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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bewerten der Qualität der Präparation
von Probenträgersätzen und
Proben, und insbesondere auf einen automatisierten Tester für die Population
von biologischen Proben, die auf Probenträgern fixiert und präpariert
sind.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die Erkennung von Krankheitsprozessen,
für die
eine Probe genommen wird, kann dann nicht möglich sein, wenn die Probenpräparationen,
wie die Fixierung oder Färbung
("staining") nicht korrekt oder
unterschiedlich sind. Demnach besteht ein Bedürfnis, biologische Proben bereitzustellen,
die mindestens ein minimales Qualitätsniveau besitzen, um eine
höhere
Wirksamkeit der Krankheitsfeststellung bereitzustellen. Ein Verfahren
zum Bewerten von Probenpräparationen
stellt sicher, dass Proben unter der Verwendung von Techniken und
Material präpariert
werden, die ein gewünschtes
Qualitätsniveau
bereitstellen, um das Ermitteln von interessierenden Krankheitsprozessen
zu ermöglichen.
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Weiterhin kann beim derartigen Bewerten
auch festgestellt werden, ob präparierte
Proben für
eine Untersuchung mit einem Computer geeignet sind. Die Bewertung
kann so eingestellt werden, dass Anforderungen für ein ausgewähltes automatisiertes
System erfüllt
werden. Des weiteren kann das Bewerten Informationen über die
Probenpräparation
und physikalische Eigenschaften beinhalten, die verbessert werden
müssen.
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Probenpräparationen beeinflussen Eigenschaften
von Proben, einschließlich
morphologischer Details der Zellen. Morphologische Details der Zellen
in biologischen Proben müssen
intakt bleiben und für
visuelle oder computergestützte
Untersuchungen der biologischen Proben sichtbar gemacht werden,
um effektiv zu sein. Das Färben
("staining") macht die fixierten
zellulären
Strukturen sichtbar. Unsachgemäßes Fixieren
von Proben gestattet es der Zellmorphologie, sich zu verändern und
zu degenerieren. Unsachgemäßes Färben ("staining") kann zelluläre Details
verdecken oder zelluläre
Strukturen nicht sichtbar machen. Die Bewertung sollte feststellen,
ob die Probenpräparation
in einer solchen Weise durchgeführt
wird, dass gute Fixierung und Färbung
der Zellen für
visuelle Untersuchung oder Analyse durch automatisierte Vorrichtungen
bereitgestellt wird. Siehe zum Beispiel die Einleitung zu "Diagnostic Cytopathology
of the Uterine Cervix",
S. 1–9,
von S. Patten, und "Sensitivity
and Specificity of Routine Diagnostic Cytology" von S. Patten in "The Automation of Uterine Cancer Cytology", S. 406–415, herausgegeben
von Wied, Bahr und Bartels. Gegenwärtig werden Probenpräparationen
periodisch durch menschliche visuelle Betrachtung geprüft.
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Wie in den oberhalb angegebenen Fundstellen
beschrieben wird, ist das Zusammenstellen von Proben oder "sampling" ein anderes Charakteristikum,
welches eine starke Auswirkung auf die diagnostische Nutzbarkeit
von Proben hat. Wenn die Probe aus dem falschen anatomischen Ort
oder mit schlechter Technik entnommen würde, ist es möglich, dass
das richtige Spektrum von Zelltypen nicht vorhanden ist. Die Bewertung
sollte feststellen, ob das Zusammenstellen von Proben eine gute
Auswahl von Zellen für
die Untersuchung bereitstellt.
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Physikalische Charakteristiken von
Probenträgern
sind wichtig für
die automatisierte Untersuchung von biologischen Proben. Physikalische
Charakteristika, wie die Dicke eines Probenträgers, die Ausrichtung eines
Deckglases oder die Markierung eines Probenträgers, müssen innerhalb vorher festgelegter
Parameter liegen, um eine effektive Bildaufnahme und computergestützte Untersuchung
zu ermöglichen.
Diese Qualitäten
beinhalten die Qualität
und Zugänglichkeit
der aufgenommenen Probe. Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten
Mal ein praktikables Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen dieser
Qualitäten
bereit.
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US-Patent Nr. 4,667,335 beschreibt
ein Verfahren zum Untersuchen des Inhalts eines Volumens einer biologischen
Probe mit Partikeln zum Feststellen der diagnostischen Signifikanz
des Volumens der biologischen Probe. Eine Anzahl von Aliquoten der
Probe werden verteilt und unter geringer Feldvergrößerung untersucht.
Die Gesamtzahl von untersuchten Aliquoten unter geringer Feldvergrößerung ist
ein erster Teil des Volumens der biologischen Probe. Der Prozentsatz
von in dem ersten Teil festgestellten Partikeln wird bestimmt. Der
festgestellte Prozentsatz von Partikeln wird mit einem ersten bekannten
Prozentsatz verglichen. In dem Fall, dass der Vergleich das Ergebnis
erbringt, dass die Probe eine für
Diagnosezwecke unzureichende Anzahl von Partikeln enthält, wird
das Verfahren beendet. Im anderen Fall wird das Verfahren fortgesetzt.
Ein zweiter Teil des Volumens der biologischen Probe mit einer Mehrzahl
von Allquoten wird unter hoher Feldvergrößerung untersucht. Der Prozentsatz
der unter hoher Feldvergrößerung festgestellten
Partikel wird totalisiert. Dann wird er mit einem zweiten bekannten
Prozentsatz verglichen. Die diagnostische Signifikanz der biologischen
Probe wird durch den Vergleich des zweiten Prozentsatzes von Partikeln
mit dem Prozentsatz von Partikeln bestimmt, der in dem zweiten Teilvolumen
gezählt
wurde.
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Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung,
ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, die objektive
Messungen von Probenfärbung
und -fixierung, Probenzusammenstellungsqualität und physikalischen Eigenschaften
des Probenträgers
bereitstellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die Erfindung stellt ein Verfahren
zum Bewerten von Probenträgereigenschaften
und der Qualität
von Probenpräparationen
gemäß Patentanspruch
1 bereit. Das Verfahren gemäß der Erfindung
verwendet ein Bildanalysesystem, welches weiterhin ein Bildsammelsystem
aufweist, das eine Kamera, eine Bewegungssteuerung, ein Beleuchtungssystem
und ein Bildübertragungsinterface
besitzt. Das Bildsammelsystem ist zum Sammeln von Bilddaten einer
auf einem Probenträger
montierten Probe ausgebildet. Das Bildsammelsystem ist mit einem
Datenverarbeitungssystem verbunden, um Bilddaten von dem Bildsammelsystem
zu dem Datenverarbeitungssystem zu übertragen. Das Datenverarbeitungssystem
implementiert einen Prozess mit mehreren Schritten. Ein erster Schritt
umfasst die Bewertung von physikalischen Eigenschaften des Probenträgers. Ein
zweiter Schritt umfasst die Bewertung der Probenzusammenstellungsqualität. Ein dritter
Schritt umfasst die Bewertung der Probenträgerhandhabungsqualität. Ein vierter
Schritt umfasst die Bewertung der Probenpräparationsqualität. Ein fünfter Schritt
umfasst die Bewertung der Probenanalysegenauigkeit.
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Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile
der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann anhand der Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform,
der Patentansprüche
und Zeichnungen klar werden, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche
Elemente bezeichnen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Um diese Erfindung zu veranschaulichen,
wird eine bevorzugte Ausführungsform
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen beschrieben.
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Die 1A, 1B und 1C zeigen eine Ausführungsform der Erfindung.
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2 zeigt
ein Flussdiagramm des Verfahrens zum Bewerten der Qualität des Probenträgers und
der Probenpräparation
gemäß der Erfindung.
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3 ist
ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Bewerten der Qualität von Probenträgern und
Probenpräparationen.
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4 zeigt
ein vereinfachtes schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung
gemäß der bevorzugten
Ausführungsform.
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5A zeigt
ein Schema eines Deckglases und Probenträgers mit einer zu analysierenden
Probe.
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5B ist
ein Diagramm einer einzigen Feldansicht geringer Vergrößerung.
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6 ist
ein hochrangiges Flussdiagramm eines Prozesses, durch den die besten
Fokuspositionen auf einer Probe bestimmt werden.
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7 ist
ein Flussdiagramm eines Prozesses, durch den Bilder von unterschiedlichen
fokalen Tiefen gesammelt und verarbeitet werden anhand eines Beispiels
der bevorzugten Ausführungsform.
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Die 8 und 9 zeigen ein Flussdiagramm
der Verarbeitung eines initialen Fokus-Scans, welches ein als Gradientenfokuswert
("gradient focus
score") bezeichnetes
Verfahren benutzt, und welches einen Startpunkt für die Anwendung
des Mustererkennungsfokussierverfahrens bestimmt.
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10 ist
ein Beispielsausdruck eines Gradientenfokuswerts entlang eines Satzes
fokaler Tiefen, eine gefilterte Version davon und die ausgegebene
Ableitung der gefilterten Version, wobei die Ausdrucke verwendet
werden, um ein Verfahren zu veranschaulichen, bei dem Höchstwerte
in dem Gradientenfokuswert aufgefunden werden.
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11 zeigt
Wege von Mustererkennungs-Fokus-Scans, bezeichnet als zellulläre Fokus-Scans, über die
Oberfläche
einer Probe.
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Die 12A, 12B, 12C und 12D zeigen
vier einfache morphologische Binäroperationen.
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13 ist
ein Datenflussdiagramm des morphologischen Verfahrens des zellulären Fokuswerts.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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In einer momentan bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das hierin offenbarte System in einem System
zum Analysieren von zervikalen Pap Abstrichen ("cervical pap smears"), wie dies in der US-Patentanmeldung
mit der Nummer 07/838,064 mit dem Titel "Verfahren zum Identifizieren normaler
biomedizinischer Proben",
Alan C. Nelson, et al., angemeldet am 18. Februar 1992; US-Patentanmeldung
Nr. 08/179,812, angemeldet am 10. Januar 1994, die eine Teilungsanmeldung
(CIP) der US-Patentanmeldung Nr. 07/838,395 mit dem Titel "Verfahren zum Identifizieren
von Objekten mittels Datenverarbeitungstechniken", S. James Lee, et al., angemeldet am
18. Februar 1992; US-Patentanmeldung Nr. 07/838,070, nunmehr US-Patent
Nr. 5,315,700 mit dem Titel "Verfahren
und Vorrichtung zum schnellen Verarbeiten von Datensequenzen", Richard S. Johnston
et al., angemeldet am 18. Februar 1992; US-Patentanmeldung Nr. 07/838,065,
nunmehr US-Patent Nr. 5,361,140 mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zur dynamischen
Korrektur von mikroskopischen Bildsignalen", Jon W. Hayenga et al., angemeldet
am 18. Februar 1992; und US-Patentanmeldung Nr. 08/302,355, angemeldet
am 7. Februar 1994 mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zur schnellen
Aufnahme von fokussierten mikroskopischen Bildern" von Hayenga et al.,
die eine Teilungsanmeldung (CIP) der Anmeldung mit der Nummer 07/838,063,
angemeldet am 18. Februar 1992 ist, beschrieben.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ebenfalls biologische und zytologische Systeme, wie diese in den
folgenden Patentanmeldungen beschrieben sind, die auf den gleichen
Anmelder wie die vorliegende Erfindung lauten, angemeldet am 20.
September 1994 (sofern nicht anders angegeben): US-Patentanmeldung
Nr. 08/309,118 von Kuan et al. mit dem Titel "Feldpriorisierungsvorrichtung und -verfahren", US-Patentanmeldung Nr.
08/309,061 von Wilhelm et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum automatisierten Identifizieren
von Zellgruppierungen auf einer biologischen Probe", US-Patentanmeldung
Nr. 08/309,116 von Meyer et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum automatisierten Identifizieren
von dicken Zellgruppierungen auf biologischen Proben", US-Patentanmeldung
Nr. 08/098,115 von Lee et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum Selbstkalibrieren biologischer
Analysesysteme",
US-Patentanmeldung
Nr. 08/308,992 von Lee et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum Identifizieren und Integrieren
von multiplen Zellmustern",
US-Patentanmeldung Nr. 08/309,063 von Lee et al. mit dem Titel "Verfahren zur zytologischen
Systemdynamiknormalisierung",
US-Patentanmeldung
Nr. 08/309,248 von Rosenlof et al. mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung
zum Erkennen eines Deckglases eines Probenträgers eines Mikroskops", US-Patentanmeldung Nr.
08/309,077 von Rosenlof et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum Erkennen von Blasen
in Deckglasklebstoffen",
US-Patentanmeldung Nr. 08/309,931 von Lee et al. mit dem Titel "Zytologische Probenträgerauswertevorrichtung", US-Patentanmeldung
Nr. 08/309,148 von Lee et al. mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum Erkennen
von bildebenen Modulationsmustern", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,250
von Lee et al. mit dem Titel "Vorrichtung
zur Identifizierung von freiliegenden Zellen", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,117
von Wilhelm et al. mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum Erkennen
von ungeeigneten Bedingungen für
die automatisierte Zytologieauswertung". Gegenstand der Offenbarung ist ebenfalls
US-Patentanmeldung Nr. 08/455,296 von Lee et al., angemeldet am
31. Mai 1995 und angemeldet vom selben Anmelder, mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung
zum kontinuierlichen Überwachen
und Vorhersagen von Präparationen
von Probenträgern
und Proben für
eine biologische Probenpopulation".
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Im Folgenden wird nun auf die 1A, 1B und 1C Bezug
genommen, die ein schematisches Diagramm einer Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
500 zum Auswerten der Qualität
der Probenträger-
und Probenpräparation
zeigen. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung
weist ein Abbildungssystem 502, ein Bewegungskontrollsystem 504,
ein Bildverarbeitungssystem 536, ein zentrales Verarbeitungssystem 540 und
eine Arbeitsstation 542 auf. Das Abbildungssystem 502 weist
einen Illuminator 508, Bildoptiken 510, eine CCD-Kamera 512,
einen Illuminationssensor 514 und ein Bildaufnahme- und
-fokussiersystem 516 auf. Das Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 stellt
den CCD-Kameras 512 Videozeitdaten
bereit, wobei die CCD-Kameras 512 dem Bildaufnahme- und
-fokussiersystem 516 Bilder bereitstellen, die Scanlinien
aufweisen. Die Intensität
des Illuminationssensors wird dem Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 bereitgestellt, wobei
ein Illuminationssensor 514 die Probe des Bildes von der
Optik 510 erhält.
In manchen Ausführungsformen
kann die Optik 510 Farbfilter aufweisen. In einer Ausführungsform
der Erfindung kann die Optik weiterhin ein automatisiertes Mikroskop 511 enthalten.
Der Illuminator 508 stellt die Illumination eines Probenträgers bereit.
Das Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 stellt dem VME-Bus 538 Daten
bereit. Der VME-Bus sendet die Daten an ein Bildverarbeitungssystem 536.
Das Bildverarbeitungssystem 536 weist Sehfeldprozessoren 568 auf.
Die Bilder werden entlang des Bildbusses 564 von der Bildaufnahme-
und -fokussiersystem 516 gesendet. Ein Zentralprozessor 540 regelt
den erfindungsgemäßen Betrieb
durch den VME-Bus 538. In einer Ausführungsform weist der Zentralprozessor 562 eine
MOTOROLA 68030 CPU auf. Der Bewegungsregler 504 weist einen
Magazinbehandler 518, einen Mikroskoptischregler 520,
einen Mikroskopmagazinregler 522 und einen Kalibrierungs-Probenträger 524 auf.
Der Motorantrieb 526 positioniert den Probenträger unter
der Optik. Ein Barcodeleser 528 liest einen auf dem Probenträger 524 angeordneten
Barcode. Ein Berührungssensor 530 bestimmt,
ob ein Probenträger
unter den Objektiven des Mikroskops angeordnet ist und eine Türsperrung 532 verhindert
den Betrieb, wenn die Türen
geöffnet
sind. Der Bewegungsregler 534 regelt den Motorantrieb 526 in
Abhängigkeit
von dem Zentralprozessor 540. Ein Ethernet-Kommunikationssystem 560 kommuniziert
mit einer Arbeitsstation 542, um eine Regelung des Systems bereitzustellen.
Eine Festplatte 544 wird von der Arbeitsstation 550 geregelt.
In einer Ausführungsform
kann die Arbeitsstation 550 eine Arbeitsstation aufweisen.
Ein Bandlaufwerk 546 ist mit der Arbeitsstation 550 verbunden,
genauso wie ein Modem 548, ein Monitor 552, eine
Tastatur 554 und eine Maus-Anzeigevorrichtung 556. Ein
Drucker 558 ist mit dem Ethernet 560 verbunden.
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Während
des Betriebs regelt der ein echtzeitbetriebssystemabarbeitender
Zentralcomputer 540 das Mikroskop 511 und den
Prozessor, um Bilder von dem Mikroskop 511 aufzunehmen
und zu digitalisieren. Der Computer 540 regelt ebenfalls
den Mikroskoptisch, um die Probe unter dem Objektiv des Mikroskops
anzuordnen und zwischen einem und 15 Sehfeldprozessoren 560 (FOV),
die Bilder unter Kontrolle des Computers 540 aufnehmen.
Es versteht sich, dass die unterschiedlichen hierin beschriebenen
Verfahren in Software implementiert sein können, um in einem digitalen
Prozessor zu laufen. Die Software kann z. B. in dem Zentralprozessor 540 eingebettet
sein.
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Im Folgenden wird auf
2 Bezug genommen, die ein
Verfahrensflussdiagramm des Verfahrens zum Bewerten der Qualität von Probenträgern- und
Probenpräparationen
gemäß der Erfindung
zeigt. Ein Techniker stellt einen Satz von Laborprobenträgern mit
repräsentativen
normalen und anormalen Probenträgern
in Schritt 10 zusammen. In einer bevorzugten Ausführungsform
nimmt die Prüfperson
400 Probenträger auf.
Der Probenträgersatz
weist die folgenden Probenträger
auf:
200 | Probenträger innerhalb
normaler Grenzen, |
150 | niedriggradige
SIL-Probenträger,
und |
50 | hochgradige
SIL-Probenträger |
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Niedriggradige schuppige intraephitheliale
Lesionen (SIL) und hochgradige SIL sind niedriggradige und hochgradige
schuppige intraephitheliale Lesionen des Uterus-Cervix.
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Die Probenträger in jeder Kategorie können vorteilhafterweise
weniger als ein Jahr alt sein und sollten zufällig aus einem Probenträgerarchiv
eines Labors ausgewählt
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können alle
Probenträger
vorzugsweise Deckgläser
aus Glas aufweisen. Ein automatisiertes System, wie es beispielsweise
in den angegebenen Patenten beschrieben ist, verarbeitet den Probenträgersatz
zum Erhalten von Daten zum Bewerten der Qualität der Probenträger- und
der Probenpräparation
in Schritt 20. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das automatisierte
System den AutoPap® 300 von NeoPath, Inc.
aus Bellevue, WA aufweisen. Das automatisierte System verarbeitet
und nimmt Daten von den aufgenommenen Probenträgern auf.
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In den Schritten 30–70 führt das
automatisierte System eine Reihe von Tests bezüglich der in Schritt 20 aufgenommenen
Daten aus. In Schritt 30 führt
das automatisierte System einen Test betreffend physikalische Eigenschaften
des Probenträgers
aus, um die physikalischen Eigenschaften von Pap-Abstrich-Probenträgern einzuschätzen, um
festzustellen, ob sie erfolgversprechend mit einem vorbestimmten
automatisierten biologischen Probenanalysator gescannt werden können, wie
beispielsweise dem AutoPap® 300-System. Der Test betreffend die physikalischen
Eigenschaften des Probenträgers
schätzt
die physikalischen Eigenschaften der aus dem Labor stammenden Probenträger ein.
Diese physikalischen Eigenschaften können z. B. die in Tabelle 1
gezeigten Eigenschaften einschließen.
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Die Vorrichtung und die
Probe
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Im Folgenden wird nun auf 4 Bezug genommen, die ein
vereinfachtes schematisches Blockdiagramm eines Beispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zeigt, um das erfindungsgemäße Verfahren
und die Vorrichtung besser erklären
zu können.
Die gezeigte Vorrichtung weist einen Zentralcomputer 101,
ein Echtzeit-Scan-Steuersystem 102, welches die Bewegung
des motorisierten Tisches 103 des Mikroskops mit dem Bildaufnahmesystem
104 koordiniert,
ein stroboskopisches Illuminationssystem 105, ein Mikroskopobjektiv 107 geringer
Vergrößerung,
eine elektronische Kamera 108 des CCD-Typs, ein oder mehrere
reservierte Bildverarbeitungssysteme 109 und einen Berührungssensor 110 auf.
Das stroboskopische Illuminationssystem 105 fokussiert
einen kurzen Lichtblitz der Probe 106. Die Probe 106 ist
auf einem Glasaufnahmeträger 201 montiert
und unter einem transparenten Deckglas 202 geschützt.
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Der Computer 101 kann vorteilhafterweise
programmiert sein, um die Schritte des Fokussierverfahrens, wie
unterhalb detailliert beschrieben, zu begleiten. In 4 stellen die Pfeile zwischen den unterschiedlichen
Komponenten den Informationsfluss zwischen den Teilen der Vorrichtung
dar.
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5A zeigt
schematisch eine detailliertere Ansicht eines Probenträgers 201,
auf dem eine typische Probe 106 montiert ist, die dann
mit einem transparenten Deckglas 202 abgedeckt wird. Ein
typischer Probenträger 201 kann
18 mm lang und 27 mm breit bei einer Dicke von 1 mm sein. Ein typisches
Deckglas 202 kann 60 mm lang, 24 mm breit und 0,13 mm dick
sein. Der beste Fokus auf die Proben 106 variiert von Punkt
zu Punkt, aufgrund von Verwölbungen
in der Kombination von Probenträger
und Deckglas und der immanenten dreidimensionalen Gestalt der Proben
selbst.
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Ein Raster 203 ist in 5B dargestellt, wobei dieses über die
Probe 201 gelegt ist. Das Raster 203 kann in der
konkreten Ausführung
der Erfindung nicht sichtbar sein, aber es wird hierin für illustrative
Zwecke benutzt. Das Raster 203 ist nicht maßstabsgerecht
dargestellt. Das Raster 203 zeigt die Unterteilung des
Probenträgers
in Feldansichten niedriger Vergrößerung,
wie Blickfeld 210, die detaillierter in 5B gezeigt sind. Jedes der Blickfelder 210 geringer
Vergrößerung ist
in 25 Blickfelder höherer
Vergrößerung 211,
zum Beispiel, unterteilt. In einer Ausführungsform der Erfindung enthält ein aufgenommenes,
digitalisiertes Bild einer geringen Vergrößerung ein Blickfeld mit 512 × 512 Pixeln,
und es gibt eine Probenfläche
von etwa 1,4 mm × 1,4 mm
wieder.
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Finden des
Deckglases
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Im Folgenden wird auf 4 und auf 6 Bezug genommen. Das Fokussieren auf
eine Probe beginnt damit, dass der Zentralcomputer 101 Anweisungen
zum Bewegen des Tisches 103 zu einem vorbestimmten zentralen
Ort in Verfahrensschritt 401 an den Scan-Controller 102 schickt.
Der zentrale Ort wird unter Berücksichtigung
des ungefähr
bekannten Orts der Probe 106 in einer solchen Weise ausgewählt, dass
sogar kleine Deckgläser,
die ordnungsgemäß über der
Probe angeordnet sind, einen wesentlichen Bereich um den zentralen
Ort abdecken müssen.
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In Schritt 402 instruiert der Zentralcomputer 101 den
Scan-Controller 102, den Tisch 103 in der senkrechten
Achse zu dem Probenträger 201 zu
bewegen, so dass sich die Probe 106 dem Berührungssensor 110 annähert. Diese
Bewegung setzt sich fort, bis entweder der Bewegungssensor 110 Kontakt
mit dem Deckglas 202 über
der Probe 106 bei Schritt 403 feststellt oder das Ende der Bewegung
in Schritt 404 erreicht wurde. Das Erreichen des Endes der Bewegung
bei Schritt 404 zeigt an, dass entweder kein Probenträger vorhanden ist
oder ein Probenträger
vorhanden ist, der für
die Vorrichtung zu dünn
ist. In diesem Fall stoppt die automatische Verarbeitung des in
Rede stehenden Probenträgers
bei Schritt 405.
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Wenn der Bewegungssensor 110 Kontakt
mit dem Deckglas über
der Probe 106 bei Schritt 403 anzeigt, berichtet der Scan-Controller 102 den
Ort des Tisches, an dem die Berührung
stattgefunden hat, an den Zentralcomputer 101, der diesen
bei Schritt 406 abspeichert. Dieser Ort zeigt den Ort des Tisches
der Oberseite des Deckglases an dem zentralen Punkt an, wie dieser
als Startpunkt zum Fokussieren verwendet wird. Wenn der Berührungssensor
Kontakt mit dem Deckglas an einem höheren Punkt als der vorbestimmten
Höhe anzeigt,
ist der Probenträger
zu dick. In einem solchen Fall stoppt die automatische Verarbeitung
des in Rede stehenden Probenträgers.
Insbesondere wird der Ort des Berührungssensors 110 derart
kalibriert, dass er einen bekannten Abstand von der fokalen Ebene
der Objektivlinse 107 durch Verwendung von für diesen
Zweck geschaffenen Zielen entspricht. In Schritt 411 wird diese
Kalibrierung verwendet, um den Tisch 103 in eine Position
zu bewegen, so dass die fokale Ebene der Objektivlinse 107 direkt
unterhalb der Oberseite des Deckglases 202 an dem zentralen
Berührungsort
liegt.
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Bevor jedoch das Fokussieren fortgesetzt
werden kann, muss der Ort des Deckglases besser bestimmt werden.
In Richtung dieses Endes werden bei Schritt 407 vier weitere Berührungen
ausgeführt,
die im Wesentlichen ähnlich
zu den ersten oberhalb beschriebenen Berührungen bei den Schritten 402
bis 404 sind. Diese Berührungen
werden an unterschiedlichen Orten des Probenträgers innerhalb einer minimalen
zentralen Deckglasfläche
durchgeführt.
Die Orte des Deckglases bei jedem dieser Berührungen werden ebenfalls aufgenommen.
Bei Schritt 408 wird eine Ebene der kleinsten Quadrate von den fünf Berührungsorten
konstruiert und die Abweichung der Ebene mit einem erlaubten Maximum
verglichen. Wenn die Abweichung des Maximum überschreitet oder wenn eine
der vier Berührungen
keinen Ort aufnehmen konnte, wird die Verarbeitung des Probenträgers bei
Schritt 405 gestoppt. Ein sehr stark abweichendes Deckglas bei Schritt
408 zeigt normalerweise an, dass der Probenträger nicht richtig in die Vorrichtung
geladen wurde.
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Da die ungefähre Position des Deckglases
bekannt ist, wird zu diesem Zeitpunkt eine detailliertere Suche
nach den Rändern
bei Schritt 409 durchgeführt.
Wenn die Ränder
des Deckglases nicht gefunden wurden oder wenn deren Größe oder
Form als nicht korrekt angezeigt wurde, wird bei Schritt 410 die
Verarbeitung des Probenträgers
wiederum bei Schritt 405 angehalten.
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Bei Schritt 411 wird der Tisch zu
der zentralen Berührungsposition
zurückgeführt. Dies
geschieht bei einer solchen Höhe,
dass die fokale Ebene des Objektivs 107 direkt unterhalb
der berührten
Oberfläche
des Deckglases 202 ist. Bei Schritt 412 wird das Fokussieren
der Probe 106 fortgesetzt, wobei der zentrale Computer 101 den
Scan-Controller 102 zum Koordinieren der Bewegung des Tisches 103 mit
dem Bildaufnahmesystem 104 instruiert, um einen initialen
Fokus-Scan durchzuführen,
wobei von der Position ausgegangen wird, bei der das Objektiv 107 ein
Bild direkt unterhalb der Oberfläche
des Deckglases 202 in der zentralen Berührungsposition auf die CCD-Kamera 108 fokussiert.
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Der initiale
Fokus-Scan
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Zu diesem Zeitpunkt beschreiben wir
den initialen Fokus-Scan im Detail, wobei wiederum auf die 5A, 5B, 6, 7, 8, 9, 10 und 11 sowie 4 Bezug
genommen wird.
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Der Zweck eines Fokus-Scans ist es,
Bilder aus unterschiedlichen fokalen Ebenen in der Probe aufzunehmen
und zu verarbeiten, um die beste fokale Ebene zu finden. Jeder Fokus-Scan wird gemäß dem Beispiel
der bevorzugten Ausführungsform
wie folgt ausgeführt.
Im Folgenden wird gemeinsam auf die 4 und 7 Bezug genommen. Der Zentralcomputer
101 reicht
eine Liste von Tischpositionen an den Scan-Controller 102 weiter,
wobei es sich um Tischpositionen handelt, bei denen Bilder bei Schritt
1501 zu sammeln sind. Die Tischpositionen sind derart ausgewählt, dass
das Objektiv 107 in unterschiedlichen Ebenen in der Probe 106 fokussiert.
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Der Scan-Controller 102 berechnet
den zeitlichen Ablauf der Bewegung des Tisches und konstruiert eine
Tabelle, wobei aufeinanderfolgenden Positionen des Tisches zu sammelnden
Bildern zugeordnet werden, sowie der Zeitpunkt, zu dem sich der
Tisch an dem jeweiligen Ort befinden wird. Die Einträge der Tabelle
werden berechnet und an das Bildaufnahmesystem 104 bei
Schritt 1502 weitergegeben.
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Sobald das Bildaufnahmesystem 104 die
Tabelle bei Schritt 1503 erhalten hat, initiiert der Scan-Controller 102 die
Bewegung des Tisches 103. Die Bewegung des Tisches wird
von Encodern bei Schritt 1504 überwacht,
um Korrektheit zu sichern. Jegliche falsche Tischpositionen werden
dem Computer 101 berichtet, der wiederum den Tisch zurücksetzen
und die Verarbeitung wieder aufnehmen kann.
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Zu jedem in der Tabelle aufgeführten Zeitpunkt
signalisiert das Bildaufnahmesystem 104 dem stroboskopischen
Illuminator 105 bei Schritt 1505 zu blitzen. Der Illuminator 105 fokussiert
einen kurzen Lichtblitz auf der Probe 106 an dem spezifizierten
Ort bei Schritt 1506. Das Illuminatorsystem überwacht die Blitze des "Strobe" mit einem Lichtsensor
bei Schritt 1507. Jegliche fehlende Blitze oder Blitze falscher
Intensität
werden dem Computer 101 berichtet, der die Verarbeitung
des Probenträgers
anhalten kann.
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Bei Schritt 1508 fokussiert das Objektiv 107 ein
Bild von dem illuminierten Blickfeld der Probe 106 auf die
Kamera 108. Bei Schritt 1509 sammelt das Bildaufnahmesystem 104 eine
digitale Wiedergabe des Bildes, welches von der Kamera 108 aufgenommen
wurde. In einem Beispiel besteht die digitale Wiedergabe des Bildes
aus 512 Zeilen × 512
Spalten von Pixeln, von denen jedes einem Grauwert von 0 (steht
für den
dunkelsten Wert) bis 255 (steht für den hellsten Wert) zu gewiesen
ist. Falls notwendig, kann das Bild in analoger Form von der Kamera 108 an
das Bildaufnahmesystem 104 gesendet werden und dann durch
einen Analog-/Digitalumwandler geschickt werden, um die digitale
Wiedergabe zu erstellen. Das Bildaufnahmesystem 104 sendet
jedes digitale Bild, das es aufgenommen hat, an den oder die Bildverarbeiter 109 bei
Schritt 1510. Der oder die ausgewählte Bildverarbeiter 109 vollführt eine
vorprogrammierte Sequenz von morphologischen, rechnerischen und
logischen Operationen auf jedem Bild, das von dem Bildaufnahmesystem 104 gesendet
wurde, um einen oder mehrere Faktoren der Fokusqualität abzuleiten.
Diese Faktoren werden berechnet und an den Computer 101 bei
Schritt 1511 gesendet. Sobald der Computer 101 die Faktoren
von jedem Bild in der Liste erhalten hat, die ursprünglich an
den Scan-Controller 102 bei Schritt 1501 gesendet wurden,
verarbeitet er die Liste von Faktoren, um den optimalen Fokusort
bei Schritt 1512 zu bestimmen.
-
Während
die Bilder aufgenommen und verarbeitet werden, setzt der Tisch 103 die
Bewegung der Probe 106 in Übereinstimmung mit den Befehlen
des Scan-Controllers 102 von Schritt 1503 an fort, bis
die Liste gesammelter Bilder zuende ist. Der initiale Fokus-Scan
beginnt, wie oberhalb beschrieben, bei einer Position, an der das
Objektiv 107 auf eine Bildebene direkt unterhalb der Oberfläche des
Deckglases an dem zentralen Berührungsort
fokussiert ist. Der Scan wird weiter unterhalb des Deckglases fortgesetzt,
wobei für
jede Tiefe des Fokus des Objektivs 107 ein Bild gesammelt
wird, bis die der maximalen optischen Dicke des Deckglases entsprechende
Tiefe überschritten
wurde. Die maximale optische Dicke des Deckglases kann eine vorbestimmte,
zulässige
Dicke sein, die von der jeweilig verwendeten Vorrichtung abhängt.
-
Der initiale Fokus-Scan wird benutzt,
um einen Startpunkt, auch "seed
point" genannt,
zu identifizieren, um das System auf die Probe zu fokussieren. Da
es nicht wichtig ist, ob dieser Startpunkt von den Zellen in der
Probe abgeleitet oder lediglich Schmutz oder anderes Material auf
der Oberfläche
des Probenträgers
ist, wird eine morphologische Mustererkennung nicht für den initialen
Fokus-Scan benutzt.
-
Stattdessen wird ein einfacherer
Intensitätsgradient-Fokusqualitätsfaktor
wie folgt berechnet. Nunmehr wird auf 8 Bezug
genommen, die das Verfahrensflussdiagramm für den Bildprozessor zeigt,
wenn dieser den Gradientfokuswert berechnet. Beginnend bei Schritt
601 wird ein Histogramm der Graustufen des Bildes berechnet. Dieses
Histogramm wird verwendet, um ein Maß der Illuminationshelligkeit
oder ein Helligkeitsniveau, das in dem Bild vorliegt, zu berechnen.
Insbesondere kann das Helligkeitsniveau als das höchste Intensitätsniveau
definiert sein, bei dem 0,1% oder mehr der Pixel der Bildaufnahme
eine höhere
Intensität
besitzen.
-
Bei Schritt 602 werden die horizontalen
und vertikalen Gradienten der Lichtintensität bei jedem der Pixel in dem
digitalisierten Bild berechnet. Für den vertikalen Gradienten
wird die Berechnung bei jedem Pixel derart ausgeführt, dass
der Intensitätswert
des Pixels direkt unterhalb von dem Pixel direkt oberhalb abgezogen
wird. Der horizontale Gradient wird in einer vergleichbaren Weise
berechnet. Diese Gradienten werden mit einem Schwellenwert verglichen,
um den Effekt des Bildrauschens betreffend das Maß der Bildschärfe zu reduzieren.
Gradienten unterhalb des vorbestimmten Schwellenwerts werden als
0 behandelt. Der Fachmann wird unter Verwendung dieser Offenbarung
verstehen, dass der Schwellenwert empirisch oder von den Rauscheigenschaften
der spezifischen verwendeten Bildvorrichtung abgeleitet werden kann.
-
Um die besten fokalen Orte verschiedener
Regionen innerhalb des Blickfelds voneinander unterscheiden zu können, unterteilt
der Bildprozessor das Blickfeld in ein Gitter von 5 × 5, wie
dies in 5B bei Schritt 603
gezeigt ist. Die anschließende
Verarbeitung berechnet 25 unterschiedliche Fokuswerte, von denen
jeweils eins für
einen der 25 Bereiche in dem Raster steht.
-
Bei Schritt 604 werden 50 Histogramme
berechnet, von denen jeweils zwei einem der 25 Rasterbereiche in
dem Bild entsprechen.
-
Die zwei Histogramme werden auf den
Bildern des horizontalen bzw. vertikalen Gradienten berechnet.
-
Sogar ein Fokussiervorgang, der keine
Mustererkennung ausführt,
muss die Größe der zu
fokussierenden Objekte in gewisser Weise berücksichtigen, um Informationen
aus dem geeigneten Bereich räumlicher Frequenz
aufzunehmen. Aufgrund der Tatsache, dass das hierin beschriebene
Fokussiersystem ausgebildet ist, um bei geringen Vergrößerungen
auf kleinen Objekten zu arbeiten, berücksichtigt der Intensitätsgradientalgorithmus
die Größe, indem
nur die 50 hochgradigsten in den 25 Regionen bei Schritt 605 verwendet
werden. Der Rest des Gradienthistogramms wird nicht berücksichtigt.
-
Bei Schritt 606 werden die Quadrate
dieser 50 Gradienten aufsummiert und durch das Helligkeitsniveau
geteilt, um 25 Fokustreffer für
jedes Bild in dem Fokus-Scan herzustellen. Das Helligkeitsniveau
wird verwendet, um die Treffer zu normalisieren, um deren Abhängigkeit
von der Illumination von quadratisch auf linear zu reduzieren. Dies
ist sinnvoll, weil der Algorithmus bei Bildern in einem Kontext
verwendet werden kann, in dem die Illumination aus irgendwelchen
Gründen
undeutlich ist.
-
Sobald das Bildverarbeitungssystem 109 die
25 Gradientenfokustreffer für
jedes Bild in dem initialen Fokus-Scan berechnet hat, werden diese
Treffer gemeinsam mit der entsprechenden Fokusposition an den Zentralcomputer 101 zurückgesendet,
wie dies oberhalb beschrieben und in Schritt 1511 in 7 gezeigt ist.
-
Die Aufgabe des Zentralcomputers 101 in
Schritt 1512 von 7 ist
es, Höchstwerte
in den Fokustreffern als Funktion der Fokusposition in jedem der
25 Bereiche zu suchen, falsche Fluktuationen aufgrund von Rauschen
zu ignorieren und eine initiale Abschätzung der besten fokalen Ebene
zu treffen. Dieses wird wie in 9 gezeigt
erreicht.
-
Zunächst werden bei Schritt 620
die Treffer für
jeden Bereich über
die Fokusposition gefiltert, um Rauschen in den Fokustreffern zu
reduzieren. Für
diesen Zweck wird ein Gauß'scher Kernel mit
einer halben Breite bei dem halben Maximum verwendet, das der Tiefe
des Feldes des Objektivs entspricht.
-
Zweitens wird im Schritt 621 die
Ableitung der Fokustreffer bezüglich
der Position für
jeden Bereich und jede Position berechnet, indem die gefilterten
Fokustreffer bei jeder Position und jedem Bereich von den gefilterten
Fokustreffern der darauf folgenden Position für denselben Bereich abgezogen
werden.
-
Drittens werden bei Schritt 622 Höchstwerte
in dem Fokustrefter in allen Bereichen identifiziert, indem nach
Mustern über
Positionen von zwei positiven Ableitungen gefolgt bei zwei negativen
Ableitungen gesucht wird und überprüft wird,
um sicherzustellen, dass das Fokusergebnis an dem Höchstwert
oberhalb eines vorbestimmten Minimums liegt, um das Auffinden falscher
Höchstwerte
zu vermeiden. Der präzise
Ort des Höchstwerts
wird durch lineare Interpolation des Gradienten zum Nulldurchgang
gefunden.
-
7 zeigt
den Vorgang des Auffindens der Höchstwerte
durch Ausdrucken eines Beispiels der originalen Fokustreffer 701,
der Gauß-gefilterten
Fokustreffer 702 und der Differenz der gefilterten Treffer 703,
gegenüber
der Fokusposition. Die in 7 ausgedruckten
Treffer geben die in einem einzigen Bereich aufgefundenen Werte
wieder. Die interpolierte 0 der Ableitung bei 704 gibt die berechnete
Position des Höchstwerts wieder.
Es ist zu beachten, dass die positiven Ableitungen vor dem Höchstwert
und die negativen Ableitungen hinter dem Höchstwert liegen.
-
Viertens wird in Schritt 623 die
Schärfe
jedes Höchstwerts
gemessen, indem die Größe der zweiten Ableitung
der gefilterten Fokustreffer an dem Höchstwert durch die Größe des Höchstwerts
geteilt wird. Die Schärfe
stellt ein Anzeichen bereit, wie bestimmt eine Präferenz für die gegebene
Fokusposition den Höchstwert
anzeigt.
-
Fünftens
werden in Schritt 624 alle aufgefundenen Höchstwerte in allen Bereichen
in zwei Klassen unterteilt: solche, die eine minimale optische Dicke
des Deckglases oder mehr unterhalb des höchsten Höchstwerts haben und solche,
die dies nicht haben. Sie werden unterteilt, um alle Höchstwerte,
die von Schmutz oben auf dem Deckglas stammen können, von den richtigen Höchstwerten
von der Probe zu unterscheiden.
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Sechstens wird in Schritt 625 in
jedem Bereich der Höchstwert
mit dem höchsten
Fokuswert in jeder Klasse beibehalten, während alle anderen Höchstwerte
in dem gleichen Bereich und der gleichen Klasse ignoriert werden.
Somit werden maximal 25 Höchstwerte
in jeder Klasse berücksichtigt.
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Siebtens wird in Schritt 626 ein
gewichteter Mittelwert der Position der Höchstwerte in jeder Klasse gewählt, um
die beste Fokusposition für
das volle Blickfeld in jeder Klasse wiederzugeben. Die Höchstwertpositionen
werden anhand der relativen Höchstwertschärfe gewichtet,
die in Schritt 623 berechnet wurde, um die gewichteten Mittelwerte
herzuleiten. Falls irgendeiner der Höchstwerte eine Schärfe besitzt,
die größer als
ein Faktor 4 weniger als der schärfste
Höchstwert
in der Klasse ist, wird dieser nicht bei der Mittelung berücksichtigt,
da er für
diesen Schritt zu weich ist. Somit verbleiben maximal zwei mögliche Fokuspositionen.
Es ist zu beachten, dass es möglich
ist, dass alle Höchstwerte
in der oberen Klasse sind, wobei dann nur eine Fokusposition in
diesem Stadium vorhanden ist.
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Achtens wird zum Vermeiden der Möglichkeit
des Fokussierens auf die Oberfläche
des Deckglases, wenn dort zwei Fokuspositionen vorhanden sind, die
niedrigere Klasse (weiter unterhalb des Deckglases) als repräsentativ
für den
besten Fokus auf der Probe bei Schritt 627 ausgewählt.
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Neuntens und abschließend scheitert
der Scan beim Auffinden einer besten Fokusposition bei Schritt 630,
wenn kein gültigen
Höchstwerte
bei Schritt 622 gefunden wurden. Andererseits wird die bei Schritt
627 gewählte
Fokusposition von dem Computer 101 bei Schritt 629 abgespeichert.
In dieser Weise wird die Diskussion des initialen Fokus-Scans abgeschlossen.
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Mehrfache
Versuche eines initialen Scans
-
Im Folgenden wird wieder auf 6 Bezug genommen. Das Ergebnis
des initialen Fokus-Scans
bei Schritt 412 ist somit entweder eine Start-Fokusposition oder
das Scheitern beim Auffinden eines Höchstwertes. In nahezu allen
Fällen
ist der oberhalb beschriebene initiale Fokus-Scan erfolgreich, wenn
ein eine Probe tragender Probenträger verwendet wird, der die
physikalischen Anforderungen bezüglich
der Deckglasdicke und -anordnung erfüllt. Dies ist deshalb der Fall,
weil nur sehr wenig Material zum Darauffokussieren erforderlich ist
und der Scan in der Mitte des Probenträgers durchgeführt wird,
wo wahrscheinlich ein Teil der Probe angeordnet ist.
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Dennoch wird beim Auffinden eines
Fehlers in Schritt 413 zusätzlich
versucht, einen "seed
point" zum Fokussieren
zu finden. Insbesondere wenn eine geringere Anzahl von Versuchen
als eine gesetzte Anzahl in Schritt 414 durchgeführt wurde, wird ein neuer Ort
in Schritt 415 ausgewählt,
der sich in einem Blickfeld befindet, das benachbart zu dem ist,
in dem gerade ein Fokus-Scan versucht wurde. Das Verfahren versucht
dann einen weiteren initialen Scan in Schritt 412. Die folgenden
Versuche können
in einem spiralförmigen
Muster um den ursprünglichen
Berührungspunkt
durchgeführt
werden, so dass neue Blickfelder weiter ausgewählt werden, während so
nahe wie möglich
an dem mittigen Berührungsort
geblieben wird. Nur wenn alle der gesetzten Anzahl von Versuchen
in Schritt 414 nicht erfolgreich waren, wird das Verarbeiten des
Probenträgers in
Schritt 405 beendet.
-
Sobald eine initiale Fokusposition
in Schritt 412 gefunden wurde, beginnen die Mustererkennung oder zelluläre Fokus-Scans
an diesem Punkt, der als der "seed
point" bezeichnet
wird, um eine Karte der Fokusebene zu erstellen.
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11 zeigt
den Weg der zellulären
Fokus-Scans über
die Oberfläche
der Probe, wobei der Ort des "seed
point" mit einem "X" markiert ist. Die Quadrate 801 stellen
die gescannten Blickfelder dar, während die Pfeile 802 den
Weg zeigen, dem der Tisch folgt. Der Zweck des Folgens des gezeigten
Weges ist es, so nah wie möglich
zum Erreichen einer repräsentativen
Probe von den Probenträgern
zu kommen, während
die zum Scannen erforderliche Zeit minimiert wird. Der verwendete
Tisch braucht zum gleichzeitigen Bewegen in zwei Dimensionen nicht
mehr Zeit als zum Bewegen in nur einer, so dass die dargestellten
diagonalen Bewegungen die Bewegungsgeschwindigkeit maximieren.
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Im Folgenden wird wiederum auf 6 Bezug genommen. In Schritt
416 erfolgen die ersten Scans rechts von und benachbart zu dem "seed point" in 11. Das in 11 dargestellte
Zickzackmuster dreht um, wie beispielsweise bei 804, jedes
Mal, wenn das Scannen die Ränder
des Deckglases erreichen. Das gesamte Muster muss beendet werden,
bevor das hintere rechte Ende des Deckglases in 11 erreicht wurde. Das Scannen setzt
dann bei den Schritten 422 und 416 fort, wobei erneut benachbart
zu dem "seed point", links von dem "seed point" begonnen wird, an
dem mit einem Kreis in 11 markierten
Scan. Es ist zu beachten, dass die letzte Umkehrung des Scannens 803,
dargestellt in 11, fünf Schritte
erfordert. Dies ist zu vergleichen mit den drei durchzuführenden
Schritten bei 804 und jeder anderen Umkehrung. Dieses verdeutlicht
die Tatsache, dass bei unterhalb beschriebenen Bedingungen die Anzahl
von Schritten in einer Umkehr von drei auf fünf erhöht wird, um die Verarbeitung
der Probe zu beschleunigen.
-
Die zwei ersten zellulären Fokus-Scans
werden in der fokalen Ebene zentriert, die von dem "seed point" definiert ist. Zelluläre Fokus-Scans
sind weitaus flacher als die oberhalb beschriebenen Gradienten-Scans.
Diese bestehen lediglich aus der Aufnahme und der Verarbeitung von
vier Bildern, die wiederum ungefähr
durch die Tiefe des Fokus der Objektivlinse getrennt sind. Dieses
macht die zellulären
Scans sehr viel schneller. Das Auffinden der besten Fokusposition
aus einem zellulären
Scan ist notwendigerweise einfacher als aus einem Gradienten-Scan,
da nur vier Punkte vorhanden sind, mit denen gearbeitet wird. Es
wird mehr Wert auf das Verarbeiten des Bildes gelegt, um das Signal
von Rauschen zu befreien und insbesondere die Nuklei gut getrennter
Zellen zu erkennen und auf diese zu fokussieren. Es ist zu beachten,
dass Zellen in Haufen oftmals weniger hilfreiche Informationen bereitstellen,
wenn ihre Nuklei nicht klar auseinandergehalten werden können.
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Zelluläre Morphologie
-
Die Verarbeitung eines Bildes in
einem zellulären
Fokus-Scan weist eine Kombination einfacher morphologischer Vorgänge auf.
Die 12A–12D zeigen vier einfache
morphologische Binäroperationen. 12A zeigt eine Erosion mit
einem 3 × 3-Block,
während 12B eine Dilation mit dem
gleichen Block zeigt. 12C zeigt
eine Erosion mit einem 5 × 5-Drahtrahmen, und 12D zeigt eine Dilation
mit demselben Drahtrahmen.
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Ein morphologischer Vorgang, wie
eine Erosion oder eine Dilation, schließt zwei Objekte ein. Das erste Objekt
ist das Bild, auf dem gearbeitet wird, und das zweite Objekt ist
ein Strukturierungselement, mit dem der Vorgang ausgeführt wird.
Das Strukturierungselement kann als Gitter von Pixeln dargestellt
werden, dessen Werte entweder "an" oder "aus" sind und welches
ein einzigartiges mittleres Pixel aufweist. Die mittleren Pixel der
Strukturierungselemente in 12A–12D sind mit X gekennzeichnet.
-
Ein morphologischer Vorgang kann
die Vergegenwärtigung
beim Platzieren der Mitte des Strukturierelements über jedes
Pixel in dem originalen Bild sein. Eine Binäroperation arbeitet auf Bildern,
deren Pixel weder "an" noch "aus" sind. Die beiden
einfachsten Operationen sind die binäre Erosion und Dilation. Die
binäre Erosion
schaltet alle Pixel in dem Bild auf "aus",
wenn das Strukturierelement darauf zentriert ist. Dies bezieht sich
auf Bilder, die mindestens ein "aus"-Pixel in Überdeckung
mit einem "an"-Pixel des Elements
besitzen. Alle anderen Pixel in dem Bild sind auf "an" gesetzt. Dilation
stellt alle Pixel in dem Bild auf "an",
wenn das Strukturierelement darauf zentriert ist, wobei mindestens
ein "an"-Pixel des Bilds Überdeckung
mit einem "an"-Pixel des Strukturelements
besitzen. Alle anderen Pixel werden auf "aus" gesetzt.
Binäre
Erosion und Dilation werden bequem zu Graustufen-Erosion und -Dilation verallgemeinert.
Graustufen-Erosion ersetzt den Wert jedes Pixels in dem Bild durch
das Minimum der Werte dieser Pixel, die "an"-Pixeln
in dem Element entsprechen. Graustufen-Dilation ersetzt den Wert
jedes Pixels durch das Maximum der Werte der Pixel, die den "an"-Pixeln in dem Element
entsprechen. Erosion und Dilation werden kombiniert, um zusammengesetzte Operationen
durchzuführen.
Insbesondere wird eine Dilation gefolgt von einer Erosion mit demselben
Element als Schließen
bezeichnet, während
eine Erosion gefolgt von einer Dilation als Öffnen bezeichnet wird.
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13 ist
ein Datenflussdiagramm des zellulären Fokuswert-morphologischen
Prozesses. Jedes Bild aus jedem zellulären Fokus-Scan wird nach dem
Abspeichern in der Kamera 108 und dem Digitalisiertwerden durch
das Bildaufnahmesystem 104 durch diesen Satz von Operationen
von dem Bildprozessor (den Bildprozessoren) 109 verarbeitet.
Wie in 10 dargestellt
ist, besitzt das Verfahren vier Hauptzweige.
-
Auf dem ersten Zweig wird ein Histogramm 1011 von
den Graustufenwerten des Bildes 1001 genommen, und drei
Graustufenwerte 1012, als weißes, cyto und dunkles Niveau
bezeichet, werden aus dem Histogramm berechnet. Der weiße Wert
ist derselbe wie das Helligkeitsniveau, welches in der obigen Diskussion der
Gradientenfokuswerte beschrieben wurde. Das Cyto-Niveau ist als
95% des weißen
Werts definiert. Wie der Name andeutet, stellen Teile des Bildes
mit Grauniveaus unterhalb dieses Niveaus Flächen mit zumindest einigem
Cytoplasma dar. Das dunkle Niveau ist als 1/15 des weißen Werts
definiert, plus eine Menge, die einen Rauschboden darstellt. Teile
des Bildes mit Grauniveaus unterhalb des dunklen Werts stellen entweder
dicke Klumpen der Probe oder Artefakte anderen Materials dar. Solche
Teile werden beim Fokussieren nicht berücksichtigt.
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Auf dem zweiten Zweig des zellulären morphologischen
Verfahrens wird jedes Pixel in dem Originalbild 1001 bei
Schritt 1021 getestet, um zu sehen, ob sein Grauniveau den Cyto-Schwellenwert überschreitet. Wenn
dies der Fall ist, wird das korrespondierende Pixel in einem Binärbild auf
0 gesetzt. Wenn dies nicht der Fall ist, wird das Binärpixel auf
1 gesetzt. Das hierdurch erzeugte Binärbild passiert durch eine morphologische Öffnung 1022 durch
eine 5 × 5-Box,
gefolgt von einer Öffnung 1023 von
einer 43 × 43-Box.
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Die Öffnung 1022 von der
5 × 5-Box
ist zum Abstoßen
von Teilen ausgebildet, die zu klein sind, um Zellen zu repräsentieren,
während
die Öffnung 1023 von
der 43 × 43-Box
Teile detektiert, die so groß sind, dass
sie zusammenhängende
Gruppen von Zellen anstelle von Zellen mit Öffnungen dazwischen darstellen müssen. In Übereinstimmung
mit den Erfordernissen des Fokussierens auf freiliegenden Zellen
werden die Ergebnisse der zwei Öffnungen
exklusiv mit "oder" in Schritt 1024
verbunden, um ein cytoplasmisches Binärbild zu generieren, welches
dann bei 1025 von einer 5 × 5-Box
dilatiert wird, um jeden Nukleus aufzunehmen, der im Randbereich
der Zellen angeordnet sein kann.
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Der dritte Zweig des zellulären Fokuswertalgorithmusses überprüft jedes
Pixel des Originalbilds 1001 in Schritt 1031, um herauszufinden,
ob es ein Grauniveau besitzt, welches größer als das oberhalb definierte Dunkelniveau
ist. Wenn dies der Fall ist, wird das korrespondierende Pixel eines
Binärbildes
auf 1 gesetzt. Wenn dies nicht der Fall ist, wird es auf 0 gesetzt.
Das resultierende dunkle Binärbild
wird bei 1032 erodiert von einer 43 × 43-Box, um Fokussieren auf den Rändern dicker
Klumpen von Proben oder Teilen, die mit Artefakten überlagert
sind, zu verhindern. Das dunkle Binärbild wird dann mit "und" gemäß 1033 mit
dem cytoplasmischen Binärbild
kombiniert, um ein Binärbild
herzustellen, welches die gestatteten Regionen für zu erkennende Nuklei darstellt.
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Der vierte und letzte Zweig des Algorithmus
ist zum Erkennen von Nuklei ausgebildet. Er beginnt mit einem Graustufen-Schließen 1041 des
Originalbilds 1001 von einem 5 × 5-Stein. Dieses Schließen wird
normalerweise die interessierenden Nuklei aus dem Bild entfernen.
Das Originalbild 1001 wird dann in Schritt 1042 von dem
Ergebnis des Schließens
abgezogen, um ein texturverbessertes invertiertes Bild herzustellen, in
welchem die Nuklei als deutliche helle Punkte erscheinen.
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Um ein Binärbild zu entwickeln, welches
die Nuklei identifiziert, wird das Ergebnis des Schließens in Schritt
1043 durch 8 geteilt und dann gegen das texturverstärkte Bild
in Schritt 1044 getestet. Wenn das Grauniveau des texturverstärkten Bildes
das Maß des
lokalen Ähnlichkeitsniveaus überschreitet,
wird das in Rede stehende Pixel als potentieller Teil eines Nukleus
in Schritt 1044 markiert. Dieses Binärbild wird mit "und" gemäß 1045 mit
den erlaubten Teilen des Binärbilds
kombiniert, um eine Binärmaske
möglicher
nuklearer Pixel zu generieren.
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Das somit in Schritt 1045 hergestellte
Binärmaskenbild
hat den Fehler, dass wenige Restriktionen nuklearer Größe oder
Form darauf platziert wurden. Die nächsten Schritte sind zum Beheben
dieser Beschränkung
ausgebildet. Zunächst
wird eine Öffnung 1046 von
einer 2 × 2-Box
angewendet, um solitäre
Pixel oder Stränge
von Pixeln einfacher Breite zu eliminieren. Zweitens wird eine Dilation 1047 der
resultierenden Maske durch einen 7 × 7 hohlen Rahmen von Pixeln
bei 1048 invertiert, dann mit "und" gemäß 1049 mit
der Maske kombiniert, um solche Teile der voraussichtlichen Nuklei
loszuwerden, die nicht in den 7 × 7-Rahmen passen. Dieses erfordert, dass
die voraussichtlichen Nuklei ungefähr elliptische Gestalt besitzen.
Drittens und zum Abschluss wird das resultierende Binärbild gemäß 1050 mit
einer 3 × 3-Box
dilatiert, um die Ränder
der Nuklei in der Maske einzuschließen. Das Ergebnis von Schritt
1050 ist das letztendliche Maskenbild, welches Nuklei zeigt, die
alle Erfordernisse zum Fokussieren erfüllen.
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Sogar nachdem die Nuklei identifiziert
wurden, bleibt es erforderlich, die Schärfe zu messen, mit der diese
fokussiert sind. Um dies zu tun, wird das in Schritt 1042 hergestellte
texturverstärkte
Bild gemäß 1051 durch
einen 3 × 3-Stein
erodiert, und das resultierende Bild von dem texturverstärkten Bild
selbst gemäß 1052 abgezogen,
um ein verstärktes
Gradientenbild herzustellen. In Schritt 1053 wird dieses verstärkte Gradientenbild
dann auf 0 gesetzt, und zwar dort wo das finale Maskenbild aus Schritt
1050 eine 0 enthält.
Es verbleibt dort ungeändert,
wo das finale Maskenbild eine 1 enthält.
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Schließlich wird ein Histogramm 1054 von
den Grauniveaus des resultierenden Bildes genommen, um ein Maß der Quantität der aufgefundenen
nuklearen Masse zu addieren und natürlich die Schärfe des
Fokus auf die Nuklei. Zwei Maße
werden aus dem Histogramm 1054 bei Schritt 1055 wie folgt
berechnet. Zunächst wird
jedes Niveau des verstärkten
Gradientenbilds unterhalb von 5% des weißen Niveaus als hervorgerufen von
nichtnuklearem Material ignoriert. Daraufhin wird jeder Pixel oberhalb
dieses Niveaus in die Summe der Gesamtzahl akzeptabler nuklearer
Pixel gezählt,
und das nukleare Schärfemaß wird als
das mittlere Quadrat verstärkte
Gradientenniveau der Pixel berechnet, die oberhalb von 5% des weißen Niveaus
sind. Die Summe des akzeptablen nuklearen Pixel ist ein Maß der Menge
verwendbarer aufgefundener Probe, während das nukleare Schärfemaß durch
das weiße
Niveau geteilt wird, um die Abhängigkeit
von dem Helligkeitsniveau zu reduzieren und dann als der zelluläre Fokuswert
verwendet zu werden.
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Zelluläre Fokusverarbeitung
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Der Zentralcomputer 101 erhält dann
vier Fokuswerte und vier Pixelzählungen
von dem Bildprozessor (den Bildprozessoren) 109 für jeden
durchgeführten
zellulären
Fokus-Scan. Der Computer verarbeitet diese Maße. Die Verarbeitung läuft wie
unterhalb beschrieben ab.
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Zunächst bestimmt der Computer,
welcher Fokuswert der höchste
ist. Wenn der höchste
Fokuswert der am weitesten von dem Deckglas entfernte ist, ist das
Ergebnis des Fokus-Scans
ein Anzeichen, dass es notwendig ist, sich weiter weg von dem Deckglas
zu bewegen, um eine bessere Fokusebene zu erhalten. Wenn dies nicht
der Fall ist, wird die nukleare Pixelzählung des Bildes mit dem höchsten Fokuswert überprüft, um zu
sehen, ob diese 0,1% des Bildes überschreitet.
Wenn dies nicht der Fall ist, ist offensichtlich nicht genug in
dem Blickfeld zum Fokussieren vorhanden und der Computer legt fest,
dass das Scannen in derselben Ebene fortgesetzt wird.
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Wenn die nukleare Pixelzählung größer als
0,1% des Bildes ist und das Bild mit dem höchsten Fokuswert das nächste zu
dem Deckglas ist, ist das Ergebnis des Fokus-Scans ein Anzeichen
dafür,
dass es notwendig sein könnte,
sich näher
an das Deckglas zu bewegen, um eine bessere Fokusebene zu erhalten.
Ausreichende Daten werden vor der Bewegung in Richtung des Deckglases
aufgenommen, um zu verhindern, dass eine Bewegung zum versuchten
Fokussieren auf Material auf dem Deckglas über sehr dünne Probenträger stattfindet.
-
Wenn das Bild mit dem höchsten Fokuswert
weder oben noch unten in dem Scan ist und das Bild mit dem höchsten Fokuswert
eine nukleare Pixelzählung
von mehr als 0,1% des Bildes hat, können die Differenzen der Fokuswerte
linear interpoliert werden, um den Höchstwert zu lokalisieren. Die
Interpolation wird an dem Nulldurchgang in der Ableitung durchgeführt, und
zwar in analoger Weise zu dem als 704 in 7 dargestellten interpolierten Nulldurchgang.
Dies zeigt das erfolgreiche Auffinden eines besten Fokus an, und
sein Ort wird aufgenommen. Schließlich ist das Anzeichen zum
weiteren Fokussieren das Zentrieren über der aufgenommenen besten
Fokusebene.
-
Im Folgenden wird nunmehr erneut
auf 6 Bezug genommen.
Diese folgt der Verwendung zellulärer Fokus-Scans in dem Fokus-Scanning
der Probe. Wie zuvor erwähnt
wurde, werden die ersten zwei zellulären Fokus-Scans in Schritt
416 über
der durch den "seed
point" definierten
Ebene zentriert. Bei Schritt 417 wird das Ergebnis des ersten dieser
Scans von dem Computer 101 verarbeitet. Nach dem Ableiten
des Ergebnisses fragt der Computer 101 den nächsten zellulären Scan
im Schritt 418 an.
-
Wenn das Ergebnis des gerade verarbeiteten
Fokus-Scans anzeigt, dass der Fokus gemäß 1103 abgesenkt werden sollte,
wird der angefragte Scan 418 einen Fokusschritt tiefer
als der gerade verarbeitete Scan zentriert. Wenn das Ergebnis anzeigte,
dass nicht genug Daten gemäß 1105 vorhanden
waren, wird der angefragte Scan 418 über derselben Ebene wie der
gerade verarbeitete Scan zentriert. Wenn das Ergebnis anzeigte,
dass der Fokus gemäß 1107 höher gebracht
werden sollte, wird die Ebene des letzten erfolgreichen Fokus-Scans getestet, um
zu sehen, ob die momentane Fokusposition weniger als die Hälfte einer
minimalen optischen Dicke des Deckglases darüber ist. Wenn dies der Fall
ist, wird der angefragte Scan 418 einen Fokusschritt höher zentriert.
Wenn dies nicht der Fall ist, wird zum Verhindern des Versuchs des
Fokussierens auf der Oberfläche
des Deckglases der angefragte Scan 418 über derselben Ebene wie der
gerade zuvor verarbeitete Scan zentriert.
-
Im Folgenden wird nunmehr erneut
auf 6 Bezug genommen.
In Schritt 419 testet der Computer die Position des Fokus-Scans,
der gerade angefragt wurde, um zu sehen, ob er im äußeren rechten
oder linken Ende des Deckglases ist. Dies geschieht in Übereinstimmung
mit dem in 11 dargestellten
Scanmuster. Wenn dies nicht der Fall ist, kehrt der Computer zu
Schritt 417 zurück,
um das Ergebnis des gerade abgeschlossenen Scans zu berechnen und
dann einen neuen Scan bei Schritt 418 anzufragen. Es ist zu beachten, dass
die fokale Höhe
jedes zellulären
Scans auf dem Ergebnis des Scans zwei davor basiert. Dies gestattet es
dem Scan-Controller 102, dem Bildaufnahmesystem 104, dem Bildprozessor
(den Bildprozessoren) 109 und dem Computer 101,
Fokus-Scans kontinuierlich gleichzeitig zu verarbeiten, so schnell
der Tisch sich bewegen kann, wobei keine Verzögerungszeit benötigt wird,
um die Ergebnisse einer Berechnung abzuwarten.
-
Wenn ein Ende des Deckglases in Schritt
419 erreicht wurde, verbleiben noch zwei Ergebnisse von Fokus-Scans,
die in Schritt 420 zu verarbeiten sind. Dann überprüft der Computer in Schritt
421, um zu sehen, ob das Fokus-Scannen bereits in beide Richtungen
von dem "seed point" durchgeführt wurde,
wie dies in 11 gezeigt
ist. Wenn dies der Fall ist, wird das zelluläre Fokus-Scannen der Probe
bei Schritt 423 abgeschlossen. Wenn dies nicht der Fall ist, kehrt
die Maschine an den "seed
point" in Schritt
422 zurück
und beginnt das Scannen in entgegengesetzter Richtung zurück in Schritt
416. Die ersten beiden Fokus-Scans
in beide Richtungen werden über
der Ebene des "seed
point" zentriert.
-
Eine minimale Anzahl erfolgreicher
zellulärer
Fokus-Scans wird benötigt,
um korrekt auf einer Probe zu fokussieren. In einer beispielhaften
Ausführungsform
beträgt
die minimale Anzahl 24 Scans. Wenn diese Anzahl nicht erreicht
wurde, nachdem alle in 11 gezeigten
Scans abgeschlossen wurden, muss die Probe für eine automatische Verarbeitung
abgelehnt werden. "Pap"-Abstriche, die aus
diesem Grund abgelehnt wurden, sind normalerweise aufgrund unzureichender
schuppiger Zellularität
unbefriedigend. Zusätzlich
ist es möglich,
erfolgreiche Scans nur in einem Bereich des Probenträgers zu
haben. Wenn erfolgreiche Fokus-Scans nicht alle Bereiche des Probenträgers abdecken,
wird der Probenträger
abgelehnt, weil die Proben in zu kleinen Flächen angeordnet sind.
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Sobald ein Modell der Fokusoberfläche der
Probe zur Verfügung
steht, kann es als Anleitung zum Scannen der gesamten Probe unter
dem Deckglas bei geringer Vergrößerung verwendet
werden. Es kann ebenfalls als Ausgangspunkt für die Vergrößerung großer Stärke verwendet werden, die auf
die Probe fokussiert. Wenn die Fokusoberfläche zu schräggestellt ist, kann Fokussieren
mit starker Vergrößerung nicht
für das gesamte
Blickfeld hoher Vergrößerung möglich sein.
Wenn die Fokusoberfläche
zu schräggestellt
ist, wird die Verarbeitung des Probenträgers gestoppt. Wenn die Fokusoberfläche zu variabel
ist, ist es möglich,
dass Fokus-Scans fehlerhafte Fokusinformationen bereitgestellt haben.
Wenn die Fokuskarte zu variabel ist, stoppt die Verarbeitung der
Probenträger
als "Fokussieren
auf Probe nicht möglich".
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Die Daten des erfolgreichen Fokus-Scans
können
ebenfalls gemeinsam mit der Höhe
des Deckglases, die von dem Berührungssensor
gegeben wurde, verwendet werden, um die optische Dicke des Deckglases über der
Probe abzuschätzen.
Wenn die optische Dicke des Deckglases zu groß oder zu klein ist, wird eine inakzeptabel
große
sphärische
Aberration hergestellt, wenn die Probe durch eine Objektivlinse
hoher Auflösung
betrachtet wird. Als Ergebnis davon kann die Probe ungeeignet für Untersuchungen
mit Mikroskopen großer
Vergrößerung sein.
Wenn das Maß zwischen
Probe und Deckglas, die optische Dicke, größer als ein erster vorbestimmter
Abstand oder kleiner als ein zweiter vorbestimmter Abstand ist,
wird die Verarbeitung des Probenträgers beendet.
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In der bevorzugten Ausführungsform
wird das Fokusoberflächenmodell
verwendet, um das Scannen der Probe mit geringer Vergrößerung zu
führen.
Bereiche der Probe werden auf mögliche
Anormalitäten
untersucht. Jedes Blickfeld des Probenträgers wird bezüglich der
Wahrscheinlichkeit des Enthaltens einer Anormalität eingeschätzt. Wenn
zu wenige Blickfelder eingeschätzt
werden, kann es sein, dass der Probenträger nicht ordnungsgemäß gescannt
wurde, so dass die Verarbeitung dieses Probenträgers gestoppt wird. Während des
Scans mit geringer Vergrößerung werden
Blasenbereiche identifiziert. Wenn zu viele Blasenbereiche existieren,
stoppt die Verarbeitung des Probenträgers.
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In einer Ausführungsform wird nach dem Scan
mit geringer Vergrößerung ein
Fokusoberflächenmodell für den Scan
mit großer
Vergrößerung geschaffen.
Da die Tiefe des Feldes bei großer
Vergrößerung reduziert ist,
wird eine korrekte Fokusoberfläche
benötigt.
Fokus-Scans werden in ziemlich der gleichen Weise wie für die Fokusoberfläche geringer
Vergrößerung ausgeführt, mit
der Ausnahme, dass die Scans bei großer Vergrößerung ausgeführt werden.
Wenn die Oberfläche
der großen
Vergrößerung zu
variabel ist oder zu wenige Fokus-Scans erfolgreich sind, stoppt
die Verarbeitung des Probenträgers.
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Ein Scan mit großer Vergrößerung wird nach der Erstellung
des Fokusoberflächenmodells
großer
Vergrößerung ausgeführt. Während des
Scans mit großer
Vergrößerung werden
Bereiche des Probenträgers,
die während
des Scans mit geringer Vergrößerung als
potentiell Anormalitäten
enthaltend eingestuft wurden, abgebildet und bei großer Vergrößerung analysiert.
Die Fokusoberfläche
großer
Vergrößerung dient
als die wesentliche Abschätzung
der Fokusposition für
das Bildaufnehmen mit großer
Vergrößerung.
Wenn die von der Fokusoberfläche
mit großer
Vergrößerung bereitgestellte
Position zu Bildmaterial führt,
welches vorbestimmte Fokuskriterien nicht erfüllt, werden zusätzliche
Bildaufnahmeversuche in dem gleichen Probenträgerbereich bei unterschiedlichen
Fokuspositionen unternommen. Wenn nach der vorbestimmten Anzahl
von Aufnahmeversuchen der Bereich außerhalb des vorbestimmten Fokuskriteriums
verbleibt, wird der Probenträgerbereich verworfen.
Wenn zu wenige Probenträgerbereiche
korrekt während
des Scans mit hoher Vergrößerung fokussiert
wurden, wird die Verarbeitung des Probenträgers abgebrochen. Wenn während des
Scans mit großer
Vergrößerung weniger
als die vorbestimmte Anzahl korrekt fokussierter Scans beim ersten
Mal vorliegt oder zu viele Probenträgerbereiche nicht korrekt fokussiert
sind, kann es sein, dass das Fokusoberflächenmodell großer Vergrößerung nicht
korrekt war.
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Die Bildqualität wird überprüft, um gutes Bildmaterial zu
gewährleisten.
Bildsättigung,
Pixel mit Werten von 0 oder 255 werden für jedes Bild gezählt. Die
Anzahl der Bilder mit Sättigung
wird gezählt.
Wenn zu viele Bilder entweder während
des Scans mit geringer oder großer
Vergrößerung gesättigt sind,
kann es sein, dass die Optik für
verlässliches
Betrachten oder Aufnehmen der Probe nicht geeignet ist. Zusätzlich ist
es möglich, dass
Bildartefakte, wie beispielsweise Streifen, auf manchen Systemen
erkennbar sind, wenn Schmutz den optischen Weg verdunkelt. Wenn
Streifen in mehr als einer vorbestimmten Anzahl von Bildern festgestellt
werden, ist es möglich,
dass der Probenträger
zu schmutzig zum korrekten Betrachten und Aufnehmen der Probe ist.
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Während
der Evaluierung stoppt das automatisierte System die Verarbeitung
von Probenträgern,
die aus einem akzeptablen Bereich bezüglich irgendeines vorausgewählten Kriteriums
herausfallen. Das automatisierte System kann einen Anteil der Probenträger zählen, die
nicht verarbeitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist es festgelegt, dass der Probenträgersatz besteht, wenn der Anteil
von Probenträgern,
die nicht verarbeitet werden, weniger als 6% beträgt. Anderenfalls
besteht der Probenträgersatz
nicht.
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In Schritt 40 führt das automatisierte System
einen Probensammelqualitätstest
aus, um die Qualität und
das Ausreichen des Probenmaterials, welches auf dem Probenträger vorhanden
ist, zu evaluieren. Die Probensammelqualität ist hochgradig abhängig von
den Testwerkzeugen und -techniken für die Probensammlung einer
Klinik. In der bevorzugten Ausführungsform
kann der Probensammelqualitätstest
zwei Tests umfassen. Die Tabellen 2 und 3 führen Qualitäten auf, bezüglich welcher
die Probenträgersätze getestet
werden können.
Probenträger,
die durch diese Tests durchfallen, bilden die Ausfälle der
Probensammelqualität.
Tabelle 2 zeigt Ausfälle
aufgrund des Aufbaus von Probenträgern. Tabelle 3 zeigt Ausfälle aufgrund
der Prozesstauglichkeit. Prozesstauglichkeitsfehler können z.
B. Probenträger
einschließen,
für die
Prozessergebnisse nicht als verlässlich
erwartet werden können,
z. B. wenn der Prozess zu wenige Referenzzellen erkennt. Der Anteil von
Probenträgern,
die aus diesem Grund durch die Verarbeitung durchfallen, wird gemessen.
In der bevorzugten Ausführungsform
wird der Probenträgersatz
als den ersten Test bestehend angesehen, wenn der Anteil von Probenträgern, die
in dem ersten Test durchgefallen sind, weniger als 7% beträgt. Anderenfalls
scheitert der Probenträgersatz.
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In der bevorzugten Ausführungsform
misst und reiht der zweite Probenqualitätstest das Referenzzellenverhältnis für alle normalen
Probenträger
ein. Das Referenzzellenverhältnis
ist die Anzahl festgestellter Referenzzellen (d. h. freiliegender
Zwischenzellen) auf einem Probenträger, geteilt durch die Anzahl
aller auf dem Probenträger
festgestellter Objekte. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Probenträgersatz
als den Test bestehend angesehen, wenn 85% der normalen Probenträger ein
Referenzzellenverhältnis
größer als 0,015
haben. Anderenfalls scheitert der Test.
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Es ist erforderlich, dass der Probenträgersatz
sowohl den Probenqualitätstest
als auch den Probensammelqualitätstest
besteht.
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Das automatisierte System vollführt einen
Probenträgerhandhabungsqualitätstest in
Schritt 50. Der Probenträgerhandhabungsqualitätstest stellt
fest, ob Probenträgervorgehensweisen
abgeändert
werden sollen, um eine effektive Verarbeitung in einem ausgewählten automatisierten
System, wie beispielsweise dem AutoPap® 300
System, zu vereinfachen. Der Test evaluiert die Qualität der Barcodierung,
Reinigung und des Ladens der Probenträger in einer vorausgewählten Klinik.
Die Tabellen 4 und 5 führen
Tests betreffend die Probenträgerhandhabungsqualitätsausfälle auf.
Die Tabelle 4 führt
Ausfälle
betreffend die Einrichtung der Probenträger auf. Die Tabelle 5 führt Ausfälle betreffend
die Eignung von Bildverarbeitungsverfahren auf. Das System misst
den Prozentsatz von Probenträgern,
die durch diese Tests durchfallen. In der bevorzugten Ausführungsform
wird der Probenträgersatz
als den Probenträgerhandhabungsqualitätstest bestehend
angesehen, wenn der Anteil von Probenträgern, der durchfällt, weniger
als 5% ist. Anderenfalls fällt
der Probenträgersatz durch.
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Das automatisierte System vollführt einen
Präparationsqualitätstest in
Schritt 60. Der Präparationsqualitätstest evaluiert
das Ergebnis der labormäßigen Verfahren
der Fixierung, Färbung
und Versehung mit einem Deckglas, um zu sehen, ob die Präsentation
der Zellen innerhalb eines akzeptablen Bereichs ist. In der bevorzugten
Ausführungsform
weisen fünf
Tests den Präparationsqualitätstest auf.
Um den vollen Test zu bestehen, muss der Probenträgersatz
alle Tests bestehen. Im Folgenden wird nun auf die Tabellen 6 und
7 Bezug genommen, wobei die Probenträger, die die Verarbeitung aufgrund
der in der Tabelle angegebenen Gründe nicht bestehen, die Ausfälle der
Präparationsqualität aufweisen.
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Die Dichte der cytoplasmischen Flecke
wird gemessen. Wenn das Maß der
cytoplasmischen Flecke außerhalb
vorbestimmter Grenzen ist, kann das automatisierte System den Probenträger nicht
richtig bewerten. Der Probenträger
wird als ungeeignet für
Bildverarbeitungsverfahren bezeichnet.
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Ebenfalls der Kontrast zwischen den
Referenzzellennuklei und Cytoplasma. Wenn dieses Kontrastmaß außerhalb
der vorbestimmten Grenzen ist, wird der Probenträger als ungeeignet für Bildverarbeitungsverfahren
der Vorrichtung bezeichnet.
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Der Anteil von Probenträgern, die
aus diesen Gründen
nicht verarbeitet werden können,
wird gemessen. Die Tabelle 6 gibt die Probenträger mit Ausfällen wegen
der Einrichtung an. Die Tabelle 7 gibt Ausfälle wegen der Eignung für Bildverarbeitungsverfahren
an. In der bevorzugten Ausführungsform
besteht der Probenträgersatz
den ersten Test, wenn der Anteil von Probenträgern, der durch den ersten
Test durchgefallen ist, weniger als 5 beträgt. Anderenfalls fällt der
Probenträgersatz
durch.
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Der zweite Präparationsqualitätstest misst
die nukleare Fleckendichte auf der auf dem Probenträger erkannten
Referenzzelle. Die Messwerte werden in einer "mittleren Flecken" binären
Datei abgespeichert. Die mittlere optische Dichte jedes erkannten
Zwischen-Zellnukleus
wird gezählt.
Die Daten betreffend alle erkannten Zwischen-Zellnuklei auf dem
Probenträger
werden in einem 10-bin Histogramm gesammelt. Der durchschnittliche
Fleckwert für
normale Probenträger
wird berechnet. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Probenträgersatz
den Test, wenn der durchschnittliche Fleckwert größer als
4,2 und weniger als 6,4 ist. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz
durch.
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Der dritte Präparationsqualitätstest zählt die
Anzahl potentiell anormaler Zellnuklei, die auf einem Probenträger erkannt
wurden (Stufe 3 anormale). Das 80. Perzentil der normalen Probenträger, die
Zellen mit endozervikalen Komponenten enthalten, wird berechnet.
In der bevorzugten Ausführungsform
besteht der Probensatz den Test, wenn das 80. Perzentil größer als
3 ist. Anderenfalls fällt
der Probenträgersatz
durch.
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Der vierte Präparationsqualitätstest misst
das 80. Perzentil des QC-Werts der normalen Probenträger, die
Endozervikalkomponenten-Zellen enthalten. In der bevorzugten Ausführungsform
besteht der Probenträgersatz
den Test, wenn das 80. Perzentil größer als 0,15 und kleiner als
0,6 ist. Anderenfalls fällt
der Probenträgersatz
durch.
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Der fünfte Präparationsqualitätstest misst
den Mittelwert der nuklearen Textur der Referenzzelle (nuklearer
Unschärfemittelwert)
für die
normalen Probenträger,
die Endozervikalkomponenten-Zellen enthalten. In der bevorzugten
Ausführungsform
besteht der Prozensatz den Test, wenn der Mittelwert größer als
5,65 ist. Anderenfalls fällt
der Probenträgersatz
durch.
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In Schritt 70 führt das automatisierte System
einen Klassifikationstest durch. Der Klassifikationstest evaluiert,
ob der Kundenprobenträger
und die Zellenpräsentation
innerhalb des Trainingsbereichs AutoPap® 300
Systems sind, um eine effektive Interpretation durch das System
zu ermöglichen.
Der Test evaluiert die Korrektheit der Probenträgerklassifikationen.
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Der Systemkorrektheitstest evaluiert
die Empfindlichkeit in Bezug auf anormale Probenmorphologie. Das
80. Perzentil des QC-Werts der normalen Probenträger wird berechnet. In der
bevorzugten Ausführungsform
besteht der Probenträgersatz
den Test, wenn mehr als 70% der niedriggradigen Probenträger und
80% der hochgradigen Probenträger
QC-Werte oberhalb des 80. Perzentils für die normalen Probenträger haben.
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In Schritt 80 integriert dann das
automatisierte System die Ergebnisse der Tests in den Schritten 30–70. In
der bevorzugten Ausführungsform
muss der Probenträgersatz
jeden Test bestehen oder der Probenträgersatz wird als durchfallend
angesehen. Wenn der Probenträgersatz
besteht, gibt die Testergebnisintegration wieder, dass der Probenträgersatz
in Schritt 90 akzeptabel ist. Wenn der Probenträgersatz durchfällt, macht
die Testergebnisintegration Vorschläge für eine Einstellung der Labor-
oder Klinikprozesse in Schritt 100. Im Folgenden wird auf 3 Bezug genommen. 3 zeigt ein detailliertes
Flussdiagramm des Verfahrens zum Bewerten von Probenträgern und
der Qualität
von Probenpräparationen
gemäß der Erfindung.
In einer Ausführungsform
der Erfindung werden Probenträger
in Schritt 103 gesammelt. In dem Verfahrensschritt 104 werden
die gesammelten Probenträger
gereinigt, und ein Barcode wird an den Probenträgern befestigt. Bei Verfahrensschritt 106 werden
die Probenträger
in Übereinstimmung
mit den unterschiedlichen Qualitätssteuerverfahren,
die hierin beschrieben sind, verarbeitet. Die Verarbeitung schließt die Verfahrensschritte 108 bis 126 ein,
wie in 3 gezeigt und
mit Bezug auf die unterhalb angegebenen Tabellen. In Verfahrensschritt 108 wird
ein Prozentsatz von Probenträgern
bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung
wegen physikalischer Eigenschaften nicht bestehen. In Verfahrensschritt 118 werden
Probenträger
als inakzeptabel bestimmt, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund
physikalischer Eigenschaften nicht bestehen, wenn mehr als 6 der
Probenträger
diesen Test nicht bestanden haben. In Verfahrensschritt 110 wird
ein Prozentsatz von Probenträgern
bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung
aufgrund von Probensammeleigenschaften nicht bestehen. In Verfahrensschritt 120 werden
Probenträger
bestimmt, die nicht akzeptabel sind, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung
aufgrund Probensammeleigenschaften nicht bestehen, wenn mehr als
7% der Probenträger
diesen Test durchfallen. In Verfahrensschritt 112 wird
ein Prozentsatz von Probenträgern
bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung
aufgrund von Probenträgerhandhabungsqualitätseigenschaften
nicht bestehen. In Verfahrensschritt 112 werden Probenträger bestimmt,
die inakzeptabel sind, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund
von Probenträgerhandhabungsqualitätseigenschaften
nicht bestehen, wenn mehr als 5% der Probenträger diesen Test durchfallen.
In Verfahrensschritt 114 wird ein Prozentsatz von Probenträgern bestimmt,
die die Qualitätssteuerverarbeitung
aufgrund von Probenpräparationseigenschaften
nicht bestehen. In Verfahrensschritt 124 werden Probenträger bestimmt,
die inakzeptabel sind, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund
von Probenqualitätseigenschaften
nicht bestehen, wenn mehr als 5% der Probenträger diesen Test durchfallen.
In Verfahrensschritt 116 wird ein Prozentsatz anormaler
Probenträger
bestimmt, die höher
liegen als das 80. Perzentil der normalen Proben. In Verfahrensschritt 126 werden
Probenträger
bestimmt, die nicht akzeptabel sind, weil weniger als 70% der niedriggradigen
Probenträger
oder weniger als 80% der hochgradigen Probenträger Werte größer als
das 80. Perzentil der normalen Proben haben.
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Die Erfindung wurde in erheblicher
Detaillierung beschrieben, um die Anforderungen an eine Patentanmeldung
zu erfüllen
und dem Fachmann die Informationen bereitzustellen, die notwendig
sind, um die neuen Prinzipien anzuwenden und solche benötigten besonderen
Komponenten zu konstruieren und zu benutzen. Dennoch versteht es
sich, dass die Erfindung mit spezifisch anderen Ausrüstungen
und Vorrichtungen ausgeführt
werden kann und dass verschiedene Modifikationen sowohl zu den Ausrüstungsdetails
als auch zu den Betriebsverfahren ausgeführt werden können, ohne
den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.