.

Der Ausgang des Schmitt-Triggers 39 ist über ein Ventil 49 an parallel zusammengeschaltete elektronische Schalter 50 und 51 angeschlossen, deren miteinander verbundene Ausgänge an den Elektromotor 25 geschaltet sind. Das Ventil 49 ist mit einem Kondensator 52 überbrückt. Der Ausgang des Ventils 49 ist mit der gemeinsamen Schiene 'der nicht gezeigten Speisequelle des Schmitt-Triggers 39 über einen Regelwiderstand. 53 verbunden. Der Ausgang der Schalter 50 und 51 steht über ein Ventil 54 mit einem Tongenerator 55 und einem Kondensator 56 in Verbindung, über den die Speisimg des Tongenerators 55 erfolgt. ·

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Zur Ermittlung des Verhältnisses von veränderten KikrοObjekten 'zur Gesamtzahl der Mikroobjekte im Untersuchungsmuster enthält die Einrichtung einen Impulszähler 57» der über einen Ausschalter 58 an den Ausgang des Verstärkers 21 des Kanals 15 zur Registrierung der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung angeschlossen ist, sowie-einen Impulszähler 59j der über einen Ausschalter 60 an den Ausgang des Verstärkers 18 des- Kanals 14 zur Registrierung der kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung geschaltet ist, und einen Impulszähler 61, der über einen Ausschalter 62 mit dem Ausgang des Verhältnisgrößendiskriminators 23 verbunden ist.

Zur Erhaltung der allgemeinen statistischen Charakteristik aller Ilikroobjekte des Musters enthält die Einrichtung einen Impulsamplitudenanalysator 63 und einen mit diesem in Reihe liegenden elektronischen Signalteiler 64 ₃ deren Eingänge über einen zweipoligen Ausschalter 65 Bn die Ausgänge der Verstärker 18 und 21 der zur Registrierung der entsprechenden kurz- ' welligen bzw* langweilligen Komponenten der Lumineszenzstrahlung von Mikroobjekten bestimmten Kanäle 14 und 15 angeschlossen sind. Der elektronische Signalteiler 64 ist nach der bekannten Schaltungsvariante ausgeführt, die im Buch "Analoge und digitale integrierte Schaltungen", red. von S.W. Jakubowski, S. 239, 240, Verlag "Sowetskoje Radio", Moskau, 1979, angeführt ist«, ·

Die Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften der Mikroobjekte funktioniert wie folgt.

Ein Liikroobjekte 8 (Fig. 1) enthaltendes Huster wird auf dem Objekttisch 9 des Lumineszenzmikroskops 1 angeordnet. Die von der Kollektorlinse 3 gesammelte und vom Lichtfilter 4 herausgelöste Strahlung der Anregungsquelle 2 gelangt auf die mit einem Interferensbelag versehene Lichtzerlegungsplatte 6,

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die diese Anregungsstrahlung unter einem Winkel von 90° zum Mikroobjektiv 7 reflektiert, das die Änregungsstrahlung auf die Ebene des !.lusters mit den Ivükroobjekten 8 fokussiert, bei welcheir unter Einwirkung der Anregungsstrahlung der Quelle 2 die Lumineszenz hervorgerufen wird. Die LLmiineszenz strahlung der Mikroobjekte 8 wird vom Mikroobjektiv 7 gesammelt, von der mit einem Interferenzbelag überzogenen Lichtzerlegungsplatte 6 durchgelassen, vom Spiegel 10 reflektiert und erzeugt ein Bild der Mikroobjekte 8 in ihrem Lumineszenzlicht. Dieses Lumineszenzbild der Mikroobjekte 8 wird voii der Bedienungsperson mit Hilfe des Okulars 11 und des Lichtfilters 12 betrachtet, welches die Strahlung der Quelle 2 absorbiert. Bei der Betrachtung der Lumineszenzabbildung der im Muster enthaltenen Mikroobjekte 8 durch das Okular 11 verändert die. Bedienungsperson die Apertur der Peldblende 5 des Mikroskops 1 in der Weise, daß das Gesichtsfeld des Mikroskops 1 gleich oder um einige Male größer als ein einzelnes lumineszierendes Mikroobjekt 8 im Muster wird» Darauf verschiebt die Bedienungsperson den Spiegel 10 aus dem Strahlengang der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8, wobei diese Strahlung auf die Lichtzerlegungsplatte 13 mit ihrem Interferenzbelag fällt, die die Lumineszenzstrahltmg des Mikroobjekts 8 in zwei Komponenten zerlegt. Die kurzwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 wird von der Lichtzerlegungsplatte 13 reflektiert, durchdringt das Lichtfilter 16 und gelangt zur Fotokatode des fotoelektronischen Vervielfachers 17, der diese kurzwellige Komponente der Mikroobjektstrahlung in ein der Intensität der Komponente proportionales elektrisches Signal umwandelt. Das Ausgangssignal des fotoelektroniechen Vervielfachers 17 wird vom Verstärker 18 verstärkt und einem der Eingänge der zur Erfassung von Komponenten der Lumineszenzstrahlung vorgesehenen Einheit 22 zugeführt. Die langwellige Komponente der LLunineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 durchdringt ungehindert die mit einem Interferenzbelag überzogene Licht-

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zerlegungsplatte 13> passiert das Lichtfilter 19 und fällt auf die Fotokatode des Fotovervielfacher 20,· der diese langwellige Komponente der Lumineszenastrahlung des Mikroobjekts 8 in ein der Intensität der Komponente proportionales elektrisches Signal umformt. Das Ausgangssignal des Fotovervielfacher 20 'wird vom Verstärker 21 verstärkt und gelangt zum zweiten Eingang der zur Erfassung von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmten Einheit 22· Diese Einheit 22 ist als Elektronenstrahlröhre 26 (Fig. 2, 3) ausgeführt.

DenHorizontalablenkplatteii 27 der Einheit 22 wird das Signal vom Ausgang des zum Kanal 14 für die Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung gehörenden Verstärkers 18 zugeführt. Auf die Vertikalablenkplatten der Einheit 22 wird das Signal vom Ausgang des Verstärkers 21 vom Kanal 15 gegeben, der für die Registrierung der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung vorgesehen ist. Infolgedessen wird der Elektronenstrahl von seiner Anfangslage am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 zu einem Punkt abgelenkt, bei dem das Verhältnis seiner Vertikalkoordinate zu seiner Horizontalkoordinate dem Verhältnis der Intensität der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Ivlikroobjekts 8 zur Intensität der kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung dieses Mikroobjekts 8 proportional ist.

Bei einer Ausführungsvariante der Einrichtung zur Untersuchung von Ltimineszenzeigenschaften der Mikroobjekte wird im Lumineszenzmikroskop 1 eine amplitudenmodulierte Anregungsstrahlungsquelle 2 benutzt, die mit Wechselstrom gespeist wird. Infolgedessen bewegt sich der Elektronenstrahl (Fig. 2) mit der IMu-. lationsfrequenz zwischen seinem Anfangspunkt (Nullpunkt) undeinem Punkt, bei dem die Horizontalkoordinate der kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung und die Vertikalkoordinate der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des

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Mikroobjekts 8 proportional sind, wobei am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 eine leuchtende Linie 34 entsteht, deren Ueigungswinkeltangens dem Verhältnis der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des I.iikrootgekts 8 proportional ist. Bei. Einschaltung des Elektromotors 25 (Pig. 1), der die horizontale Verschiebung des Objekttisches 9 im Lumineszenzmikroskop 1 bewirkt,, erscheinen im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 abwechselnd die Mikroobjekte 8, wobei jedem dieser Mikroobjekte am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 eine leuchtende Linie 34, 34% 34" (Pig· 2) entspricht. Wenn im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 ein Mikroobjekt 8 erscheint, bei dem der Wert des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente der Luraineszenzstrahlung größer als der durch den Anordnungspunkt des fotoelektrischen Gebers 29 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 festgelegtem'Wert ist, schneidet die diesem Ivlikroobjekt 3 entsprechende leuchtende Linie' 34 die Anordnungsstelle des fotoelektrischen Gebers 29, wobei an seinem Ausgang ein elektrisches Signal entsteht, welches das Ansprechen der Steuereinheit 24 (Pig. 1) be\7.irkt. Die letztere bringt den Elektromotor .25 zum Stehen, so daß das erkannte Mikroobjekt 8 im Mittelpunkt des Gesichtsfeldes des Lumineszenzmikroskops 1 bleibt. Gleichzeitig gibt die Steuer- ^; einheit 24 der Bedienungsperson ein Tonsignal, welches die Erkennung des veränderten Mikroobjekts 8 signalisiert, des- ' sen Lumineszenzkenndaten näher zu untersuchen sind. Uach durchgeführter Untersuchung der Lumineszenzkennwerte des erkannten Mikroobjekts 8 schaltet die Bedienungsperson den Elektromotor 25 wieder ein und setzt den Suchvorgang fort.

Durch Verschiebung des fotoelektrischen Gebers 29 (Pig. 2) längs des in der Platte 31 vorgesehenen Schlitzes 32 und durch Drehung dieser Platte 31 um die Achse 33 stellt die Bedienungsperson den fotoelektrischen Geber 29 in einem belie-

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bigen vorher gewählten Punkt des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26 ein und gibt dadurch die Grenze der Lokalisation von veränderten Mikroobjekten vor.

In einer anderen Ausführungsvariante der Einrichtung zur Untersuchung von Luriineszenzeigenschaften der MikroObjekte wird'im .Lumineszenzmikroskop 1 eine Anregungsstrahlungsquelle 2 (J¹Ig. 1)" benutzt, die mit Gleichstrom gespeist wirdο Darum entspricht jedem im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 erscheinenden Mikroobjekt 8 bei eingeschaltetem Elektromotor 25 des Objekttisches 9 ein am Schirm 30 (Pig. 3) der Elektronenstrahlröhre 26 entstehender Leuchtfleck 37, bei dem seine Horizontalkoordinate der kurswelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 und seine Vertikalkomponente der langwelligen Komponente seiner Lumineszenzstrahlung proportional sind.

Bei dieser Variante der Einrichtung funktioniert der Verhältnisgrößendiskriminator 23 von Komponenten der Lumineszenzstrahlung der Mikroobjekte folgenderweise.

Bei eingeschaltetem Elektromotor 25 (Pig. 1.) des Objekttisches 9 erscheinen im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 nacheinander die Mikroobjekte 8, wobei jedem dieser Mikroobjekte 8 ein am Schirm.30 der Elektronenstrahlröhre 26 entstehender Leuchtfleck 37, 37', 37" (Pig. 3) entspricht. Wenn im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 ein Mikroobjekt 8 erscheint, bei dem der Wert des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung größer als der durch die Konfigura- · tion der Maske 36 gegebene Wert ist, erscheint der Leuchtfleck 37 in dem Teil des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26, der durch die Maske 36 nicht verdeckt ist, wobei der Leuchtfleck 37 vom fotoelektrischen Geber 35 registriert wird, an dessen Ausgang ein elektrisches Signal entsteht, welches dem Eingang der Steuereinheit 24 (Pig· 1) zugeführt wird. Durch

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Änderung der Konfiguration der am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 angeordneten Maske 36 gibt die Bedienungsperson eine beliebige Grenze der Lokalisation von veränderten Mikroobjekten 8 vor.

Die Steuereinheit 24 funktioniert wie folgt.

Beim Schließen des Kontaktes des Startknopfes 47 (Fig. 4) wird dem nichtinvertierenden Eingang.des Schmitt-Triggers 39 über einen Widerstand 41 eine positive Spannung zugeführt, wobei am Ausgang des Schmitt-Triggers 39 eine positive Spannung erscheint, die über das Ventil 49 zum Eingang der parallel zusammengeschalteten elektronischen Schalter 50 und 51 gelangt. Hierbei wird der elektronische Schalter 50 leitend und schließt den vom positiven Pol der Speisequelle führenden Speiseäromkreis des Elektromotors 25. Der Elektromotor 25 verschiebt den Objekttisch des Lumineszenzmikroskops 1. Beim Erscheinen eines veränderten Ivlikroobjekts 8 im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 entsteht am Ausgang des VerhältnisgrÖßendiskriminators 23 ein elektrisches Signal, das nach seiner Verstärkung im Verstärker 38 dem invertierenden Eingang des Schmitt-Triggers 39 zugeführt wird und in diesem einen Zustand einstellt, bei dem am Ausgang des Schmitt-Triggers 39 eine negative Spannung erscheint· Im Laufe eines Zeitabschnitts, der durch die Zeitkonstante des aus dem Kondensator 52 und dem Regelwiderstand 53 bestehenden RC-Gliedes bestimmt wird, liegt diese Spannung am Eingang der parallel verbundenen elektronischen Schalter 50 und 51· In- " folgedessen wird der elektronische Schalter 50 gesperrt und unterbricht den vorn Pluspol der Speisequelle führenden Speisestromzwoig des Elektromotors 25· In der Zeitspanne, die von den Werten des Kondensators 52 und des Regelwiderstandes 53 abhängt, ist der elektronische Schalter 51 leitend und schließt den negativen Speisestromzweig des Elektromotors

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25, wobei der Objekttisch 9 zurückgeschoben wird und die trägheitsbedingte Verschiebung des Mikroobjekts 8 in bezug auf den Mittelpunkt des Gesichtsfeldes des Lumineszenzmikroskops 1 kompensiert. Durch die vom Ausgang des elektronischen Schalters 51 über das Ventil 54 zugeführte negative Spannung wird der Kondensator 56 aufgeladen, von dem der Tongenerator 55 gespeist wird. Der Tongenerator gibt der Bedienungsperson ein Tonsignal bei der Erkennung eines Mikroobjekts 8, bei dem die Größe des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente seiner Lumineszenzstrahlung über dem vom Verhältnisgrößendiskriminator 23 vorgegebenen Pegel liegt.

Nach Erhaltung dieses Tonsignals führt die Bedienungsperson den Spiegel 10 in den Strahlengang ein und beginnt mit Hilfe des mit dem Lichtfilter 2 ausgestatteten Okulars 11 die morphologische Untersuchung des -erkannten tiikroobjekts 8. Danach schiebt die Bedienungsperson den Spiegel 10 aus dem Strahlengang des Lumineszenzmikroskops 1 heraus und untersucht die unter Einwirkung von physikalisch-chemischen Eaktoren, z« B. der Ultraviolettstrahlung, erfolgte Änderung des Verhältnisses der kurzwelligen, und der langwelligen Komponenten der Strahlung des erkannten llikroobjekts.

Nach Beendigung der Untersuchung des erkannten Mikroobjekts leitet die Bedienungsperson durch das Drücken des Startknopfes 47 die Suche der Mikroobjekte 8 mit vorgegebenen Lumineszenzkennwerten ein. -Durch Drücken des , Stopknopfes 46 kann die Bedienungsperson in jedem beliebigen Moment die negative Spannung auf den nichtinvertierenden Eingang des Schmitt-Triggers 39 geben und die Arbeit des Elektromotors 25 stoppen. Mit Hilfe des Schleifers -42 des Potentiometers 43 wird die erforderliche Betriebsart des Schmitt-Triggers 39 vorgegeben. Der Schalter 48 blockiert den Startknopf 47 für die Zeit der Einstellung der Einrichtung zur Untersuchung

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von Luinineszenzeigenschaften der Mikroobjekte 8. Indem der Bediener mit Hilfe des Ausschalters 58 den Impulszähler 57 an den Ausgang des Kanals 15 zur. Registrierung der langwelligen Komponente der liikroobjekt-Lumineszenzstrahlung anschließt oder mit Hilfe des Ausschalters 60 den Impulszähler 59 an den Ausgang des Kanals 14 zur Registrierung der kurzwelligen Komponente der Hikroobjekt-Luraineszenzstrahlung anschaltet, erhält er die Information über.die Gesamtzahl von lumineszierenden Mikroobjekten 8 im Untersuchungsmuster. Beim Anschluß des .Impulszählers 61 an den Ausgang des Diskriminators 23 mit Hilfe des Ausschalters 62 erhält der Bediener Angaben über die Anzahl von veränderten Mikroobjekten 8 im Untersuchungsmuster, und auf Grund der angezeigten Werte des Impulszählers 57 oder 59 und des Impulszählers 61 bestimmt er die relative Menge von veränderten Iviikroobjekten 8 im Untersuchungsmuster.

Bei der mit Hilfe des zweipoligen Ausschalters 65 erfolgenden Anschaltung der Eingänge des elektronischen Signalteilers 64 an die Ausgänge der zur Registrierung der kurzwelligen und der langwelligen Komponenten der Mikroobjekt-Luiuineszenzstrahlung bestimmten Kanäle 14 und 15 erhält man am Ausgang des elektronischen Signalteilers 64 ein Ausgangssignal, welches dem Wert des Verhältnisses der langwelligen Komponente zur kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts entspricht. Vom Ausgang des elektronischen ,Signalteilers 64 werden die Signale dem Eingang des Impuls— amplitudenanalysators 63 zugeführt, der ein Staffelbild der Amplitudenverteilung· der Werte von Verhältnissen der langwelligen und der kurzwelligen Komponenten der Lumineszenzstrahlung aller zum Untersuchungsmuster gehörenden lumineszierenden Mikroobjekte konstruiert.

Die Benutzung der Einrichtung in verschiedenen Anwendungsgebieten wird durch nachstehende Beisuiele veranschaulicht.

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mm OO — il

Beispiel 1: Medizinische Diagnostik

Abstriche von Blut, Knochenmark, Aszitesflüssigkeit, abgeschabter Schleimhaut, Abdrücke des Biopsiematerials, Gewebeschnitte werden im Laufe von 4 bis 10 Minuten auf dem Objektglas mit der Carnoi-Plüssigkeit oder einer Ethanol-Azeton-Lösung (1 : 1) fixiert, in einer Zitrat-Phosphat-Pufferlösung mit pH'= 4>0 ·.· 4,6 im Laufe von 4 bis 6 Minuten gehalten und mittels einer Akridinorange-Lösung-mit einer Konzen-

-5-4 tration von 5·10 ,..10 M sowie einer Zitrat-Phosphat-Pufferlösung mit pH = 4,0 ... 4,2 bei einer Temperatur von 18 ... 20 °G im Laufe von 8...12 Min. gefärbt. Die gefärbten! Präparate werden mit derselben Pufferlösung oder mit destilliertem Wasser gespült, mit einem Deckglas bedeckt und auf dem Objekttisch 9 der Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften der Mikroobjekte angeordnet.

Man benutzt die Interferenzplatte 13 (l⁷ig. 1)_} die die Strahlung im grünen Spektralbereich (500...580 nm) reflektiert und im roten Spektralbereich (600...700 nm) durchläßt, so\7ie die Lichtfilter 4, 16, 19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 436 nm (4), 530 nm (16) und 640 nm (19). Die Impulszähler 59 und 61 sind angeschlossen.

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Intensität Ι^λ der -roten Komponente (64Ο nm) der Lumineszenz strahlung einer Zelle · zur Intensität I^q <3-^er grünen Komponente (53Ο nm) der Zellenluxiineszenz, das dem Verhältnis der Menge von Einspiral-ITukleinsäuren (US-..) zur Menge von Zweispiral-Hukleinsäuren in der Zelle proportional ist:

wobei A ein Proportionalitätsfaktor ist. Hach Einstellung einer bestimmten Ansprechschwelle des Verhältnisgrößendiskri-

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minators 23 schaltet der Bediener durch Betätigung des Startknopfes 47 den Elektromotor--25 des Objekttisches 9 im Lumineszenzraikroskop 1 ein Lind findet schnell eine veränderte Zelle, deren -Kennwert oC über der von ihm eingestellten AnsprechsciiV/elle des Verhältnisgröi3endiskriminators 23 liegt. Nach Erhaltung eines Tonsignals rückt der Bediener den Spiegel 10 in den Strahlengang und untersucht die erkannte veränderte Zelle nach ihren morphologischen Daten·

Wach.' Beendigung der morphologischen Untersuchung der Zelle führt der Bediener den Spiegel 10 wieder aus dem Strahlengang heraus und untersucht den Vorgang der Farbstoff-Foto— destruction in der erkannten Zelle. Verläuft die Fotodestruktion des Farbstoffes unter Einwirkung der Strahlung der Quelle 2 so, daß die Bewegungsbahn 66 (Fig. 5) des Leuchtflecks 37 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 längs der Linie gerichtet ist, die den Koordinatenanfangspunkt und den die betreffende Zelle kennzeichnenden Ausgangspunkt verbindet, so gehört die erkannte Zelle zur normalen differenzierten Zellenart, und der hohe ⁰C-Wert dieser Zelle ist die Folge ihrer erhöhten synthetischen Aktivität.

Wenn in einem.der oben aufgeführten zytologischen Präparate, mit Ausnahme von Knochenmark, bei dem das Vorhandensein von Blastomzellen als normal gilt, unter den gefundenen Zellen mit erhöhtem oC -Wert eine Zelle erkannt wird, in der die Fotodestruktion des Farbstoffes unter Einwirkung.der Anregungsstrahlungsquelle 2 so erfolgt, daß die Intensitätsabnahme bei der roten Komponente (64O mn) von einer Erhöhung der Intensität der grünen Komponente (530 nm) begleitet wird und die Bewegungsbahn 67 des Leuchtflecks 37 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre-26 einen bedeutenden Anteil aufweist, der senkrecht zu der den Koordinatenanfangspunkt mit dem Ausgangspunkt 37 verbindenden Linie steht, so ist diese Zelle nichtdifferenziert (oder eine dedifferenzierte Krebszelle) und zeugt von einer gefährlichen Pathologie des

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Organismus* Ira Falle, wenn die Fotodestruktion der erwähnten Art für den segmentkernigen Granulozyt charakteristisch ist, der anhand der morphologischen Merkmale mit Hilfe des Okulars 11 leicht erkannt wird, weist dies auf eine Art von Lupus systemicus beim betreffenden Organismus hin·

Nach Beendigung der visuellen und apparativen Untersuchung der erkannten veränderten Zelle drückt der Bediener auf den Startknopf 47 und setzt das Suchen fort» Im Ergebnis der Präparatanalyse erhält der Bediener mit Hilfe des Impulszählers 59 die Information über die Gesamtzahl von kernhaltlgen Zellen im Präparat, mit Hilfe des Impulszählers 61 die Angaben über die Menge von veränderten Zellen im betreffenden Präparat sowie die Hinweise auf den Veranderungsgrad von vorhandenen Zellen auf der morphologischen und molekularen Ebene.

Beispiel 2; Immunologie

Die Zellen eines Organismus läßt man mit den durch Lumineszenzfarbstoffe, ζ. Β/£(^ΓΙ|" (4-Azetamid, 4' - Isothiozyanostilben-2, 2^f - Disulfonsäure) markierten Antikörpern nach einem für diese immune Reaktion geeigneten Verfahren ausbrüten, setzt zusätzlich die Bromid-Etydium-Lösung (2,7~Diamino-10-Ethyl-9-Pheylphenantrydium-Broraid) mit einer Konzentration von 10 ...10 g/ml hinzu, deckt das Präparat mit einem Deckglas und legt es nach 1 bis 8 Min« auf den Objekttisch 9. ·

Man benutzt die Interferenzplatte 13 (Fig· 1), die die Strahlung im blauen Spektralbereich (400..»500 nm) reflektiert und im roten Spektralbereich (580...700 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4, 16, 19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 365 nm (4), 460 nm (16) und 610 nm (19) und schaltet die Impulszähler 57 und 61 ein. .

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Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Intensität I^go der Lumineszenz im blauen' Spektralbereich zur Intensität Ig-]q _m im roten Spektralbereich, welches das Verhältnis der Immimfluoreszenz-Liarkierung (M) zur Gesamtmenge von Nukleinsäuren (ITS) in der betreffenden Zelle wiedergibt:

-ν (2), wobei A einen Proportionalitätsfaktor bedeutet.

Nach Einstellung der entsprechenden Ansprechschwelle des Verhältnisgrößendiskriminators 23 schaltet der Bediener den Elektromotor 25 durch einen Druck auf den Startknopf 47 ein und findet schnell die Zellen mit hoher immuner Aktivität, falls solche im Präparat vorhanden sind. Die erkannten Zellen werden mit Hilfe des Okulars 11 morphologisch untersucht. Im Ergebnis der durchgeführten Analyse der Probe erhält der Bediener mit Hilfe des Impulszählers 57 die Information über die Gesamtzahl von kernhaltigen Zellen in der Probe, mit Hilfe des Impulszählers 61 die Angaben über die Anzahl von Zellen mit hoher immuner Aktivität und mit Hilfe des Okulars 11 die morphologischen Daten der Zellen mit hoher immuner Aktivität. . ^ ·

Beispiel 3 Mikrobiologier-

Zur Suspension von gramnegativen Mikroorganismen (Produzenten) setzt man wäßrige Lösungen von ANS (i-Anilin-Naphthalen-8- . Sulfonät) in einer Konzentration von 10 g/ml sowie von Bromide tyd ium (10 g/ml) hinzu. Das erhaltene Gemisch wird auf das Objektglas aufgetragen, mit einem Deckglas bedeckt und auf dem Objekttisch 9 angeordnet.

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Man benutzt die mit Interferenzbelag versehene Lichtzerlegungsplatte 13) die die Strahlung im blauen' Spektralbereich (400...520 nra) reflektiert und im roten Spektralbereich (580...700 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4, 16, 19, deren Durchlaßbereichsmaxima bei 365 nm (4), 490 nm (16) und 610 nm (19) liegen.

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Lumineszenzintensität Ir₁Q . im roten Spektralbereich zur Intensität. I^qq ^^ im blauen Spektralbereich:

= ^I61O^/I49O (3), .

welches den Grad der Zellschädigung charakterisiert.

Nach der Einstellung der Ansprechschwelle des Verhältnisgrößendiskriminators 23 und nach der Betätigung des Startknopfes 47 erkennt der Bediener schnell die im Präparat enthaltenen Zellen mit dem vorgegebenen oder größeren Beschädigungsgrad und; unterzieht sie der morphologischen Analyse mit Hilfe des Okulars 11·

Beispiel 4; Zellenenergetik

Eine Suspension von lebenden Zellen oder ein Abdruck des Biopsiematerials wird auf das Objektglas aufgetragen, mit einem Deckglas bedeckt und auf dem Objekttisch 9 angeordnet.

Man benutzt eine Lichtzerlegungsplatte 13, die die Strahlung im blauen Spektralbereich (400*..490- nm) reflektiert und im grünen Spektralbereich (500...600 nm)· durchläßt, sowie die Lichtfilter 4₅ 16 und 19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 365 nm (4), 470 nra (16) und 530 nm (19).

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(— j ( · SB' ^B* » ^iT

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Lumineszenzstrahlungs-Intensität von oxydierten Plavoproteinen auf der Wellenlänge von 530 nm zur Lumineszenzintensität der reduzierten Pyridinnu'kleotide auf der Wellenlänge von 470 nm:

welches die energetische Aktivität der Zelle charakterisiert«

Nach der-Einstellung der Ansprechschwelle des Verhältnisgrö'ßendiskriminators 23 und nach der Betätigung des Startknopfes 47 erkennt der Bediener schnell die Zellen mit erhöhter energetischer Aktivität und untersucht sie mit Hilfe des Okulars 11.

Beispiel ^: Biomonitorin^ des lükrpphytoplanktons

Ein Wassertropfen aus einem zu untersuchenden Wasserbecken wird auf das Objektglas aufgetragen, mit einem Deckglas bedeckt und auf den Objekttisch 9 gelegt.

Man benutzt eine Interferenzplatte 13» die die Strahlung im gelb-orangenen Spektralbereich (56O.*.660 nm) reflektiert und im roten Spektralbereich (67O...75O nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4» 16, 19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 436 na (4), 660 nm (16), 680 nm (19) und schaltet die Impulszähler 57 und 61 an.

Als charakteristisches Merkmal einer Zelle benutzt man das Verhältnis der Lumineszenzintensität des Allophykozyanins bei 66O nm zur Lumineszenzintensität des Chlorophylls bei 680 mn:

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- 28 welches das Alter von Zellen der Blaugrünalgen kennzeichnet.

Nach der Einstellung der Ansprechschwelle des Verhältnisgrößendiskriminators 23 erkennt der Bediener im Präparat die Zellen der Blaugrünalgen, die sich im stationären Entwicklungsstadium befinden. Dabei erhält der Bediener mit Hilfe des Impulszählers 61 die Information über das Verhältnis'der Anzahl von Zellen der Blaugrünalgen, die sich im Wasserbecken im stationären Entwicklungsstadium befinden, zur Gesamtzahl von Zellen des Mikrophytoplanktons, die mittels des Impulszählers 57 ermittelt wird.

Dasselbe Präparat wird im Laufe von 5 bis 10 Min. der totalen Bestrahlung durch Ultraviolettstrahlung von 365 nm Wellenlänge unterzogen, worauf es wiederholt analysiert wird. Im Ergebnis dieser Analyse erhält man das Verhältnis der Gesamtzahl von Zellen der Blaugrünalgen, die mittels des Impulssählers 61 bestimmt wird, zur Gesamtzahl von Zellen des Llikrophytoplanktons, die mit Hilfe des Impulszählers 57 ermittelt wird.

Die erfindungsgemäß ausgeführte Einrichtung weist bei allen aufgeführten Anwendungsbeispielen gegenüber den bekannten zu ähnlichen Zwecken angewandten Einrichtungen entscheidende Vorteile auf. Bei Benutzung der vorgeschlagenen Einrichtung in der medizinischen Diagnostik, .ähnlich dem Beispiel 1, kann während eines Arbeitstages die Analyse von 100 bis 200 Präparaten des menschlichen Gewebes zwecks Erkennung von dedifferenzierten Krebszellen beim Vorhandensein von einer bis zwei pathologischen Zellen in 1000 bis 10000 normalen Zellen. Dabei erhöht sich stark die Genauigkeit der Diagnose des dediffereiizierten Zustands einer Krebszelle infolge der Auswertung ihrerbesonderen physikalisch-chemischen Kennwerte (Parbstoff-Fotodestruktion) zusätzlich zur üblichen morphologischen visuellen

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Analyse einer derartigen Zelle. Der verhältnisraäßig einfache Aufbau der Hinrichtung bedingt eine wesentliche (um das 7-bis 10fache) Senkung ihrer Herstellimgs- und Betriebskosten gegenüber den bekannten automatischen Einrichtungen, bei denen zur Erkennung der pathologieverdächtigen Zellen morphologische Merlanale benutzt v/erden.

Claims

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Erfindungsanspruch

Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten mit einem Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch ein Mikroobjekt liegt und im Wege der durch die Strahlung einer Anregungsstrahlungsquelle hervorgerufenenLumineszenzstrahlung des Mikroobjektes eine Lichtzerlegungsplatte mit Interferenzbelag angeordnet ist, um die kurzwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenz-Strahlung zu einem Kanal für die Registrierung der entsprechenden Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung zu reflektieren und die langwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahluiig hindurchzulassen, gekennzeichnet durch zusätzliche Verwendung einer Reihenschaltung mit einer Einheit (22) zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Hikroobjekt-Lumineszenzstrahlung, die mit ihren Eingängen an die Ausgänge der Kanäle (14, 15) zur Registrierung von entsprechenden Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung angeschlossen ist, einem Verhältnisgrößendiskriminator (2.3) für die Komponenten der Mikroob.jekt-LLimineszenzstrahlung, dessen Ausgangssignal die Information über das Vorhandensein eines veränderten Mikroobjekts (8) trägt, sowie mit einer Steuereinheit (24) und einem mit dem Objekttisch (9) des Lumineszenzmikroskops (1) verbundenen Elektromotor (25)»

Einrichtung nach Punkt 1, gekennzeichnet durch die Ausführung der Einheit (22) zur Erfassung des Verhältnisses von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahliing in der Art einer Elektronenstrahlröhre (26) mit Horizontalablenkplatten (27), die mit dem Ausgang eines Kanals (14) zur Registrierung der entsprechenden Komponente der Mikroobjekt-Luinineszenzstrahlung verbunden sind, und mit Vertikalablenkplatten (28), die an den Ausgang des anderen
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Kanals (15) cur Registrierung der entsprechenden Komponente der IJikroobjekt-Iuraineszenzstrahlung angeschlossen sind.
3. Einrichtimg nach Punkt 2, gekennzeichnet, dadurch, daß die Anregungsstrahlungsquelle (2) eine Quelle mit modulierter Strahlung und veränderlicher Frequenz darstellt und der Verhältnisgrößendiskriminator (23) für die Komponenten'der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung als fotoelektrischer Geber '(29) ausgeführt ist, der am Schirm (30) der Elektronenstrahlröhre (26) verschoben werden kann und in einem Punkt befestigt ist, der beim Überqueren dieses Punktes durch eine dem Verhältnis von Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung entsprechende leuchtende Linie (34) die Grenze der Lokalisation von veränderten I.iikroobjekten (8) bestimmt.
4. Einrichtung nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Verhältnisgrößendiskriminator ('23) für die Komponenten der Mikroobjekt-Lumiiieszenzstrahlung eine am Schirm (30) der Elektronenstrahlröhre (26) angeordnete Maske (36) enthält, deren Konfiguration die Grenze der Lokalisation von veränderten Mikroobjekten (8) bestimmt, sowie einen fotoelektrischen Geber (35) im Strahlengang des vom Schirm (30) der Elektronenstrahlröhre (26) emittierten Lichtstromes aufweist.
5. Einrichtung nach den Punkten 1 bis 4, gekennzeichnet durch zusätzliche Ausstattung mit einem elektronischen Signalteiler (64), dessen Eingänge an die Ausgänge der Kanäle (14, 15) zur Registrierung der entsprechenden Komponenten der Mikroobjekt-Liuniiiessenzstrahlung angeschlossen sind, sowie mit einem mit dem Signalteiler (64) in Reihe liegenden Irüpiilsaniplitudenanaljrsator (63). '
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Einrichtung nach den Punkten 1 bis 5, gekennzeichnet;
durch die Anwendung von drei Impuls zählern (57, 59, 61.)'» von denen zwei Impulszähler (57, 59) an die Ausgange der Kanäle (14, 15) zur Registrierung der. entsprechenden Komponenten der Hikrooboekt-Lumineszenzs-fcrahlung angeschlossen sind und der dritte Impulszähler (61) am Ausgang des Verhältnisgrößendiskriminators (23) für die Komponenten der l.iikroobjekt-Lumineszenzstrahlung liegt.

Hierzu iL_Se!ten Zeichnungen