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VERWEIS AUF ZUGEHÖRIGE
ANMELDUNGEN
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der US provisorischen
Patentanmeldung Nr.: 60/845,861, eingereicht am 20. September 2006, und
der deutschen Patentanmeldung
DE
10 2006 038 , eingereicht am 15. August 2006, wobei die
Offenbarung von beiden hierin eingefügt ist.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellanalyse und insbesondere
auf ein Verfahren der Zellanalyse, in welchem die zu analysierenden
Zellen haftend auf einem Objektträger gebracht werden und mit
einem ersten Färbemittel angefärbt werden, bei dem
ein erstes digitales Bild der gefärbten, auf den Objektträger
gebrachten Zellen aufgenommen und dann gespeichert wird, bei dem
dieselben Zellen auf dem Objektträger mit einem zweiten
Färbemittel behandelt werden nachdem das erste digitale
Bild aufgenommen wurde, sodass sich ihre optisch messbaren Eigenschaften ändern,
und bei dem dann ein zweites digitales Bild derselben auf den Objektträger gebrachten
Zellen aufgenommen und dann gespeichert wird.
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Das
deutsche Patent Nr.:
DE 101
28 552 offenbart ein derartiges analytisches Verfahren
und eine Vorrichtung für die Durchführung derartiger
Analysen. Diese Veröffentlichung beschreibt Verfahren und
Vorrichtungen, in welchen die zu analysierenden Zellen haftend auf
einen Objektträger gebracht werden und verschiedenen Behandlungen
zum Zweck der Bestimmung verschiedener Zelleigenschaften unterzogen
werden.
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Diese
Behandlungen enthalten insbesondere das „Färben"
bzw. „Anfärben" der Zellen, bei dem die Zellen
in Kontakt mit einer chemischen Substanz gebracht werden, die verschiedene
chemische Reaktionen in Zellen gemäß ihren Eigenschaften
auslöst, wobei sich die chemischen Reaktionen gewöhnlich
in einer Änderung der optisch wahrnehmbaren Zelleigenschaften
niederschlagen und das Transmissions-, Absorptions- und/oder Lumineszenzverhalten der
Zellen ändern. Im einfachsten Fall ändern die
Zellen ihre Farbe auf der Grundlage ihrer Eigenschaften, was es
ermöglicht auf der Grundlage ihrer Farbe oder des Musters
ihrer räumlichen Verteilung der Farbe, die Zellen in verschiedene
Kategorien, wie etwa normal/anormal, einzuteilen.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird hiermit hervorgehoben, dass obwohl
diese Anmeldung ausschließlich von „Anfärben"
mittels eines „Färbemittels" spricht, dass diese
Begriffe hiernach sich auf alle Arten von Behandlungen der haftend
auf einen Objektträger gebrachten Zellen beziehend zu verstehen
sind, die das Emissions-, Transmissions-, und/oder Absorptionsverhalten
der Zellen in Bezug auf elektromagnetische Wellen, insbesondere
in Beziehung auf elektromagnetische Wellen mit Wellenlängen
im sichtbaren Bereich ändern. „Färben"
in diesem Sinn kann folglich ebenfalls bedeuten, dass die Zellen
nicht einer chemischen sondern vielmehr einer physikalischen Behandlung,
wie z. B. einer Bestrahlung oder einer Wärmebehandlung
ausgesetzt werden. Das hierin beschriebene Verfahren ist insbesondere
vorteilhaft, weil es eine Analyse von Körperzellen beschreibt,
welche die Frühdiagnose von Krebs mit einem hohen Grad
an Genauigkeit ermöglicht.
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Es
ist aus verschiedenen Gründen vorteilhaft, die Krebsdiagnose
insbesondere für den Zweck der Krebsvorsorge, auf die Analyse
von Zellproben anstelle von Gewebeproben (Histologie, obwohl heute
das vorherrschende Werkzeug für die Routinediagnostik,
die Eingriffe umfasst, die in einem Verlust an Blut resultieren)
oder Organbildgebung (Röntgenstrahlen, Ultraschall usw.)
zu stützen. Zellen sind die frühesten Manifestationen
eines im Entstehen begriffenen Krebses. Je früher der Eingriff
durchgeführt wird, desto größer sind
die Chancen einer Heilung der Krankheit. Ferner werden Zellproben
mittels eines Bürstenabstriches oder einer Feinnadelbiopsie genommen
und bedingen keinen Blutverlust und wenig oder gar keinen Schmerz.
Patienten akzeptieren daher die Untersuchungen und die Untersuchungskosten
werden niedrig gehalten.
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Ein
hoher Grad an Genauigkeit ist insbesondere bei Einsatz in der Vorsorgediagnostik
erforderlich. Die Falschnegativrate muss gering bleiben (hohe Sensitivität),
sodass positive Befunde nicht übersehen und Proben nicht
mit einem falschen Sicherheitsgefühl betrachtet werden.
Jedoch muss die Falschpositivrate ebenfalls gering bleiben (hohe
Spezifizität), da der Anteil von negativen Fällen
in der Vorsorgephase stark vorherrschen wird und jeder falschpositive
Befund zu kostenintensiven Nachfolgeuntersuchungen oder zu einer
absolut unnötigen Therapie führt, wobei die rechtlichen
Konsequenzen nicht erwähnt werden. Keines der routinemäßig
eingesetzten cytopathologischen Diagnostikverfahren bietet zur gleichen
Zeit eine hohe Sensitivität und Spezifität. Außerdem
sind cytopathologische Analysen gewöhnlich zeitaufwändig,
erfordern ein gut ausgebildetes Personal und sind daher kostspielig.
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Das
in
DE 101 28 552 A1 beschriebene
Verfahren hat viele Vorteile. Die Genauigkeit der Diagnose ist auf
das erforderliche Maß durch die Fusion von zellspezifischen
Eigenschaften erhöht, die in einer Reihe von analytischen
Schritten gewonnen werden. Dies wird durch die ergänzenden
Analysen erzielt, die an dem gleichen mikroskopischen Präparat
mittels zwischenzeitlichen Entfärben und Neueinfärben und
durch die Existenz von zu einzelnen Zellen zugeordneten Analysewerten
durchgeführt werden.
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Nichtsdestotrotz
besteht ein Bedarf für ein Zellanalyseverfahren mit hoher
Sensitivität und hoher Spezifizität. Die vorliegende
Erfindung deckt diesen Bedarf.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist ein mikroskopisches Analyseverfahren für
cytologische Präparate, in welchem ein gefärbtes
Zellpräparat nach der Analyse entfernt wird, und dann nach
Neueinfärbung von unterschiedlicher Natur nochmals analysiert
wird. In diesem Verfahren müssen die einzelnen Zellen nach jedem
Neueinfärben präzise zur Deckung gebracht werden.
Die Analyseergegnisse gelten daher nicht pauschal für die
Gesamtheit des Präparats, sondern können individuell
den analysierten Zellen zugeordnet und in einen mehrdimensionalen
zellspezifischen Merkmalsvektor fusioniert werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN
DER ZEICHNUNGEN
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Die
Organisation und die Art und Weise der Struktur und der Durchführung
der Erfindung, zusammen mit anderen Aufgaben und Vorteilen davon,
werden am Besten unter der Bezugnahme auf die folgende Beschreibung
zusammengenommen mit den beigefügten, nicht maßstabsgetreuen
Zeichnungen verstanden werden, wobei gleiche Bezugszeichen, gleiche
Elemente bezeichnen, in denen:
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1 eine
diagrammartige Ansicht der Vorrichtung der bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist.
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2 ein
Diagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist.
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2a ein
Diagramm einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist.
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3 ein
Diagramm einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist.
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4 ein
Diagramm einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist.
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5 ein
Diagramm einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist.
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6 eine
Tabelle der diagnostischen Signifikanz der Ergebnisse der Verfahren
der Ausführungsformen der Erfindung ist.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
DER AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
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Während
die Erfindung in verschiedenen Formen ausgeführt werden
kann, werden spezifischen Ausführungsformen in den Zeichnungen
gezeigt und hierin ausführlich beschrieben, wobei zu verstehen
ist, dass die vorliegende Offenbarung als beispielhaft für
die Prinzipien der Erfindung anzusehen ist, und es nicht beabsichtigt
ist, die Erfindung auf das zu beschränken, was hierin veranschaulicht und
beschrieben wird.
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Die
Verfahren der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung
werden, wie in der 1 gezeigt, bevorzugt auf einem
Mikroskopsystem 20 durchgeführt. Das System 20 enthält
ein Mikroskop 22. In einigen Ausführungsformen
ist das Mikroskop 22 bevorzugt ein Inversionsmikroskop
bzw. Umkehrmikroskop. Das Mikroskop 22 umfasst eine Beleuchtungsquelle 23,
bevorzugt für eine Beleuchtung im sichtbaren Gereicht.
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Eine
motorisierte Bühne 24 und eine Kamera 26 sind
auf dem Mikroskop 22 befestigt. In anderen Ausführungsformen
wird ein Lasergenerator 28 daneben angebracht und mit einer
zentralen Steuerungseinheit 30 gekoppelt. Ein Computer 32,
wie etwa ein PC oder ein ähnlicher Computer, und ein Monitor
oder eine Anzeige 34 ist mit dem Mikroskopsystem 20 gekoppelt.
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Für
die praktische Verwendung in der Pathologie, insbesondere bei der
Diagnose von Krebs, ist es zwingend erforderlich, dass die Funktionalität,
die Verfahrensabläufe und die Anwenderfreundlichkeit des
Analyseverfahrens nicht nur an die speziellen Erfordernisse dieser
medizinischen Disziplin, sondern ebenfalls auf die speziellen Bedürfnisse
der in diesem Gebiet beschäftigten Personen angepasst sind. Außerdem
sollte, neben verschiedenen diagnostischen Vorteilen das Analyseverfahren
wirtschaftlich bleiben, d. h. zeit- und kostensparend. Um diese
Erfordernisse zu erfüllen, wird man mit der Herausforderung
einer weiteren Verfeinerung des für die praktische Verwendung
beschriebenen Basisverfahrens konfrontiert.
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Diese
Herausforderung wird gemäß einem ersten Gesichtspunkt
der Erfindung gelöst, bei dem in einem derartigen Verfahren
eine Gruppe von Präparaten mit zu analysierenden Zellen
unter Verwendung eines Färbemittels eines hochsensitiven
Analyseverfahrens gefärbt wird und dann nur die Präparate mit
positiven Befunden weiterverarbeitet werden, wie in dem Flussdiagramm
in der 2 gezeigt.
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Die
Anwendung dieses Verfahrens für die Zellanalyse gliedert
sich in eine Reihe von Schritten, wobei die Anzahl davon durch die
in den einzelnen Schritten erhaltenden Analyseergebnisse bestimmen wird
(Rekursivität): eine optimale Wirtschaftlichkeit des gesamten
Analyseverfahrens wird erzielt, wenn eine Strategie einer schrittweisen
Einengung der Analyse auf unsichere Befunde eingesetzt wird. Ein Präparat
von Zellen wird auf einen Objektträger (Schritt 201)
gebracht. In einem ersten Verfahrensschritt werden alle untersuchten
Präparate einem hochsensitiven Analyseverfahren unterzogen
(Schritt 203). Ein hoher Grad an Sensitivität
wird im Allgemeinen durch Verringerung des Schwellenwertes erzielt. Dies
minimiert das Risiko des Übersehens von positiven Befunden.
Jedoch erhöht dies zwangsläufig die Anzahl von
Falschpositiven (Fehlalarmen). Der Nutzen kann jedoch in der Tatsache
gesehen werden, dass dieses Verfahren negative Befunde von allen weiteren
Analysen eliminiert. Bevorzugt werden Zellen mit positiven Befunden
(sowohl Richtig- als auch Falschpositive) ausgewählt (Schritt 205).
Nur diese Zellen werden dem weiteren analytischen Schritt des Färbens
mit einem Färbemittel eines hochspezifischen Analyseverfahrens
unterzogen (Schritt 207). Zellen mit positiven Befunden
werden dann ausgewählt (Schritt 209).
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Nachfolgende
Analysen (Schritt 211) erfolgen nur an verbleibenden Präparaten
mit unsicheren Befunden unter Verwendung verschiedener Analyseverfahren,
die, wenn notwendig, das Färben der Präparate
und das Neueinfärben erfordern. Mit dem Voranschreiten
des Analysevorgangs werden die Verfahren so gewählt, dass
der Schwerpunkt von einer hohen Sensitivität auf Kosten
der Spezifität, sich zunehmend zu Gunsten der Spezifität
verschiebt. Die Analysenkette wird erst beendet, wenn alle verbleibenden
Unsicherheiten ausgeräumt oder die Analysemöglichkeiten
ausgeschöpft sind.
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Ein
weiterer Gesichtspunkt der Erfindung, der einen erfinderischen Beitrag
für die Erhöhung der Effizienz darstellt und unabhängig
von der Strategie des schrittweisen Einengens wie vorher beschrieben ist,
ist die Gewinnung einer Auswahl der zu analysierenden Zellen und
die Konzentration von weiteren analytischen Schritten auf diese
Auswahl. Die Zahl der zu analysierenden Zellen kann durch weitere Analysen
nur der ausgewählten Zellen reduziert werden. Außerdem
kann das Auswählen von Zellen eine Kontrollfunktion für
weitere analytische Schritte zur Verfügung stellen. Wie
in der 2a gezeigt, hat dieser Gesichtspunkt
der Erfindung die Schritte des Aufbringens eines Präparats
von Zellen auf einen Objektträger (Schritt 221),
des Färbens der Zellen zur Verwendung eines hochsensitiven
Analyseverfahrens (Schritt 223), des Auswählens
von Objektträgern mit positiven Zellen und Speicherns der
Koordinaten der positiven Zellen (Schritt 225), des Anfärbens
ausgewählter Objektträger unter Verwendung hochspezifischer
Analyseverfahren nur an vorher ausgewählten Zellen (Schritt 227)
und des Auswählens von Objektträgern von positiven
Zellen und Speicherna der Koordinaten dieser positiven Zellen (Schritt 229).
Nachfolgende Analysen (Schritt 231) werden an verbleibenden
Präparaten mit unsicherem Befund unter Verwendung verschiedener
Analyseverfahren, die, wenn notwendig, das Entfärben und Neueinfärben
der Präparate erfordert. Mit dem Fortschreiten des Analysevorgangs
werden die Verfahren so ausgewählt, dass der Schwerpunkt
von einer hohen Sensitivität auf Kosten der Spezifität
sich zunehmend zu Gunsten der Spezifität verschiebt. Die Analysekette
wird erst beendet, wenn verbleibende Unsicherheiten ausgeräumt
oder die Analysemöglichkeiten ausgeschöpft sind.
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In
einer Reihe von aufeinanderfolgenden Analytiseschritten kann die
Effizienz ansteigen und die Signifikanz der Ergebnisse kann erhöht
werden, wenn eine Vorauswahl bereits, wie in 3 gezeigt, innerhalb
der gesamten Kollektion der untersuchten Zellen erfolgt ist. In
dieser Ausführungsform wird ein Voranalyseverfahren durchgeführt,
z. B. einschließlich und nicht beschränkt auf
die Verwendung eines sogenannten immunocytochemischen Markers (z.
B. P16Ink4a oder L1-Virus-Capsid für
den Nachweis von Gebärmutter- oder Gebärmutterhalskrebs),
wie hiernach ausführlicher beschrieben wird.
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Wie
in der 3 gezeigt, wird ein hochsensitives Präparat
von Zellen auf einen Objektträger aufgebracht (Schritt 301).
Es werden Zellen vorausgewählt und ihre Koordinaten werden
gespeichert (Schritt 303). Die Objektträger werden
dann unter Verwendung eines spezifischeren Analyseverfahrens gefärbt
(Schritt 305). Zellen mit positiven Befunden werden ausgewählt
(Schritt 307). Nachfolgende Analysen (Schritt 309)
werden nur an verbleibenden Präparaten mit unsicheren Befunden
unter Verwendung verschiedener Analyseverfahren durchgeführt,
die, wenn notwendig, das Entfärben und Neueinfärben der
Präparate erfordern.
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Hier
können zellbezogenen Ergebnisse des entsprechenden vorhergehenden
Analyseschritts herangezogen werden, wie etwa die Klassifizierung
gemäß dem Zelltyp, das Ansprechen auf einen immunocytochemischen
Marker, eine durch Segmentierung nachgewiesene auffällige
Zellkernmorphologie oder eine auffällige Konzentration
von benachbarten Zellen. Wenn gemäß diesem Verfahren,
sogenannte „Interessenbereiche" („regions of interest";
ROIs) und/oder sogar einzelne Zellen identifiziert und ihre Koordinaten
zu der Begleitinformation der zu speichernden Bilder hinzugefügt
werden, können die weiteren Analysen auf die identifizierten
Zellen konzentriert oder gar beschränkt werden. Diese Zellen
können ebenfalls eine Steuerungsfunktion einnehmen, wie
etwa die für bestimmte analytische Vorgänge notwendige
Aufteilung in Analysezellen und Bezugszellen.
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Die
Zellauswahl und gegebenenfalls die Klassifikation können
manuell unter visueller Kontrolle durchgeführt werden:
Bilder werden an der gewünschten Mikroskopposition aufgenommen,
wobei der Bediener z. B. einen Joystick oder einen Fußknopf
bedient. Wenn notwendig, können einzelne Zellen mit der
Hilfe eines interaktiven Elements, wie etwa einem Joystick oder
einer Maus, einem Rollball oder einem Graphiktablett registriert
werden. Alle diese Vorgänge können auf einem Computerbildschirm 34 durchgeführt
werden, der ständig Informationen von der Kamera 26 erhält,
oder auf welchem das aufgenommene oder nachfolgend digitalisierte Standbild
angezeigt wird. Ein durch den verbundenen Computer 32 erzeugtes
Bild kann in den Strahlengang des Mikroskops 22 integriert
werden, wodurch die Position eines interaktiv positionierten Zeigers
oder Fadenkreuzes dem optischen Mikroskopbild überlagert
wird.
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Ein
weiterer Gesichtspunkt für die Erhöhung der Effizienz
der Anwendung des Zellanalyseverfahrens, der unabhängig
von den vorher aufgelisteten Verfahrensschritten existiert, ist
dass eine Gruppe von Präparaten mit zu analysierenden Zellen
einem automatischen Analyseschritt unterzogen wird. Zum Beispiel
ist in dieser Ausführungsform der erste Analyseschritt 303 des
Verfahrens der 3 automatisiert. Es ist hierbei
vorteilhaft, wenn der automatische Analyseschritt als eine Voranalyse
verwendet wird, um verdächtige Zellen anzuzeigen. In einer
Ausführungsform ist die Verwendung von sogenannten immunocytochemischen
Markern (z. B. P16Ink4a oder L1-Virus-Capsid
für den Nachweis von Gebärmutter- oder Gebärmutterhalskrebs)
in der Anfangsphase der Analyse signifikant. Da die Wirkung dieser Markersubstanzen
die klare Markierung von Zellen beim leichtesten Verdacht einer
malignen Transformation oder deren Vorstufe ist, kann die beabsichtigte
Vorauswahl mit einem hohen Grad an Automatisierung durchgeführt
werden. Insbesondere können derartige Marker-Demonstrationen
automatisch mit digitalen Mikroskopen abgesucht werden (dies sind Vorrichtungen,
in welchen die Vergrößerungsoptiken auf die Interaktion
mit einer Digitalkamera optimiert sind und in welchen die Okulare
für die direkte Betrachtung entfernt sein können).
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Insbesondere
wenn die Markereigenschaften eine ausgiebige Färbung des
Zellkerns und/oder des Cytoplasmas im Fall einer positiven Reaktion einschließen,
welches der Fall bei der Markersubstanz P16Ink4a ist,
kann ein für die Dimensionen von herkömmlichen
Mikroskopobjektträgern optimierter Linearscanner verwendet
werden. Bei dieser Art von Scanner wird die zweidimensionale Sensoranordnung,
das gewöhnliche Grundelement der Digitalkamera 26,
durch eine hochauflösende lineare Sensoranordnung (Zeilensensor)
ersetzt, welche in der Lage ist, die interessierende Präparatoberfläche
mit einer einzig linearen Bewegung rechtwinklig zur Sensorachse
abzutasten.
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Anstelle
eines einzeiligen Sensors kann auch ein mehrzeiliger Sensor oder
eine Kombination von parallel zueinander angeordneten mehrzeiligen Sensoren
eingesetzt werden, sodass der Fächer des durch das Präparat
tretenden Lichts z. B. durch ein Prisma aufgespalten wird und über
Filter für verschiedene Teile des Spektrums zu den einzelnen
Sensorzeilen ausgelenkt wird, sodass gleichzeitig ein mehrkanaliges,
z. B. ein spektral differenziertes Bild, aufgenommen wird.
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Obwohl
die mit Lichtmikroskopen erreichbare optische Auflösung
technisch noch nicht mit den derzeit vorhandenen Zeilensensoren
erreicht werden kann, vereinfacht die Reduktion auf eine kontinuierliche
lineare Bewegung zwischen Optiken und Präparat anstelle
einer zweidimensionalen Schrittbewegung beträchtlich die
Mechaniken und beschleunigt das Abtasten.
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Unabhängig
von den verschiedenen Schritten für die Erhöhung
der Effizienz, ist ein wesentlicher beabsichtigter Gesichtspunkt
eine Verbesserung der Verfahrenstechnik. Dies wird durch einen weiteren
Gesichtspunkt der Erfindung erzielt, wobei das erste digitale Bild
und das zweite digitale Bild zur Deckung gebracht werden, in dem
durch Zusammenführen bzw. Fusion lokaler Bilddaten ein
Feinabgleich erzielt wird.
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Wenn
ein ausgewähltes Präparat einer nachfolgenden
Analyse unterzogen wird, sollten nicht nur die in der vorhergehenden
Analyse festgelegten Regionen wieder untersucht werden. Vielmehr
sollten auch die in den vorhergehenden Untersuchungen identifizierten
Zellen ebenfalls wieder untersucht werden, und sogar mit der Präzision
der optischen Auflösung zur Deckung gebracht werden. Bei
einer gewünschten Präzision der Ausrichtung in
der Größenordnung einer halben Wellenlänge
des Lichts, ist dies allein mechanisch unpraktikabel und extrem
teuer.
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Hier
führt bei tolerierbarem finanziellem Aufwand die Interaktion
zwischen mechanischen und digitalen Einstellungsmechanismen zu dem
gewünschten Erfolg. Es ist bereits bekannt, dass durch
eine computergesteuerte Bewegung des Mikroskoptisches 24 die
erwünschte Position zunächst mit der mechanischen
Toleranz des Tischpositionierungsmechanismus angesteuert werden
kann. Das Verfahren sucht dann nach Entsprechungen in der Konstellation
der Zellen oder Zellkerne zwischen dem aktuellen Kamerabild und
dem in dem vorhergehenden Analyseschritt gespeicherten Bilden. Von
dem linearen, ggf. winkelmäßigen Versatz zwischen
den Bildern wird ein Verschiebungs- und wenn notwendig auch ein
Rotationsvektor berechnet, mit welchem die Tischposition mechanisch
korrigiert wird. Ein dritter Schritt schließt einen digitalen
Feinabgleich unter Verwendung der bekannten Verfahren der digitalen Bildverarbeitung
ein.
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Ein
derartiger Feinabgleich, welcher die Gleichmäßigkeit
der Deckungsgleichheit des Bildes einer Zelle in verschiedenen Färbungen
auf die Präzision der optischen Auflösung bringt,
ist ein notwendiges Erfordernis, wenn über die Fusion von
lokalen Bilddaten hinaus die Fusion lokaler Bilddaten für
die Verbesserung von lokal vorbereitenden Bildanalyseverfahren genutzt
werden soll. Die Segmentierungsverfahren, wie z. B. die Identifizierung
des Verlaufs der Zellkernmembran oder die Beschreibung von Cytoplasmagrenzen,
können davon profitieren.
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Zum
Beispiel ist die Zellkernmembran besser bei einer Feulgen-Färbung
zu identifizieren, während die Cytoplasmamembrangrenze
leichter in einer MGG- oder Papanicolaou-Färbung zu identifizieren ist.
Außerdem kann die Analyse der Feinstrukturierung bestimmter
Zellbereiche auf der Basis eines mehrdimensionalen Bildvektors aus
den Bildpunktwerten der verschiedenen Färbungen aufschlussreichere
Zusatzinformationen zu Verfügung stellen. Es ist folglich
vorteilhaft, wenn die Feinstrukturierung bestimmter Zellbereiche
auf der Basis eines mehrdimensionalen Bildvektors aus den Bildpunktwerten verschiedener
Färbungen analysiert wird.
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In
einer speziellen Ausführungsform kann das Einstellungsverfahren
hierarchisch über nacheinander aufgenommene Bildsätze
vorgenommen werden, in dem das erste digitale Bild und das zweite digitale
Bild zur Deckung gebracht werden, indem zunächst ein größerer
Bereich, aufgenommen bei geringerer Auflösung, und dann
ein kleinerer Bereich, aufgenommen bei einer höheren Auflösung,
erfasst wird.
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Es
ist hierbei vorteilhaft, wenn Mikroskopobjektträger mit
Gittern oder Markierungen, wie etwa eingravierten Linien, verwendet
werden.
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Ein
spezielles Problem können Zellen sein, die sich während
dem Entfärbe- und Neufärbeverfahren von ihrer
ursprünglichen Position lösen und an einer anderen
Position wieder abgelagert werden. Diese Zellen werden als „Schwimmer"
bezeichnet. Als ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung wird daher vorgeschlagen,
dass die Zellen, die von ihrer ursprünglichen Position
während eines Färbeverfahrens gelöst
werden, durch Suchen sowohl nach fehlenden als auch überzähligen
Objekten und Suche nach einem entsprechenden Objekt, erfasst werden. Gemäß der
Erfindung können „Schwimmer" folglich durch Suchen
sowohl nach fehlenden als auch überzähligen Objekten
bei einer Untersuchung der Übereinstimmungen der Zell-
oder Zellkernkonstellation, wie vorher erwähnt, erfasst
werden. Wenn ein entsprechendes Objekt auf der Grundlage von morphologischen
Merkmalen gefunden werden kann, können z. B. die diagnostisch
relevanten Merkmale ebenfalls für diese Zellen fusioniert
werden.
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Ein
weiterer Gesichtspunkt der Erfindung stellt eine histologische Untersuchung
zu Verfügung, in welcher der zu analysierende Gewebebereich
festgelegt wird. Die Erfindung betrifft folglich eine Verbindung
des Verfahrens mit der Histologie für den Zweck der Erlangung
von präziseren histologischen Befunden. Eine nachfolgende
cytologische Untersuchung folgt somit einer histologischen Untersuchung.
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In
diesem Fall ist die Abfolge allgemein wie folgt: eine Gewebeprobe
wird in Formalin fixiert und dann in Parafin eingebettet. Von diesem
Gewebeblock wird ein Dünnschnitt abgetragen, in welchem die
Zellen unter dem Mikroskop z. B. nach HE-Färbung bewertet
werden. Normalerweise werden ROIs (Interessenbereiche; „regions
of interest") mit einem Stift auf der Abdeckplatte „umrandet".
Diese im Allgemeinen sehr groben Abgrenzungen der ROIs werden auf
die Oberfläche des Gewebes übertragen und mit einem
Skalpell eingeschnitten. Ein Schnitt mit Abmessungen von etwa 50–70 μm
Dicke wird dann entfernt, von welchem die ROIs als ein Ergebnis
des vorher durchgeführten Einschneidens der ROI-Abgrenzungen
abgelöst werden können. Die Zellen von diesem
Abschnitt werden enzymatisch isoliert, die Zellkerne isoliert, auf
einem Glasmikroskopobjektträger für cytologische
Untersuchung aufgebracht und einer Zellkernanalyse z. B. nach einer
Feulgen-Färbung unterzogen.
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Bei
einem derartigen Verfahren ist es vorteilhaft, wenn die Zellen klassifiziert
werden. Die Ergebnisse einer nachfolgenden Zellkernanalyse sind
besonders aufschlussreich, wenn das Kollektiv der auf diese Weise
gesammelten Zellen als verdächtige Proben, insbesondere
die von Unterbereichen des Gewebeabschnitts, die enger eingegrenzt
werden können, sowohl normale Zellen als auch Bezugszellen
klassifiziert werden kann.
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Da
die Ortsinformation im Zellisolierungsverfahren verloren geht, werden
wenn notwendig erfindungsgemäß ebenfalls materialspezifische
Zellkerneigenschaften, in einer Klassifizierung verwendet. Dies
können morphologische Besonderheiten sein, für
welche die Kriterien mittels einer Analyse signifikanter Kernformeigenschaften
(Kernoberfläche, Ovalität, Nucleolengrößen,
usw.) von interaktiv in dem histologischen Präparat ausgewählter
Zellen etabliert, sodass Zellkerne von vergleichbarer Form automatisch
in dem cytologischen Präparat angeordnet werden können.
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Es
ist vorteilhaft, wenn die zu analysierenden Zellen aus dem cytologischen
Präparat mit einem computergesteuerten Skalpell entfernt
werden können. Das Nachfahren von markierten Abgrenzungen unter
dem Mikroskop mit einem Skalpell, das für die Entfernung
der vorher erwähnten ROIs erforderlich ist, kann ebenfalls
computergestützt durch interaktive Eingabe von Abgrenzungen
und den durch Computer gesteuerten Skalpell erfolgen. Auf diese
Weise können die ROIs präziser abgegrenzt werden,
was es ermöglicht, dass der Anteil der Zellkerne aus den diagnostisch
relevanten Bereichen in dem resultierenden Material relativ erhöht
wird.
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Ein
letzter Schritt eines Analyseverfahrens kann die – gegebenenfalls
mechanische – Herauslösung von Einzelzellen für
den Zweck der molekularbiologischen Analyse (z. B. einer DNA-Analyse
mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)) sein. Dies geschieht
konventionell, indem die gewünschte Zelle, nachdem das
Deckglas entfernt ist, von dem Mikroskopobjektträger mit
einer Mikropräparationsnadel unter visueller mikroskopischer
Kontrolle abgetrennt wird und dann die Zellen mit einem Kapillarröhrchen,
das direkt über ihnen angeordnet ist, aufgesaugt werden.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird dieses Verfahren durch
eine Zellanalysevorrichtung gestützt, die es erlaubt, die
Zellen computergestützt automatisch anzusteuern. Die von den
vorhergehenden Untersuchungen bekannte gewünschte Position
wird hierbei verwendet.
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Ein
weiterer Gesichtspunkt der Erfindung, welcher ebenfalls unabhängig
von den vorgeschriebenen Maßnahmen erfinderisch ist, sieht
vor, dass auf die an den Objektträger anhaftenden Zellen
ein Material aufgebracht wird, dessen Adhäsionseigenschaften
mit einem Laserstrahl erhöht werden, und dass die Koordinaten
von vorher ausgewählten Zellen mit einem positionssteuerbaren
Laser angesteuert werden.
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Die
Zeit und die Ausgaben für eine molekularbiologische Analyse
von einer oder einigen wenigen Zellen sind allgemein nur für
die Forschung berechtigt. Die Zeit und die Ausgaben können
reduziert werden, wenn größere Kollektive von
Zellen erhältlich sind. Erfindungsgemäß wird
dies durch die folgenden Maßnahmen erzielt: wenn die zusammen
zu platzierenden Zellen identifiziert und ihre Koordinaten markiert
sind, wird das Deckglas entfernt. Ein Material, wie etwa z. B. eine
Folie, deren Oberfläche adhäsiv wird, wenn sie
einer moderaten Erwärmung unterzogen wird, wird dann auf
das Präparat gegeben. Diese Adhäsivität
bzw. Haftwirkung kann durch Beschichten des Films mit einen in bekannten
Heißklebern verwendeten Material erzielt werden. Der Effekt kann
ebenfalls in der Folie selbst liegen, wenn sie z. B. aus einem Material
hergestellt wird, das in der Schmelzphase adhäsive Eigenschaften
entwickelt.
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Durch
ein punktuelles Erwärmen mittels eines positionsgesteuerten
Lasers bei den Koordinaten der vorher ausgewählten Zellen,
kann dieser Effekt für die Anheftung der Zellen an die
Folie verwendet werden. Nach diesem Schritt wird die Folie abgehoben
und die damit abgehobenen Zellen werden entfernt und für
die weitere Analyse eingesammelt. Die Folie kann für die
maximale Absorption der Laserstrahlenergie und den kontinuierlichen
Schutz der Zellen pigmentiert sein. Die Positionssteuerung des Laserstrahls
kann durch Integrieren der Strahlführung in das Analysemikroskop
realisiert werden.
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Ein
weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist die Erhöhung der
Gebrauchstauglichkeit und der Akzeptanz der neuen Verfahren durch
ein verbessertes funktionelles Design des technischen Konzepts.
Es sollte in Betracht gezogen werden, dass Pathologen sehr vielseitige
Instrumente für ihre Arbeit benötigen. Die Verwendung
eines Datenbank-basierten Arbeitsplatzsystems wird daher unabhängig
von den vorher beschriebenen Gesichtspunkten der Erfindung vorgeschlagen.
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Technisch
ausgedrückt eröffnet die Anwendung der in der
Erfindung beschriebenen Verfahren unter Nutzung aller beschriebenen
Optionen und Modifikationen einen mehrdimensionalen Merkmalsraum,
den der Pathologe in der Lage sein sollte fallabhängig
zusammenzustellen. Dies erfordert digitale Arbeitsplatzsysteme,
die gemäß der Verwendung ausgestattet sind und,
wenn notwenig, durch eine zweckmäßige digitale
Infrastruktur unterstützt werden.
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Derartige
Arbeitsplatzsysteme können geschlossene Vorrichtungen sein,
die einen Arbeitsplatzrechner und ein digital steuerbares Mikroskop, ausgestattet
mit einer Digitalkamera, umfassen. Sie können ebenfalls
Komponenten eines Netzwerks von verteilten Arbeitsplatzsystemen
sein. Diese können für Teilaufgaben des gesamten
Analyseverfahrens, wie etwa Vorauswahl, Analyse mit oder ohne visuelle interaktive
Kontrolle oder Bewertung der Analyseergebnisse und Erstellung der
Befunde auf der Grundlage der konsolidierten Analyseergebnisse und begleitender
Information spezialisiert sein. Die Arbeitsabläufe können
durch vernetzte Zentralsysteme für die Organisation, die
Ablaufsteuerung, die Archivierung von Bildern und Daten, die Buchhaltung,
als auch die Kommunikation mit externen Systemen (zentrale Krankenhausinformationssysteme,
PACS, Telemedizin-Netzwerke) unterstützt, und, wenn notwendig,
im Sinne einer Arbeitsflussarchitektur gesteuert werden.
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Die
Architektur des Arbeitsplatzsystems ist datenbankbasiert, wobei
die Datenbank als ein lokaler oder zentraler Netzwerkserver realisiert
sein kann. Neben anderen Funktionen ermöglicht die Datenbank
das Aufzeichnen aller aufgenommenen Bilder und ihrer Begleitinformationen.
Diese enthalten primär die Identifikationsdaten der Präparate,
die Koordinaten aller durchgeführten Aktionen an dem Präparat
und in den Bildern, als auch alle Analysedaten, wie z. B. Konturen,
Messwerte und Klassifizierung.
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Die
Analysefunktionen sind bevorzugt modular ausgelegt. Sie greifen
auf ein gemeinsames Repositorium an Grundfunktionen, wie etwa Bildbearbeitungen,
graphische Darstellungssobjekte, Interaktionselemente und I/O-Funktionen
zu. Die Softwareplattform kann als ein spezialisiertes Betriebssystem verstanden
werden, das auf einem Standartbetriebssystem basiert. Diese Architektur
erlaubt zum einen den gleichmäßigen und kontinuierlichen
Betrieb von verschiedenen Funktionsmodulen und zum anderen die Anzeige
ihrer verschiedenen Analyseergebnisse.
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Das
Arbeitsplatzsystem bietet Möglichkeiten, Funktionsabläufe
abhängig von der fallspezifischen Fragestellung festzulegen
und die Ergebnisdarstellung jeweils zweckmäßig
zu gestalten. Dies kann auf der Grundlage des verwendeten Materials
(z. B. Gebärmutterhalsabstriche, Feinnadel-Aspirationsbiopsien
der Prostata oder des Pankreas, Urin oder Bronchialsekret), der
Art des zu verwendenden Analyseverfahrens (z. B. DNA-Bildcytometrie,
Immunocytochemie, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), AgNOR-Analyse,
Chromatinmusteranalyse), dem eingesetzten Färbungsverfahren
(z. B. MGG, Papanicolaou, Pararosanilin, Thionin, AEC, Texasrot,
Fluoreszein), den verwendeten Markern (z. B. p16, Ki67, BerEP4,
L1-Kapsid, Chromosom-1), der zu analysierenden Zellkompartimente
(z. B. Zellkern, Nucleoli, Cytoplasma), dem diagnostischen klinischen
Ziel (z. B. Tumorart, gutartig/bösartig, Grad der Bösartigkeit, Lokalisation
des Primärtumors, wenn Metastasen beteiligt sind), dem
mikroskopischen Vorgang (z. B. Durchlicht, Dunkelfeld, Fluoreszenz),
dem diagnostischen „Algorithmus" (z. B. Prozentsatz von
positiven Zellen, Anzahl von AgNORs, DNA-Stammlinienploidie und
Größer-9c-Rate, Anzahl von Zellen ohne Chromosom-1)
und schließlich ausführbarer oder gewünschter
Grad der Automation (z. B. visuell-interaktiv, computergestützt,
halbautomatisch, vollautomatisch) basieren.
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Die
Ergebnisse können in der Form von numerischen Werten, Tabellen,
Histogrammen oder Klassengruppierungen präsentiert werden.
Die Steuerung des Verfahrensablaufs kann durch die Verwendung einer
symbolischen Darstellung aller Vorgänge auf einem sogenannten „virtuellen
Objektträger" (eine digitale Darstellung des mikroskopischen
Objektträgers) vereinfacht werden.
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Die
Erfindung beschreibt eine Vielzahl von Maßnahmen, die den
Prozess der Zellanalyse optimieren, wie in der 4 gezeigt,
in welchen Zellen haftend auf einen Objektträger (Schritt 401)
gebracht werden, die Zellen werden mit einem Färbemittel
gefärbt (Schritt 403), ein erstes digitales Bild
der auf den Objektträger gebrachten gefärbten
Zellen wird genommen und das erste digitale Bild wird gespeichert (Schritt 405),
die selben Zellen werden, nachdem das erste digitale Bild genommen
ist, auf dem selben Objektträger mit einem zweiten Färbemittel
behandelt (Schritt 407), das eine optisch messbare Eigenschaft der
Zellen ändert, und ein zweites digitales Bild der auf den
Objektträger gebrachten Zellen wird aufgenommen und gespeichert
(Schritt 409). Die individuellen Maßnahmen sind
unabhängig voneinander erfinderisch. Fachleute können
eine Fülle von Neuerungen, deren praktische Anwendung leicht
verständlich ist, aus der Beschreibung entnehmen. Daher
verzichtet dieses Dokument darauf, eine Vielzahl von Ausführungsformen
für die einzelnen Gesichtspunkte der Erfindung zu präsentieren.
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Der
Grundgedanke der Erfindung wird jedoch durch eine diagrammartig
in der 5 dargestellte, bevorzugte Ausführungsform
veranschaulicht, die zur Diagnose eines malignen Mesothelioms oder
eines metastasierenden Krebses bzw. Karzinoms unter Verwendung einer
Sammlung von wenigen Zellen aus einem Körperhöhlenerguss
dient.
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Ein
Beispiel für eine medizinische Aufgabenstellung, in welcher
die erfindungsgemäße Vorrichtung vorteilhaft eingesetzt
werden können, ist die Frühdiagnose von Rippenfellkrebs
(malignes Mesotheliom) als auch bei der Differenzierung dieser Krankheit
von einem metastasierenden Karzinom an Zellmaterial, das aus einem
Körperhöhlenerguss gewonnen werden kann. Um einen
besonders hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit zu erzielen,
können bis zu vier aufeinanderfolgende analytische Schritte
eingesetzt werden, die jeweils auf der Behandlung von mikroskopischen
Zellpräparaten mit unterschiedlichen Färbemitteln
oder Markerdarstellungen basieren. Zunächst wird ein Zellenpräparat aus
einem Körperhöhlenerguss genommen (Schritt 501).
Es reichen gerade einmal 100 Zellen aus, in welchen eine geeignete
Konstellation von Analyseergebnissen durch die im Folgenden beschriebene Analysekette
gefunden wurden, um eine der vorher angegebenen Diagnosen zu geben,
wie eine medizinische Studie bestätigt hat (Pomjanski
N et al., Early Diagnosis of Mesothelioma in Serous Effusions Using
AgNOR Analysis; ANALYTICAL AND QUANTITATIVE CYTOLOGY AND HISTOLOGY,
23 Nr. 2 (2001) pp 152–159) (die Offenbarung davon
wird hierin durch Bezugnahme aufgenommen).
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Die
Analyse des Zellmaterials beginnt mit einer Papanicolaou-Färbung,
welche sowohl den Zellkern als auch das Cytoplasma färbt
(Schritt 503). Diese Färbung ist besonders gut
für die visuelle Bewertung der Zellmorphologie geeignet.
In diesem analytischen Schritt wird das mikroskopische Präparat
visuell untersucht. Auffällige Zellen werden registriert, d.
h. wenn eine oder mehrere Zellen in einem Sichtfeld vorhanden sind,
wird ein Interaktionselement, wie etwa ein Joystick 4 oder ein Fußknopf,
aktiviert, durch welchen eine Koordinatenmessprozedur, und, wenn
notwendig, eine Digitalbildgebung, ausgelöst werden (Schritt 505).
Die Verwendung eines automatisierbaren morphometrischen Verfahrens
für das Präscreenen auf morphologisch auffällige
Zellen kann ebenfalls als eine Möglichkeit betrachtet werden
(Schritt 507). Dieses Verfahren ist eine Sammlung von digitalen
Bildanalyseverfahren, in welchen nach einer Zellkern- und/oder Cytoplasma-Segmentierung
aus den Konturverläufen Maße abgeleitet werden,
um die Form und strukturelle Eigenschaften zu charakterisieren.
Eine automatische Klassifizierungsvorrichtung kann in Anspruch genommen
werden, um die Zellen gemäß der Zellart zu klassifizieren und
sie gemäß dem Grad ihrer Verdächtigkeit
auf der Grundlage von morphometrischen Charakteristiken zu differenzieren
(509). Präparate ohne verdächtige Merkmale
werden nach diesem Schritt verworfen.
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Nachdem
das Deckglas abgehoben ist, wird das Präparat entfernt
(Schritt 511) und dann mit einem immunocytochemischen Marker – Calretinin oder
BerEP4 – präpariert (Schritt 513). Calretinin färbt
nur mesotheliomale Zellen, während BerEP4 nur Zellen von
epithelialer Herkunft färbt, folglich die meisten Krebszellen.
Die vorher als morphologisch verdächtig markierten Zellen
können nun auf ihre Markerpositivität untersucht
werden (Schritt 515). Wenn notwendig, kann das gesamte
Präparat auf markerpositive Zellen untersucht werden. Dieses Vorgehen
kann automatisch erfolgen, weil markerpositive Zellen leicht von
markernegativen Zellen unterschieden werden können. Die
auf diese Weise markierten und identifizierten Zellen können
individuell in den nachfolgenden analytischen Schritten angefahren
werden. Im Fall von Markerpositivität von morphologisch
verdächtigen Zellen, werden eine nachfolgende DNA-Cytometrie
(Hinweis auf Polyploidisierung, 3. analytischer Schritt) als auch
eine AgNOR-Analyse (Kriterium: mehr als 4,5 AgNORs pro Zellkern
im Medium, 4. analytischer Schritt) durchgeführt (Schritt 517).
Die nachfolgenden analytischen Schritte dienen der Bestätigung
der vorläufigen Diagnose „malignes Mesotheliom"
im Fall von Claretinin-Positivität (Pomjanski et
al, 2001), während in dem Fall von BerEP4-Positivität
von Zellen in dem Ergusssediment diese dazu dienen, die vorläufige
Diagnose von metastasierenden Karzinomzellen (Motherby et
al, 1999) zu bestätigen.
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Nach
erneutem Entfärben (Schritt 519) wird das Präparat
mit einem Feulgen-Färbemittel präpariert (Schritt 521),
das stöchiometrisch mit der DNA des Zellkerns reagiert.
Dies dient dem Zweck der Bestimmung des DNA-Gehalts (Schritt 523)
welcher einen Indikator für eine ggf. erfolgte oder sich
entwickelnde Transformation der Zelle zu einer Tumorzelle darstellt.
Zellen, die nach den Ergebnissen der bereits durchgeführten
Analysen einer weiteren Klassifizierung bedürfen, werden
automatisch unter dem Mikroskop angefahren, ihre Zellkerne werden
segmentiert und eine integrale Messung der optischen Dichte wird
innerhalb der lokalisierten Kontur durchgeführt. Nach verschiedenen
bekannten Kalibrierungs- und Korrekturprozeduren wird der DNA-Gehalt
der Zelle aus dieser Messung bestimmt.
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Es
kann notwendig sein, die in der vorherigen Analyse identifizierten
verdächtigen Tumorzellen weiter zu differenzieren und zu
typifizieren. Dabei kann die Analyse der AgNORs eine Rolle spielen. AgNORs
sind Kernproteine, wobei ihre Anzahl, Größe und
Anordnung Informationen über das Vorhandensein oder Aggressivität
eines Tumors zur Verfügung stellen kann. Nach dem erneuten
Entfärben (Schritt 525), wird das Präparat
mit einer Silbersalzlösung behandelt (Schritt 527).
Die silberbindenden AgNORs werden braun gefärbt. Innerhalb
der Zellkerne der untersuchten Zellen wird nun eine Segmentierung
der silbergefärbten AgNORs durchgeführt. Die Bewertung
der Zellkontur, erhalten in dem vorhergehenden analytischen Schritt,
hat eine unterstützenden Funktion, da diese Zellkontur
nur schwach bei der vorliegenden Färbung sichtbar ist. Eine
Segmentierung der Nucleoli innerhalb der Zellkontur, die vorteilhaft
in der Feulgen-Färbung durchgeführt wird, ist
hilfreich, weil die Detektion der Nucleoli-Konturen relevante zusätzliche
Informationen für die Differenzierung der AgNORs zur Verfügung stellt.
Nach der Identifizierung und Segmentierung der AgNORs (Schritt 529)
wird die Oberfläche gemessen (Schritt 531). Es
wird dann sichergestellt, ob ein AgNOR einzeln („Satellit")
oder in einer Gruppe („Cluster") auftritt (Schritt 533).
Dieser Analyseschritt wird ebenfalls automatisch durchgeführt.
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Die
diagnostische Bedeutung der Ergebnisse der abgelaufenen Analysekette
wird in der in 6 dargestellten Tabelle zweckmäßig
gezeigt.
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Eine
klare Diagnose von Mesotheliom oder Krebs kann nicht auf der Grundlage
der Ergebnisse eines analytischen Schritts allein erfolgen. Wie
auch in anderen Anwendungen mit einer an das diagnostische klinische
Ziel angepassten Auswahl und Kombination von analytischen Verfahren,
begründet dies einen diagnostischen Fortschritt, der durch
die Verwendung eines Verfahrens und einer Vorrichtung gemäß der
Erfindung erzielt werden kann.
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Während
bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
gezeigt und beschrieben werden, ist es verständlich, dass
Fachleute verschiedene Modifikationen der Erfindung ohne Abweichen vom
Geist und Umfang der beigefügten Ansprüche entwerfen
können.
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Zusammenfassung
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Die
Erfindung beschreibt ein Verfahren der Zellanalyse, in welchem die
zu analysierenden Zellen haftend auf einem Objektträger
gebracht werden und mit einem ersten Färbemittel angefärbt
werden. Ein erstes digitales Bild der gefärbten, auf den
Objektträger gebrachten Zellen wird dann aufgenommen und gespeichert.
Nachdem das erste digitale Bild aufgenommen wurde, werden dieselben
Zellen auf dem Objektträger mit einem zweiten Färbemittel
in einer Weise behandelt, dass sich ihre optisch messbaren Eigenschaften ändern.
Dann wird ein zweites digitales Bild der auf den Objektträger
gebrachten Zellen aufgenommen und dann gespeichert. Erfindungsgemäß wird
eine Gruppe von Präparaten mit zu analysierenden Zellen
zunächst mit einem Färbemittel eines hochsensitiven
Analyseverfahrens gefärbt und dann nur die Präparate
mit positiven Befunden weiterverarbeitet.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102006038 [0001]
- - DE 10128552 [0003]
- - DE 10128552 A1 [0008]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Pomjanski
N et al., Early Diagnosis of Mesothelioma in Serous Effusions Using
AgNOR Analysis; ANALYTICAL AND QUANTITATIVE CYTOLOGY AND HISTOLOGY,
23 Nr. 2 (2001) pp 152–159 [0062]
- - Pomjanski et al, 2001 [0064]
- - Motherby et al, 1999 [0064]