DE69629292T2

DE69629292T2 - Verfahren zum feststellen der preparationsgüte von objektträgern und proben

Info

Publication number: DE69629292T2
Application number: DE69629292T
Authority: DE
Inventors: S. Paul WILHELM; J. Shih-Jong LEE
Original assignee: TriPath Imaging Inc
Current assignee: TriPath Imaging Inc
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2016-05-30
Also published as: EP0829065A4; ES2123476T3; AU5882596A; AU725820B2; EP0829065B1; WO1996038809A1; US5671288A; EP0829065A1; JP2001502414A; DE69629292D1; ES2123476T1; CA2220388C; ATE246378T1; JP3822242B2; DE829065T1; GR980300048T1; DK0829065T3; CA2220388A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bewerten der Qualität der Präparation von Probenträgersätzen und Proben, und insbesondere auf einen automatisierten Tester für die Population von biologischen Proben, die auf Probenträgern fixiert und präpariert sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erkennung von Krankheitsprozessen, für die eine Probe genommen wird, kann dann nicht möglich sein, wenn die Probenpräparationen, wie die Fixierung oder Färbung ("staining") nicht korrekt oder unterschiedlich sind. Demnach besteht ein Bedürfnis, biologische Proben bereitzustellen, die mindestens ein minimales Qualitätsniveau besitzen, um eine höhere Wirksamkeit der Krankheitsfeststellung bereitzustellen. Ein Verfahren zum Bewerten von Probenpräparationen stellt sicher, dass Proben unter der Verwendung von Techniken und Material präpariert werden, die ein gewünschtes Qualitätsniveau bereitstellen, um das Ermitteln von interessierenden Krankheitsprozessen zu ermöglichen.
Weiterhin kann beim derartigen Bewerten auch festgestellt werden, ob präparierte Proben für eine Untersuchung mit einem Computer geeignet sind. Die Bewertung kann so eingestellt werden, dass Anforderungen für ein ausgewähltes automatisiertes System erfüllt werden. Des weiteren kann das Bewerten Informationen über die Probenpräparation und physikalische Eigenschaften beinhalten, die verbessert werden müssen.
Probenpräparationen beeinflussen Eigenschaften von Proben, einschließlich morphologischer Details der Zellen. Morphologische Details der Zellen in biologischen Proben müssen intakt bleiben und für visuelle oder computergestützte Untersuchungen der biologischen Proben sichtbar gemacht werden, um effektiv zu sein. Das Färben ("staining") macht die fixierten zellulären Strukturen sichtbar. Unsachgemäßes Fixieren von Proben gestattet es der Zellmorphologie, sich zu verändern und zu degenerieren. Unsachgemäßes Färben ("staining") kann zelluläre Details verdecken oder zelluläre Strukturen nicht sichtbar machen. Die Bewertung sollte feststellen, ob die Probenpräparation in einer solchen Weise durchgeführt wird, dass gute Fixierung und Färbung der Zellen für visuelle Untersuchung oder Analyse durch automatisierte Vorrichtungen bereitgestellt wird. Siehe zum Beispiel die Einleitung zu "Diagnostic Cytopathology of the Uterine Cervix", S. 1–9, von S. Patten, und "Sensitivity and Specificity of Routine Diagnostic Cytology" von S. Patten in "The Automation of Uterine Cancer Cytology", S. 406–415, herausgegeben von Wied, Bahr und Bartels. Gegenwärtig werden Probenpräparationen periodisch durch menschliche visuelle Betrachtung geprüft.
Wie in den oberhalb angegebenen Fundstellen beschrieben wird, ist das Zusammenstellen von Proben oder "sampling" ein anderes Charakteristikum, welches eine starke Auswirkung auf die diagnostische Nutzbarkeit von Proben hat. Wenn die Probe aus dem falschen anatomischen Ort oder mit schlechter Technik entnommen würde, ist es möglich, dass das richtige Spektrum von Zelltypen nicht vorhanden ist. Die Bewertung sollte feststellen, ob das Zusammenstellen von Proben eine gute Auswahl von Zellen für die Untersuchung bereitstellt.
Physikalische Charakteristiken von Probenträgern sind wichtig für die automatisierte Untersuchung von biologischen Proben. Physikalische Charakteristika, wie die Dicke eines Probenträgers, die Ausrichtung eines Deckglases oder die Markierung eines Probenträgers, müssen innerhalb vorher festgelegter Parameter liegen, um eine effektive Bildaufnahme und computergestützte Untersuchung zu ermöglichen. Diese Qualitäten beinhalten die Qualität und Zugänglichkeit der aufgenommenen Probe. Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal ein praktikables Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen dieser Qualitäten bereit.
US-Patent Nr. 4,667,335 beschreibt ein Verfahren zum Untersuchen des Inhalts eines Volumens einer biologischen Probe mit Partikeln zum Feststellen der diagnostischen Signifikanz des Volumens der biologischen Probe. Eine Anzahl von Aliquoten der Probe werden verteilt und unter geringer Feldvergrößerung untersucht. Die Gesamtzahl von untersuchten Aliquoten unter geringer Feldvergrößerung ist ein erster Teil des Volumens der biologischen Probe. Der Prozentsatz von in dem ersten Teil festgestellten Partikeln wird bestimmt. Der festgestellte Prozentsatz von Partikeln wird mit einem ersten bekannten Prozentsatz verglichen. In dem Fall, dass der Vergleich das Ergebnis erbringt, dass die Probe eine für Diagnosezwecke unzureichende Anzahl von Partikeln enthält, wird das Verfahren beendet. Im anderen Fall wird das Verfahren fortgesetzt. Ein zweiter Teil des Volumens der biologischen Probe mit einer Mehrzahl von Allquoten wird unter hoher Feldvergrößerung untersucht. Der Prozentsatz der unter hoher Feldvergrößerung festgestellten Partikel wird totalisiert. Dann wird er mit einem zweiten bekannten Prozentsatz verglichen. Die diagnostische Signifikanz der biologischen Probe wird durch den Vergleich des zweiten Prozentsatzes von Partikeln mit dem Prozentsatz von Partikeln bestimmt, der in dem zweiten Teilvolumen gezählt wurde.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, die objektive Messungen von Probenfärbung und -fixierung, Probenzusammenstellungsqualität und physikalischen Eigenschaften des Probenträgers bereitstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Bewerten von Probenträgereigenschaften und der Qualität von Probenpräparationen gemäß Patentanspruch 1 bereit. Das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet ein Bildanalysesystem, welches weiterhin ein Bildsammelsystem aufweist, das eine Kamera, eine Bewegungssteuerung, ein Beleuchtungssystem und ein Bildübertragungsinterface besitzt. Das Bildsammelsystem ist zum Sammeln von Bilddaten einer auf einem Probenträger montierten Probe ausgebildet. Das Bildsammelsystem ist mit einem Datenverarbeitungssystem verbunden, um Bilddaten von dem Bildsammelsystem zu dem Datenverarbeitungssystem zu übertragen. Das Datenverarbeitungssystem implementiert einen Prozess mit mehreren Schritten. Ein erster Schritt umfasst die Bewertung von physikalischen Eigenschaften des Probenträgers. Ein zweiter Schritt umfasst die Bewertung der Probenzusammenstellungsqualität. Ein dritter Schritt umfasst die Bewertung der Probenträgerhandhabungsqualität. Ein vierter Schritt umfasst die Bewertung der Probenpräparationsqualität. Ein fünfter Schritt umfasst die Bewertung der Probenanalysegenauigkeit.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann anhand der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform, der Patentansprüche und Zeichnungen klar werden, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche Elemente bezeichnen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Um diese Erfindung zu veranschaulichen, wird eine bevorzugte Ausführungsform unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Die 1A, 1B und 1C zeigen eine Ausführungsform der Erfindung.
2 zeigt ein Flussdiagramm des Verfahrens zum Bewerten der Qualität des Probenträgers und der Probenpräparation gemäß der Erfindung.
3 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Bewerten der Qualität von Probenträgern und Probenpräparationen.
4 zeigt ein vereinfachtes schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung gemäß der bevorzugten Ausführungsform.
5A zeigt ein Schema eines Deckglases und Probenträgers mit einer zu analysierenden Probe.
5B ist ein Diagramm einer einzigen Feldansicht geringer Vergrößerung.
6 ist ein hochrangiges Flussdiagramm eines Prozesses, durch den die besten Fokuspositionen auf einer Probe bestimmt werden.
7 ist ein Flussdiagramm eines Prozesses, durch den Bilder von unterschiedlichen fokalen Tiefen gesammelt und verarbeitet werden anhand eines Beispiels der bevorzugten Ausführungsform.
Die 8 und 9 zeigen ein Flussdiagramm der Verarbeitung eines initialen Fokus-Scans, welches ein als Gradientenfokuswert ("gradient focus score") bezeichnetes Verfahren benutzt, und welches einen Startpunkt für die Anwendung des Mustererkennungsfokussierverfahrens bestimmt.
10 ist ein Beispielsausdruck eines Gradientenfokuswerts entlang eines Satzes fokaler Tiefen, eine gefilterte Version davon und die ausgegebene Ableitung der gefilterten Version, wobei die Ausdrucke verwendet werden, um ein Verfahren zu veranschaulichen, bei dem Höchstwerte in dem Gradientenfokuswert aufgefunden werden.
11 zeigt Wege von Mustererkennungs-Fokus-Scans, bezeichnet als zellulläre Fokus-Scans, über die Oberfläche einer Probe.
Die 12A, 12B, 12C und 12D zeigen vier einfache morphologische Binäroperationen.
13 ist ein Datenflussdiagramm des morphologischen Verfahrens des zellulären Fokuswerts.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
In einer momentan bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das hierin offenbarte System in einem System zum Analysieren von zervikalen Pap Abstrichen ("cervical pap smears"), wie dies in der US-Patentanmeldung mit der Nummer 07/838,064 mit dem Titel "Verfahren zum Identifizieren normaler biomedizinischer Proben", Alan C. Nelson, et al., angemeldet am 18. Februar 1992; US-Patentanmeldung Nr. 08/179,812, angemeldet am 10. Januar 1994, die eine Teilungsanmeldung (CIP) der US-Patentanmeldung Nr. 07/838,395 mit dem Titel "Verfahren zum Identifizieren von Objekten mittels Datenverarbeitungstechniken", S. James Lee, et al., angemeldet am 18. Februar 1992; US-Patentanmeldung Nr. 07/838,070, nunmehr US-Patent Nr. 5,315,700 mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum schnellen Verarbeiten von Datensequenzen", Richard S. Johnston et al., angemeldet am 18. Februar 1992; US-Patentanmeldung Nr. 07/838,065, nunmehr US-Patent Nr. 5,361,140 mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zur dynamischen Korrektur von mikroskopischen Bildsignalen", Jon W. Hayenga et al., angemeldet am 18. Februar 1992; und US-Patentanmeldung Nr. 08/302,355, angemeldet am 7. Februar 1994 mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zur schnellen Aufnahme von fokussierten mikroskopischen Bildern" von Hayenga et al., die eine Teilungsanmeldung (CIP) der Anmeldung mit der Nummer 07/838,063, angemeldet am 18. Februar 1992 ist, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls biologische und zytologische Systeme, wie diese in den folgenden Patentanmeldungen beschrieben sind, die auf den gleichen Anmelder wie die vorliegende Erfindung lauten, angemeldet am 20. September 1994 (sofern nicht anders angegeben): US-Patentanmeldung Nr. 08/309,118 von Kuan et al. mit dem Titel "Feldpriorisierungsvorrichtung und -verfahren", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,061 von Wilhelm et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum automatisierten Identifizieren von Zellgruppierungen auf einer biologischen Probe", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,116 von Meyer et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum automatisierten Identifizieren von dicken Zellgruppierungen auf biologischen Proben", US-Patentanmeldung Nr. 08/098,115 von Lee et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum Selbstkalibrieren biologischer Analysesysteme", US-Patentanmeldung Nr. 08/308,992 von Lee et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum Identifizieren und Integrieren von multiplen Zellmustern", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,063 von Lee et al. mit dem Titel "Verfahren zur zytologischen Systemdynamiknormalisierung", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,248 von Rosenlof et al. mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum Erkennen eines Deckglases eines Probenträgers eines Mikroskops", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,077 von Rosenlof et al. mit dem Titel "Vorrichtung zum Erkennen von Blasen in Deckglasklebstoffen", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,931 von Lee et al. mit dem Titel "Zytologische Probenträgerauswertevorrichtung", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,148 von Lee et al. mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum Erkennen von bildebenen Modulationsmustern", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,250 von Lee et al. mit dem Titel "Vorrichtung zur Identifizierung von freiliegenden Zellen", US-Patentanmeldung Nr. 08/309,117 von Wilhelm et al. mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum Erkennen von ungeeigneten Bedingungen für die automatisierte Zytologieauswertung". Gegenstand der Offenbarung ist ebenfalls US-Patentanmeldung Nr. 08/455,296 von Lee et al., angemeldet am 31. Mai 1995 und angemeldet vom selben Anmelder, mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zum kontinuierlichen Überwachen und Vorhersagen von Präparationen von Probenträgern und Proben für eine biologische Probenpopulation".
Im Folgenden wird nun auf die 1A, 1B und 1C Bezug genommen, die ein schematisches Diagramm einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 500 zum Auswerten der Qualität der Probenträger- und Probenpräparation zeigen. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung weist ein Abbildungssystem 502, ein Bewegungskontrollsystem 504, ein Bildverarbeitungssystem 536, ein zentrales Verarbeitungssystem 540 und eine Arbeitsstation 542 auf. Das Abbildungssystem 502 weist einen Illuminator 508, Bildoptiken 510, eine CCD-Kamera 512, einen Illuminationssensor 514 und ein Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 auf. Das Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 stellt den CCD-Kameras 512 Videozeitdaten bereit, wobei die CCD-Kameras 512 dem Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 Bilder bereitstellen, die Scanlinien aufweisen. Die Intensität des Illuminationssensors wird dem Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 bereitgestellt, wobei ein Illuminationssensor 514 die Probe des Bildes von der Optik 510 erhält. In manchen Ausführungsformen kann die Optik 510 Farbfilter aufweisen. In einer Ausführungsform der Erfindung kann die Optik weiterhin ein automatisiertes Mikroskop 511 enthalten. Der Illuminator 508 stellt die Illumination eines Probenträgers bereit. Das Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 stellt dem VME-Bus 538 Daten bereit. Der VME-Bus sendet die Daten an ein Bildverarbeitungssystem 536. Das Bildverarbeitungssystem 536 weist Sehfeldprozessoren 568 auf. Die Bilder werden entlang des Bildbusses 564 von der Bildaufnahme- und -fokussiersystem 516 gesendet. Ein Zentralprozessor 540 regelt den erfindungsgemäßen Betrieb durch den VME-Bus 538. In einer Ausführungsform weist der Zentralprozessor 562 eine MOTOROLA 68030 CPU auf. Der Bewegungsregler 504 weist einen Magazinbehandler 518, einen Mikroskoptischregler 520, einen Mikroskopmagazinregler 522 und einen Kalibrierungs-Probenträger 524 auf. Der Motorantrieb 526 positioniert den Probenträger unter der Optik. Ein Barcodeleser 528 liest einen auf dem Probenträger 524 angeordneten Barcode. Ein Berührungssensor 530 bestimmt, ob ein Probenträger unter den Objektiven des Mikroskops angeordnet ist und eine Türsperrung 532 verhindert den Betrieb, wenn die Türen geöffnet sind. Der Bewegungsregler 534 regelt den Motorantrieb 526 in Abhängigkeit von dem Zentralprozessor 540. Ein Ethernet-Kommunikationssystem 560 kommuniziert mit einer Arbeitsstation 542, um eine Regelung des Systems bereitzustellen. Eine Festplatte 544 wird von der Arbeitsstation 550 geregelt. In einer Ausführungsform kann die Arbeitsstation 550 eine Arbeitsstation aufweisen. Ein Bandlaufwerk 546 ist mit der Arbeitsstation 550 verbunden, genauso wie ein Modem 548, ein Monitor 552, eine Tastatur 554 und eine Maus-Anzeigevorrichtung 556. Ein Drucker 558 ist mit dem Ethernet 560 verbunden.
Während des Betriebs regelt der ein echtzeitbetriebssystemabarbeitender Zentralcomputer 540 das Mikroskop 511 und den Prozessor, um Bilder von dem Mikroskop 511 aufzunehmen und zu digitalisieren. Der Computer 540 regelt ebenfalls den Mikroskoptisch, um die Probe unter dem Objektiv des Mikroskops anzuordnen und zwischen einem und 15 Sehfeldprozessoren 560 (FOV), die Bilder unter Kontrolle des Computers 540 aufnehmen. Es versteht sich, dass die unterschiedlichen hierin beschriebenen Verfahren in Software implementiert sein können, um in einem digitalen Prozessor zu laufen. Die Software kann z. B. in dem Zentralprozessor 540 eingebettet sein.
Im Folgenden wird auf 2 Bezug genommen, die ein Verfahrensflussdiagramm des Verfahrens zum Bewerten der Qualität von Probenträgern- und Probenpräparationen gemäß der Erfindung zeigt. Ein Techniker stellt einen Satz von Laborprobenträgern mit repräsentativen normalen und anormalen Probenträgern in Schritt 10 zusammen. In einer bevorzugten Ausführungsform nimmt die Prüfperson 400 Probenträger auf. Der Probenträgersatz weist die folgenden Probenträger auf:

200 Probenträger innerhalb normaler Grenzen,

150 niedriggradige SIL-Probenträger, und

50 hochgradige SIL-Probenträger
Niedriggradige schuppige intraephitheliale Lesionen (SIL) und hochgradige SIL sind niedriggradige und hochgradige schuppige intraephitheliale Lesionen des Uterus-Cervix.
Die Probenträger in jeder Kategorie können vorteilhafterweise weniger als ein Jahr alt sein und sollten zufällig aus einem Probenträgerarchiv eines Labors ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können alle Probenträger vorzugsweise Deckgläser aus Glas aufweisen. Ein automatisiertes System, wie es beispielsweise in den angegebenen Patenten beschrieben ist, verarbeitet den Probenträgersatz zum Erhalten von Daten zum Bewerten der Qualität der Probenträger- und der Probenpräparation in Schritt 20. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das automatisierte System den AutoPap^® 300 von NeoPath, Inc. aus Bellevue, WA aufweisen. Das automatisierte System verarbeitet und nimmt Daten von den aufgenommenen Probenträgern auf.
In den Schritten 30–70 führt das automatisierte System eine Reihe von Tests bezüglich der in Schritt 20 aufgenommenen Daten aus. In Schritt 30 führt das automatisierte System einen Test betreffend physikalische Eigenschaften des Probenträgers aus, um die physikalischen Eigenschaften von Pap-Abstrich-Probenträgern einzuschätzen, um festzustellen, ob sie erfolgversprechend mit einem vorbestimmten automatisierten biologischen Probenanalysator gescannt werden können, wie beispielsweise dem AutoPap^® 300-System. Der Test betreffend die physikalischen Eigenschaften des Probenträgers schätzt die physikalischen Eigenschaften der aus dem Labor stammenden Probenträger ein. Diese physikalischen Eigenschaften können z. B. die in Tabelle 1 gezeigten Eigenschaften einschließen.
Tabelle 1
Die Vorrichtung und die Probe
Im Folgenden wird nun auf 4 Bezug genommen, die ein vereinfachtes schematisches Blockdiagramm eines Beispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt, um das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung besser erklären zu können. Die gezeigte Vorrichtung weist einen Zentralcomputer 101, ein Echtzeit-Scan-Steuersystem 102, welches die Bewegung des motorisierten Tisches 103 des Mikroskops mit dem Bildaufnahmesystem 104 koordiniert, ein stroboskopisches Illuminationssystem 105, ein Mikroskopobjektiv 107 geringer Vergrößerung, eine elektronische Kamera 108 des CCD-Typs, ein oder mehrere reservierte Bildverarbeitungssysteme 109 und einen Berührungssensor 110 auf. Das stroboskopische Illuminationssystem 105 fokussiert einen kurzen Lichtblitz der Probe 106. Die Probe 106 ist auf einem Glasaufnahmeträger 201 montiert und unter einem transparenten Deckglas 202 geschützt.
Der Computer 101 kann vorteilhafterweise programmiert sein, um die Schritte des Fokussierverfahrens, wie unterhalb detailliert beschrieben, zu begleiten. In 4 stellen die Pfeile zwischen den unterschiedlichen Komponenten den Informationsfluss zwischen den Teilen der Vorrichtung dar.
5A zeigt schematisch eine detailliertere Ansicht eines Probenträgers 201, auf dem eine typische Probe 106 montiert ist, die dann mit einem transparenten Deckglas 202 abgedeckt wird. Ein typischer Probenträger 201 kann 18 mm lang und 27 mm breit bei einer Dicke von 1 mm sein. Ein typisches Deckglas 202 kann 60 mm lang, 24 mm breit und 0,13 mm dick sein. Der beste Fokus auf die Proben 106 variiert von Punkt zu Punkt, aufgrund von Verwölbungen in der Kombination von Probenträger und Deckglas und der immanenten dreidimensionalen Gestalt der Proben selbst.
Ein Raster 203 ist in 5B dargestellt, wobei dieses über die Probe 201 gelegt ist. Das Raster 203 kann in der konkreten Ausführung der Erfindung nicht sichtbar sein, aber es wird hierin für illustrative Zwecke benutzt. Das Raster 203 ist nicht maßstabsgerecht dargestellt. Das Raster 203 zeigt die Unterteilung des Probenträgers in Feldansichten niedriger Vergrößerung, wie Blickfeld 210, die detaillierter in 5B gezeigt sind. Jedes der Blickfelder 210 geringer Vergrößerung ist in 25 Blickfelder höherer Vergrößerung 211, zum Beispiel, unterteilt. In einer Ausführungsform der Erfindung enthält ein aufgenommenes, digitalisiertes Bild einer geringen Vergrößerung ein Blickfeld mit 512 × 512 Pixeln, und es gibt eine Probenfläche von etwa 1,4 mm × 1,4 mm wieder.
Finden des Deckglases
Im Folgenden wird auf 4 und auf 6 Bezug genommen. Das Fokussieren auf eine Probe beginnt damit, dass der Zentralcomputer 101 Anweisungen zum Bewegen des Tisches 103 zu einem vorbestimmten zentralen Ort in Verfahrensschritt 401 an den Scan-Controller 102 schickt. Der zentrale Ort wird unter Berücksichtigung des ungefähr bekannten Orts der Probe 106 in einer solchen Weise ausgewählt, dass sogar kleine Deckgläser, die ordnungsgemäß über der Probe angeordnet sind, einen wesentlichen Bereich um den zentralen Ort abdecken müssen.
In Schritt 402 instruiert der Zentralcomputer 101 den Scan-Controller 102, den Tisch 103 in der senkrechten Achse zu dem Probenträger 201 zu bewegen, so dass sich die Probe 106 dem Berührungssensor 110 annähert. Diese Bewegung setzt sich fort, bis entweder der Bewegungssensor 110 Kontakt mit dem Deckglas 202 über der Probe 106 bei Schritt 403 feststellt oder das Ende der Bewegung in Schritt 404 erreicht wurde. Das Erreichen des Endes der Bewegung bei Schritt 404 zeigt an, dass entweder kein Probenträger vorhanden ist oder ein Probenträger vorhanden ist, der für die Vorrichtung zu dünn ist. In diesem Fall stoppt die automatische Verarbeitung des in Rede stehenden Probenträgers bei Schritt 405.
Wenn der Bewegungssensor 110 Kontakt mit dem Deckglas über der Probe 106 bei Schritt 403 anzeigt, berichtet der Scan-Controller 102 den Ort des Tisches, an dem die Berührung stattgefunden hat, an den Zentralcomputer 101, der diesen bei Schritt 406 abspeichert. Dieser Ort zeigt den Ort des Tisches der Oberseite des Deckglases an dem zentralen Punkt an, wie dieser als Startpunkt zum Fokussieren verwendet wird. Wenn der Berührungssensor Kontakt mit dem Deckglas an einem höheren Punkt als der vorbestimmten Höhe anzeigt, ist der Probenträger zu dick. In einem solchen Fall stoppt die automatische Verarbeitung des in Rede stehenden Probenträgers. Insbesondere wird der Ort des Berührungssensors 110 derart kalibriert, dass er einen bekannten Abstand von der fokalen Ebene der Objektivlinse 107 durch Verwendung von für diesen Zweck geschaffenen Zielen entspricht. In Schritt 411 wird diese Kalibrierung verwendet, um den Tisch 103 in eine Position zu bewegen, so dass die fokale Ebene der Objektivlinse 107 direkt unterhalb der Oberseite des Deckglases 202 an dem zentralen Berührungsort liegt.
Bevor jedoch das Fokussieren fortgesetzt werden kann, muss der Ort des Deckglases besser bestimmt werden. In Richtung dieses Endes werden bei Schritt 407 vier weitere Berührungen ausgeführt, die im Wesentlichen ähnlich zu den ersten oberhalb beschriebenen Berührungen bei den Schritten 402 bis 404 sind. Diese Berührungen werden an unterschiedlichen Orten des Probenträgers innerhalb einer minimalen zentralen Deckglasfläche durchgeführt. Die Orte des Deckglases bei jedem dieser Berührungen werden ebenfalls aufgenommen. Bei Schritt 408 wird eine Ebene der kleinsten Quadrate von den fünf Berührungsorten konstruiert und die Abweichung der Ebene mit einem erlaubten Maximum verglichen. Wenn die Abweichung des Maximum überschreitet oder wenn eine der vier Berührungen keinen Ort aufnehmen konnte, wird die Verarbeitung des Probenträgers bei Schritt 405 gestoppt. Ein sehr stark abweichendes Deckglas bei Schritt 408 zeigt normalerweise an, dass der Probenträger nicht richtig in die Vorrichtung geladen wurde.
Da die ungefähre Position des Deckglases bekannt ist, wird zu diesem Zeitpunkt eine detailliertere Suche nach den Rändern bei Schritt 409 durchgeführt. Wenn die Ränder des Deckglases nicht gefunden wurden oder wenn deren Größe oder Form als nicht korrekt angezeigt wurde, wird bei Schritt 410 die Verarbeitung des Probenträgers wiederum bei Schritt 405 angehalten.
Bei Schritt 411 wird der Tisch zu der zentralen Berührungsposition zurückgeführt. Dies geschieht bei einer solchen Höhe, dass die fokale Ebene des Objektivs 107 direkt unterhalb der berührten Oberfläche des Deckglases 202 ist. Bei Schritt 412 wird das Fokussieren der Probe 106 fortgesetzt, wobei der zentrale Computer 101 den Scan-Controller 102 zum Koordinieren der Bewegung des Tisches 103 mit dem Bildaufnahmesystem 104 instruiert, um einen initialen Fokus-Scan durchzuführen, wobei von der Position ausgegangen wird, bei der das Objektiv 107 ein Bild direkt unterhalb der Oberfläche des Deckglases 202 in der zentralen Berührungsposition auf die CCD-Kamera 108 fokussiert.
Der initiale Fokus-Scan
Zu diesem Zeitpunkt beschreiben wir den initialen Fokus-Scan im Detail, wobei wiederum auf die 5A, 5B, 6, 7, 8, 9, 10 und 11 sowie 4 Bezug genommen wird.
Der Zweck eines Fokus-Scans ist es, Bilder aus unterschiedlichen fokalen Ebenen in der Probe aufzunehmen und zu verarbeiten, um die beste fokale Ebene zu finden. Jeder Fokus-Scan wird gemäß dem Beispiel der bevorzugten Ausführungsform wie folgt ausgeführt. Im Folgenden wird gemeinsam auf die 4 und 7 Bezug genommen. Der Zentralcomputer 101 reicht eine Liste von Tischpositionen an den Scan-Controller 102 weiter, wobei es sich um Tischpositionen handelt, bei denen Bilder bei Schritt 1501 zu sammeln sind. Die Tischpositionen sind derart ausgewählt, dass das Objektiv 107 in unterschiedlichen Ebenen in der Probe 106 fokussiert.
Der Scan-Controller 102 berechnet den zeitlichen Ablauf der Bewegung des Tisches und konstruiert eine Tabelle, wobei aufeinanderfolgenden Positionen des Tisches zu sammelnden Bildern zugeordnet werden, sowie der Zeitpunkt, zu dem sich der Tisch an dem jeweiligen Ort befinden wird. Die Einträge der Tabelle werden berechnet und an das Bildaufnahmesystem 104 bei Schritt 1502 weitergegeben.
Sobald das Bildaufnahmesystem 104 die Tabelle bei Schritt 1503 erhalten hat, initiiert der Scan-Controller 102 die Bewegung des Tisches 103. Die Bewegung des Tisches wird von Encodern bei Schritt 1504 überwacht, um Korrektheit zu sichern. Jegliche falsche Tischpositionen werden dem Computer 101 berichtet, der wiederum den Tisch zurücksetzen und die Verarbeitung wieder aufnehmen kann.
Zu jedem in der Tabelle aufgeführten Zeitpunkt signalisiert das Bildaufnahmesystem 104 dem stroboskopischen Illuminator 105 bei Schritt 1505 zu blitzen. Der Illuminator 105 fokussiert einen kurzen Lichtblitz auf der Probe 106 an dem spezifizierten Ort bei Schritt 1506. Das Illuminatorsystem überwacht die Blitze des "Strobe" mit einem Lichtsensor bei Schritt 1507. Jegliche fehlende Blitze oder Blitze falscher Intensität werden dem Computer 101 berichtet, der die Verarbeitung des Probenträgers anhalten kann.
Bei Schritt 1508 fokussiert das Objektiv 107 ein Bild von dem illuminierten Blickfeld der Probe 106 auf die Kamera 108. Bei Schritt 1509 sammelt das Bildaufnahmesystem 104 eine digitale Wiedergabe des Bildes, welches von der Kamera 108 aufgenommen wurde. In einem Beispiel besteht die digitale Wiedergabe des Bildes aus 512 Zeilen × 512 Spalten von Pixeln, von denen jedes einem Grauwert von 0 (steht für den dunkelsten Wert) bis 255 (steht für den hellsten Wert) zu gewiesen ist. Falls notwendig, kann das Bild in analoger Form von der Kamera 108 an das Bildaufnahmesystem 104 gesendet werden und dann durch einen Analog-/Digitalumwandler geschickt werden, um die digitale Wiedergabe zu erstellen. Das Bildaufnahmesystem 104 sendet jedes digitale Bild, das es aufgenommen hat, an den oder die Bildverarbeiter 109 bei Schritt 1510. Der oder die ausgewählte Bildverarbeiter 109 vollführt eine vorprogrammierte Sequenz von morphologischen, rechnerischen und logischen Operationen auf jedem Bild, das von dem Bildaufnahmesystem 104 gesendet wurde, um einen oder mehrere Faktoren der Fokusqualität abzuleiten. Diese Faktoren werden berechnet und an den Computer 101 bei Schritt 1511 gesendet. Sobald der Computer 101 die Faktoren von jedem Bild in der Liste erhalten hat, die ursprünglich an den Scan-Controller 102 bei Schritt 1501 gesendet wurden, verarbeitet er die Liste von Faktoren, um den optimalen Fokusort bei Schritt 1512 zu bestimmen.
Während die Bilder aufgenommen und verarbeitet werden, setzt der Tisch 103 die Bewegung der Probe 106 in Übereinstimmung mit den Befehlen des Scan-Controllers 102 von Schritt 1503 an fort, bis die Liste gesammelter Bilder zuende ist. Der initiale Fokus-Scan beginnt, wie oberhalb beschrieben, bei einer Position, an der das Objektiv 107 auf eine Bildebene direkt unterhalb der Oberfläche des Deckglases an dem zentralen Berührungsort fokussiert ist. Der Scan wird weiter unterhalb des Deckglases fortgesetzt, wobei für jede Tiefe des Fokus des Objektivs 107 ein Bild gesammelt wird, bis die der maximalen optischen Dicke des Deckglases entsprechende Tiefe überschritten wurde. Die maximale optische Dicke des Deckglases kann eine vorbestimmte, zulässige Dicke sein, die von der jeweilig verwendeten Vorrichtung abhängt.
Der initiale Fokus-Scan wird benutzt, um einen Startpunkt, auch "seed point" genannt, zu identifizieren, um das System auf die Probe zu fokussieren. Da es nicht wichtig ist, ob dieser Startpunkt von den Zellen in der Probe abgeleitet oder lediglich Schmutz oder anderes Material auf der Oberfläche des Probenträgers ist, wird eine morphologische Mustererkennung nicht für den initialen Fokus-Scan benutzt.
Stattdessen wird ein einfacherer Intensitätsgradient-Fokusqualitätsfaktor wie folgt berechnet. Nunmehr wird auf 8 Bezug genommen, die das Verfahrensflussdiagramm für den Bildprozessor zeigt, wenn dieser den Gradientfokuswert berechnet. Beginnend bei Schritt 601 wird ein Histogramm der Graustufen des Bildes berechnet. Dieses Histogramm wird verwendet, um ein Maß der Illuminationshelligkeit oder ein Helligkeitsniveau, das in dem Bild vorliegt, zu berechnen. Insbesondere kann das Helligkeitsniveau als das höchste Intensitätsniveau definiert sein, bei dem 0,1% oder mehr der Pixel der Bildaufnahme eine höhere Intensität besitzen.
Bei Schritt 602 werden die horizontalen und vertikalen Gradienten der Lichtintensität bei jedem der Pixel in dem digitalisierten Bild berechnet. Für den vertikalen Gradienten wird die Berechnung bei jedem Pixel derart ausgeführt, dass der Intensitätswert des Pixels direkt unterhalb von dem Pixel direkt oberhalb abgezogen wird. Der horizontale Gradient wird in einer vergleichbaren Weise berechnet. Diese Gradienten werden mit einem Schwellenwert verglichen, um den Effekt des Bildrauschens betreffend das Maß der Bildschärfe zu reduzieren. Gradienten unterhalb des vorbestimmten Schwellenwerts werden als 0 behandelt. Der Fachmann wird unter Verwendung dieser Offenbarung verstehen, dass der Schwellenwert empirisch oder von den Rauscheigenschaften der spezifischen verwendeten Bildvorrichtung abgeleitet werden kann.
Um die besten fokalen Orte verschiedener Regionen innerhalb des Blickfelds voneinander unterscheiden zu können, unterteilt der Bildprozessor das Blickfeld in ein Gitter von 5 × 5, wie dies in 5B bei Schritt 603 gezeigt ist. Die anschließende Verarbeitung berechnet 25 unterschiedliche Fokuswerte, von denen jeweils eins für einen der 25 Bereiche in dem Raster steht.
Bei Schritt 604 werden 50 Histogramme berechnet, von denen jeweils zwei einem der 25 Rasterbereiche in dem Bild entsprechen.
Die zwei Histogramme werden auf den Bildern des horizontalen bzw. vertikalen Gradienten berechnet.
Sogar ein Fokussiervorgang, der keine Mustererkennung ausführt, muss die Größe der zu fokussierenden Objekte in gewisser Weise berücksichtigen, um Informationen aus dem geeigneten Bereich räumlicher Frequenz aufzunehmen. Aufgrund der Tatsache, dass das hierin beschriebene Fokussiersystem ausgebildet ist, um bei geringen Vergrößerungen auf kleinen Objekten zu arbeiten, berücksichtigt der Intensitätsgradientalgorithmus die Größe, indem nur die 50 hochgradigsten in den 25 Regionen bei Schritt 605 verwendet werden. Der Rest des Gradienthistogramms wird nicht berücksichtigt.
Bei Schritt 606 werden die Quadrate dieser 50 Gradienten aufsummiert und durch das Helligkeitsniveau geteilt, um 25 Fokustreffer für jedes Bild in dem Fokus-Scan herzustellen. Das Helligkeitsniveau wird verwendet, um die Treffer zu normalisieren, um deren Abhängigkeit von der Illumination von quadratisch auf linear zu reduzieren. Dies ist sinnvoll, weil der Algorithmus bei Bildern in einem Kontext verwendet werden kann, in dem die Illumination aus irgendwelchen Gründen undeutlich ist.
Sobald das Bildverarbeitungssystem 109 die 25 Gradientenfokustreffer für jedes Bild in dem initialen Fokus-Scan berechnet hat, werden diese Treffer gemeinsam mit der entsprechenden Fokusposition an den Zentralcomputer 101 zurückgesendet, wie dies oberhalb beschrieben und in Schritt 1511 in 7 gezeigt ist.
Die Aufgabe des Zentralcomputers 101 in Schritt 1512 von 7 ist es, Höchstwerte in den Fokustreffern als Funktion der Fokusposition in jedem der 25 Bereiche zu suchen, falsche Fluktuationen aufgrund von Rauschen zu ignorieren und eine initiale Abschätzung der besten fokalen Ebene zu treffen. Dieses wird wie in 9 gezeigt erreicht.
Zunächst werden bei Schritt 620 die Treffer für jeden Bereich über die Fokusposition gefiltert, um Rauschen in den Fokustreffern zu reduzieren. Für diesen Zweck wird ein Gauß'scher Kernel mit einer halben Breite bei dem halben Maximum verwendet, das der Tiefe des Feldes des Objektivs entspricht.
Zweitens wird im Schritt 621 die Ableitung der Fokustreffer bezüglich der Position für jeden Bereich und jede Position berechnet, indem die gefilterten Fokustreffer bei jeder Position und jedem Bereich von den gefilterten Fokustreffern der darauf folgenden Position für denselben Bereich abgezogen werden.
Drittens werden bei Schritt 622 Höchstwerte in dem Fokustrefter in allen Bereichen identifiziert, indem nach Mustern über Positionen von zwei positiven Ableitungen gefolgt bei zwei negativen Ableitungen gesucht wird und überprüft wird, um sicherzustellen, dass das Fokusergebnis an dem Höchstwert oberhalb eines vorbestimmten Minimums liegt, um das Auffinden falscher Höchstwerte zu vermeiden. Der präzise Ort des Höchstwerts wird durch lineare Interpolation des Gradienten zum Nulldurchgang gefunden.
7 zeigt den Vorgang des Auffindens der Höchstwerte durch Ausdrucken eines Beispiels der originalen Fokustreffer 701, der Gauß-gefilterten Fokustreffer 702 und der Differenz der gefilterten Treffer 703, gegenüber der Fokusposition. Die in 7 ausgedruckten Treffer geben die in einem einzigen Bereich aufgefundenen Werte wieder. Die interpolierte 0 der Ableitung bei 704 gibt die berechnete Position des Höchstwerts wieder. Es ist zu beachten, dass die positiven Ableitungen vor dem Höchstwert und die negativen Ableitungen hinter dem Höchstwert liegen.
Viertens wird in Schritt 623 die Schärfe jedes Höchstwerts gemessen, indem die Größe der zweiten Ableitung der gefilterten Fokustreffer an dem Höchstwert durch die Größe des Höchstwerts geteilt wird. Die Schärfe stellt ein Anzeichen bereit, wie bestimmt eine Präferenz für die gegebene Fokusposition den Höchstwert anzeigt.
Fünftens werden in Schritt 624 alle aufgefundenen Höchstwerte in allen Bereichen in zwei Klassen unterteilt: solche, die eine minimale optische Dicke des Deckglases oder mehr unterhalb des höchsten Höchstwerts haben und solche, die dies nicht haben. Sie werden unterteilt, um alle Höchstwerte, die von Schmutz oben auf dem Deckglas stammen können, von den richtigen Höchstwerten von der Probe zu unterscheiden.
Sechstens wird in Schritt 625 in jedem Bereich der Höchstwert mit dem höchsten Fokuswert in jeder Klasse beibehalten, während alle anderen Höchstwerte in dem gleichen Bereich und der gleichen Klasse ignoriert werden. Somit werden maximal 25 Höchstwerte in jeder Klasse berücksichtigt.
Siebtens wird in Schritt 626 ein gewichteter Mittelwert der Position der Höchstwerte in jeder Klasse gewählt, um die beste Fokusposition für das volle Blickfeld in jeder Klasse wiederzugeben. Die Höchstwertpositionen werden anhand der relativen Höchstwertschärfe gewichtet, die in Schritt 623 berechnet wurde, um die gewichteten Mittelwerte herzuleiten. Falls irgendeiner der Höchstwerte eine Schärfe besitzt, die größer als ein Faktor 4 weniger als der schärfste Höchstwert in der Klasse ist, wird dieser nicht bei der Mittelung berücksichtigt, da er für diesen Schritt zu weich ist. Somit verbleiben maximal zwei mögliche Fokuspositionen. Es ist zu beachten, dass es möglich ist, dass alle Höchstwerte in der oberen Klasse sind, wobei dann nur eine Fokusposition in diesem Stadium vorhanden ist.
Achtens wird zum Vermeiden der Möglichkeit des Fokussierens auf die Oberfläche des Deckglases, wenn dort zwei Fokuspositionen vorhanden sind, die niedrigere Klasse (weiter unterhalb des Deckglases) als repräsentativ für den besten Fokus auf der Probe bei Schritt 627 ausgewählt.
Neuntens und abschließend scheitert der Scan beim Auffinden einer besten Fokusposition bei Schritt 630, wenn kein gültigen Höchstwerte bei Schritt 622 gefunden wurden. Andererseits wird die bei Schritt 627 gewählte Fokusposition von dem Computer 101 bei Schritt 629 abgespeichert. In dieser Weise wird die Diskussion des initialen Fokus-Scans abgeschlossen.
Mehrfache Versuche eines initialen Scans
Im Folgenden wird wieder auf 6 Bezug genommen. Das Ergebnis des initialen Fokus-Scans bei Schritt 412 ist somit entweder eine Start-Fokusposition oder das Scheitern beim Auffinden eines Höchstwertes. In nahezu allen Fällen ist der oberhalb beschriebene initiale Fokus-Scan erfolgreich, wenn ein eine Probe tragender Probenträger verwendet wird, der die physikalischen Anforderungen bezüglich der Deckglasdicke und -anordnung erfüllt. Dies ist deshalb der Fall, weil nur sehr wenig Material zum Darauffokussieren erforderlich ist und der Scan in der Mitte des Probenträgers durchgeführt wird, wo wahrscheinlich ein Teil der Probe angeordnet ist.
Dennoch wird beim Auffinden eines Fehlers in Schritt 413 zusätzlich versucht, einen "seed point" zum Fokussieren zu finden. Insbesondere wenn eine geringere Anzahl von Versuchen als eine gesetzte Anzahl in Schritt 414 durchgeführt wurde, wird ein neuer Ort in Schritt 415 ausgewählt, der sich in einem Blickfeld befindet, das benachbart zu dem ist, in dem gerade ein Fokus-Scan versucht wurde. Das Verfahren versucht dann einen weiteren initialen Scan in Schritt 412. Die folgenden Versuche können in einem spiralförmigen Muster um den ursprünglichen Berührungspunkt durchgeführt werden, so dass neue Blickfelder weiter ausgewählt werden, während so nahe wie möglich an dem mittigen Berührungsort geblieben wird. Nur wenn alle der gesetzten Anzahl von Versuchen in Schritt 414 nicht erfolgreich waren, wird das Verarbeiten des Probenträgers in Schritt 405 beendet.
Sobald eine initiale Fokusposition in Schritt 412 gefunden wurde, beginnen die Mustererkennung oder zelluläre Fokus-Scans an diesem Punkt, der als der "seed point" bezeichnet wird, um eine Karte der Fokusebene zu erstellen.
11 zeigt den Weg der zellulären Fokus-Scans über die Oberfläche der Probe, wobei der Ort des "seed point" mit einem "X" markiert ist. Die Quadrate 801 stellen die gescannten Blickfelder dar, während die Pfeile 802 den Weg zeigen, dem der Tisch folgt. Der Zweck des Folgens des gezeigten Weges ist es, so nah wie möglich zum Erreichen einer repräsentativen Probe von den Probenträgern zu kommen, während die zum Scannen erforderliche Zeit minimiert wird. Der verwendete Tisch braucht zum gleichzeitigen Bewegen in zwei Dimensionen nicht mehr Zeit als zum Bewegen in nur einer, so dass die dargestellten diagonalen Bewegungen die Bewegungsgeschwindigkeit maximieren.
Im Folgenden wird wiederum auf 6 Bezug genommen. In Schritt 416 erfolgen die ersten Scans rechts von und benachbart zu dem "seed point" in 11. Das in 11 dargestellte Zickzackmuster dreht um, wie beispielsweise bei 804, jedes Mal, wenn das Scannen die Ränder des Deckglases erreichen. Das gesamte Muster muss beendet werden, bevor das hintere rechte Ende des Deckglases in 11 erreicht wurde. Das Scannen setzt dann bei den Schritten 422 und 416 fort, wobei erneut benachbart zu dem "seed point", links von dem "seed point" begonnen wird, an dem mit einem Kreis in 11 markierten Scan. Es ist zu beachten, dass die letzte Umkehrung des Scannens 803, dargestellt in 11, fünf Schritte erfordert. Dies ist zu vergleichen mit den drei durchzuführenden Schritten bei 804 und jeder anderen Umkehrung. Dieses verdeutlicht die Tatsache, dass bei unterhalb beschriebenen Bedingungen die Anzahl von Schritten in einer Umkehr von drei auf fünf erhöht wird, um die Verarbeitung der Probe zu beschleunigen.
Die zwei ersten zellulären Fokus-Scans werden in der fokalen Ebene zentriert, die von dem "seed point" definiert ist. Zelluläre Fokus-Scans sind weitaus flacher als die oberhalb beschriebenen Gradienten-Scans. Diese bestehen lediglich aus der Aufnahme und der Verarbeitung von vier Bildern, die wiederum ungefähr durch die Tiefe des Fokus der Objektivlinse getrennt sind. Dieses macht die zellulären Scans sehr viel schneller. Das Auffinden der besten Fokusposition aus einem zellulären Scan ist notwendigerweise einfacher als aus einem Gradienten-Scan, da nur vier Punkte vorhanden sind, mit denen gearbeitet wird. Es wird mehr Wert auf das Verarbeiten des Bildes gelegt, um das Signal von Rauschen zu befreien und insbesondere die Nuklei gut getrennter Zellen zu erkennen und auf diese zu fokussieren. Es ist zu beachten, dass Zellen in Haufen oftmals weniger hilfreiche Informationen bereitstellen, wenn ihre Nuklei nicht klar auseinandergehalten werden können.
Zelluläre Morphologie
Die Verarbeitung eines Bildes in einem zellulären Fokus-Scan weist eine Kombination einfacher morphologischer Vorgänge auf. Die 12A–12D zeigen vier einfache morphologische Binäroperationen. 12A zeigt eine Erosion mit einem 3 × 3-Block, während 12B eine Dilation mit dem gleichen Block zeigt. 12C zeigt eine Erosion mit einem 5 × 5-Drahtrahmen, und 12D zeigt eine Dilation mit demselben Drahtrahmen.
Ein morphologischer Vorgang, wie eine Erosion oder eine Dilation, schließt zwei Objekte ein. Das erste Objekt ist das Bild, auf dem gearbeitet wird, und das zweite Objekt ist ein Strukturierungselement, mit dem der Vorgang ausgeführt wird. Das Strukturierungselement kann als Gitter von Pixeln dargestellt werden, dessen Werte entweder "an" oder "aus" sind und welches ein einzigartiges mittleres Pixel aufweist. Die mittleren Pixel der Strukturierungselemente in 12A–12D sind mit X gekennzeichnet.
Ein morphologischer Vorgang kann die Vergegenwärtigung beim Platzieren der Mitte des Strukturierelements über jedes Pixel in dem originalen Bild sein. Eine Binäroperation arbeitet auf Bildern, deren Pixel weder "an" noch "aus" sind. Die beiden einfachsten Operationen sind die binäre Erosion und Dilation. Die binäre Erosion schaltet alle Pixel in dem Bild auf "aus", wenn das Strukturierelement darauf zentriert ist. Dies bezieht sich auf Bilder, die mindestens ein "aus"-Pixel in Überdeckung mit einem "an"-Pixel des Elements besitzen. Alle anderen Pixel in dem Bild sind auf "an" gesetzt. Dilation stellt alle Pixel in dem Bild auf "an", wenn das Strukturierelement darauf zentriert ist, wobei mindestens ein "an"-Pixel des Bilds Überdeckung mit einem "an"-Pixel des Strukturelements besitzen. Alle anderen Pixel werden auf "aus" gesetzt. Binäre Erosion und Dilation werden bequem zu Graustufen-Erosion und -Dilation verallgemeinert. Graustufen-Erosion ersetzt den Wert jedes Pixels in dem Bild durch das Minimum der Werte dieser Pixel, die "an"-Pixeln in dem Element entsprechen. Graustufen-Dilation ersetzt den Wert jedes Pixels durch das Maximum der Werte der Pixel, die den "an"-Pixeln in dem Element entsprechen. Erosion und Dilation werden kombiniert, um zusammengesetzte Operationen durchzuführen. Insbesondere wird eine Dilation gefolgt von einer Erosion mit demselben Element als Schließen bezeichnet, während eine Erosion gefolgt von einer Dilation als Öffnen bezeichnet wird.
13 ist ein Datenflussdiagramm des zellulären Fokuswert-morphologischen Prozesses. Jedes Bild aus jedem zellulären Fokus-Scan wird nach dem Abspeichern in der Kamera 108 und dem Digitalisiertwerden durch das Bildaufnahmesystem 104 durch diesen Satz von Operationen von dem Bildprozessor (den Bildprozessoren) 109 verarbeitet. Wie in 10 dargestellt ist, besitzt das Verfahren vier Hauptzweige.
Auf dem ersten Zweig wird ein Histogramm 1011 von den Graustufenwerten des Bildes 1001 genommen, und drei Graustufenwerte 1012, als weißes, cyto und dunkles Niveau bezeichet, werden aus dem Histogramm berechnet. Der weiße Wert ist derselbe wie das Helligkeitsniveau, welches in der obigen Diskussion der Gradientenfokuswerte beschrieben wurde. Das Cyto-Niveau ist als 95% des weißen Werts definiert. Wie der Name andeutet, stellen Teile des Bildes mit Grauniveaus unterhalb dieses Niveaus Flächen mit zumindest einigem Cytoplasma dar. Das dunkle Niveau ist als 1/15 des weißen Werts definiert, plus eine Menge, die einen Rauschboden darstellt. Teile des Bildes mit Grauniveaus unterhalb des dunklen Werts stellen entweder dicke Klumpen der Probe oder Artefakte anderen Materials dar. Solche Teile werden beim Fokussieren nicht berücksichtigt.
Auf dem zweiten Zweig des zellulären morphologischen Verfahrens wird jedes Pixel in dem Originalbild 1001 bei Schritt 1021 getestet, um zu sehen, ob sein Grauniveau den Cyto-Schwellenwert überschreitet. Wenn dies der Fall ist, wird das korrespondierende Pixel in einem Binärbild auf 0 gesetzt. Wenn dies nicht der Fall ist, wird das Binärpixel auf 1 gesetzt. Das hierdurch erzeugte Binärbild passiert durch eine morphologische Öffnung 1022 durch eine 5 × 5-Box, gefolgt von einer Öffnung 1023 von einer 43 × 43-Box.
Die Öffnung 1022 von der 5 × 5-Box ist zum Abstoßen von Teilen ausgebildet, die zu klein sind, um Zellen zu repräsentieren, während die Öffnung 1023 von der 43 × 43-Box Teile detektiert, die so groß sind, dass sie zusammenhängende Gruppen von Zellen anstelle von Zellen mit Öffnungen dazwischen darstellen müssen. In Übereinstimmung mit den Erfordernissen des Fokussierens auf freiliegenden Zellen werden die Ergebnisse der zwei Öffnungen exklusiv mit "oder" in Schritt 1024 verbunden, um ein cytoplasmisches Binärbild zu generieren, welches dann bei 1025 von einer 5 × 5-Box dilatiert wird, um jeden Nukleus aufzunehmen, der im Randbereich der Zellen angeordnet sein kann.
Der dritte Zweig des zellulären Fokuswertalgorithmusses überprüft jedes Pixel des Originalbilds 1001 in Schritt 1031, um herauszufinden, ob es ein Grauniveau besitzt, welches größer als das oberhalb definierte Dunkelniveau ist. Wenn dies der Fall ist, wird das korrespondierende Pixel eines Binärbildes auf 1 gesetzt. Wenn dies nicht der Fall ist, wird es auf 0 gesetzt. Das resultierende dunkle Binärbild wird bei 1032 erodiert von einer 43 × 43-Box, um Fokussieren auf den Rändern dicker Klumpen von Proben oder Teilen, die mit Artefakten überlagert sind, zu verhindern. Das dunkle Binärbild wird dann mit "und" gemäß 1033 mit dem cytoplasmischen Binärbild kombiniert, um ein Binärbild herzustellen, welches die gestatteten Regionen für zu erkennende Nuklei darstellt.
Der vierte und letzte Zweig des Algorithmus ist zum Erkennen von Nuklei ausgebildet. Er beginnt mit einem Graustufen-Schließen 1041 des Originalbilds 1001 von einem 5 × 5-Stein. Dieses Schließen wird normalerweise die interessierenden Nuklei aus dem Bild entfernen. Das Originalbild 1001 wird dann in Schritt 1042 von dem Ergebnis des Schließens abgezogen, um ein texturverbessertes invertiertes Bild herzustellen, in welchem die Nuklei als deutliche helle Punkte erscheinen.
Um ein Binärbild zu entwickeln, welches die Nuklei identifiziert, wird das Ergebnis des Schließens in Schritt 1043 durch 8 geteilt und dann gegen das texturverstärkte Bild in Schritt 1044 getestet. Wenn das Grauniveau des texturverstärkten Bildes das Maß des lokalen Ähnlichkeitsniveaus überschreitet, wird das in Rede stehende Pixel als potentieller Teil eines Nukleus in Schritt 1044 markiert. Dieses Binärbild wird mit "und" gemäß 1045 mit den erlaubten Teilen des Binärbilds kombiniert, um eine Binärmaske möglicher nuklearer Pixel zu generieren.
Das somit in Schritt 1045 hergestellte Binärmaskenbild hat den Fehler, dass wenige Restriktionen nuklearer Größe oder Form darauf platziert wurden. Die nächsten Schritte sind zum Beheben dieser Beschränkung ausgebildet. Zunächst wird eine Öffnung 1046 von einer 2 × 2-Box angewendet, um solitäre Pixel oder Stränge von Pixeln einfacher Breite zu eliminieren. Zweitens wird eine Dilation 1047 der resultierenden Maske durch einen 7 × 7 hohlen Rahmen von Pixeln bei 1048 invertiert, dann mit "und" gemäß 1049 mit der Maske kombiniert, um solche Teile der voraussichtlichen Nuklei loszuwerden, die nicht in den 7 × 7-Rahmen passen. Dieses erfordert, dass die voraussichtlichen Nuklei ungefähr elliptische Gestalt besitzen. Drittens und zum Abschluss wird das resultierende Binärbild gemäß 1050 mit einer 3 × 3-Box dilatiert, um die Ränder der Nuklei in der Maske einzuschließen. Das Ergebnis von Schritt 1050 ist das letztendliche Maskenbild, welches Nuklei zeigt, die alle Erfordernisse zum Fokussieren erfüllen.
Sogar nachdem die Nuklei identifiziert wurden, bleibt es erforderlich, die Schärfe zu messen, mit der diese fokussiert sind. Um dies zu tun, wird das in Schritt 1042 hergestellte texturverstärkte Bild gemäß 1051 durch einen 3 × 3-Stein erodiert, und das resultierende Bild von dem texturverstärkten Bild selbst gemäß 1052 abgezogen, um ein verstärktes Gradientenbild herzustellen. In Schritt 1053 wird dieses verstärkte Gradientenbild dann auf 0 gesetzt, und zwar dort wo das finale Maskenbild aus Schritt 1050 eine 0 enthält. Es verbleibt dort ungeändert, wo das finale Maskenbild eine 1 enthält.
Schließlich wird ein Histogramm 1054 von den Grauniveaus des resultierenden Bildes genommen, um ein Maß der Quantität der aufgefundenen nuklearen Masse zu addieren und natürlich die Schärfe des Fokus auf die Nuklei. Zwei Maße werden aus dem Histogramm 1054 bei Schritt 1055 wie folgt berechnet. Zunächst wird jedes Niveau des verstärkten Gradientenbilds unterhalb von 5% des weißen Niveaus als hervorgerufen von nichtnuklearem Material ignoriert. Daraufhin wird jeder Pixel oberhalb dieses Niveaus in die Summe der Gesamtzahl akzeptabler nuklearer Pixel gezählt, und das nukleare Schärfemaß wird als das mittlere Quadrat verstärkte Gradientenniveau der Pixel berechnet, die oberhalb von 5% des weißen Niveaus sind. Die Summe des akzeptablen nuklearen Pixel ist ein Maß der Menge verwendbarer aufgefundener Probe, während das nukleare Schärfemaß durch das weiße Niveau geteilt wird, um die Abhängigkeit von dem Helligkeitsniveau zu reduzieren und dann als der zelluläre Fokuswert verwendet zu werden.
Zelluläre Fokusverarbeitung
Der Zentralcomputer 101 erhält dann vier Fokuswerte und vier Pixelzählungen von dem Bildprozessor (den Bildprozessoren) 109 für jeden durchgeführten zellulären Fokus-Scan. Der Computer verarbeitet diese Maße. Die Verarbeitung läuft wie unterhalb beschrieben ab.
Zunächst bestimmt der Computer, welcher Fokuswert der höchste ist. Wenn der höchste Fokuswert der am weitesten von dem Deckglas entfernte ist, ist das Ergebnis des Fokus-Scans ein Anzeichen, dass es notwendig ist, sich weiter weg von dem Deckglas zu bewegen, um eine bessere Fokusebene zu erhalten. Wenn dies nicht der Fall ist, wird die nukleare Pixelzählung des Bildes mit dem höchsten Fokuswert überprüft, um zu sehen, ob diese 0,1% des Bildes überschreitet. Wenn dies nicht der Fall ist, ist offensichtlich nicht genug in dem Blickfeld zum Fokussieren vorhanden und der Computer legt fest, dass das Scannen in derselben Ebene fortgesetzt wird.
Wenn die nukleare Pixelzählung größer als 0,1% des Bildes ist und das Bild mit dem höchsten Fokuswert das nächste zu dem Deckglas ist, ist das Ergebnis des Fokus-Scans ein Anzeichen dafür, dass es notwendig sein könnte, sich näher an das Deckglas zu bewegen, um eine bessere Fokusebene zu erhalten. Ausreichende Daten werden vor der Bewegung in Richtung des Deckglases aufgenommen, um zu verhindern, dass eine Bewegung zum versuchten Fokussieren auf Material auf dem Deckglas über sehr dünne Probenträger stattfindet.
Wenn das Bild mit dem höchsten Fokuswert weder oben noch unten in dem Scan ist und das Bild mit dem höchsten Fokuswert eine nukleare Pixelzählung von mehr als 0,1% des Bildes hat, können die Differenzen der Fokuswerte linear interpoliert werden, um den Höchstwert zu lokalisieren. Die Interpolation wird an dem Nulldurchgang in der Ableitung durchgeführt, und zwar in analoger Weise zu dem als 704 in 7 dargestellten interpolierten Nulldurchgang. Dies zeigt das erfolgreiche Auffinden eines besten Fokus an, und sein Ort wird aufgenommen. Schließlich ist das Anzeichen zum weiteren Fokussieren das Zentrieren über der aufgenommenen besten Fokusebene.
Im Folgenden wird nunmehr erneut auf 6 Bezug genommen. Diese folgt der Verwendung zellulärer Fokus-Scans in dem Fokus-Scanning der Probe. Wie zuvor erwähnt wurde, werden die ersten zwei zellulären Fokus-Scans in Schritt 416 über der durch den "seed point" definierten Ebene zentriert. Bei Schritt 417 wird das Ergebnis des ersten dieser Scans von dem Computer 101 verarbeitet. Nach dem Ableiten des Ergebnisses fragt der Computer 101 den nächsten zellulären Scan im Schritt 418 an.
Wenn das Ergebnis des gerade verarbeiteten Fokus-Scans anzeigt, dass der Fokus gemäß 1103 abgesenkt werden sollte, wird der angefragte Scan 418 einen Fokusschritt tiefer als der gerade verarbeitete Scan zentriert. Wenn das Ergebnis anzeigte, dass nicht genug Daten gemäß 1105 vorhanden waren, wird der angefragte Scan 418 über derselben Ebene wie der gerade verarbeitete Scan zentriert. Wenn das Ergebnis anzeigte, dass der Fokus gemäß 1107 höher gebracht werden sollte, wird die Ebene des letzten erfolgreichen Fokus-Scans getestet, um zu sehen, ob die momentane Fokusposition weniger als die Hälfte einer minimalen optischen Dicke des Deckglases darüber ist. Wenn dies der Fall ist, wird der angefragte Scan 418 einen Fokusschritt höher zentriert. Wenn dies nicht der Fall ist, wird zum Verhindern des Versuchs des Fokussierens auf der Oberfläche des Deckglases der angefragte Scan 418 über derselben Ebene wie der gerade zuvor verarbeitete Scan zentriert.
Im Folgenden wird nunmehr erneut auf 6 Bezug genommen. In Schritt 419 testet der Computer die Position des Fokus-Scans, der gerade angefragt wurde, um zu sehen, ob er im äußeren rechten oder linken Ende des Deckglases ist. Dies geschieht in Übereinstimmung mit dem in 11 dargestellten Scanmuster. Wenn dies nicht der Fall ist, kehrt der Computer zu Schritt 417 zurück, um das Ergebnis des gerade abgeschlossenen Scans zu berechnen und dann einen neuen Scan bei Schritt 418 anzufragen. Es ist zu beachten, dass die fokale Höhe jedes zellulären Scans auf dem Ergebnis des Scans zwei davor basiert. Dies gestattet es dem Scan-Controller 102, dem Bildaufnahmesystem 104, dem Bildprozessor (den Bildprozessoren) 109 und dem Computer 101, Fokus-Scans kontinuierlich gleichzeitig zu verarbeiten, so schnell der Tisch sich bewegen kann, wobei keine Verzögerungszeit benötigt wird, um die Ergebnisse einer Berechnung abzuwarten.
Wenn ein Ende des Deckglases in Schritt 419 erreicht wurde, verbleiben noch zwei Ergebnisse von Fokus-Scans, die in Schritt 420 zu verarbeiten sind. Dann überprüft der Computer in Schritt 421, um zu sehen, ob das Fokus-Scannen bereits in beide Richtungen von dem "seed point" durchgeführt wurde, wie dies in 11 gezeigt ist. Wenn dies der Fall ist, wird das zelluläre Fokus-Scannen der Probe bei Schritt 423 abgeschlossen. Wenn dies nicht der Fall ist, kehrt die Maschine an den "seed point" in Schritt 422 zurück und beginnt das Scannen in entgegengesetzter Richtung zurück in Schritt 416. Die ersten beiden Fokus-Scans in beide Richtungen werden über der Ebene des "seed point" zentriert.
Eine minimale Anzahl erfolgreicher zellulärer Fokus-Scans wird benötigt, um korrekt auf einer Probe zu fokussieren. In einer beispielhaften Ausführungsform beträgt die minimale Anzahl 24 Scans. Wenn diese Anzahl nicht erreicht wurde, nachdem alle in 11 gezeigten Scans abgeschlossen wurden, muss die Probe für eine automatische Verarbeitung abgelehnt werden. "Pap"-Abstriche, die aus diesem Grund abgelehnt wurden, sind normalerweise aufgrund unzureichender schuppiger Zellularität unbefriedigend. Zusätzlich ist es möglich, erfolgreiche Scans nur in einem Bereich des Probenträgers zu haben. Wenn erfolgreiche Fokus-Scans nicht alle Bereiche des Probenträgers abdecken, wird der Probenträger abgelehnt, weil die Proben in zu kleinen Flächen angeordnet sind.
Sobald ein Modell der Fokusoberfläche der Probe zur Verfügung steht, kann es als Anleitung zum Scannen der gesamten Probe unter dem Deckglas bei geringer Vergrößerung verwendet werden. Es kann ebenfalls als Ausgangspunkt für die Vergrößerung großer Stärke verwendet werden, die auf die Probe fokussiert. Wenn die Fokusoberfläche zu schräggestellt ist, kann Fokussieren mit starker Vergrößerung nicht für das gesamte Blickfeld hoher Vergrößerung möglich sein. Wenn die Fokusoberfläche zu schräggestellt ist, wird die Verarbeitung des Probenträgers gestoppt. Wenn die Fokusoberfläche zu variabel ist, ist es möglich, dass Fokus-Scans fehlerhafte Fokusinformationen bereitgestellt haben. Wenn die Fokuskarte zu variabel ist, stoppt die Verarbeitung der Probenträger als "Fokussieren auf Probe nicht möglich".
Die Daten des erfolgreichen Fokus-Scans können ebenfalls gemeinsam mit der Höhe des Deckglases, die von dem Berührungssensor gegeben wurde, verwendet werden, um die optische Dicke des Deckglases über der Probe abzuschätzen. Wenn die optische Dicke des Deckglases zu groß oder zu klein ist, wird eine inakzeptabel große sphärische Aberration hergestellt, wenn die Probe durch eine Objektivlinse hoher Auflösung betrachtet wird. Als Ergebnis davon kann die Probe ungeeignet für Untersuchungen mit Mikroskopen großer Vergrößerung sein. Wenn das Maß zwischen Probe und Deckglas, die optische Dicke, größer als ein erster vorbestimmter Abstand oder kleiner als ein zweiter vorbestimmter Abstand ist, wird die Verarbeitung des Probenträgers beendet.
In der bevorzugten Ausführungsform wird das Fokusoberflächenmodell verwendet, um das Scannen der Probe mit geringer Vergrößerung zu führen. Bereiche der Probe werden auf mögliche Anormalitäten untersucht. Jedes Blickfeld des Probenträgers wird bezüglich der Wahrscheinlichkeit des Enthaltens einer Anormalität eingeschätzt. Wenn zu wenige Blickfelder eingeschätzt werden, kann es sein, dass der Probenträger nicht ordnungsgemäß gescannt wurde, so dass die Verarbeitung dieses Probenträgers gestoppt wird. Während des Scans mit geringer Vergrößerung werden Blasenbereiche identifiziert. Wenn zu viele Blasenbereiche existieren, stoppt die Verarbeitung des Probenträgers.
In einer Ausführungsform wird nach dem Scan mit geringer Vergrößerung ein Fokusoberflächenmodell für den Scan mit großer Vergrößerung geschaffen. Da die Tiefe des Feldes bei großer Vergrößerung reduziert ist, wird eine korrekte Fokusoberfläche benötigt. Fokus-Scans werden in ziemlich der gleichen Weise wie für die Fokusoberfläche geringer Vergrößerung ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die Scans bei großer Vergrößerung ausgeführt werden. Wenn die Oberfläche der großen Vergrößerung zu variabel ist oder zu wenige Fokus-Scans erfolgreich sind, stoppt die Verarbeitung des Probenträgers.
Ein Scan mit großer Vergrößerung wird nach der Erstellung des Fokusoberflächenmodells großer Vergrößerung ausgeführt. Während des Scans mit großer Vergrößerung werden Bereiche des Probenträgers, die während des Scans mit geringer Vergrößerung als potentiell Anormalitäten enthaltend eingestuft wurden, abgebildet und bei großer Vergrößerung analysiert. Die Fokusoberfläche großer Vergrößerung dient als die wesentliche Abschätzung der Fokusposition für das Bildaufnehmen mit großer Vergrößerung. Wenn die von der Fokusoberfläche mit großer Vergrößerung bereitgestellte Position zu Bildmaterial führt, welches vorbestimmte Fokuskriterien nicht erfüllt, werden zusätzliche Bildaufnahmeversuche in dem gleichen Probenträgerbereich bei unterschiedlichen Fokuspositionen unternommen. Wenn nach der vorbestimmten Anzahl von Aufnahmeversuchen der Bereich außerhalb des vorbestimmten Fokuskriteriums verbleibt, wird der Probenträgerbereich verworfen. Wenn zu wenige Probenträgerbereiche korrekt während des Scans mit hoher Vergrößerung fokussiert wurden, wird die Verarbeitung des Probenträgers abgebrochen. Wenn während des Scans mit großer Vergrößerung weniger als die vorbestimmte Anzahl korrekt fokussierter Scans beim ersten Mal vorliegt oder zu viele Probenträgerbereiche nicht korrekt fokussiert sind, kann es sein, dass das Fokusoberflächenmodell großer Vergrößerung nicht korrekt war.
Die Bildqualität wird überprüft, um gutes Bildmaterial zu gewährleisten. Bildsättigung, Pixel mit Werten von 0 oder 255 werden für jedes Bild gezählt. Die Anzahl der Bilder mit Sättigung wird gezählt. Wenn zu viele Bilder entweder während des Scans mit geringer oder großer Vergrößerung gesättigt sind, kann es sein, dass die Optik für verlässliches Betrachten oder Aufnehmen der Probe nicht geeignet ist. Zusätzlich ist es möglich, dass Bildartefakte, wie beispielsweise Streifen, auf manchen Systemen erkennbar sind, wenn Schmutz den optischen Weg verdunkelt. Wenn Streifen in mehr als einer vorbestimmten Anzahl von Bildern festgestellt werden, ist es möglich, dass der Probenträger zu schmutzig zum korrekten Betrachten und Aufnehmen der Probe ist.
Während der Evaluierung stoppt das automatisierte System die Verarbeitung von Probenträgern, die aus einem akzeptablen Bereich bezüglich irgendeines vorausgewählten Kriteriums herausfallen. Das automatisierte System kann einen Anteil der Probenträger zählen, die nicht verarbeitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es festgelegt, dass der Probenträgersatz besteht, wenn der Anteil von Probenträgern, die nicht verarbeitet werden, weniger als 6% beträgt. Anderenfalls besteht der Probenträgersatz nicht.
In Schritt 40 führt das automatisierte System einen Probensammelqualitätstest aus, um die Qualität und das Ausreichen des Probenmaterials, welches auf dem Probenträger vorhanden ist, zu evaluieren. Die Probensammelqualität ist hochgradig abhängig von den Testwerkzeugen und -techniken für die Probensammlung einer Klinik. In der bevorzugten Ausführungsform kann der Probensammelqualitätstest zwei Tests umfassen. Die Tabellen 2 und 3 führen Qualitäten auf, bezüglich welcher die Probenträgersätze getestet werden können. Probenträger, die durch diese Tests durchfallen, bilden die Ausfälle der Probensammelqualität. Tabelle 2 zeigt Ausfälle aufgrund des Aufbaus von Probenträgern. Tabelle 3 zeigt Ausfälle aufgrund der Prozesstauglichkeit. Prozesstauglichkeitsfehler können z. B. Probenträger einschließen, für die Prozessergebnisse nicht als verlässlich erwartet werden können, z. B. wenn der Prozess zu wenige Referenzzellen erkennt. Der Anteil von Probenträgern, die aus diesem Grund durch die Verarbeitung durchfallen, wird gemessen. In der bevorzugten Ausführungsform wird der Probenträgersatz als den ersten Test bestehend angesehen, wenn der Anteil von Probenträgern, die in dem ersten Test durchgefallen sind, weniger als 7% beträgt. Anderenfalls scheitert der Probenträgersatz.
In der bevorzugten Ausführungsform misst und reiht der zweite Probenqualitätstest das Referenzzellenverhältnis für alle normalen Probenträger ein. Das Referenzzellenverhältnis ist die Anzahl festgestellter Referenzzellen (d. h. freiliegender Zwischenzellen) auf einem Probenträger, geteilt durch die Anzahl aller auf dem Probenträger festgestellter Objekte. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Probenträgersatz als den Test bestehend angesehen, wenn 85% der normalen Probenträger ein Referenzzellenverhältnis größer als 0,015 haben. Anderenfalls scheitert der Test.
Es ist erforderlich, dass der Probenträgersatz sowohl den Probenqualitätstest als auch den Probensammelqualitätstest besteht.
Tabelle 2
Tabelle 3
Das automatisierte System vollführt einen Probenträgerhandhabungsqualitätstest in Schritt 50. Der Probenträgerhandhabungsqualitätstest stellt fest, ob Probenträgervorgehensweisen abgeändert werden sollen, um eine effektive Verarbeitung in einem ausgewählten automatisierten System, wie beispielsweise dem AutoPap^® 300 System, zu vereinfachen. Der Test evaluiert die Qualität der Barcodierung, Reinigung und des Ladens der Probenträger in einer vorausgewählten Klinik. Die Tabellen 4 und 5 führen Tests betreffend die Probenträgerhandhabungsqualitätsausfälle auf. Die Tabelle 4 führt Ausfälle betreffend die Einrichtung der Probenträger auf. Die Tabelle 5 führt Ausfälle betreffend die Eignung von Bildverarbeitungsverfahren auf. Das System misst den Prozentsatz von Probenträgern, die durch diese Tests durchfallen. In der bevorzugten Ausführungsform wird der Probenträgersatz als den Probenträgerhandhabungsqualitätstest bestehend angesehen, wenn der Anteil von Probenträgern, der durchfällt, weniger als 5% ist. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz durch.
Tabelle 4
Tabelle 5
Das automatisierte System vollführt einen Präparationsqualitätstest in Schritt 60. Der Präparationsqualitätstest evaluiert das Ergebnis der labormäßigen Verfahren der Fixierung, Färbung und Versehung mit einem Deckglas, um zu sehen, ob die Präsentation der Zellen innerhalb eines akzeptablen Bereichs ist. In der bevorzugten Ausführungsform weisen fünf Tests den Präparationsqualitätstest auf. Um den vollen Test zu bestehen, muss der Probenträgersatz alle Tests bestehen. Im Folgenden wird nun auf die Tabellen 6 und 7 Bezug genommen, wobei die Probenträger, die die Verarbeitung aufgrund der in der Tabelle angegebenen Gründe nicht bestehen, die Ausfälle der Präparationsqualität aufweisen.
Die Dichte der cytoplasmischen Flecke wird gemessen. Wenn das Maß der cytoplasmischen Flecke außerhalb vorbestimmter Grenzen ist, kann das automatisierte System den Probenträger nicht richtig bewerten. Der Probenträger wird als ungeeignet für Bildverarbeitungsverfahren bezeichnet.
Ebenfalls der Kontrast zwischen den Referenzzellennuklei und Cytoplasma. Wenn dieses Kontrastmaß außerhalb der vorbestimmten Grenzen ist, wird der Probenträger als ungeeignet für Bildverarbeitungsverfahren der Vorrichtung bezeichnet.
Der Anteil von Probenträgern, die aus diesen Gründen nicht verarbeitet werden können, wird gemessen. Die Tabelle 6 gibt die Probenträger mit Ausfällen wegen der Einrichtung an. Die Tabelle 7 gibt Ausfälle wegen der Eignung für Bildverarbeitungsverfahren an. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Probenträgersatz den ersten Test, wenn der Anteil von Probenträgern, der durch den ersten Test durchgefallen ist, weniger als 5 beträgt. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz durch.
Tabelle 6
Tabelle 7
Der zweite Präparationsqualitätstest misst die nukleare Fleckendichte auf der auf dem Probenträger erkannten Referenzzelle. Die Messwerte werden in einer "mittleren Flecken" binären Datei abgespeichert. Die mittlere optische Dichte jedes erkannten Zwischen-Zellnukleus wird gezählt. Die Daten betreffend alle erkannten Zwischen-Zellnuklei auf dem Probenträger werden in einem 10-bin Histogramm gesammelt. Der durchschnittliche Fleckwert für normale Probenträger wird berechnet. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Probenträgersatz den Test, wenn der durchschnittliche Fleckwert größer als 4,2 und weniger als 6,4 ist. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz durch.
Der dritte Präparationsqualitätstest zählt die Anzahl potentiell anormaler Zellnuklei, die auf einem Probenträger erkannt wurden (Stufe 3 anormale). Das 80. Perzentil der normalen Probenträger, die Zellen mit endozervikalen Komponenten enthalten, wird berechnet. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Probensatz den Test, wenn das 80. Perzentil größer als 3 ist. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz durch.
Der vierte Präparationsqualitätstest misst das 80. Perzentil des QC-Werts der normalen Probenträger, die Endozervikalkomponenten-Zellen enthalten. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Probenträgersatz den Test, wenn das 80. Perzentil größer als 0,15 und kleiner als 0,6 ist. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz durch.
Der fünfte Präparationsqualitätstest misst den Mittelwert der nuklearen Textur der Referenzzelle (nuklearer Unschärfemittelwert) für die normalen Probenträger, die Endozervikalkomponenten-Zellen enthalten. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Prozensatz den Test, wenn der Mittelwert größer als 5,65 ist. Anderenfalls fällt der Probenträgersatz durch.
In Schritt 70 führt das automatisierte System einen Klassifikationstest durch. Der Klassifikationstest evaluiert, ob der Kundenprobenträger und die Zellenpräsentation innerhalb des Trainingsbereichs AutoPap^® 300 Systems sind, um eine effektive Interpretation durch das System zu ermöglichen. Der Test evaluiert die Korrektheit der Probenträgerklassifikationen.
Der Systemkorrektheitstest evaluiert die Empfindlichkeit in Bezug auf anormale Probenmorphologie. Das 80. Perzentil des QC-Werts der normalen Probenträger wird berechnet. In der bevorzugten Ausführungsform besteht der Probenträgersatz den Test, wenn mehr als 70% der niedriggradigen Probenträger und 80% der hochgradigen Probenträger QC-Werte oberhalb des 80. Perzentils für die normalen Probenträger haben.
In Schritt 80 integriert dann das automatisierte System die Ergebnisse der Tests in den Schritten 30–70. In der bevorzugten Ausführungsform muss der Probenträgersatz jeden Test bestehen oder der Probenträgersatz wird als durchfallend angesehen. Wenn der Probenträgersatz besteht, gibt die Testergebnisintegration wieder, dass der Probenträgersatz in Schritt 90 akzeptabel ist. Wenn der Probenträgersatz durchfällt, macht die Testergebnisintegration Vorschläge für eine Einstellung der Labor- oder Klinikprozesse in Schritt 100. Im Folgenden wird auf 3 Bezug genommen. 3 zeigt ein detailliertes Flussdiagramm des Verfahrens zum Bewerten von Probenträgern und der Qualität von Probenpräparationen gemäß der Erfindung. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Probenträger in Schritt 103 gesammelt. In dem Verfahrensschritt 104 werden die gesammelten Probenträger gereinigt, und ein Barcode wird an den Probenträgern befestigt. Bei Verfahrensschritt 106 werden die Probenträger in Übereinstimmung mit den unterschiedlichen Qualitätssteuerverfahren, die hierin beschrieben sind, verarbeitet. Die Verarbeitung schließt die Verfahrensschritte 108 bis 126 ein, wie in 3 gezeigt und mit Bezug auf die unterhalb angegebenen Tabellen. In Verfahrensschritt 108 wird ein Prozentsatz von Probenträgern bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung wegen physikalischer Eigenschaften nicht bestehen. In Verfahrensschritt 118 werden Probenträger als inakzeptabel bestimmt, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund physikalischer Eigenschaften nicht bestehen, wenn mehr als 6 der Probenträger diesen Test nicht bestanden haben. In Verfahrensschritt 110 wird ein Prozentsatz von Probenträgern bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund von Probensammeleigenschaften nicht bestehen. In Verfahrensschritt 120 werden Probenträger bestimmt, die nicht akzeptabel sind, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund Probensammeleigenschaften nicht bestehen, wenn mehr als 7% der Probenträger diesen Test durchfallen. In Verfahrensschritt 112 wird ein Prozentsatz von Probenträgern bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund von Probenträgerhandhabungsqualitätseigenschaften nicht bestehen. In Verfahrensschritt 112 werden Probenträger bestimmt, die inakzeptabel sind, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund von Probenträgerhandhabungsqualitätseigenschaften nicht bestehen, wenn mehr als 5% der Probenträger diesen Test durchfallen. In Verfahrensschritt 114 wird ein Prozentsatz von Probenträgern bestimmt, die die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund von Probenpräparationseigenschaften nicht bestehen. In Verfahrensschritt 124 werden Probenträger bestimmt, die inakzeptabel sind, weil sie die Qualitätssteuerverarbeitung aufgrund von Probenqualitätseigenschaften nicht bestehen, wenn mehr als 5% der Probenträger diesen Test durchfallen. In Verfahrensschritt 116 wird ein Prozentsatz anormaler Probenträger bestimmt, die höher liegen als das 80. Perzentil der normalen Proben. In Verfahrensschritt 126 werden Probenträger bestimmt, die nicht akzeptabel sind, weil weniger als 70% der niedriggradigen Probenträger oder weniger als 80% der hochgradigen Probenträger Werte größer als das 80. Perzentil der normalen Proben haben.
Die Erfindung wurde in erheblicher Detaillierung beschrieben, um die Anforderungen an eine Patentanmeldung zu erfüllen und dem Fachmann die Informationen bereitzustellen, die notwendig sind, um die neuen Prinzipien anzuwenden und solche benötigten besonderen Komponenten zu konstruieren und zu benutzen. Dennoch versteht es sich, dass die Erfindung mit spezifisch anderen Ausrüstungen und Vorrichtungen ausgeführt werden kann und dass verschiedene Modifikationen sowohl zu den Ausrüstungsdetails als auch zu den Betriebsverfahren ausgeführt werden können, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.

Claims

Verfahren zum Auswerten eines Probenträgersatzes unter Verwendung eines automatisierten Probenträgerabtastsystems, wobei das automatisierte Probenträgerabtastsystem einen Zentralrechner (101), ein Echtzeitabtaststeuersystem (102), das die Bewegung eines motorisierten Objekttisches (103) eines Mikroskops mit einem Bildaufnahmesystem (104) koordiniert, ein stroboskopisches Beleuchtungssystem (105), ein Mikroskopobjektiv (107) geringer Vergrößerung, eine elektronische Kamera (108) vom CCD-Typ, ein oder mehrere spezialisierte Bildverarbeitungssysteme (109) und einen Berührungssensor (110) umfasst, wobei das stroboskopische Beleuchtungssystem (105) einen kurzen Lichtblitz auf die Probe (106) richtet und wobei die Probe (106) auf einem Glasprobenträger (201) befestigt und von einer transparenten Probenabdeckung (202) abgedeckt ist, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) Verwenden des automatisierten Probenträgerabtastsystems zur Auswertung der physikalischen Eigenschaften des Probenträgers; und (b) Feststellen, ob ein Probenträger erfolgreich von einem vorbestimmten automatisierten Analysator für biologische Proben abgetastet werden kann, basierend auf dem Schritt des Auswertens der physikalischen Eigenschaften des Probenträgers.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin den Schritt Ausführen mindestens einer Messung von Probenträgerdimension aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen mindestens eines Oberflächenmerkmals einer Probenträgerprobenabdeckung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob eine Länge einer Probenträgerabdeckung innerhalb eines Satzes von vorgegebenen Grenzwerten liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob eine Breite einer Probenträgerprobenabdeckung innerhalb vorgegebener Grenzwerte liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob eine Probenabdeckungsfläche innerhalb vorgegebener Grenzwerte liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob mindestens ein Abstand zwischen Probe und Probenabdeckung kleiner als ein vorgegebenes Maß ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob mindestens ein Abstand zwischen Probe und Probenabdeckung größer als ein vorgegebenes Maß ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen mindestens einer geometrischen Eigenschaft des Probenträgers aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Auswertens von physikalischen Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob die Probenträgerprobenabdeckungsecken innerhalb vorgegebener Grenzwerte rechtwinklig sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Auswertens physikalischer Eigenschaften eines Probenträgers weiterhin ein Überprüfen aufweist, ob eine Probenträgerprobenabdeckung zu dem Probenträger mehr als ein vorgegebener Grenzwert schräg verläuft.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Probenträger von einem automatisierten System mit einem Abbildungssystem betrachtete wird, wobei das Abbildungssystem in der Lage ist, sich auf eine Probe zu fokussieren, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt Überprüfen aufweist, ob sich das Abbildungssystem zu einem vorgegebenen Grad an Genauigkeit auf die Probe fokussiert hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Parameter einer physikalischen Eigenschaft gemessen wird und das weiterhin den Schritt Bestimmen, ob der mindestens eine Parameter innerhalb vorgegebener Grenzwerte liegt, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Parameter einer physikalischen Eigenschaft gemessen wird und das weiterhin den Schritt Bestimmens, ob der mindestens eine Parameter innerhalb eines Trainingsbereichs des vorbestimmten automatisierten Analysators für biologische Proben liegt aufweist.