WO2015032630A1 - Mikrodissektionsgerät und verfahren zum isolieren von zellen eines vorbestimmten zelltyps - Google Patents

Mikrodissektionsgerät und verfahren zum isolieren von zellen eines vorbestimmten zelltyps Download PDF

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WO2015032630A1
WO2015032630A1 PCT/EP2014/067877 EP2014067877W WO2015032630A1 WO 2015032630 A1 WO2015032630 A1 WO 2015032630A1 EP 2014067877 W EP2014067877 W EP 2014067877W WO 2015032630 A1 WO2015032630 A1 WO 2015032630A1
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tissue
sample
image
microdissection
predetermined
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PCT/EP2014/067877
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Guido Hennig
Mark Matzas
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the invention relates to a microdissection device and an in vitro method for removing cells of a predetermined cell type from at least one tissue sample.
  • the molecular pathology is one of the fastest growing ⁇ Send submarkets of the in vitro diagnostics market. Among other things, this is due to an increasing demand for personalized medicine in the field of cancer therapy, which targets expensive targeted therapies against tumor-activated molecules in cancer cells.
  • the effect of Arz ⁇ neiffens is mainly dependent on the presence or absence of tumor-specific mutations in so-called "driver genes" or "key genes". This may lead to the approval of molecular companion diagnostic tests that are associated with a given, targeted therapy (eg, mutations in the kRAS gene for cetuximab or
  • Panitumumab, EGFR for erlotinib and gefitinib and BRAF for vemurafinib The quality, accuracy and speed of mutation analysis ⁇ are for a cancer patient is often already in a metastatic and a life-threatening condition, the key to maintaining a proper and quietest ⁇ processing enabled therapy. But quality, accuracy and speed of mutation analysis are as important to gleicheinspa ⁇ tion and efficiency in the health system, to make a comparison write-targeted therapy with high costs (up to 60,000 euros per therapy and patient) to get those can also benefit from it.
  • Assay technologies are available for analyzing mutations based on DNA extracted from FFPE tissue and various sequencing technologies, e.g. Sanger sequencing, pyro-sequencing, deep-sequencing, or real-time PCR methods involving either allele-specific PCR or melting curve analysis or mass spectrometry, k) recommendation of the pathologist for a targeted therapeutic proposal by evaluation the morphological (HE-cut) and molecular analysis.
  • sequencing technologies e.g. Sanger sequencing, pyro-sequencing, deep-sequencing, or real-time PCR methods involving either allele-specific PCR or melting curve analysis or mass spectrometry, k) recommendation of the pathologist for a targeted therapeutic proposal by evaluation the morphological (HE-cut) and molecular analysis.
  • False negative results can occur when an analytical undetected "hidden" tumor DNA mutation. If too much healthy tissue with the tissue segment ent ⁇ removed, a mutation can be, for example, by means of the classical Sanger sequencing, (a sensitivity of only about 30% ratio having mutant allele to healthy allele) can no longer be detected. This false negative resulting ⁇ nit frequently result from insufficient or imprecise and subjective or imprecise manual microdissection transfer of tissue cut-outs in the sample vessel to
  • False positive results may arise in particular by Konta ⁇ mination of a sample with liquid or scratched tumor material in an environment of operational microdissection by unentdecktable transferred mutation positive pieces of tissue in mutation-negative pieces of tissue and later de ⁇ be tektiert.
  • An object of the invention is to increase the efficiency and accuracy of a microdissection by automation, which also allows an improvement in the operating speed and throughput (faster result) as well as a standardization of the workflow with improved reproducibility.
  • the object is achieved by an inventive
  • the invention is based on the idea, the critical
  • microdissection device for isolating cells of a predetermined cell type from at least one tissue sample and the method according to the invention enable a faster, more accurate and standardized performance of a microdissection.
  • the microdissection device comprises a
  • Microdissection device for removing a selected tissue section of the at least one tissue sample by means of at least one cutting element, e.g. using a laser or ultrasound-based techniques.
  • Mikrodissetechnische is characterized by an image pickup device, an analysis device and a control device.
  • the image pickup device for example a camera takes at least an image, in particular a digital image, at least part of the egg ⁇ nes at least one tissue sample.
  • an image of part of a tissue sample and / or a subset of a plurality of tissue samples can be recorded.
  • the at least one image can be used to predetermine the tissue section to be removed and / or archived, eg as a control image, in, for example, a data memory or a laboratory information system.
  • the analysis means for selecting a tissue section from the tissue sample in at least one image taken ⁇ directed can be implemented in a microprocessor of the microdissection.
  • the analysis device can be set up to display an image, for example a colored one
  • tissue section of the reference sample comprising tumor cells, for example, to select and locate tissue sample so that and / or to predetermine.
  • the definition and / or localization of, for example, certain tissue areas or tissue sections on the reference section can be effected eg by one or more complex image recognition algorithms, especially tumor-recognizing algorithms, but also eg by the complex analysis of the human eye and brain of a pathologist.
  • the control device which is set up to align the at least one cutting element of the microdissection device depending on the selection, can also be used e.g. be realized in a microprocessor.
  • the microdissection is characterized in front of a gezzie ⁇ NEN system, that the said means are installed within a device housing and coupled to each other.
  • a user such as a pathologist or laboratory technician, for example several of the tissue samples or Replikatoncee and a Refe ⁇ rence sample on a respective sample support, for example a slide, in the device and may then simple operating procedures, the tissue samples, in particular the movie, thereof cutouts and, for example, cause the device to remove a selected tissue slice from the tissue sample on at least one of the loaded replica cuts.
  • the inventive method for isolating cells of a predetermined cell type from at least one predetermined tissue sample on a sample carrier in each case in a modern fiction, ⁇ microdissection accordingly comprises the steps of:
  • said selection signal describes coordinates of at least one of Be ⁇ limitation of a tissue section on the sample carrier with the reference sample, - in response to the selection signal aligning the min ⁇ least one cutting element of the at least one loading ⁇ limitation in each of the reference sample and / or at least ei ⁇ ner further tissue sample as a predetermined tissue sample and thereby removing the selected tissue cut by the at least one cutting element of the at least a predetermined tissue sample.
  • a boundary of a tissue section in this case comprises a contour profile of the tissue section.
  • microdissection thus proceeds to a much greater extent automatically. Subjective deviations between different e.g. Mutation tests by e.g. Different qualifications and experiences of different laboratory technicians and inaccurate dissections are avoided. Likewise, a standardization of different laboratories. Avoiding manual work avoids contamination due to false positives. The method also saves time, e.g. a cancer patient can be treated earlier.
  • Microdissetations Center a display device of the analysis device such as a screen or other means for displaying the at least one image, and / or Be ⁇ dien adopted the analysis device for selecting the at least one tissue section by the user.
  • the image pickup device can transmit the image of the reference sample to the display device of the analyzer which displays the image.
  • a Be ⁇ dien dressed is a device that receive an operator action of the user and can generate the selection signal depending on the operating action, such as a User interface with a touch screen coupled to it.
  • the analysis device can be set up to compare the image of a reference sample with a predetermined image of the predetermined cell type, in particular a digital image of the predetermined cell type, and to select the tissue section from the at least one tissue sample as a function of a result of the comparison.
  • the reference sample is a tissue sample whose cells are marked, for example, by a hematoxylin-eosin stain ("HE stain”) .
  • HE stain hematoxylin-eosin stain
  • the user of the microdissection device thus becomes a suggestion submitted a possible limitation of the tissue to be removed section, the user can This speeds the process and supports the user in low be ⁇ colorations accept eg or change.. It has proved to be particularly advantageous if the
  • Microdissetations réelle a transfer device for transferring or transferring one or more remote tissue sections in a sample vessel comprises.
  • This prevents loss of cells, as may occur with manual transfer of the excised tissue section.
  • This advantageously results in the avoidance of false negative results and an improvement in quality in a subsequent mutation analysis to create a personalized drug.
  • the transfer of the at least one removed tissue section into a sample vessel by the transfer device can be effected, for example, by arranging the sample vessel under the microscope slide, ie by means of a gravure device. tion, or, for example, by picking up the removed tissue cutout on, for example, a small spatula controlled by the control device, for example, and stripping off the removed tissue cutout on the sample vessel. This enriches cells of the desired cell type.
  • tissue sample on a sample carrier such as a plurality of superposed microtome sections of tissue
  • the problem may arise that the individual tissue sections twisted not exactly lie on one another and against each other or are shifted (ie, a so-called "Drift” aufwei ⁇ sen). It may also happen be that different tissue samples ⁇ , which are fixed on different sample carrier, not precisely mounted in the same position. in both cases, removal of a tissue cutout may would be made in a fuzzy removing the selected tissue cutout.
  • the microdissection device comprises a scanning device which is adapted to a deviation of a relative position of two separate layers of the tissue sample or a deviation To detect the position of two tissue samples on different sample carriers.
  • An exemplary scanning device is a scanner.
  • the method comprises the steps:
  • a microdissection device In order to increase the throughput of tissue samples, for example a multiplicity of tissue samples from different patients, and to enable a documentation of the course of the method, a microdissection device according to the invention has proven to be advantageous according to a further embodiment comprising an identification code reading device and / or an identification code writing device.
  • An identification ⁇ code reading device is a device for detecting and recognizing an identification code such as a bar code on a sample carrier, so that a tissue sample on the sample carrier, for example, assigned to a patient and the image of the tissue sample is stored in the file of the patient, for example.
  • An identification code descriptor is a means for creating an identification code, eg, for creating a bar code on a sample vessel into which the removed tissue segment (or tissue sections) of the respective patient are transferred.
  • the method according to the invention can comprise the reading out of an identification code of a sample carrier by an identification code reading device and / or the creation of an identification code on a sample carrier by the identification code writing device.
  • the step of extracting is at least one
  • Biopolymers such as a nucleic acid
  • the removed tissue ⁇ section in the microdissection device comprises.
  • a speaking device that makes this possible, it is preferably ⁇ integrated into the microdissection device.
  • a further automation of a mutational analysis can be made possible in a further embodiment of the method according to the invention by a step of amplifying the extra- ⁇ -extracted biopolymer and / or the sequencing of the extracting ⁇ th biopolymer.
  • a corresponding device for amplifying for example, a nucleic acid, eg a thermocycler, and / or a corresponding one
  • the microdissection device 10 comprises an image recording device 12 and a
  • the microdissection device 10 further comprises an analysis device 20, eg a microprocessor, which is used to select a tissue section from one or more tissue samples in at least one image of the Image recording device 12 is set up.
  • the analysis device 20 can furthermore comprise an operating device and / or a display device via which, as shown in FIG. 1, a user, eg, a pathologist, can view, analyze, and select a tissue slice via an operator action, such as moving and clicking with a computer mouse.
  • the image pickup device 12 the
  • Microdissection device 14 and analyzer 20 are present in device 10 in a closed system.
  • the microdissection 10 can therefore receive tissue samples 18 Pro ⁇ benurl 16 and, as a result of a Runaway ⁇ led process of the invention one or more tissue sections which are selected automatically or by a user as a relevant tissue cuttings and thus readied ⁇ true ready.
  • Microdissection device 10 communicate via common communication protocols by means of wireless or wired communication links.
  • the microdissection instrument 10 may also include a transfer device (shown in Figure 1 not shown), which transfers the tissue or ⁇ cuttings removed into a sample vessel 22nd FIG. 1 likewise shows a sample carrier 16, for example a
  • tissue ⁇ sample 18 is firmly stored, for example, a sample of a histological ⁇ rule cut, for example, human, animal or plant tissue.
  • the tissue sample 18 may also comprise a plurality of histological replicas, for example a plurality of tissue sections .
  • the tissue sample may for example also a ge ⁇ colored reference sample comprise 18 '.
  • separate purification system 24 for example a device for the automatic extraction of, for example, at least one protein or at least one nucleic acid (such as DNA, RNA or polynucleotide) can be carried out an extraction of the respective biopolymer (Sil).
  • the so purified At least one biopolymer, for example a nucleic acid, of the removed tissue section (s) can subsequently be amplified by, for example, a thermocycler known to the person skilled in the art (not shown in FIG. 1) and / or by a
  • Sequencing assembly 26 e.g. a Sanger sequencer, are sequenced (S12).
  • S12 a Sanger sequencer
  • FIG 2 illustrates an embodiment of a he ⁇ inventive method in an exemplary inventive microdissection instrument 10.
  • the user intends for example, the isolation and enrichment of tumor cells to the presence or absence of a mutation of a driver gene, such as BRAF, EGFR or KRAS a personalized to create To prove therapy.
  • a driver gene such as BRAF, EGFR or KRAS
  • a first tissue sample 18, eg a histological section of a tissue surgically removed from a patient's body, on a first sample carrier 16 can be received by the microdissection device 10 through a sample receiving device 28 of the microdissection device 10 (method step S1).
  • the microdissection instrument 10 additionally receives a further sample carrier 16 with a further tissue sample 18 'of the same tissue, for example, a Refe ⁇ rence sample 18' comprises, wherein the tissue is a hematoxylin-eosin stain (for example, by
  • the image recording device 12 which for example comprises a digital camera, a (digital) microscope or a scanner (such as a HE scanner), takes an image 30, in particular a di ⁇ (S2) and transmits the image to the analysis device 20 (S3)
  • the image acquisition device 12 can once again display an image 30 of the tissue sample 18 as a control image 30 picture 30 or more pictures of the 30 can be stored in a data store, for example, to an electronic patient record.
  • the analysis device 20 is, for example, in a microprocessor of the
  • the analysis device 20 displays, for example, the image 30 by means of a display device 32, for example a screen or touch screen.
  • the image 30 in FIG. 2 shows, for example, an enlarged region of the reference sample 18 'with a plurality of cells, of which the cells shown by hatching represent, for example, colored tumor cells.
  • the user can comprising means of an operating device 34 of the Mikrodissetations réelles 10, for example a loading ⁇ user interface of the analysis device 20, for example a mouse or a touch screen, a tissue to be removed segment 36 marked on the image 30 (S5).
  • the operating device 34 can be set up to change the display of the image 30, that is, for example, to zoom in, zoom out, or move the image 30. Selecting or predetermining the fabric section 36 includes only while marking the tissue section 36 on the screen 30 to ⁇ sums so no on-line control of at least one
  • the analyzing means 20 may be the image 30 of the reference sample 18 'with compare, for example, a predetermined image of said predetermined cell type, wherein the pre-added image ⁇ example of in a data memory
  • Microdissetations réelles can be stored and, for example image data, which describe a typical staining pattern of eg tumor cells includes.
  • the analysis device 20 can mark a tissue section 36 on the image 30 and display it on the display device 32, thus "suggesting" a tissue section 36.
  • the user selects the cells hatched on the image 30.
  • the analysis means 20 detects the operating action and determined depending on the control action those coordinates on the product benlie 16, the write ⁇ be the location of the tissue cutout 36th
  • the coordinates are coordinates of a two- or dreidimensionslen coordinate system on the respective sample carrier 16.
  • the analyzer 20 can automatically select the tissue section 36 by analyzing the image 30 on predetermined structures of the dyeing and, as already described above, this with predetermined image data compares. If a staining pattern matches a section of the tissue sample 18, the analysis device 20 can select this tissue section 36 and thereby predetermine it.
  • the analysis means 20 generates a selection signal that the coor- dinates, ie, a contour, at least one Begren ⁇ wetting of the targeted tissue section 36 on the sample carrier 16 describes a function of the selected tissue out ⁇ cutout 36th
  • a control device 40 which intercepts the selection signal emp ⁇ depends (S4), at least a cutting element 38 in accordance with the at least one boundary in each of the reference sample 18 'and / or at least a further tissue sample 18 as terme ⁇ agreed tissue sample 18 off (S6).
  • a cutting element 38 comprises an instrument or instrument part which can cut or cut a tissue, eg a laser or a scalpel.
  • the cutting element 38 is preferably a constituent part of the ⁇ Mikrodisse Needless worn 14, preferably comprising a "laser capture microdissection” system or a "laser-microbeam Microdissection” system.
  • the cutting element 38 controlled by the control device 40 at the at least one boundary removes the predetermined tissue section 36 from the tissue sample 18 and / or the reference sample 18 '(S7). It exists with the inventive method, the possibility of multiple ⁇ out the selected tissue segment 36 corresponding tissue cutouts 36 to remove from a variety of tissue samples 18 and / or replicas.
  • the determined coordinates are respectively transmitted by the analysis device 20 to the corresponding coordinates of the respective sample carrier 16.
  • the microdissection device 10 may comprise a scanning device 42, preferably a scanner, which detects a relative spatial position of the tissue sample 18 ', 18 on the sample carrier 16 (S9). This may include scanning the at least one predetermined tissue sample 18 and thereby determining a deviation of a relative position of two tissue sample layers of the same predetermined tissue sample 18, e.g. a tissue sample 18 several histological histological
  • a first fabric ⁇ layer eg a first histological tissue section, rotated relative to an overlying fabric layer 90 °, 42 detects the scanning device this deviation and corrected in response to the selection signal and / or the determined deviation, the orientation of the at least one cutting element 38 for removing the predetermined turn ⁇ beausterrorisms 36 of the first fabric layer of the same before ⁇ particular tissue sample eighteenth
  • the scanning device 42 may also detect a deviation of the relative position of the at least one predetermined tissue sample 18 to the reference sample 18 'on the respective sample carrier 16 and the orientation of the at least one depending on the selection signal and the determined deviation
  • the sample carrier (s) 16 may be mounted on a shelf of a bottom of the microdissection device 10, for example, during the process inside the device.
  • a plurality of sample carriers 16 can be mounted next to one another and exchanged for one another during the process. be moved by means of a movable belt between the various devices of the device.
  • the microdissection device 10 may additionally comprise a transfer device 44, for example an arrangement in which the removed tissue section 36 falls under the influence of gravity into a sample vessel 46 or by, for example, an arrangement with a spring which catapults the removed tissue section into the sample vessel 46 (S8).
  • a thermoplastic membrane of Varsge ⁇ fäßes 46 may be connected to the removed tissue segment 36 by the transfer device 44, for example.
  • the transfer device 44 can be controlled by the control device (S8).
  • the inventive method can an identification code 48 of the sample carrier 16, for example a bar code, by an op tional ⁇ identification code reader of the
  • Microdissetations réelles read 10 and / or create such an identification code by an optional identification code writing device of Mikrodissetations réelles 10 on eg the sample vessel 46.
  • the identification code can include patient data, for example.
  • the microdissection 10 can connect so as patient data and / or one or more of the educational or 30 of the tissue samples 18 to each other and / or transmitted, for example via a wireless or wired Karlu ⁇ nikationsthetic to a laboratory information system.
  • Biopolymers eg of a nucleic acid, of amplifying the biopolymer and / or sequencing of the biopolymer (S12) are not shown in FIG. 2, but can also be described below by means of corresponding devices 24, 26 of the microdissection device 10 or followed by separate devices.
  • the embodiments described above illustrate the principle of the present invention to automate the critical operations.
  • the microdissection instrument 10 of the invention may Example ⁇ , as an "integrated and automated image analysis unit with a tissue-Mikrodissektor and a Pathologen- cockpit" can be realized.
  • Sample receiving means 28 for e.g. accidentally “loading” the device 10 with tissue samples 18 on specimen carriers;
  • a digital camera as an image pickup device 12 and / or a scanning device 42, for example, a high-resolution digital color image such as a reference sample 18 'ge ⁇ winnen;
  • Graphical user interface as operator device 34 and display device 32 for a pathologist, for example, to "screen” or check the reference sample 18 ', to identify and / or mark a tissue slice 36 of interest, e.g. by means of an image analysis software known to the person skilled in the art, and / or by X, Y and / or Z coordinates of e.g. To determine tissue and paraffin;
  • - Data memory e.g. Hard disk for storing and / or archiving the image data from the e.g. HE stained reference sample 18 'and / or uncolored sections of further replicates 18 (before and / or after removal of the tissue section 36) and / or the selected X, Y and / or Z coordinates;
  • Microdissection device 14 e.g. a "laser capture microdissection” system or a gravity-associated microdissection technology system that selects the tissue cutout 36 of interest, such as one or more
  • Transfer means 44 for transferring the tissue section 36 into a sample vessel 46 e.g., 1.5 milliliters

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Abstract

Mikrodissektionsgerät (10) und Verfahren zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer vorbestimmten Gewebeprobe (18) auf jeweils einem Probenträger (16) in einem Mikrodissektionsgerät (10), umfassend die Schritte des Bereitstellens eines Bildes (30) von einer ersten Gewebeprobe (18') als Referenzprobe durch eine Bildaufnahmeeinrichtung (12, S3) und des Erzeugens eines Auswahlsignals durch eine Analyseeinrichtung (20, S4), das Koordinaten von mindestens einer Begrenzung eines Gewebeausschnitts (36) auf dem Probenträger (16) mit der Referenzprobe (18') beschreibt. Es erfolgt das Ausrichten mindestens eines Schneidelements (38) gemäß der mindestens einen Begrenzung mindestens einer vorbestimmten Gewebeprobe (18, S6) und hierdurch Entfernen des ausgewählten Gewebeausschnitts (36, S7). Eine Abtasteinrichtung (42) kann ein Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe (18) durchführen (S9) und eine Abweichung einer relativen Lage der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe (18) zu der Referenzprobe (18') oder verschiedener Gewebeschichten einer Gewebeprobe (18) zueinander zum Korrigieren der Ausrichtung ermitteln (S10).

Description

Beschreibung
Mikrodissektionsgerät und Verfahren zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps
Die Erfindung betrifft ein Mikrodissektionsgerät und ein in vitro Verfahren zum Entfernen von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer Gewebeprobe. Die molekulare Pathologie ist einer der am schnellsten wach¬ senden Teilmärkte des In-vitro-Diagnostik-Marktes . Dies ist unter anderem bedingt durch eine steigende Nachfrage nach personalisierter Medizin auf dem Gebiet der Krebstherapie, in der teure zielgerichtete Therapien gegen Tumor-aktivierte Mo- leküle in Krebszellen gerichtet sind. Die Wirkung eines Arz¬ neimittels ist hauptsächlich abhängig von der Präsenz oder Abwesenheit von Tumor-spezifischen Mutationen in sogenannten „Treibergenen" oder „Schlüsselgenen". Dies kann zur Zulassung molekularer „Companion Diagnostic"-Tests führen, die mit ei- ner vorgegebenen, zielgerichteten Therapie verbunden sind (z.B. Mutationen in dem Gen kRAS für Cetuximab oder
Panitumumab, EGFR für Erlotinib und Gefitinib und BRAF für Vemurafinib) . Die Qualität, Genauigkeit und Geschwindigkeit der Mutations¬ analyse sind für einen Krebspatienten, der sich oft bereits in einem metastasierten und einem lebensbedrohlichen Zustand befindet, der Schlüssel zum Erhalt einer richtigen und leis¬ tungsfähigen Therapie. Qualität, Genauigkeit und Geschwindig- keit der Mutationsanalyse sind aber ebenso für Kosteneinspa¬ rung und Effizienz im Gesundheitssystem wichtig, um eine Ver- schreibung einer zielgerichteten Therapie mit hohen Kosten (bis zu 60.000 Euro pro Therapie und Patient) nur denjenigen zukommen zu lassen, die auch davon profitieren können.
Die Laborroutine der molekularen Pathologie umfasst den Ar¬ beitsablauf des Mutationstests, der derzeit durch die folgen¬ den Schritte gekennzeichnet ist: a) Resektionieren des Tumors in einer Radiologie oder einem Operationsraum,
b) Fixieren des Tumors unter Beibehalten der Morphologie durch eine Formalin-Fixierung (etwa z.B. 16 Stunden
Dauer) ,
c) Einbetten des Tumors in Paraffin in Gewebekassetten, was zu einem sogenannten Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten „FFPE-Block" führt,
d) Schneiden des Tumorblocks in mehrere ca. 5 bis 10 Mik¬ rometer dicke Replikate (also Gewebeschnittpräparate) durch ein Mikrotom, wobei meistens ein oder seltener mehrere Replikate auf einem Objektträger aufgebracht werden,
e) Färben eines repräsentativen Schnittreplikates auf dem
Objektträger durch z.B. Hämatoxylin-Eosin-Färbung („HE- Färbung")als Referenzschnitt,
f) mikroskopische Analyse der HE-Sektion durch den Patho¬ logen, bei der in einem Gewebeausschnitt von Interesse allgemeine pathologische Gewebeausschnitte oder spezi¬ ell mit Tumorzellen bestückte Gewebeausschnitte identi¬ fiziert und relevante Gewebeareale mit einem Stift oder Markierstift auf einem Deckglas über der Referenzprobe markiert werden,
g) manuelles Ausschneiden (Ernten) des Gewebeausschnitts von Interesse durch einen Techniker, aus
paraffinisierten, ungefärbten (oder alternativ aus deparaffinisierten, gefärbten) konsekutiven Replikat- sektionen aus dem FFPE-Block auf Objektträgern, wobei die HE-gefärbte Referenzprobe als Vorlage dient; diese sogenannte „Mikrodissektion" gewährleistet das Anrei¬ chern von Tumorzellen, wobei ein Schwellenwert des pro¬ zentualen Anteils an Tumorzellen durch Richtlinien für nachfolgende molekulare Analysen festgelegt ist, h) Überführen der Gewebeausschnitte in Probengefäße (22,
46) aus Plastik,
i) Extrahieren von Nukleinsäuren (bisher meist manuell) , j) Mutationsanalyse auf DNA-Ebene (oder zunehmend auch RNA-Ebene) , wobei hierfür eine Vielzahl von
Assaytechnologien zum Analysieren von Mutationen zur Verfügung stehen, die auf aus FFPE-Gewebe extrahierter DNA basieren und verschiedene Sequenziertechnologien, wie z.B. Sanger-Sequenzierung, Pyro-Sequenzierung, „Deep-Sequencing" oder Real-Time-PCR-Methoden, die entweder Allel-spezifische PCR oder Schmelzkurven-Analyse umfassen oder Massenspektrometrie, verwendet werden, k) Empfehlung des Pathologen hinsichtlich eines zielgerichteten Therapievorschlags durch Bewertung der morphologischen (HE-Schnitt) und molekularen Analyse.
Diese Schritte nehmen einen signifikanten Teil der täglichen Routine und der Arbeitslast in der molekularen Pathologie ein, wobei täglich bis zu mehreren hundert Tumorproben bearbeitet werden. Die Analysedauer eines solchen Prozesses be¬ trägt normalerweise mehrere Tage, wird zu einem Großteil von Hand durchgeführt und ist nur geringfügig standardisiert.
Dieses Prinzip kann jedoch auch außerhalb der Krebsforschung angewendet werden, also auf allen Gebieten, in denen bestimmte Zellen aus histologischen Gewebeschnitten für nachfolgende molekulare Analysen isoliert werden.
Genauigkeit, Schnelligkeit, Arbeitsablauf und Standardisie¬ rung der Mutationsanalyse sind der Schlüssel zu einer effi¬ zienten prädiktiven und zielgerichteten Therapieentscheidung. Die Genauigkeit wird sowohl durch falsch positive als auch falsch negative Ergebnisse der Mutationsanalyse beeinflusst, genauer gesagt durch die oben genannten Arbeitsschritte f) bis j) . Bisherige Verfahren zum Isolieren und dadurch dem Anreichern von spezifischen Gewebearealen von Objektträgern verlaufen komplett manuell und dadurch sehr subjektiv und sind sehr fehleranfällig.
Um falsch negative und falsch positive Ergebnisse zu vermei¬ den, kann Laborpersonal trainiert werden, aber auch hier kann die Qualität von Labor zu Labor variieren. Die Qualitätssi¬ cherung zwischen Labors wird bisher durch Testen der Fertigkeiten des Personals und Ringstudien zu gewährleisten versucht. Ein wesentlicher Erfolgsfaktor wäre eine zunehmende Automatisierung des Prozesses unter Einbeziehung des Pathologen .
Falsch negative Ergebnisse können bei einer analytischen undetektierten „verborgenen" Tumor-DNA-Mutation auftreten. Wird zuviel gesundes Gewebe mit dem Gewebeausschnitt ent¬ fernt, kann eine Mutation z.B. mittels der klassischen Sanger-Sequenzierung, die eine Sensitivität von nur etwa 30% (Verhältnis mutiertes Allel zu gesundem Allel) aufweist, nicht mehr detektiert werden. Diese falsch negativen Ergeb¬ nisse ergeben sich meist aus ungenügender oder ungenauer und subjektiver Mikrodissektion oder ungenauem manuellen Überführen von Gewebeausschnitten in das Probengefäß zur
Nukleinsäureextraktion.
Falsch positive Ergebnisse können sich besonders durch Konta¬ mination einer Probe mit flüssigem oder gekratzten Tumormaterial in einer Umgebung der operativen Mikrodissektion ergeben, indem unentdeckterweise Mutations-positive Gewebestücke auf Mutation-negative Gewebestücke überführt und später de¬ tektiert werden.
In beiden Fällen würden bestimmte Krebspatienten ggf. falsch therapeutisch behandelt werden.
Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist die Erhöhung der Effizienz und Genauigkeit einer Mikrodissektion durch Au- tomatisierung, die zudem eine Verbesserung der Arbeitsgeschwindigkeit und des Durchsatzes (schnelleres Ergebnis) als auch eine Standardisierung des Arbeitsablaufes mit verbesserter Reproduzierbarkeit ermöglicht. Die Aufgabe wird gelöst von einem erfindungsgemäßen
Mikrodissektionsgerät gemäß dem Patentanspruch 1. Die ge¬ stellte Aufgabe wird ebenfalls gelöst von einem erfindungsge¬ mäßen Verfahren gemäß dem Patentanspruch 7. Vorteilhafte Wei- terbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben .
Die Erfindung basiert auf der Idee, die kritischen
Arbeitschritte in einem geschlossenen System zu automatisie¬ ren. Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgerät zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer Gewebeprobe und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichen eine schnellere, genauere und standardisierte Durchführung einer Mikrodissektion .
Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgerät umfasst eine
Mikrodissektionseinrichtung zum Entfernen eines ausgewählten Gewebeausschnitts der mindestens einen Gewebeprobe mittels mindestens eines Schneidelements, z.B. mittels eines Lasers oder Ultraschall-basierter Techniken. Das
Mikrodissektionsgerät ist durch eine Bildaufnahmeeinrichtung, eine Analyseeinrichtung und eine Steuereinrichtung gekennzeichnet .
Die Bildaufnahmeeinrichtung, z.B. eine Kamera, nimmt mindestens ein Bild, insbesondere ein digitales Bild, zumindest ei¬ nes Teils der mindestens einen Gewebeprobe auf. Dabei kann ein Bild eines Teils einer Gewebeprobe und/oder einer Teil- menge mehrerer Gewebeproben aufgenommen werden. Das mindestens eine Bild kann zum Vorbestimmen des zu entfernenden Gewebeausschnitts herangezogen werden und/oder, z.B. als Kontrollbild, in z.B. einem Datenspeicher oder einem Labor- Informationssystem archiviert werden.
Die Analyseeinrichtung, die zum Auswählen eines Gewebeausschnitts aus der Gewebeprobe in zumindest einem Bild einge¬ richtet ist, kann beispielsweise in einem Mikroprozessor des Mikrodissektionsgerät realisiert sein. Die Analyseeinrichtung kann dazu eingerichtet sein, ein Bild z.B. einer gefärbten
Gewebeprobe als Referenzprobe auf z.B. Tumorzellen zu analy¬ sieren und einen Gewebeausschnitt der Referenzprobe, der z.B. Tumorzellen umfasst, auszuwählen und damit zu lokalisieren und/oder vorzubestimmen . Die Definition und/oder Lokalisation von z.B. bestimmten Gewebearealen oder Gewebeauschnitten auf dem Referenzschnitt kann dabei z.B. durch einen oder mehrere komplexe Bilderkennungsalgorithmen, besonders Tumor- erkennenden Algorithmen, aber auch z.B. durch die komplexe Analytik des menschlichen Auges und Gehirns eines Pathologen erfolgen .
Die Steuereinrichtung, die zum Ausrichten des mindestens ei- nen Schneidelements der Mikrodissektionseinrichtung in Abhängigkeit von der Auswahl eingerichtet ist, kann ebenfalls z.B. in einem Mikroprozessor verwirklicht sein.
Das Mikrodissektionsgerät liegt dadurch in einem geschlosse¬ nen System vor, d.h. die genannten Einrichtungen sind innerhalb eines Gerätegehäuses verbaut und miteinander gekoppelt. Ein Benutzer, z.B. ein Pathologe oder Laborant, gibt z.B. mehrere der Gewebeproben bzw. Replikatschnitte und eine Refe¬ renzprobe auf jeweils einem Probenträger, z.B. einem Objektträger, in das Gerät ein und kann dann mit einfachen Bedienhandlungen die Gewebeproben, insbesondere die anschauen, Ausschnitte hiervon auswählen und das Gerät dazu veranlassen, z.B. einen ausgewählten Gewebeschnitt von der Gewebeprobe auf mindestens einem der geladenen Replikatschnitte zu entfernen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer vorbestimmten Gewebeprobe auf jeweils einem Probenträger in einem erfindungs¬ gemäßen Mikrodissektionsgerät umfasst dementsprechend die Schritte :
- Bereitstellen eines Bildes von einer ersten Gewebeprobe als Referenzprobe durch die Bildaufnahmeeinrichtung,
- Erzeugen eines Auswahlsignals durch die Analyseeinrichtung, wobei das Auswahlsignal Koordinaten von mindestens einer Be¬ grenzung eines Gewebeausschnitts auf dem Probenträger mit der Referenzprobe beschreibt, - in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal Ausrichten des min¬ destens einen Schneidelements gemäß der mindestens einen Be¬ grenzung jeweils in der Referenzprobe und/oder mindestens ei¬ ner weiteren Gewebeprobe als vorbestimmte Gewebeprobe und hierdurch Entfernen des ausgewählten Gewebeausschnitts durch das mindestens eine Schneidelement aus der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe.
Eine Begrenzung eines Gewebeausschnitts umfasst dabei einen Konturverlauf des Gewebeausschnitts. Unter dem Ausrichten des mindestens einen Schneidelements ist dabei das Einstellen des Schneidelements auf den Konturverlauf des Gewebeausschnitts auf dem Bild zu verstehen.
Der Vorgang der Mikrodissektion verläuft somit zu einem erheblich größeren Anteil automatisch. Subjektive Abweichungen zwischen unterschiedlichen z.B. Mutationstests durch z.B. unterschiedliche Qualifikationen und Erfahrungen verschiedener Labortechniker und ungenaue Dissektionen werden vermieden. Ebenso erfolgt eine Standardisierung unterschiedlicher Labors. Durch Vermeiden der manuellen Arbeitsschritte wird eine Kontamination durch falsch positive Ergebnisse vermieden. Das Verfahren spart zudem Zeit, wodurch z.B. ein krebskranker Patient früher therapiert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das
Mikrodissektionsgerät eine Anzeigeeinrichtung der Analyseeinrichtung, z.B. einen Bildschirm oder eine andere Einrichtung zum Anzeigen des mindestens einen Bilds, und/oder eine Be¬ dieneinrichtung der Analyseeinrichtung zum Auswählen des mindestens einen Gewebeausschnitts durch den Benutzer umfassen.
Die Bildaufnahmeeinrichtung kann gemäß dieser Ausführungsform das Bild der Referenzprobe an die Anzeigeeinrichtung der Ana- lyseeinrichtung übertragen, die das Bild anzeigt. Eine Be¬ dieneinrichtung ist dabei eine Einrichtung, die eine Bedienhandlung des Benutzers empfangen und in Abhängigkeit von der Bedienhandlung das Auswahlsignal erzeugen kann, wie z.B. eine Benutzerschnittstelle mit einem daran gekoppelten Touch- Screen .
Dies ermöglicht z.B. dem Pathologen, selbst die Gewebeproben zu sichten und eine sinnvolle Entscheidung über den zu entfernenden Gewebeausschnitt zu treffen.
Alternativ oder zusätzlich kann die Analyseeinrichtung dazu eingerichtet sein, das Bild einer Referenzprobe mit einem vorgegebenen Bild des vorbestimmten Zelltyps, insbesondere eines digitalen Bildes des vorbestimmten Zelltyps, zu vergleichen und in Abhängigkeit eines Ergebnisses des Vergleichs den Gewebeausschnitt aus der mindestens einen Gewebeprobe auszuwählen. Die Referenzprobe ist dabei eine Gewebeprobe, deren Zellen z.B. durch eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung („HE- Färbung") markiert sind. Dadurch wird eine vollautomatische Mikrodissektion ermöglicht. Durch einen entsprechenden Verfahrensschritt in dem erfindungsgemäßen Vefahren wird dem Benutzer des Mikrodissektionsgeräts somit ein Vorschlag einer möglichen Begrenzung des zu entfernenden Gewebeausschnitts unterbreitet, den der Benutzer z.B. annehmen oder ändern kann. Dies beschleunigt das Verfahren und unterstützt den Be¬ nutzer bei schlechten Färbungen. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das
Mikrodissektionsgerät eine Überführungseinrichtung zum Überführen oder Übertragen eines oder mehrerer entfernter Gewebeausschnitte in ein Probengefäß, z.B. ein Plastikröhrchen oder ein Reaktionsgefäß aus Plastik, umfasst. Dadurch wird einem Verlust von Zellen, wie er bei einem manuellen Überführen des ausgeschnittenen Gewebeausschnitts auftreten kann, vorgebeugt. Hierdurch ergibt sich vorteilhaft ein Vermeiden falsch negativer Ergebnisse und eine Verbesserung der Qualität bei einem einer Mutationsanalyse nachfolgenden Erstellen eines personalisierten Medikaments. Das Überführen des mindestens einen entfernten Gewebeausschnitts in ein Probengefäß durch die Überführungseinrichtung kann z.B. durch eine Anordnung des Probengefäßes unter dem Objektträger, also mittels Gravi- tation, oder z.B. durch Aufnehmen des entfernten Gewebeausschnittes auf z.B. einen kleinen, durch z.B. die Steuereinrichtung gesteuerten Spatel und Abstreifen des entfernten Gewebeausschnittes am Probengefäß erfolgen. Dadurch werden Zel- len des gewünschten Zelltyps angereichert.
Umfasst eine Gewebeprobe auf einem Probenträger z.B. mehrere übereinander liegende Mikrotomschnitte eines Gewebes, kann sich das Problem ergeben, dass die einzelnen Gewebeschnitte nicht exakt aufeinander liegen und gegeneinander verdreht oder verschoben sind (also eine sogenannte „Drift" aufwei¬ sen) . Ebenfalls kann es passieren, dass verschiedene Gewebe¬ proben, die auf verschiedenen Probenträger fixiert sind, nicht exakt in der gleichen Position angebracht sein. In beiden Fällen würde ein Entfernen eines Gewebeausschnittes unter Umständen zu einem nicht exakten Entfernen des ausgewählten Gewebeausschnittes erfolgen. Um eine solche „Drift" zu korri¬ gieren, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn, gemäß einer weiteren Ausführungsform, das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgeräts eine Abtasteinrichtung umfasst, die dazu ausgelegt ist, eine Abweichung einer relativen Lage zweier voneinander getrennten Schichten der Gewebeprobe oder einer Abweichung einer Lage zweier Gewebeproben auf unterschiedlichen Probenträgern zu erfassen. Eine beispielhafte Abtasteinrichtung ist dabei ein Scanner.
In der entsprechenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren die Schritte:
- Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe durch die Abtasteinrichtung und dadurch Ermitteln einer Abweichung einer relativen Lage zweier Gewebeprobenschichten derselben vorbestimmten Gewebeprobe und/oder einer relativen Lage der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe zu der Referenzprobe auf dem jeweiligen Probenträger, und
- in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und der ermittelten Abweichung Korrigieren der Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements für jede Gewebeschicht derselben vorbestimm¬ ten Gewebeprobe und/oder Korrigieren der Ausrichtung des min- destens einen Schneidelements für die jeweilige vorbestimmte Gewebeprobe .
Zur Erhöhung des Durchsatzes an Gewebeproben, z.B. einer Vielzahl an Gewebeproben unterschiedlicher Patienten, und zum Ermöglichen einer Dokumentation des Verfahrensverlaufs, hat sich ein erfindungsgemäßes Mikrodissektionsgerät gemäß einer weiteren Ausführungsform als vorteilhaft erwiesen, das eine Identifikationscodeleseeinrichtung und/oder eine Identifika- tionscodeschreibeeinrichtung umfasst. Eine Identifikations¬ codeleseeinrichtung ist eine Einrichtung zum Erfassen und Erkennen eines Identifikationscodes, z.B. eines Barcodes auf einem Probenträger, sodass eine Gewebeprobe auf dem Probenträger z.B. einem Patienten zugeordnet und z.B. das Bild der Gewebeprobe in die Akte des Patienten gespeichert wird. Eine Identifikationscodeschreibeeinrichtung ist eine Einrichtung zum Erstellen eines Identifikationscodes, z.B. zum Erstellen eines Barcodes auf einem Probengefäß, in das der entfernte Gewebeausschnitt (oder die entfernten Gewebeausschnitte) des jeweiligen Patienten übertragen werden. Dadurch ist bei einer zufälligen Reihenfolge der Eingabe von Probenträgern in das Mikrodissektionsgerät, die den allgemeinen Messvorgang von Gewebeproben vieler verschiedener Patienten beschleunigt, gewährleistet, dass jede Gewebeprobe und jeder entfernte Gewe- beausschnitt dem richtigen Patienten zugeordnet werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dementsprechend in einer weiteren Ausführungsform das Auslesen eines Identifikationscodes eines Probenträgers durch eine Identifikationscodelese- einrichtung und/oder das Erstellen eines Identifikationscodes auf einem Probenträger durch die Identifikationscodeschreibe- einrichtung umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver- fahrens ist der Schritt des Extrahierens mindestens eines
Biopolymers, z.B. einer Nukleinsäure, des entfernten Gewebe¬ ausschnitts in dem Mikrodissektionsgerät umfasst. Eine ent- sprechende Einrichtung, die dies ermöglicht, ist dabei vor¬ zugsweise in das Mikrodissektionsgerät integriert.
Eine weitergehende Automatisierung einer Mutationsanalyse kann in einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch einen Schritt des Amplifizierens des extra¬ hierten Biopolymers und/oder des Sequenzierens des extrahier¬ ten Biopolymers ermöglicht werden. Eine entsprechende Ein¬ richtung zum Amplifizieren z.B. einer Nukleinsäure, z.B. ein Thermocycler, und/oder eine entsprechende
Sequenziereinrichtung sind dabei bevorzugt in das
Mikrodissektionsgerät integriert .
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die gezeigten Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Funktionsgleiche Elemente weisen in den Figuren dieselben Bezugszeichen auf. Es zeigt: FIG 1 eine Skizze zu einer erfindungsgemäßen
Mikrodissektionsgeräts gemäß einem Ausführungsform veranschaulicht, und
FIG 2 eine Skizze zu einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine weitere Ausfüh¬ rungsform eines erfindungsgemäßen
Mikrodissektionsgeräts .
In dem in der FIG 1 dargestellten Beispiel ist das einem er- findungsgemäßen Mikrodissektionsgerät 10 zugrunde liegende Prinzip veranschaulicht:
Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgeräts 10 umfasst eine Bildaufnahmeeinrichtung 12 und eine
Mikrodissektionseinrichtung 14. Das Mikrodissektionsgerät 10 umfasst weiterhin eine Analyseeinrichtung 20, z.B. einen Mikroprozessor, der zum Auswählen eines Gewebeausschnittes aus einer oder mehreren Gewebeproben in zumindest einem Bild der Bildaufnahmeeinrichtung 12 eingerichtet ist. Die Analyseeinrichtung 20 kann weiterhin eine Bedieneinrichtung und/oder eine Anzeigeeinrichtung umfassen, über die, wie im der FIG. 1 veranschaulicht, ein Benutzer, z.B. ein Pathologe, ein Bild anschauen, analysieren und über eine Bedienhandlung, wie z.B. ein Bewegen und Klicken mit einer Computermaus, einen Gewebeausschnitt auswählen kann.
Die Bildaufnahmeeinrichtung 12, die
Mikrodissektionseinrichtung 14 und die Analyseeinrichtung 20 liegen in dem Gerät 10 in einem geschlossenen System vor. Das Mikrodissektionsgerät 10 kann also Gewebeproben 18 auf Pro¬ benträger 16 empfangen und stellt als Ergebnis eines durchge¬ führten erfindungsgemäßen Verfahrens einen oder mehrere Gewe- beausschnitte, die vollautomatisch oder von einem Benutzer als relevante Gewebeausschnitte ausgewählt und damit vorbe¬ stimmt werden, bereit. Die Einrichtungen des
Mikrodissektionsgeräts 10 kommunizieren dabei über gängige Kommunikationsprotokolle mittels drahtlosen oder drahtgebun- denen Kommunikationsverbindungen. Das Mikrodissektionsgerät 10 kann ebenfalls eine Überführungseinrichtung (in der FIG 1 nicht gezeigt) umfassen, die den oder die entfernten Gewebe¬ ausschnitte in ein Probengefäß 22 überführt. Die FIG 1 zeigt ebenfalls einen Probenträger 16, z.B. einen
Objektträger oder eine Mikrotiterplatte, auf dem eine Gewebe¬ probe 18 fest gelagert ist, z.B. eine Probe eines histologi¬ schen Schnittes z.B. menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Gewebes. Die Gewebeprobe 18 kann auch mehrere, z.B. auf- einandergelegte histologische Replikate, also mehrere Gewebe¬ schnitte, umfassen. Die Gewebeprobe kann z.B. auch eine ge¬ färbte Referenzprobe 18' umfassen.
In einem beispielsweise separaten Aufreinigungssystem 24, z.B. einem Gerät zur automatischen Extraktion von z.B. mindestens einem Protein oder mindestens einer Nukleinsäure (wie z.B. DNS, RNS oder Polynukleotid) kann eine Extraktion des jeweiligen Biopolymers erfolgen (Sil). Das so aufgereinigte mindestens eine Biopolymer, z.B. eine Nukleinsäure, des oder der entfernten Gewebeausschnitte können anschließend durch z.B. einen dem Fachmann bekannten Thermocycler (in der FIG 1 nicht gezeigt) amplifiziert und/oder durch eine
Sequenzieranordnung 26, z.B. einem Sanger-Sequenziergerät, sequenziert werden (S12) . Alternativ kann das
Mikrodissektionsgerät 10 entsprechende Einrichtungen 24, 26 zum Extrahieren, Amplifizieren oder Sequenzieren umfassen. Die FIG 2 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel eines er¬ findungsgemäßen Verfahrens in einem beispielhaften erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgerät 10. Der Benutzer beabsichtigt z.B. das Isolieren und Anreichern von Tumorzellen, um die Präsenz oder Absenz einer Mutation eines Treibergens, wie z.B. bRAF, EGFR oder KRAS zum Erstellen einer personalisierten Therapie nachzuweisen.
Eine erste Gewebeprobe 18, z.B. ein histologischer Schnitt eines aus einem Patientenkörper operativ entfernten Gewebes, auf einem ersten Probenträger 16 kann durch eine Probenaufnahmeeinrichtung 28 des Mikrodissektionsgeräts 10 von dem Mikrodissektionsgerät 10 empfangen werden (Verfahrensschritt Sl) . Im Beispiel der FIG 2 empfängt das Mikrodissektionsgerät 10 zusätzlich einen weiteren Probenträger 16 mit einer weite- ren Gewebeprobe 18' desselben Gewebes, die z.B. eine Refe¬ renzprobe 18' umfasst, bei der das Gewebe durch z.B. eine Hä- matoxylin-Eosin-Färbung („HE-Färbung" ) oder Paragon-Färbung gefärbt wurde. Die Bildaufnahmeeinrichtung 12, die z.B. eine Digitalkamera, ein (Digital-) Mikroskop oder einen Scanner (wie z.B. einen HE-Scanner) umfasst, nimmt ein Bild 30, insbesondere ein di¬ gitales Bild (30, S2) der Referenzprobe 18' auf (S2) und überträgt das Bild an die Analyseeinrichtung 20 (S3) . Die Bildaufnahmeeinrichtung 12 kann nach Entfernen des Gewebeausschnitts 36 (S7) noch einmal ein Bild 30 der Gewebeprobe 18 als Kontrollbild 30 aufnehmen. Ein Bild 30 oder mehrere Bil- der 30 können in einem Datenspeicher z.B. zu einer elektronischen Patientenakte gespeichert werden.
Im vorliegenden Beispiel ist die Analyseeinrichtung 20 bei- spielsweise in einem Mikroprozessor des
Mikrodissektionsgeräts 10 verwirklicht. Die Analyseeinrich¬ tung 20 zeigt beispielsweise das Bild 30 durch eine Anzeige¬ einrichtung 32, z.B. einem Bildschirm oder Touch-Screen, an. Das Bild 30 in der FIG 2 zeigt beispielsweise einen vergrö- Berten Bereich der Referenzprobe 18' mit mehreren Zellen, von denen die schraffiert dargestellten Zellen z.B. gefärbte Tumorzellen darstellen. Der Benutzer kann mittels einer Bedieneinrichtung 34 des Mikrodissektionsgeräts 10, z.B. einer Be¬ nutzerschnittstelle der Analyseeinrichtung 20, die z.B. eine Maus oder ein Touch-Screen umfasst, einen zu entfernenden Gewebeausschnitt 36 auf dem Bild 30 markieren (S5) . Die Bedien¬ einrichtung 34 kann dazu eingerichtet sein, die Anzeige des Bildes 30 zu ändern, also z.B. in das Bild 30 hineinzuzoomen, herauszuzoomen oder es zu verschieben. Das Auswählen oder Vorbestimmen des Gewebeausschnitts 36 umfasst dabei lediglich das Markieren des Gewebeausschnitts 36 auf dem Bild 30, um¬ fasst also keine Online-Steuerung des mindestens einen
Schneidelements 38 der Mikrodissektionseinrichtung 14. Zusätzlich oder alternativ kann die Analyseeinrichtung 20 das Bild 30 der Referenzprobe 18' mit z.B. einem vorgegebenen Bild des vorbestimmten Zelltyps vergleichen, wobei das vorge¬ gebene Bild z.B. in einem Datenspeicher des
Mikrodissektionsgeräts gespeichert sein kann und z.B. Bildda- ten, die ein typisches Färbungsmuster von z.B. Tumorzellen beschreiben, umfasst. In Abhängigkeit eines Ergebnisses des Vergleichs, der z.B. über einen gängigen Bildanalysealgorithmus durchgeführt werden kann, kann die Analyseeinrichtung 20 einen Gewebeausschnitt 36 auf dem Bild 30 markieren und auf der Anzeigeeinrichtung 32 anzeigen, hierdurch also einen Gewebeausschnitt 36 „vorschlagen". Im vorliegenden Beispiel wählt der Benutzer die auf dem Bild 30 schraffiert dargestellten Zellen aus. Die Analyseeinrichtung 20 erfasst die Bedienhandlung und ermittelt in Abhängigkeit der Bedienhandlung diejenigen Koordinaten auf dem Pro- benträger 16, die die Lage des Gewebeausschnittes 36 be¬ schreiben. Die Koordinaten sind dabei Koordinaten eines zwei- oder dreidimensionslen Koordinatensystems auf dem jeweiligen Probenträger 16. Alternativ kann die Analyseeinrichtung 20 den Gewebeausschnitt 36 vollautomatisch auswählen, indem sie das Bild 30 auf vorgegebene Strukturen der Färbung analysiert und, wie bereits oben beschrieben, diese mit vorgegebenen Bilddaten vergleicht. Bei Übereinstimmung eines Färbemusters in einem Ausschnitt der Gewebeprobe 18 kann die Analyseeinrichtung 20 diesen Gewebeausschnitt 36 auswählen und damit vorbestimmen.
Die Analyseeinrichtung 20 erzeugt in Abhängigkeit des ausge¬ wählten Gewebeausschnitts 36 ein Auswahlsignal, das die Koor- dinaten, also einen Konturverlauf, mindestens einer Begren¬ zung des vorbestimmten Gewebeausschnitts 36 auf dem Probenträger 16 beschreibt. In Abhängigkeit von dem Auswahlsignal richtet eine Steuereinrichtung 40, die das Auswahlsignal emp¬ fängt (S4), mindestens ein Schneidelement 38 gemäß der min- destens einen Begrenzung jeweils in der Referenzprobe 18' und/oder mindestens einer weiteren Gewebeprobe 18 als vorbe¬ stimmte Gewebeprobe 18 aus (S6) . Ein Schneidelement 38 um- fasst ein Instrument oder Instrumententeil, das ein Gewebe zerteilen oder zerschneiden kann, z.B. ein Laser oder ein Skalpell. Das Schneidelement 38 ist vorzugsweise ein Bestand¬ teil der Mikrodissektionseinrichtung 14, die vorzugsweise ein „Laser-Capture-Microdissection"-System oder ein „Laser- Microbeam-Microdissection"-System umfasst . Das von der Steuereinrichtung 40 an der mindestens einen Begrenzung entlang gesteuerte Schneidelement 38 entfernt den vorbestimmten Gewebeausschnitt 36 aus der Gewebeprobe 18 und/oder der Referenzprobe 18' (S7) . Es besteht mit dem er- findungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit, mehrere dem ausge¬ wählten Gewebeausschnitt 36 entsprechende Gewebeausschnitte 36 aus einer Vielzahl von Gewebeproben 18 und/oder Replikaten zu entfernen. Dazu werden die ermittelten Koordinaten von der Analyseeinrichtung 20 jeweils auf die entsprechenden Koordinaten des jeweiligen Probenträgers 16 übertragen.
Das Mikrodissektionsgerät 10 kann eine Abtasteinrichtung 42, vorzugsweise einen Scanner, umfassen, der eine relative räum- liehe Lage der Gewebeprobe 18', 18 auf dem Probenträger 16 erfasst (S9) . Dies kann das Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe 18 und dadurch Ermitteln einer Abweichung einer relativen Lage zweier Gewebeprobenschichten derselben vorbestimmten Gewebeprobe 18, wenn also z.B. eine Gewebeprobe 18 mehrere aufeinandergelegte histologische
Schnitte umfasst. Ist beispielsweise eine erste Gewebe¬ schicht, also z.B. ein erster histologischer Gewebeschnitt, gegenüber einer darüber liegenden Gewebeschicht um 90° gedreht, erfasst die Abtasteinrichtung 42 diese Abweichung und korrigiert in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und/oder der ermittelten Abweichung die Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements 38 für das Entfernen des vorbestimmten Gewe¬ beausschnitts 36 aus der ersten Gewebeschicht derselben vor¬ bestimmten Gewebeprobe 18.
Die Abtasteinrichtung 42 kann auch eine Abweichung der relativen Lage der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe 18 zu der Referenzprobe 18' auf dem jeweiligen Probenträger 16 ermitteln und in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und der ermittelten Abweichung die Ausrichtung des mindestens einen
Schneidelements 38 für die jeweilige vorbestimmte Gewebeprobe 18 korrigieren (S10) .
Der oder die Probenträger 16 können während des Verfahrens innerhalb des Geräts auf z.B. einer Ablagefläche eines Bodens des Mikrodissektionsgeräts 10 gelagert sein. Dabei können beispielsweise mehrere Probenträger 16 nebeneinander gelagert sein, während des Verfahrens gegeneinander ausgetauscht wer- den oder mittels eines bewegbaren Bands zwischen den verschiedenen Einrichtungen des Geräts bewegt werden.
Das Mikrodissektionsgerät 10 kann zusätzlich eine Überfüh- rungseinrichtung 44 umfassen, z.B. eine Anordnung, bei der der entfernte Gewebeausschnitt 36 unter dem Einfluss der Schwerkraft in ein Probengefäß 46 fällt oder durch z.B. eine Anordnung mit einer Feder, die den entfernten Gewebeausschnitt in das Probengefäß 46 katapultiert (S8) . Alternativ kann z.B. auch eine thermoplastische Membran des Reaktionsge¬ fäßes 46 mit dem entfernten Gewebeausschnitt 36 durch die Überführungseinrichtung 44 verbunden werden. Die Überführungseinrichtung 44 kann von der Steuereinrichtung gesteuert werden (S8) .
Das erfindungsgemäße Verfahren kann einen Identifikationscode 48 des Probenträgers 16, z.B. einen Barcode, durch eine op¬ tionale Identifikationscodeleseeinrichtung des
Mikrodissektionsgeräts 10 auslesen und/oder einen solchen Identifikationscode durch eine optionale Identifikationscode- Schreibeeinrichtung des Mikrodissektionsgeräts 10 auf z.B. dem Probengefäß 46 erstellen. Der Identifikationscode kann dabei z.B. Patientendaten umfassen. Das Mikrodissektionsgerät 10 kann so z.B. Patientendaten und/oder ein oder mehrere Bil- der 30 des oder der Gewebeproben 18 miteinander verbinden und/oder z.B. über eine drahtlose oder drahtgebundene Kommu¬ nikationsverbindung an ein Labor-Informationssystem übertragen . Die fakultativen Verfahrensschritte des Extrahierens eines
Biopolymers (Sil), z.B. einer Nukleinsäure, des Amplifizieren des Biopolymers und/oder des Sequenzierens des Biopolymers (S12) sind in der FIG 2 nicht dargestellt, können jedoch ebenfalls dem unten beschriebenen Verfahren durch entspre- chende Einrichtungen 24, 26 des Mikrodissektionsgeräts 10 oder durch separate Geräte folgen. Die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele veranschaulichen das Prinzip der vorliegenden Erfindung, die kritischen Arbeitsschritte zu automatisieren. Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgerät 10 kann beispiels¬ weise als ein „integrierten und automatisierten Bildanalyseeinheit mit einem Gewebe-Mikrodissektor und einem Pathologen- Cockpit" realisiert werden. Es beschreibt die Integration und Automatisierung der oben aufgeführten kritischen Arbeits- schritte f) , g) und h) , die bisher komplett manuell, subjek¬ tiv und fehleranfällig sind. Es kann z.B. vollautomatisch ausgestaltet sein und die anfangs beschriebenen Arbeits¬ schritte f) , g) und h) integrieren. Ein solches Mikrodissektionssystem kann eine oder mehrere der folgenden Module umfassen:
- Probenaufnahmeeinrichtung 28 zum z.B. zufälligen „Beladen" des Geräts 10 mit Gewebeproben 18 auf Probenträgern;
- z.B. eine digitale Kamera als Bildaufnahmeeinrichtung 12 und/oder einer Abtasteinrichtung 42, um ein z.B. hochauflösendes digitales Farbbild z.B. einer Referenzprobe 18' zu ge¬ winnen ;
- Graphische Bedienoberfläche („Cockpit") als Bedieneinrich- tung 34 und Anzeigeeinrichtung 32 für z.B. einen Pathologen, um z.B. die Referenzprobe 18' zu „screenen" oder überprüfen, einen Gewebeausschnitt 36 von Interesse zu identifizieren und/oder diese zu markieren, z.B. mithilfe einer dem Fachmann bekannten Bildanalysesoftware, und/oder um X-, Y- und/oder Z- Koordinaten von z.B. Gewebe und Paraffin zu bestimmen;
- Datenspeicher, z.B. Festplatte, zum Speichern und/oder Archivieren der Bilddaten von der z.B. HE-gefärbten Referenzprobe 18' und/oder ungefärbte Sektionen weiterer Replikate 18 (vor und/oder nach dem Entfernen des Gewebeausschnitts 36) und/oder der gewählten X-, Y- und/oder Z-Koordinaten;
- Labor-Informations-System und/oder Kommunikationsverbindung zu einem Labor-Informations-System - Identifikationscodeleseeinrichtung, z.B. Barcodeleseeinrichtung für z.B. 2D-Barcodes auf einem Objektträger 16;
- Mikrodissektionseinrichtung 14, z.B. ein „Laser-Capture- Microdissection"-System oder ein Schwerkraft-assoziiertes Mikrodissektionstechnologie-System, das den Gewebeausschnitt 36 von Interesse aus z.B. einen oder mehreren
paraffinisierten, ungefärbten Sektionsreplikat oder Sektions- replikaten auf z.B. einem Objektträger aufnimmt, wobei z.B. die X- und Y-Position einer Referenzprobe 18' verwendet wird; und/oder
- Überführungseinrichtung 44 zum Überführen des Gewebeausschnitts 36 in ein Probengefäß 46 (z.B. 1,5 Milliliter
Sarstedt-Röhrchen) .

Claims

Patentansprüche
1. Mikrodissektionsgerät (10) zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer Gewebeprobe (18), umfassend eine Mikrodissektionseinrichtung (14) zum Entfernen eines ausgewählten Gewebeausschnitts (36) mittels mindestens eines Schneidelements (38),
gekennzeichnet durch
- eine Bildaufnahmeeinrichtung (12) zum Aufnehmen mindestens eines Bildes (30) zumindest eines Teils der mindestens ei¬ nen Gewebeprobe (18),
- eine Analyseeinrichtung (20), die zum Auswählen eines Gewebeausschnitts (36) aus der Gewebeprobe (18) in zumindest einem Bild (30) eingerichtet ist, und
- eine Steuereinrichtung (40) zum Ausrichten des mindestens einen Schneidelements (38) der Mikrodissektionseinrichtung (14) in Abhängigkeit von der Auswahl.
2. Mikrodissektionsgerät (10) nach Anspruch 1, weiterhin um- fassend eine Anzeigeeinrichtung (32) der Analyseeinrichtung
(20) zum Anzeigen des mindestens einen Bilds (30) und/oder eine Bedieneinrichtung (34) der Analyseeinrichtung (20) zum Auswählen des mindestens einen Gewebeausschnitts (36) durch einen Benutzer.
3. Mikrodissektionsgerät (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyseeinrichtung (20) dazu eingerichtet ist, das Bild (30) einer Referenzprobe (18') mit einem vorgegebenen Bild (30) des vorbestimmten Zelltyps zu verglei- chen und in Abhängigkeit eines Ergebnisses des Vergleichs den Gewebeausschnitt (36) aus der mindestens einen Gewebeprobe (18) auszuwählen.
4. Mikrodissektionsgerät (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Überführungseinrichtung
(44) zum Überführen des entfernten Gewebeausschnitts (36) in ein Probengefäß (22, 46) .
5. Mikrodissektionsgerät (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Abtasteinrichtung (42), die dazu ausgelegt ist, eine Abweichung einer relativen Lage zweier voneinander getrennten Schichten der Gewebeprobe (18) oder einer Abweichung einer Lage zweier Gewebeproben (18) auf unterschiedlichen Probenträgern (16) zu erfassen.
6. Mikrodissektionsgerät (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Identifikationscodelese- einrichtung und/oder eine Identifikationscodeschreibeeinrich- tung .
7. Verfahren zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer vorbestimmten Gewebeprobe (18) auf jeweils einem Probenträger (16) in einem
Mikrodissektionsgerät (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5,
- Bereitstellen eines Bildes (30) von einer ersten Gewebeprobe (18) als Referenzprobe (18') durch die Bildaufnahmeein¬ richtung (12, S2),
- Erzeugen eines Auswahlsignals durch die Analyseeinrichtung (20), wobei das Auswahlsignal Koordinaten von mindestens einer Begrenzung eines Gewebeausschnitts (36) auf dem Pro¬ benträger mit der Referenzprobe (18') beschreibt (S4),
- in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal Ausrichten des min¬ destens einen Schneidelements (38) gemäß der mindestens ei¬ nen Begrenzung jeweils in der Referenzprobe (18') und/oder mindestens einer weiteren Gewebeprobe (18) als vorbestimmte Gewebeprobe (18) durch die Steuereinrichtung (40) und hierdurch Entfernen des ausgewählten Gewebeausschnitts (36) durch das mindestens eine Schneidelement (38) aus der min¬ destens einen vorbestimmten Gewebeprobe (18, S6) .
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein Gerät (10) nach Anspruch 2 verwendet wird, umfassend die Schritte:
- Übertragen des Bildes (30) der Referenzprobe (18') an die
Anzeigeeinrichtung (32) der Analyseeinrichtung (20) und Anzeigen des Bildes (30) durch die Anzeigeeinrichtung (32, S3) , und/oder - Empfangen einer Bedienhandlung eines Benutzers durch eine Bedieneinrichtung (34) der Analyseeinrichtung (20) und in Abhängigkeit der Bedienhandlung Erzeugen des Auswahlsignals (S5) .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei ein Gerät (10) nach Anspruch 2 verwendet wird, wobei die Analyse¬ einrichtung (34) das Bild (30) der Referenzprobe (18') mit einem vorgegebenen Bild des vorbestimmten Zelltyps vergleicht und in Abhängigkeit eines Ergebnisses des Vergleichs einen
Gewebeausschnitt (36) auf dem Bild (30) markiert und auf der Anzeigeeinrichtung (32) anzeigt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei ein Ge- rät (10) nach Anspruch 4 verwendet wird, weiterhin umfassend das Überführen des mindestens einen entfernten Gewebeaus¬ schnitts (36) in ein Probengefäß (22, 46) durch die Überfüh¬ rungseinrichtung (44, S8).
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei ein Gerät (10) nach Anspruch 5 verwendet wird, weiterhin umfas¬ send die Schritte:
- Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe
(18) durch die Abtasteinrichtung (42) und dadurch Ermitteln einer Abweichung einer relativen Lage zweier Gewebeprobenschichten derselben vorbestimmten Gewebeprobe (18, S9) , und
- in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und der ermittelten Abweichung Korrigieren der Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements (38) für jede Gewebeschicht derselben vor- bestimmten Gewebeprobe (18, S10).
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei ein Gerät (10) nach Anspruch 5 verwendet wird, weiterhin umfas¬ send die Schritte:
- Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe
(18) durch die Abtasteinrichtung (42) und dadurch Ermitteln einer Abweichung einer relativen Lage der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe (18) zu der Referenzprobe (18') auf dem jeweiligen Probenträger (S9) ,
- in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und der ermittelten Abweichung Korrigieren der Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements (38) für die jeweilige vorbestimmte Gewebe¬ probe (18, S10) .
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, weiterhin umfassend den Schritt:
- Extrahieren mindestens eines Biopolymers des entfernten Ge¬ webeausschnitts (36) in dem Mikrodissektionsgerät (10, Sil) .
14. Verfahren nach Anspruch 13, weiterhin umfassend den
Schritt:
- Amplifizieren des extrahierten Biopolymers und/oder
- Sequenzieren des extrahierten Biopolymers
durch das Mikrodissektionsgerät (10, S12).
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei ein Mikrodissektionsgerät (10) nach Anspruch 6 verwendet wird, weiterhin umfassend den Schritt:
- Auslesen eines Identifikationscodes eines Probenträgers durch eine Identifikationscodeleseeinrichtung und/oder - Erstellen eines Identifikationscodes auf einem Probenträger durch die Identifikationscodeschreibeeinrichtung .
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