DE19709348A1

DE19709348A1 - Automatisches Multi-Epitop-Ligand-Kartierungssystem

Info

Publication number: DE19709348A1
Application number: DE19709348A
Authority: DE
Inventors: Walter Dr Schubert
Original assignee: Walter Dr Schubert
Current assignee: TOPOS NOMOS LTD., DE
Priority date: 1996-05-29
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 1997-12-04
Anticipated expiration: 2017-03-08
Also published as: DE59711557D1; US6150173A; DE19709348C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine automatisierte Vorrich tung zur Bestimmung und Messung einer beliebigen Anzahl Xn (n = 1,2,3 . . . N) von Molekülklassen, Molekülteilen oder Molekülgruppen in einem flüssigen oder festen Objekt. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung und Kar tierung einer beliebigen Anzahl Xn (n= 1,2,3 . . . N) an Molekülklassen, Molekülteilen oder Molekülgruppen in einem flüssigen oder festen Objekt, wobei automatisch eine beliebige Anzahl von Reagenzien gleichzeitig oder sequentiell auf ein Objekt aufgebracht und gemessen wird.

Im naturwissenschaftlichen Bereich, insbesondere der Bio logie, Chemie, Biochemie und in der Medizin werden verschiedene Techniken und Verfahren angewandt, um die korrelative Vertei lung und/oder Kombination und Anordnung von verschiedenen Mole külklassen bzw. Molekülgruppen, wie beispielsweise von Eiweiß molekülen oder Polymeren, oder gegebenenfalls das färberische Verhalten des Objekts zu untersuchen und zu bestimmen. Das Ziel dieser verschiedenen Verfahren und Techniken besteht in der Gewinnung von Kenntnissen der Anordnung, Verteilung und Struktur der Molekülgruppen in den jeweiligen flüssigen oder festen Objekten. Dabei werden die zu untersuchenden Objekte mit spezifischen Lösungen versetzt, um beispielsweise anhand der gebildeten Komplexe (z. B. EDTA-Metallkomplexe oder Antigen- Antikörper-Komplexe, etc.) die spezifischen Molekülklassen oder Molekülgruppen zu untersuchen und zu bestimmen. Insbesondere in der Medizin und Biologie werden derartige Verfahren angewandt, um über die Anordnung und Verteilung solcher Molekülspezies im jeweiligen Objekt diagnostische Meßdaten zu bestimmten Krankheitsbildern zu erhalten, oder Kenntnisse über die molekulare Organisation von Zellen oder Zellsystemen zu gewinnen.

Die aus dem Stand der Technik bekannten manuellen Verfahren werden nach einem bestimmten Schema durchgeführt. So wird im biologischen oder medizinischen Bereich das zu untersuchende Objekt mit einer Lösung versetzt, die ein spezifisches Reagenz enthält. Dieses Reagenz kann ein Farbstoff, ein Antikörper etc. sein, welches mit einer bestimmten Molekülgruppe, insbesondere unter Bildung eines spezifischen Komplexes, reagiert. Das heißt, das spezifische Reagenz markiert spezifische Gruppen bzw. Stellen im zu untersuchenden Objekt. Nach einer bestimmten Einwirkungszeit wird das spezifisch markierte Objekt unter sucht. Dies geschieht allgemein mit Hilfe von Signalvertei lungsmustern, beispielsweise bei der mikroskopischen Untersuchung von Zellen durch unterschiedliche Fluores zenzsignale unter Verwendung von Fluoreszein-iso-thio-cyanat oder Phycoerythrin.

Ein Teil der manuellen Verfahren, wie z. B. die Anfärbung von Gewebeschnitten mit einfachen Farblösungen, kann nach dem Stand der Technik auch von speziellen Färbeautomaten durchgeführt werden, für einfache Molekül-Markierungen in Zellen existieren Markierungsautomaten.

Für diese beide Verfahrensweisen - manuelle und automatische Behandlung von Objekten, speziell von Zellen oder Gewebeschnitten mit Reagenzien - gilt jedoch, daß die Ergebnisse visuell kontrolliert und in einem anderen, speziell dafür vorgesehenen gesonderten Gerät, nach manueller Einrichtung des Objektes in diesem Gerät, zum Beispiel einem Mikroskop ausgewertet werden müssen.

Komplexere Verfahren der Behandlung von Objekten mit Reagenzien, wie zum Beispiel das sequentielle Aufbringen verschiedenster Lösungen auf Zellen, die zu bestimmten Zeitpunkten während dieses Vorgangs ausgewertet oder aufgezeichnet werden müssen, sind nach dem Stand der Technik vollkommen auf manuelle Verfahren beschränkt, und extrem fehler-behaftet, d. h. nicht quantitativ auswertbar oder statistisch verwertbar. Wenn solche Methoden sehr genaue Zeitkontrollen der einzelnen Zwischenschritte (z. B. in exakt 20 minütigen Abständen) über ein großes Gesamt-Zeitinterval erfordern (z. B. über 34 Std.) werden die Grenzen der Durchführbarkeit durch einen Untersucher bei weitem überschritten.

Um die korrelative Verteilung mehrerer Molekülklassen zueinander festzustellen, werden in der Biomedizin häufig mehrere verschiedene Fluorochrome verwendet, die jeweils (direkt oder indirekt) an die zu lokalisierenden Molekülklassen gekoppelt werden. In diesem Fall werden die von diesen unterschiedlichen Fluorochromen ausgehenden Fluoreszenzsignale getrennt erfaßt. Die Beziehungssetzung dieser Signale zueinander ergibt schließlich Informationen über die korrelative Verteilung der verschiedenen Molekülklassen.

Diese Verfahren, die vor allem für die Untersuchung kombi natorischer molekularer Differenzierungsprozesse von Bedeutung sind, sind jedoch auf die Untersuchung von maximal 4 bis 5 ver schiedene Fluoreszenzsignale in einer gegebenen Probe limi tiert, da eine größere Anzahl verschiedener Fluoreszenzsignale nicht voneinander getrennt werden kann. Die bisher existieren den Verfahren sind daher hinsichtlich der in ein- und derselben Probe bestimmbaren und lokalisierbaren Molekülklassen sehr ein geschränkt. Höhergradige kombinatorische Ordnungsformen können daher bisher nicht erfaßt werden.

Eine Überwindung dieser Beschränkung ist nur möglich, in dem in einem ersten Schritt nach einer Markierung von bestimm ten Molekülklassen oder Molekülgruppen in der oben beschrie benen Weise die durch die am Ort dieser Markierung gebundenen Fluorochrome durch Bleichen infolge UV-Bestrahlung zerstört werden.

Danach wird eine zweite bzw. weitere Lösung auf das Objekt gegeben, die ein bis maximal 5 verschiedene, Fluorochrome für die Markierung weiterer Molekülklassen enthält. Nach der erfor derlichen Einwirkungszeit erhält man wiederum neue spezielle Signalverteilungsmuster von den spezifisch markierten Molekü len. Nach Bleichen der Fluorochrome wird dieser Vorgang mehr mals wiederholt. Die Anzahl an Signalverteilungsmuster steigt somit mit der Anzahl der verwendeten Reagenzlösungen. Diese verschiedenen Signalverteilungsmuster können Aufschluß über die Anordnung und Verteilung der Molekülgruppen im Objekt geben.

Diese bisher bekannten Verfahren zur Bestimmung von Molekül klassen oder Molekülgruppen weisen jedoch erhebliche Nachteile auf, da die einzelnen Verfahrenschritte manuell durchgeführt werden. Diese manuell durchgeführten Verfahrensschritte sind sehr zeitaufwendig und für moderne Verfahren, die exakte quan titative Auswertungen zur Verfügung stellen müssen, stark fehlerbehaftet bzw. nicht hinreichend standardisierbar.

Beispielsweise wird die Reagenzlösung in der Regel per Hand auf das Objekt aufpipettiert, das Objekt wird dann manuell auf einen Mikroskopiertisch gelegt und entsprechend positioniert. Alle weiteren Pipettiervorgänge erfolgen dann manuell auf dem Objekt, das sich unverändert auf dem Objekttisch des Mikroskops befindet. Beim manuellen Pipettieren wird die genaue Dosierung der Reagenzlösung nicht immer exakt eingehalten. Es ist auch nicht möglich, beim wiederholten Pipettieren die Pipette mehrmals über die exakt gleiche Stelle des Objektes zu positionieren. Darüberhinaus passiert es auch sehr leicht, daß die Pipette mit dem zu untersuchenden Objekt in Berührung kommt, so daß diese Objektstelle verändert werden kann. Hieraus resultiert eine Verfälschung der Auswertungsergebnisse.

Für eine Testreihe mit mehr als 20 verschiedenen Markern, die halbstündlich manuell aufgebracht werden, werden für die Durchführung mehrere Tage benötigt. Eine sich daran anschließende Signal- oder Bildauswertung, d. h. die Bestimmung der korrelativen Molekülverteilungsmuster, kann ebenfalls mehrere Tage bis Wochen in Anspruch nehmen, da die verschiedenen Signalverteilungsmuster zunächst einzeln ausge wertet müssen, um sie dann zu einem Gesamtbild zusammenfügen zu können. Dieses Auswertungsverfahren ist ebenfalls sehr zeitin tensiv. Um letztendlich zu einem Auswertungsergebnis zu gelan gen, sind daher oft einige Wochen erforderlich.

Aus den genannten Gründen ist es bei den bekannten Verfah ren daher nur möglich, maximal 4-5 Molekülklassen in einem Objekt zu lokalisieren und zu bestimmen, d. h. die Anzahl der Molekülklassen oder Molekülgruppen, die bisher untersucht und bestimmt werden konnten, war sehr eingeschränkt.

Infolgedessen ist es derzeit nicht möglich, eine exakte quantitative Mikroskopie höherkomplexer molekularer Kombinationsmuster einzelner Proben zu betreiben.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile bzw. Einschränkungen herkömmlicher Verfahren zur Bestimmung von Molekülklassen, Molekülgruppen oder Molekülteilen (z. b. Epi tope, Domänen) in verschiedenen Objekten zu überwinden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine automatisierte Vorrichtung zur Bestimmung und Messung einer beliebigen Anzahl Xn (n = 1.2,3 . . . n) an Molekülklassen, Molekülgruppen und Molekülteilen in einem flüssigen oder festen Objekt. Mit dieser Vorrichtung können beliebig viele Einzelmarkierungsmuster von ein- und demselben Objekt aufgenommen und durch computergestützte Bildüberlagerung in hochkomplexe molekulare Kombinationsmuster überführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein automa tisches Verfahren, mit dem eine beliebige Anzahl X (X=1,2,3 . . . N) verschiedener Molekülklassen oder Molekülgruppen in einem flüssigen oder festen Objekt automatisch bestimmt wer den kann.

In diesem automatischen Verfahren können auf der Grundlage wiederholter Fluoreszenzbleichungsvorgänge und durch Hinterein anderschalten einer beliebigen Anzahl von Fluoreszenzmarkierun gen und Fluoreszenzbleichungen beliebige komplexe Kombinationen verschiedener Molekülspezies und Molekülklassen in ein- und derselben Struktur (bevorzugt biologischer) festgestellt werden. Dadurch können höhere Formen kombinatorischer Ordnung in Systemen, bevorzugt in biologischen Systemen, festgestellt werden.

Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Pipettiersystem, ein 3D-Handhabesystem sowie ein optisches Meßsystem. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines inversen oder aufrechten Mikroskopstativs. Das 3D-Handhabesystem umfaßt ein Roboter- oder Linearführungssystem. Weiterhin ist auch ein Bildaufnahmegerät an die Vorrichtung angeschlossen und insbesondere mit der Mikroskopeinheit verbunden. Die Vorrichtung ist automatisiert, d. h. die Funk tionsabläufe der Bestandteile im einzelnen und auch in Kom bination miteinander werden durch einen Computer gesteuert und überwacht.

Fig. 1 zeigt den schematischen Aufbau einer Ausführungs form der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Automatische Pipettiergeräte sind aus dem Stand der Tech nik hinreichend bekannt. Sie sind jedoch für die erfindungsge mäße Vorrichtung nicht geeignet. Für die genaue Erfassung und Kartierung der verschiedenen Molekülklassen ist es nämlich erforderlich, daß die Pipettenspitze exakt an der gleichen Stelle des flüssigen oder festen Objekts wiederholt positio niert werden kann. Weiterhin ist es notwendig bzw. wünschens wert, daß die Pipettenspitze automatisch vor jeder Aufnahme einer neuen Lösung gewechselt wird, damit ausgeschlossen werden kann, daß noch ein geringer Anteil der vorher verwendeten Lösung in der Spitze enthalten ist. Das Pipettiersystem umfaßt einen Speicher für die Lösungen, einen Auffangspeicher für benutzte Lösungen und Pipettenspitzen, einen Speicher für die Waschlösungen, einen Speicher für die verwendbaren Pipetten spitzen, einen Behälter für die gebrauchten und abgeworfenen Pipettenspitzen und einen Behälter für die Waschlösungen nach der Einwirkungszeit.

Das Pipettiersystem der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist eine angemessene Wiederholpositioniergenauigkeit der Pipette an der Objektprobe auf, damit die Pipette beliebig oft an einen bestimmten Punkt des Objekts herangefahren werden kann. Bevor zugt ist eine Wiederholpositioniergenauigkeit von mindestens ± 0,1 mm. Weiterhin wird das Pipettiersystem so gesteuert, daß jede verwendete Lösung automatisch aufgenommen und auch automa tisch abgegeben wird. Das Pipettiersystem weist eine hohe Beweglichkeit und Flexibilität auf.

3D-Handhabesysteme werden heutzutage in fast allen Bereichen der Industrie eingesetzt. Das 3D-Handhabesystem der vorliegenden Erfindung, das die Pipette in die Lösung führt, die gefüllte Pipette an das Objekt heranfährt und nach Abgabe der Lösung wieder in die Ausgangsstellung zurückfährt, muß eine an das Objekt angepaßte Wiederholpositioniergenauigkeit aufwei sen. Die Wiederholpositioniergenauigkeit des 3D-Handhabesystems ist insbesondere für die Festlegung von bestimmten Punkten bzw. Stellen in den Objekten erforderlich, die während einer Testreihe mit verschiedenen Lösungen versetzt werden, um die spezifischen Molekülklassen zu untersuchen. Das 3D-Handhabesystem muß in der Lage sein, die während des gesamten Verfahrens vorab festgelegten Punkte im Objekt beliebig oft anzusteuern, da Abweichungen zu verfälschten Aus wertungsergebnissen führen könnten. Infolgedessen weist es ebenfalls eine Wiederholpositioniergenauigkeit, vorzugsweise von mindestens ± 0,1 mm, auf. Das 3D-Handhabesystem bewegt sich innerhalb eines 3D-Arbeitsbereiches und hat eine Drehachse für die genaue Positionierung des Pipettiergerätes. Die einzelnen Funktionen des Pipettiersystems und des 3D-Handhabesystems sowie das technische Zusammenwirken beider Systeme sind computergesteuert.

Ein weiterer wesentlicher Bestandteil der erfindungsgemäßen automatisierten Vorrichtung ist das optische Meßsystem, insbesondere ein Mikroskop. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines inversen oder aufrechten Mikroskopstativs. Dieses Mikroskop kann bei Bedarf mit einer Klimabox zur Sicherung exakter physiologischer Bedingungen für lebende Zellen, insbesondere bei Langzeit-Experimenten ausgestattet sein. Das Mikroskopstativ weist einen automatischen Filter- und Objektivwechsel auf.

Mit dem Mikroskopstativ ist ein Bildaufnahmegerät verbunden. Dieses Bildaufnahmegerät ermöglicht die computergesteuerte Bildauswertung, da es nach jedem Durchgang das jeweilige Signalverteilungsmuster, das über das Mikroskop optisch ver mittelt wird, aufnimmt.

Die automatisierte Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in ihrer Gesamtheit weist die folgenden technischen Parameter auf:

1. Steuerbarkeit durch einen zentralen Rechner
2. automatischer Pipettenspitzenwechsel
3. Wiederholpositioniergenauigkeit des 3D-Handhabesysttems und des Pipettiersystems, bevorzugterweise von mindestens ± 0,1 mm 4. keine Beeinträchtigung der einzelnen Systeme durch Schwin gungen, Emissionen, Felder bzw. des Benutzers durch Lärm
5. gegebenenfalls Thermostatierung
6. Gewährleistung eines 3D-Arbeitsbereiches und einer Drehachse für die exakte Positionierung des Pipettiergerätes.

Die erfindungsgemäße automatische Vorrichtung kann in vielen Anwendungsgebieten der Naturwissenschaften, insbesondere der Biologie und der Medizin, eingesetzt werden.

Besonders wichtige Anwendungsgebiete stellen die Krebs- und Immun-Forschung bzw. -Diagnostik dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Molekülklas sen oder Molekülgruppen in festen oder flüssigen Objekten ist dadurch gekennzeichnet, daß in einem flüssigen oder festen Objekt eine beliebige Anzahl Xn (n=1,2,3 . . . N) von verschiedenen Molekülklassen oder Molekülgruppen beliebig oft mittels spezi fischer Reagenzlösungen Yn (n=1,2,3 . . . N) automatisch bestimmt und kartiert werden kann.

Das Verfahren umfaßt die folgenden automatischen Verfahrens schritte:

I. eine Reagenzlösung Y1 wird von dem Pipettiersystem aus einem die Lösung Y1 enthaltenden Behälter automatisch entnommen.
II. Die Lösung Y1 wird automatisch auf das Objekt (fest oder flüssig) aufgebracht, das sich auf einer objekttragenden Vor richtung befindet.
III. Die Lösung Y1 wirkt über eine bestimmte, automatisch ein gestellte Zeit auf das Objekt ein.
IV. Sofort im Anschluß an dieses Einwirken oder gegebenenfalls auch während des Einwirkens kann durch automatische Betätigung des Bildaufnahmesystems des Mikroskops ein Bild des mit der Lösung Y1 behandelten Objekts aufgezeichnet werden. Alternativ kann vor Schritt IV der Schritt V eingeschaltet werden.
V. Nachdem die Lösung Y1 über eine bestimmte, automatisch ein gestellte Zeit auf das Objekt eingewirkt hat, wird die Lösung Y1 durch das Pipettiersystem abgesaugt.

Im Schritt VI sind in Abhängigkeit vom Objekt und der durchzuführenden speziellen Bestimmung verschiedene Alternati ven möglich.

VIa. Eine zweite Lösung Y1 oder die Lösung Y2 oder ein Gemisch aus Y1 und Y2 wird durch das Pipettiersystem aufgetra gen.

VIb. Nach dem Entfernen der Lösung Y1, der Lösung Y2 oder eines Gemisches aus Y1 und Y2 wird eine Waschlösung Z1 mit dem Pipettiersystem automatisch auf das Objekt gebracht und wirkt über einen bestimmbaren Zeitraum auf das Objekt ein.

VIc. Sofort nach dem Entfernen der Lösung Y1 wird eine Waschlösung Z2 oder Z3 oder Zn (n= 1,2,3 . . . N) durch das Pipet tiersystem automatisch aufgebracht.

VId. Sofort nach Entfernen der Lösung Y1 werden die Waschlösungen Z1 bis Zn in variabel festlegbarer Reihenfolge auf das Objekt aufgetragen.

VIe. Nach einer variabel automatisch eingestellten Zeit nach der Einwirkung und dem Entfernen der Lösung Y1 wird eine Waschlösung Z1 auf das Objekt gebracht.

VIf. Es werden erst nach einer variablen bestimmten ein gestellten Zeit Waschlösungen Z1 bis Zn in einer bestimmten Reihenfolge und mit einer bestimmten Einwirkungsdauer automa tisch auf das Objekt aufgebracht.

VII. Die Schritte I-VIf können mit einer Lösung Y3 oder mit verschiedenen, beliebig vielen Lösungen Yn oder mit einem Gemisch aus den verschiedenen Lösungen Yn beliebig oft wieder holt werden.

Die Schritte I-VII können jederzeit und an beliebigen Stellen der Verfahrensschritte unterbrochen werden und beliebig oft wiederholt werden, zumindestens solange, wie es das zu untersuchende Objekt erlaubt. Die einzelnen Verfahrenszyklen können sehr schnell, vorzugsweise innerhalb eines Zeitraumes von 5 min bis 30 min durchgeführt werden.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann mit der automati sierten Vorrichtung der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, die ein 3D-Handhabesystem, ein Pipettiersystem, ein optisches Meßsystem, insbesondere ein Mikroskopstativ, und ein Bildaufnahmegerät, welche von einem Computer automatisch gesteuert werden, umfaßt.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt innerhalb einer bestimmten Zeit zu exakten quantitativen und qualitativen Auswertungsergebnissen. Weiterhin können beliebig viele Molekülklassen, Molekülspezies oder Teile von Molekülen in einem Objekt untersucht und bestimmt werden. Die bei der manuellen Durchführung auftretenden Fehlerquellen sind weitgehend ausgeschlossen. Damit weist das automatisch ablaufende Verfahren der vorliegenden Erfindung erhebliche Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Untersuchung und Bestimmung verschiedener Molekülgruppen auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren durchgeführt, um beliebig viele Molekülspezies oder Epitope in einer Zelle oder einer Gewebe probe automatisch zu erfassen und zu kartieren. Das Ziel ist hierbei die Kenntnis der Anordnung und korrelativen Verteilung der Molekülgruppen, um Aufschluß über verschiedene Krankheiten und deren Behandlung zu erhalten. Dabei werden die Zellen oder Gewebeproben mit einer ersten Reagenzlösung Y1, die beispiels weise fluoreszierende Antikörper oder Liganden enthält, ver setzt. Nach einer bestimmten Inkubationszeit werden von den spezifisch markierten Gewebeproben bzw. Zellen spezielle Mar kierungsverteilungsmuster aufgenommen und registriert.

Um die Markierungsverteilungsmuster aufzunehmen, wird bei spielsweise unter automatischer Kontrolle eines Computers ein Fluorochrom automatisch angeregt, und ein Schieber der Videoka mera für eine vorgegebene Zeit geöffnet. Dadurch wird das Fluoreszenzsignal aufgezeichnet, bevorzugt in Form eines digi talen Signals, d. h. eines digitalisierten Bildes. Nach der vor gegebenen Öffnungszeit des Schiebers wird der Schieber wieder automatisch geschlossen, ebenso der Schieber der automatischen Fluoreszenzanregung. Derselbe Vorgang kann für andere, gleich zeitig in der Probe befindliche, d. h. gebundene Fluorochrome automatisch unter Zwischenschaltungen der jeweils korrekten Fluoreszenzfilter und Schieberbetätigungen wiederholt werden.

Anschließend werden die spezifisch markierten Proben gebleicht und gewaschen und dann mit einer zweiten Reagenzlö sung Y2 bzw. mit beliebig vielen Reagenzlösungen Yn oder deren Gemischen versetzt. Das automatische Verfahren, das mittels beliebig vieler solcher Markierungs-Bildaufnahme-Bleichungs- Zyklen durchgeführt werden kann, findet insbesondere Anwendung in der Medizin und Biologie. Solange das zu untersuchende feste oder flüssige Objekt es erlaubt, können die einzelnen Verfah rensschritte beliebig oft wiederholt werden. Der erste Verfah rensschritt und/oder die nachfolgenden Verfahrensschritte bzw. diese repetitiven Zyklen werden mittels eines optischen Verfah rens, wie beispielsweise der Fluoreszenzmikroskopie in Kombina tion mit der Durchlichtmikroskopie, durchgeführt. Der erste Verfahrensdurchgang wird beendet, indem mit Hilfe eines Durch lichtverfahrens von der markierten Gewebeprobe oder Zelle ein Bild, beispielsweise ein Phasenkontrastbild oder ein Differen tialinterferenzkontrastbild, registriert wird. Jeder Zyklus schließt mit dieser Registrierung eines Bildes der spezifisch markierten Gewebeprobe oder der spezifisch markierten Zelle ab.

Auf diese Weise ist es möglich, durch repetitive Markie rungs-Bildaufnahme-Bleichungszyklen beliebig viele Einzelmar kierungsmuster in der jeweilig untersuchten Probe, Zelle bzw. Gewebeprobe als Bilder zu erhalten und durch anschließende com puterunterstützte Bildüberlagerung dieser Einzelmuster die dar aus resultierenden komplexen Kombinationsmuster einzelner oder zahlreicher Molekülverteilungen zu ermitteln und beliebig als kombinatorische Muster auf die biologische Struktur (z. B. einer Zelle) quasi zu projizieren. Die Bildüberlagerung und die Bild analyse kann von speziellen Computern automatisch durchgeführt werden. Mit Hilfe computerunterstützter Bildüberlagerungen ein zelner oder zahlreicher Zellen gelingt es, die komplexen mole kularen Organisationsformen in Zellen, die prinzipiell visuell auf direktem Wege als strukturgebundene Muster nicht mehr erfaßbar sind, in rationeller Weise, z. B. über Nacht, zu erkennen und auszuwerten. Eine langwierige Auswertung der einzelnen Bilder, wie z. B. manuelle Kopien von Mustern, entfällt damit. Darüberhinaus können wesentliche quantitative Aussagen über korrelative Molekülkonzentrationen und topologische Beziehungen nur über spezielle Algorithmen erhalten werden. Weiterhin war es wegen der bisher durchgeführten visuellen Auswertung auch kaum möglich, ein Gesamtbild aus den Einzelbildern zusammenzufügen bzw. das hochkomplexe kombinatorische Verhalten in ganzen Zellsystemen zu analysieren.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es also möglich, eine Probe, Zelle oder Gewebeprobe beliebig oft mit beliebig vielen verschiedenen Reagenzlösungen spezifisch zu markieren. Dabei sind wesentliche sterische Behinderungen ausgeschlossen, wie durch Vertauschen der Reihenfolge der Reagenzien in jeder beliebigen Probe nachgewiesen werden kann, da die jeweiligen Markierungsergebnisse praktisch konstant bleiben. Die in dieser Ausführungsform der Erfindung ver wendeten Reagenzien umfassen Antikörper, Lectine, Nukleinsäuren, Biotoxine, immunoglobulin-bindende Moleküle (z. B. Proteine) oder andere spezifische Liganden, wie beispielsweise Fluorochrome oder Enzyme. Bevorzugt sind fluoreszierende Antikörper oder Liganden, insbesondere fluorochrom-konjugierte Antikörper oder Liganden. Die Objekte in dieser Ausführungsform können einzelne Zellen, mehrere Zellen, Gewebeschnitte oder aber auch auf bestimmte Träger aufgebrachte oder in bestimmten Medien (z. B. Gelen) enthaltene Moleküle sein.

Im folgenden werden die einzelnen automatisierten Verfahrensschritte zur Markierung und Messung von Molekülklassen in einer Zell- oder Gewebeprobe allgemein beschrieben, ohne das erfindungsgemäße Verfahren darauf zu beschränken. Die einzelnen Schritte können je nach Bedarf vertauscht oder weggelassen werden.

Ein Objekt, beispielsweise eine Zelle (z. B. fixierte Zel len, z. B. Aceton-fixierte Zellen, Natrium-azid-behandelte Zel len oder lebende Zellen) befindet sich auf dem Objekttisch des Mikroskops. Die automatisierten Verfahrensschritte werden nach manueller Vorbereitung der Probe und Aufbringen auf dem Objekt tisch des Gerätes wie folgt durchgeführt:

1. Aufnahme einer ersten Inkubationslösung Y1 (ein oder mehrere fluorochrom-konjugierte Reagenzien).
2. Aufpipettieren dieser Lösung Y1 auf das Objekt.
3. Inkubation des Objekts mit dieser Lösung Y1 bei einer bestimmten Temperatur, z. B. Raumtemperatur.
4. Entfernen der Inkubationslösung Y1.
5. Einmaliges oder mehrmaliges Auftropfen einer Waschlösung Z1, z. B. eine Pufferlösung.
6. Entfernen der Waschlösung Z1.
7. Registrierung des Fluoreszenzverteilungsmusters (Bildaufnahme) (Im Falle von mehreren Fluorochromen werden selektive Fluoreszenzaufnahmefilter bei der Bildaufnahme ver wendet).
8. Aufpipettieren einer Waschlösung Z2.
9. Bleichen der Probe mit Hilfe einer Fluoreszenzanregung.
10. Der Bleichungsvorgang ist beendet, wenn keine Fluoreszenz mehr vorhanden ist. Dieser Zeitpunkt wird aufgrund von Vortests vorgegeben werden oder durch das Bildaufnahmesystem überprüft bzw. festgestellt werden.
11. Entfernen der Waschlösung Z2.
12. Aufnahme einer zweiten Inkubationslösung Y2 (mit einem oder mehreren fluorochrom-konjugierten Reagenzien).
13. Auftropfen dieser Lösung auf dieselbe Zellprobe (wie oben, ohne diese zu berühren oder ohne ihre Position verschoben zu haben).
14. Fortsetzung wie unter 4-11. Danach Wiederholung desselben Vorgangs mit einer 3., 4., 5., . . . N. Inkubationslösung.

Jeder Zyklus wird durch Registrierung des korrespondierenden Phasenkontrastbildes oder Differentialinterferenzkontrastbildes beendet. Die Verfahrensschritte 1-14 werden alle automatisch durchgeführt. Die Einzelbilder werden mittels eines Computers zu einem Gesamtbild durch Bildüberlagerung zusammengefügt und ausgewertet. Dieses molekulare Gesamtbild einer Einzelzelle bzw. Gewebeprobe gibt Aufschluß über die komplexe molekulare Organisationsform in Zellen, die prinzipiell bei einer ent sprechend großen Zahl, z. B. 18 verschiedenen registrierten Molekülklassen, nicht visuell erfaßbar oder auswertbar ist, da sich bezogen auf das genannte Beispiel, eine Anzahl von 2¹⁸ verschiedenen Kombinationen ergibt. Eine weitere Steigerung dieser Differenzierungsauflösung ist ohne weiteres möglich. Die bekannten Verfahren der kombinatorischen Analyse von Systemen, vor allem von zellulären Systemen, sind mit einem kombinatorischen Unterscheidungsvermögen von 2³ bis maximal 2⁵ strikt limitiert.

Mit den bekannten Verfahren sind höhere molekulare Organisationsformen, die auf Kombinatorik beruhen so nicht erfaßbar.

Im Unterschied zu allen bisher bekannten Verfahren der kombinatorischen Analyse von Systemen, insbesondere von zellulären Systemen, weist das erfindungsgemäße Verfahren somit ein erheblich verbessertes kombinatorisch-molekulares Unterscheidungsvermögen (Auflösungsvermögen) auf.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können beispielsweise spezifische kombinatorische Differenzierungsspektren im Immunsystem allein aus einer einzelnen Blutentnahme erfaßt werden.

Damit ist es auch insbesondere in der Biologie und Medizin möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Aufschluß über die molekulare Anordnung bzw. die molekulare Verteilung einzelner Molekülgruppen sowie Aufschluß über spezielle Krankheitsbilder sowie deren Behandlungsmöglichkeiten zu erhalten.

So hat es sich bereits in der Anwendung des Verfahrens gezeigt, daß durch die praktisch unbegrenzte "Auflösung" für kombinato rische molekulare Differenzierung (d. h. Differenzierungsauf lösung) abnorme molekulare Kombinationen auf Zelloberflächen von Zellen des Immunsystems vorkommen. Diese ergeben völlig neue Einblicke in abnorme Oberflächen-Kodierungen für Zellin vasionen, beispielsweise bei bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen, und damit auch neue diagnostische und therapeuti sche Möglichkeiten.

Ein weiteres Anwendungsgebiet des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in der Kartierung komplexer Genmuster, z. B. auf Gen Chips bestehen, die für Multi Drug Testing oder das Auffinden komplexer Mutationsmuster in der Zukunft von großer Bedeutung sein werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch besonders für die Bestimmung und Untersuchung von molekularen Organisationsformen in einer Zell- oder Gewebeprobe, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Generell kann jedoch jedes Objekt in flüssiger oder fester Form auf seine Molekülstruktur bzw. Anordnung oder Anwesenheit von Molekülteilen untersucht werden. Als Beispiele hierfür seien die Untersuchung und Bestimmung von Molekülanordnungen und -kombinationen in Halbleitern, Legierungen oder Kunststoffen genannt.

Das folgende Ausführungsbeispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch einzuschränken.

Ausführungsbeispiel

Markierung von 18 verschiedenen Molekülklassen in einer Ansammlung einzelner Zellen (isolierte mononukleäre Blutleukozyten, aufgebracht auf einen Objektträger), d. h. in ein- und derselben Probe durch automatisch gesteuerte repetitive Inkubations-Imaging-Bleaching-Zyklen (RIIBZ= wiederholte Inkubations-Bildaufnahme-Bleichungs Zyklen).

Vorbereitung

1. Ein Deckglas wird mit den isolierten Zellen beschichtet.
2. Lufttrocknen der Zellen, ca. 10 min b. Raumtemperatur (RT).
3. Kurze Fixierung f. 10 Sek. in Aceton (bei RT).
4. Kurz lufttrocknen.
5. Deckglas sofort über vorgekühltes Isopentan in flüssigem Stickstoff schockfrieren.
6. (Langfristig bei minus 80 Grad lagern) oder
7. 20 min in Aceton bei minus 20 Grad dehydrieren.
8. Lufttrocknen bei RT.
9. In PBS (Phosphate buffered saline, pH 7,4 ) rehydrieren.
10. Präinkubation mit 1 : 30 normalem Ziegenserum.
11. Waschen in PBS.
12. Deckglas sofort auf einen speziellen Träger auf dem Objekttisch des inversen Mikroskops aufbringen.
13. Unter visueller Kontrolle durch das Okular die gesuchten Zellen unter Verwendung eines Phasenkontrastobjektivs einstellen.
14. Feuchte Kammer des Mikroskoptisches schließen.
15. Pipettierroboter einschalten.
16. Reihenfolge und Zeitabstände für die Pipettier-Imaging- Bleaching Schritte in den Computer eingeben.
17. Reagenzien (Antikörperlösungen, Puffer) in die vorgegebenen Gefäße (z. B. Eppendorf-Reaktionsgefäße) in dem Rack des Automaten geben.

Durchführung der RIIBZ durch den Automaten Zyklus 1

1. Eine Lösung A (100 Mikroliter Lösung, bestehend aus 80 Mikroliter phosphatgepuffertes Salz, pH 7,4 + 10 Mikroliter monoklonaler Antikörper-1, gekoppelt an Fluorescein-Iso- Thiocyanat (FITC), + 10 Mikroliter monoklonaler Antikörper-2, gekoppelt an Phycoerythrin (PE) ) wird von dem Pipettierroboter aus einem Behältnis, das diese Lösung A enthält, entnommen. Das Behältnis ist ein Plastik-Reaktionsgefäß.

2. Die Lösung A wird durch den Pipettierroboter auf das Objekt (Zellen auf dem Deckglas) aufgebracht, das sich auf dem Mikroskopobjekttisch befindet.

3. Die Lösung A wirkt über eine bestimmte Zeit auf das Objekt ein ( z. B. 20 min bei Raumtemperatur).

4. Sofort im Anschluß an 3 wird diese Inkubationslösung durch den Pipettierroboter abgesaugt und verworfen oder fakultativ in ein besonderes Abwurfgefäß (Reaktionsgefäß) im Rack des Automaten abpipettiert.

5. Es erfolgen 10 aufeinanderfolgende Waschschritte mit Puffer, die von dem Pipettierroboter aus Reaktionsgefäßen im Rack der Reihe nach aufgenommen, auf die Zellprobe aufgebracht und dann wieder abgesaugt und verworfen werden. Dauer der einzelnen Wasch Schritte ca. 2 min.

6. Nach Beendigung der 10 Wasch Schritte wird erneut eine Pufferlösung auf die Probe aufgebracht.

7. Unmittelbar nach 6 wird im Phasenkontrast-Modus automatisch für eine bestimmte Zeit mit Hilfe des Bildaufnahmegerätes (z. B. CCD Kamera) über eine bestimmte Zeit ein Bild aufgenommen und abgespeichert. Es erfolgen Bildaufnahmen in mehreren Z Ebenen durch das Präparat hindurch, um mit Hilfe von Algorithmen die optimale Schärfeebene zu ermitteln.

8. Nach 7 erfolgt die Öffnung des Fluoreszenzschiebers und Aufzeichnung des Fluoreszenzsignals, das von dem Fluorochrom Phycoerythrin ausgeht. Die entsprechenden Fluoreszenzfilterdaten müssen in dem Mikroskop so gewählt werden, daß eine praktisch absolute Trennung zwischen PE und FTTC möglich ist: z. B. Emissionsfilter für PE (DEPIL 575±7 nm) und für FITC (BP 515-545 nm). Die Aufnahme erfolgt für jedes einzelne der beiden Fluoreszenzsignale getrennt für frei programmierbare Zeiten (angepaßt an die Zellprobe) oder fakultativ simultan über Dichroische Filter. Nach einer definierten Aufzeichnungszeit erfolgt Schließen des Fluoreszenzschiebers.

9. Nach 9 erfolgt unmittelbar Bleichung der Probe durch Daueröffnen des Fluoreszenzschiebers und Anregung der Probe mit Hilfe der Anregungswellenlänge (weiches Bleichen dieser Art zerstört die gebundenen Fluorochrome, schont aber die Eigenschaften der immunogenen Domänen).

10. Nach Beendigung der Bleichungszeit wird erneut automatisch der Fluoreszenzschieber geöffnet und es wird mit derselben Zeit wie oben für jedes einzelne Fluorochrom ein Signal über das Bildaufnahmegerät aufgezeichnet (diese Signalaufzeichnung gibt Auskunft darüber, ob die Bleichungszeit für eine vollständige Beseitigung eines Emissionssignals ausgereicht hat: hierüber entscheidet die Software des Automaten oder es werden jeweils zuvor feste Zeiten für diesen Vorgang programmiert).

Zyklus 2

11. Nach 10 erfolgt Absaugen der Pufferlösung durch den Pipetting Roboter und anschließend Aufbringen einer Lösung B (bestehend aus 80 Mikroliter Puffer + 10 Mikroliter monoklonaler Antikörper-3, gekoppelt an FITC + 10 Mikroliter Antikörper-4, gekoppelt an PE).

12. Nach 11 erfolgen dann dieselben Schritte wie oben (2 bis 10: Zyklus 2).

Zyklus 3

13. Nach Beendigung des Zyklus 2 erfolgt sinngemäß Zyklus 3 mit einer neuen Lösung C (für weitere 2 Antikörper der Spezifität 5 und 6, jeweils gekoppelt an FITC und PE, respektive).

Nach Zyklus 3 können weitere N Zyklen für eine praktisch beliebige Anzahl verschiedener Antikörper automatisch gefahren werden, ohne daß dadurch die Spezifität der Markierung leidet.

Bei diesem Prinzip bleiben die Antikörper mit den gekoppelten bleichungszerstörten Fluorochromen an den Zellen gebunden, während die Zellen immer weiter mit neuen Flurochrom gekoppelten Antikörpern an den jeweils spezifischen Bindungsstellen beladen werden. Es tritt keine sterische Behinderung bei diesen Bindungen auf: dies kann durch Vertauschen der Reihenfolge der Antikörperreaktionen in jedem beliebigen Ansatz gezeigt werden.

Auf diese Weise können praktisch beliebig zahlreiche Molekülklassen in einzelnen Zellen nachgewiesen werden. Es ergibt sich die Möglichkeit, molekulare Kombinatorik in Zellen systematisch zu untersuchen.

Claims

1. Automatisierte Vorrichtung zur Bestimmung und Messung einer beliebigen Anzahl Xn (n = 1,2,3 . . . N) von Molekülklassen, Mole külgruppen und Molekülteilen auf einem flüssigen oder festem Objekt bzw. in einem flüssigen oder festem Objekt.

2. Automatisierte Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Kombination aus einem Pipettensystem, einem 3D-Handhabesystem und einem optischen Meßsystem umfaßt.

3. Automatisierte Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pipettiersystem, das 3D-Handhabesystem und das optische Meßsystem durch einen Computer gesteuert und kontrolliert wer den.

4. Automatisierte Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mit einem Bildaufnahmegerät, insbesondere einer Kamera, ausgestattet ist.

5. Automatisierte Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung beliebig viele Einzelmarkierungsmuster von ein- und demselben zu untersuchenden Objekt aufnimmt und diese durch computergestützte Bildüberlagerungen in hochkomplexe molekulare Kombinationsmuster überführt.

6. Automatisierte Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Pipettiersystem eine automatische Pipettierung für die Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeiten, einen automatischen Pipettenwechsel und eine angemessene Wiederholpositioniergenau igkeit, bevorzugt von mindestens ±0,1 mm, aufweist.

7. Automatisierte Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das 3D-Handhabesystem das Pipettensystem mit einer vorgege benen Wiederholpositioniergenauigkeit hin und her bewegen kann.

8. Automatisierte Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Meßsystem ein inverses oder aufrechtes Mikroskopstativ umfaßt.

9. Automatisierte Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskopstativ mit einer Klimabox ausgestattet ist.

10. Automatisiertes Verfahren zur Bestimmung von Molekülklas sen, Molekülgruppen Molekülteilen in einem festen oder flüssi gen Objekt, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Objekt eine beliebige Anzahl Xn (n = 1,2,3 . . . N) an Molekülklassen, Molekülgruppen oder Molekülteilen bestimmt wird.

11. Automatisiertes Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Objekt eine beliebige Anzahl Xn an Molekülgruppen, Molekülklassen oder Molekülteilen mittels gleichzeitiger oder sequentieller Aufbringung beliebig vieler Reagenzlösungen Yn (n = 1,2,3 . . . N) untersucht und gemessen wird.

12. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren beliebig oft wiederholbare Inkubation- sowie Bildaufnahme- und Bleichungszyklen umfaßt.

13. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß nach jedem Verfahrenszyklus das Signalverteilungsmuster des zu untersuchenden Objekts registriert wird.

14. Automatisiertes Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die in jedem Verfahrenszyklus erhaltenen Signalverteilungs muster durch computergestützte Bildüberlagerung in ein kom plexes Gesamtbild des zu untersuchenden Objekts überführt wird.

15. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die folgenden automatisierten Schritte um faßt:

I. Aufnahme einer ersten Lösung Y1 aus einem Behälter, der die Lösung enthält.
II. Aufbringen der Lösung Y1 auf das Objekt, das sich auf einer objekttragenden Vorrichtung befindet.
III. Einwirken der Lösung über einen automatisch eingestellten Zeitraum.
IV. Aufzeichnung eines Bildes bzw. des Meßwertes des zuvor mit der ersten Lösung Y1 behandelten Objekts oder alternativ die Durchführung des Schrittes V vor dem Schritt IV.
V. Entfernen der Lösung Y1.
VI. Wiederholung der Schritte I-V durch wiederholtes Aufbringen der ersten Lösung Y1 oder einer zweiten Lösung Y2 oder eines Gemisches aus erster und zweiter Lösung.
VII. Wiederholung der Schritte I bis VI mit beliebig vielen Lösungen Yn (n = 1,2,3 . . . N) oder einem Gemisch davon.

16. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß entweder sofort oder nach einem variablen bestimmbaren Zeit raum nach dem Entfernen der ersten oder zweiten Lösung oder der Lösung Yn oder eines Gemisches davon in Schritt V gemäß Anspruch 15 eine Waschlösung Z1 oder Z2 oder Zn (n = 1,2,3 . . . N) auf das Objekt gebracht wird.

17. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sofort oder nach einem variabel bestimmbaren Zeitraum nach Entfernen der ersten Lösung Y1 oder der zweiten Lösung Y2 oder der Lösung Yn oder eines Gemisches davon in Schritt V gemäß Anspruch 15 Waschlösungen Z1 bis Zn in variabel festgelegter Reihenfolge auf das Objekt gebracht werden.

18. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungen Farbstoffe, Komplexbildner, Antikörper, etc. umfassen.

19. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt eine Probe, eine Gewebeprobe eine Zelle oder mehrere Zellen ist.

20. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19 dadurch gekennzeichnet, daß in der Probe, Gewebeprobe, der Zelle oder in den Zellen eine beliebige Anzahl Xn an Molekülklassen, Molekülgruppen oder Molekülteilen mittels mindestens einer Reagenzlösung untersucht und bestimmt werden.

21. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß in der Probe, Gwebeprobe, der Zelle oder in den Zellen eine beliebige Anzahl Xn an Molekülklassen oder Molekülgruppen mittels verschiedener Reagenzlösungen Yn in einer variabel bestimmbaren Reihenfolge untersucht und bestimmt werden.

22. Automatisiertes Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzlösung Antikörper oder Liganden, insbesondere fluorochrom-konjugierte Antikörper oder Liganden, umfaßt.

23. Automatisiertes Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die folgenden automatisierten Verfahrens schritte aufweist:

I. Aufnahme einer ersten Reagenzlösung Y1, insbesondere einer fluorochromhaltigen Lösung, aus dem Behälter und Aufpipettieren der Lösung auf eine Probe, Gewebeprobe, eine Zelle oder Zellen.
II. Inkubation der Probe, Gewebeprobe, Zelle oder der Zelle über einen bestimmten Zeitraum.
III. Entfernen der Reaktionslösung Y1, einmaliges oder mehrma liges Aufpipettieren einer Waschlösung Z1 bis Zn.
IV. Registrierung des Markierungsverteilungsmusters.
V. Bleichen des Objekts bis keine Fluoreszenz mehr nachweisbar ist.
VI. Aufnahme einer zweiten Reagenzlösung.
VII. Wiederholung der Schritte I bis VI mit beliebig vielen Reagenzlösungen Yn oder Gemischen davon(repetitiver Markie rungs-Bildaufnahme-Bleichuns-Zyklen).