DE69815085T2 - System und verfahren zur klassifizierrung von zellproben - Google Patents

System und verfahren zur klassifizierrung von zellproben Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die automatisierte Analyse von zellularen Spezimen auf Objektträgern (microscope slides) und insbesondere auf die automatisierte Analyse von zellularen Spezimen, die gefärbte Marker enthalten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Auf dem Gebiet der medizinischen Diagnose einschließlich der Onkologie, ist die Erfassung, Kennzeichnung, Quantisierung und Charakterisierung von interessierenden Zellen, wie beispielsweise Karzinomzellen, durch das Testen von biologischen Proben oder Spezimen ein bedeutsamer Aspekt der Diagnose. Typischerweise wird eine biologische Probe, wie beispielsweise Knochenmark, Lymphknoten, peripheres Blut, Zerebrospinal-Fluid, Urin, Effusionen, feine Nadelaspirate, periphere Blutabschabungen oder andere Materialien durch Färbung des Spezimen aufbereitet, um die interessierenden Zellen zu kennzeichnen. Ein Verfahren der Zellenspezimenaufbereitung besteht darin, ein Spezimen mit einem spezifischen Tester reagieren zu lassen, der ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonales Antiserum oder eine Nukleinsäure sein kann und mit einem Teil der interessierenden Zellen, wie beispielsweise Tumorzellen, reagiert. Die Reaktion kann mittels einer enzymatischen Reaktion, wie beispielsweise alkaliner Phosphatase oder Glukoseoxidase oder Peroxidase, um ein lösliches farbloses Substrat in ein gefärbtes unlösliches Präzipitat umzuwandeln, oder durch direktes Verbinden eines Farbstoffs mit dem Tester erfasst werden.
  • Beispielsweise können Substanzen, die gelegentlich als Marker bezeichnet werden, in dem Blut einer Person als Ergebnis eines medizinisch anormalen Zustands existieren. Diese Marker können für solche Zustände, wie präleukämische Karzinome, Trisomie-21-Fötus oder andere bekannte Zustände existieren, die verursachen, dass Marker in dem Blut existieren. Diese Marker sind normalerweise nicht visuell erfassbar. Eine Blutzellenprobe kann jedoch festgelegt und mit einem Substrat eines Enzyms gebunden werden, um ein gefärbtes unlösliches Präzipitat zu erzeugen, um die Marker zu kennzeichnen. Die die aufbereiteten zellularen Spezimen enthaltenden Träger werden dann geprüft, um die Menge des in dem zellularen Spezimen enthaltenen Präzipitats auszuwerten, um zu bestimmen, ob der zellulare Spezimen angibt, dass der Zustand in der Person existiert, von der die Probe genommen wurde.
  • Blutzellen werden beispielsweise in zwei Arten klassifiziert – rote und weiße Zellen. Die roten Zellen befördern Sauerstoff mittels Hämoglobin zu dem Gewebe in einer Person. Die weißen Zellen beziehen sich im allgemeinen auf das Immunsystem einer Person. Weiße Blutzellen sind aus fünf Arten zusammengesetzt, von denen eine, Neutrophile, einen plattenförmigen Kern aufweist, der typischerweise verwendet wird, um diese Art von weißen Blutzellen zu kennzeichnen. Als Antwort auf die Anwesenheit eines Fötus weisen die neutrophilen Zellen in dem Blut einer schwangeren Frau ein erhöhtes Niveau von alkaliner Phosphatase auf. Wenn der Fötus ein Trisomie-21-Fötus ist, ist das Niveau der alkalinen Phosphatase in den Neutrophilen sogar höher. Somit kann die Menge von alkaliner Phosphatase in den Neutrophilen des Bluts einer schwangeren Frau als einen Marker für einen Trisomie-21-Fötus verwendet werden. Durch Aufbereiten eines Blutspezimens von einer schwangeren Frau mit einer Färbung zum Kennzeichnen der alkalinen Phosphatase in Neutrophilen und einer Kontrastfärbung, um die Erfassung des plattenförmigen Nukleus von Neutrophilen zu ermöglichen, kann ein Pathologe visuell die Wahrscheinlichkeit bestimmen, dass der Fötus ein Trisomie-21-Fötus ist.
  • Die Prüfung von biologischen Spezimen wurde in der Vergangenheit entweder von einem Labortechnologe oder einem Pathologen manuell durchgeführt. Bei dem manuellen Verfahren wird ein mit einem biologischen Spezimen aufbereiteter Träger mit einer niedrigen Vergrößerung unter einem Mikroskop betrachtet, um interessierenden Kandidatenzellen visuell zu lokalisieren. Diejenigen Bereiche des Trägers, wo die interessierenden Zellen lokalisiert sind, werden dann mit einer höheren Vergrößerung betrachtet, um diejenigen Objekte als interessierenden Zellen zu bestätigen. Das manuelle Verfahren ist zeitintensiv und kann für Fehler, einschließlich fehlende Bereiche des Trägers, empfänglich sein. Bei dem oben gegebenen Beispiel wird eine Abtastung mit niedriger Vergrößerung durchgeführt, um die Neutrophile anhand der plattenförmigen Kerne mittels der Kontrastfärbungsfarbe zu kennzeichnen.
  • Automatisierte Zellenanalysesysteme wurden entwickelt, um die Geschwindigkeit und die Genauigkeit des Trägerauswertungsverfahrens zu verbessern. Ein bekanntes interaktives System umfasst ein einziges Mikroskopobjektiv mit hoher Leistung zum Abtasten eines Trägergestells, wobei deren Abschnitte vorher zur Prüfung durch einen Bediener gekennzeichnet wurden. Bei diesem System tastet der Bediener zuerst jeden Träger mit einer niedrigen Vergrößerung ähnlich dem manuellen Verfahren ab und vermerkt interessierende Punkte auf dem Träger für eine spätere Analyse. Der Bediener speichert dann die Adresse der vermerkten Stelle und die zugeordnete Funktion in einer Datendatei. Sobald die interessierenden Punkte lokalisiert und von dem Bediener gespeichert wurden, wird der Träger dann in einer automatisierten Analysevorrichtung positioniert, die Bilder des Trägers an den markierten Punkten erfasst und eine Bildanalyse durchführt.
  • Es gibt ebenfalls bekannte automatisierte Spezimenanalysesysteme, die Träger automatisch betrachten, die in in einem Magazin geladenen Haltern angeordnet sind. Die Träger werden dann einzeln von dem Magazin zu einem motorisierten X-Y-Objekttisch des Mikroskops bewegt. Der motorisierte Objekttisch wird betätigt, um einen Träger in dem Halter unter einem Objektivrevolver des Mikroskops zu platzieren, und der Träger wird mit einer niedrigen Vergrößerungsleistung abgetastet. Die Ansicht des Trägers durch die Okulare des Mikroskops wird von einer Kamera erfasst, die entweder eine digitale Kamera oder eine analoge Kamera mit einem A/D-Wandler sein kann. Das digitalisierte Bild wird an ein Computersubsystem geliefert, das mit dem automatisierten Mikroskop gekoppelt ist, um interessierende Kandidaten-Objekte auf dem Träger au erfassen. Information hinsichtlich des interessierenden Kandidaten-Objekts wird dann gespeichert, und die Betrachtungsleistung für den Objektivrevolver wird auf ein hohes Vergrößerungsniveau erhöht. Der Träger wird mit hoher Vergrößerung abgetastet, und ein Bild des Trägers mit dem hohen Vergrößerungsniveau wird von der Kamera erfasst, digitalisiert und von dem Computersubsystem weiter verarbeitet, um Debris und andere Objekte zu beseitigen, die Teil des zellularen Spezimen sein können und keine Analyse erfordern. Die Abschnitte des Bildes mit hoher Vergrößerung, die interessierenden Kandidaten-Objekten entsprechen, die nicht durch die Verarbeitung mit dem Niveau mit hoher Vergrößerung beseitigt wurden, werden dann in einer Montage zum Betrachten durch einen Pathologen gespeichert. Information, die den Träger kennzeichnet, von dem das Bild erhalten wurde, und die Position des interessierenden Kandidaten-Objekts auf dem Träger wird ebenfalls mit der Montage aufgezeichnet. Wenn der Pathologe das interessierende Kandidaten-Objekt auf dem Träger betrachten möchte, kann der Pathologe den Träger in einem Halter platzieren und in das automatisierte Analysesystem laden. Das System bewegt dann den Träger zu einer Position unterhalb des Objektivrevolvers, wo unter höherer Vergrößerung der Pathologe das interessierende Kadidaten-Objekt betrachten kann, um die Auswahl des interessierenden Kandidaten-Objekts für die Montage zu bestätigen.
  • Ein Problem mit vorbekannten automatisierten Systemen ist die Schwierigkeit beim Auswerten der Menge eines in einem zellularen Spezimen vorhandenen Markers. Beispielsweise wird neutrophile alkaline Phosphatase (NAP) typischerweise gefärbt, um zu veranlassen, dass das unlösliche Produkt, das den Marker kennzeichnet, eine rote Farbe annimmt. Der zellulare Spezimen wird gewöhnlicherweise kontrastgefärbt, damit die Kerne der Zelle eine blaue Farbe annehmen. Ein einen derartigen Träger betrachtender Pathologe erfasst Neutrophile durch Lokalisieren derjenigen Zellen, die einen Kern der Farbe, Form und Größe aufweisen, der für ein Neutrophil erwartet wird. Der Pathologe wertet dann die Intensität der roten Farbe für jedes lokalisierte Neutrophil subjektiv aus und ordnet jedem eine Punktzahl zu. Der Pathologe bestimmt dann subjektiv, ob die Anzahl von hochgradig roten Neutrophilen und moderat roten Neutrophilen ausreichend ist, um zu folgern, dass der zellulare Spezimen einen bestimmten Zustand angibt. Für NAP stuft der Pathologe gewöhnlicherweise die Neutrophile mit der Bewertung von 0, 1, 2, 3 oder 4 in Übereinstimmung mit einer Bewertungsskala ein, wie beispielsweise diejenige, die mit dem Verfahren zum Verwenden des Reagenzkits bereitgestellt wird, der von Sigma Diagnostics zum Demonstrieren von alkaliner Phosphataseaktivität in den Leukozyten verkauft wird. Gemäß diesem Verfahren summiert ein Pathologe die subjektiv zugewiesenen Einstufungen für ein Marker-kennzeichnendes Präzipitat in den ersten 100 Neutrophilen, um zu einem Punktwert zu gelangen, der .verwendet werden kann, um die relative rote Intensität der Neutrophile in der zellularen Probe zu bestimmen. Diese Punktzahl kann dann verwendet werden, um-zu bestimmen, ob der der Anwesenheit des Markers zugeordnete Zustand angegeben wird.
  • Vorbekannte automatisierte Spezimenanalysesysteme waren nicht imstande, eine Einstufung bereitzustellen, die so zuverlässig ist, wie diejenige, die durch einen geschulten Pathologen möglich ist. Beispielsweise offenbart das U.S.-Patent Nr. 5.352 613, erteilt an Tafas u. a., ein zytologisches Sortierverfahren, das angibt, die Anwesenheit und die Menge derartiger Marker wie NAP auszuwerten. Das System dieses Patents weist jedoch eine Anzahl von Einschränkungen auf. Zum einen muss der Umfang von Neutrophilen oder anderen interessierender Kandidaten-Objekte genau in den Bildern lokalisiert sein, da das Verfahren dieses Patents eine durchschnittliche optische Dichte für jedes Pixel innerhalb eines interessierenden Kandidaten-Objekts berechnet. Wenn jedoch ein interessierendes Kandidaten-Objekt, wie beispielsweise ein Neutrophil, von einer roten Blutzelle überlappt wird, kann das Verfahren dieses Patents den Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts ungenau festlegen, wenn es die rote Farbkomponente verwendet, um den Umfang für das interessierende Kandidaten-Objekt festzulegen. Wenn der Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts nicht genau festgelegt wird, können Pixel tatsächlich in einem interessierenden Kandidaten-Objekt verfehlt werden, und diejenigen, die nicht tatsächlich in einem interessierenden Kandidaten-Objekt sind, können bei der Berechnung des Dichtewerts enthalten sein. Tatsächlich gibt dieses Patent nicht an, dass die Pixel für die Kerne der ausgewählten Zellen von den optischen Dichtemessungen ausgenommen sind. In einigen Fällen kann die Inklusion der Kernpixel oder die Exklusion der Pixel tatsächlich in einer Zelle die Messungen verschieben. Außerdem arbeitet das Verfahren dieses Patents an einer einzelnen Farbkomponente des Bildes des zellularen Spezimen, und als Ergebnis kann, wenn sich Zellen überlappen können, der Pixelwert der einzelnen Farbkomponente, die analysiert wird, in dem von den überlappten Zellen weitergeleiteten Licht nicht geschwächt werden.
  • Was benötigt wird, ist ein System, das Neutrophile mit NAP genau so zuverlässig wie ein geschulter Pathologeeinstuft. Was benötigt wird, ist ein automatisiertes Spezimenanalysesystem, das sich nicht auf die genaue Parameterdefinition eines interessierenden Kandidaten-Objekts stützt, um die Menge eines Markers zu messen, der ein Präzipitat innerhalb eines interessierenden Kandidaten-Objekts kennzeichnet. Was benötigt wird, ist ein System, das die Menge eines Markers genau auswerten kann, der ein Präzipitat innerhalb eines zellularen Spezimen kennzeichnet, obwohl überlappende Zellen in dem definierten interessierenden Objekt vorhanden sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Einschränkungen vorbekannter automatisierter Analysesysteme und -verfahren können durch ein System überwunden werden, das das Verfahren der Erfindung implementiert. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte eines Erhaltens eines digitalen Farbbildes einer vergrößerten Ansicht eines an dem Objektträger gebundenen zellularen Spezimen, eines Verarbeitens des digitalen Farbbildes, um eine Mehrzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten in den zellularen Spezimen zu kennzeichnen; eines Kennzeichnens eines Flächenschwerpunkts für jedes interessierende Kandidaten-Objekt, eines Berechnens eines Farbverhältnisses von mindestens zwei Farbkomponenten für jedes Pixel eines um jeden gekennzeichneten Flächenschwerpunkt zentrierten Bereichs, Berechnen eines durchschnittlichen Farbverhältnisses für alle Pixel in dem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich, der ein berechnetes Farbverhältnis aufweist, das eine vorbestimmte Farbverhältnisschwelle überschreitet, und Vergleichen des berechneten durchschnittlichen Farbverhältnisses mit mindestens einer Intensitätsschwelle, um die Menge des Markers auszuwerten, der ein Präzipitat bei jedem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich kennzeichnet.
  • Dieses Verfahren kann durch ein automatisiertes Analysesystem implementiert werden, das digitale Bilder erhält und die digitalen Bilder verarbeitet, um interessierende Kandidaten-Objekte in einem zellularen Spezimen auf einem Objektträger zu lokalisieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform berechnet das System ein Verhältnis von zwei Farbkomponenten für die Pixel in einem regelmäßig geformten Bereich um den gekennzeichneten Flächenschwerpunkt. Bei der bevorzugtesten Implementierung ist der Bereich ein um den Flächenschwerpunkt zentrierten 70-Pixel-mal-70-Pixel-Bereich. Durch Definieren eines regelmäßig geformten Bereichs um den Flächenschwerpunkt muss das Einstufungssystem nicht länger einen einem interessierenden Kandidaten-Objekt zugeordneten unregelmäßigen Umfang durchlaufen, um die für die Analyse des Objekts erforderlichen Pixel zu kennzeichnen. Statt dessen weist die Berechnung eines Farbverhältnisses mit mindestens zwei Farbkomponenten bei der Auswertung nur diejenigen Pixel wirksam auf, die Beweise des Marker-kennzeichnenden Präzipitats und seine relative Intensität enthalten. Da der um den Flächenschwerpunkt zentrierte Bereich regelmäßig geformt ist, ist die Verarbeitung der Pixel viel schneller als bei vorbekannten Verfahren. Außerdem liefert die Verwendung des Verhältnisses von zwei Farbkomponenten mehr Information, so dass das Verfahren genauer als diejenigen ist, die nur eine Farbkomponente verwenden, um die Menge eines Marker-kennzeichnenden Präzipitats auszuwerten.
  • Bei der bevorzugten Implementierung der Erfindung wird zuerst ein 70-Pixel-mal-70-Pixel-Bereich um den Flächenschwerpunkt definiert. Ein Verhältnis der roten Pixelintensität zu der grünen Pixelintensität für jedes Pixel in dem Bereich wird für die Auswertung von NAP in diesem Bereich verwendet. Das bevorzugte Verhältnis ist ein Verhältnis der Differenz zwischen den roten und grünen Pixelkomponenten zu der Summe der roten und grünen Pixelkomponenten. Da die bevorzugte Implementierung nicht den Betrag der Differenz verwendet, ist das Verhältnis eine vorzeichenbehaftete Größe innerhalb des Bereichs von –1 bis +1. Wenn eine zellulare Probe chemisch mit einer Lösung von Naphtal-AS-Biphosphatsalz und schnellem rotem Violett-LB geprüft wurde, wird die Anwesenheit von alkaliner Phosphatase durch die rote Farbe des durch Hydrolyse gebildeten Präzipitats angegeben. Als Ergebnis sind die bevorzugten Farbverhältnisse, die die Anwesenheit von NAP angeben, in dem Bereich von geringfügig größer Null bis +1. Folglich können alle die Pixel, die die Anwesenheit von NAP innerhalb des regelmäßig geformten Bereichs angeben, durch Verhältnisse mit einem positiven Wert ungleich Null gekennzeichnet werden.
  • Die Farbverhältnisse für diejenigen Pixel mit einem Farbverhältnis, das sowohl nicht Null als auch positiv ist, werden summiert und dann durch die Anzahl von Pixeln dividiert, die positive Werte ungleich Null aufweisen. Dieser berechnete Wert ist ein normiertes Verhältnis in dem Bereich von Null bis +1. Der Bereich von Null bis +1 kann dann in fünf Subregionen aufgeteilt werden, die den Punktzahlwerten 0, 1, 2, 3 und 4 entsprechen, die gewöhnlicherweise verwendet werden, um die Menge von NAP in einem zellularen Spezimen einzustufen. Die Punktzahl für 100 dieser Bereiche wird berechnet und dann summiert, um eine Gesamtpunktzahl für den zellularen Spezimen zu erhalten. Diese Gesamtpunktzahl wird dann mit einer Schwelle verglichen, um auszuwerten, ob die Menge von NAP in dem zellularen Spezimen angibt, ob die Person, von der der Spezimen erhalten wurde, den Zustand aufweist, der normalerweise von dem Marker angegeben wird.
  • Das Verfahren und das System der Erfindung stellt eine Anzahl von Verbesserungen und Vorteilen bereit. Zum einen ist, da die regelmäßig geformten Bereiche verwendet werden, um den Bereich um den Flächenschwerpunkt eines Kandidaten-Objekts von Interesse auszuwerten, die Verarbeitung der Pixel in dem Bereich viel schneller als wenn ein unregelmäßig geformter Umfang lokalisiert und dann verfolgt werden muss, um die Bilddaten für ein Kandidaten-Objekt zu verarbeiten. Die Verwendung von zwei Farbkomponenten für das Farbverhältnis ermöglicht dem System und dem Verfahren, einen regelmäßig geformten Bereich zu verwenden, da das Verhältnis nur diejenigen Pixel in dem Zytoplasma des Neutrophil wirksam kennzeichnet, die alkaline Phosphatase enthalten, ohne einen Objektparameter zu lokalisieren und zu durchlaufen. Außerdem ermöglicht die Verwendung von zwei Farbkomponenten einem System, die Anwesenheit eines Markers zu erfassen, obwohl Debris oder eine überlappende Zelle die roten Pixelwerte in dem überlappten Bereich dämpfen können. Der Leser erkennt, dass das System und das Verfahren der Erfindung verwendet werden können, um die Menge des Markers in jedem zellularen Spezimen auszuwerten, der gefärbt wurde, um den in dem zellularen Spezimen vorhandenen Marker zu kennzeichnen. Diese Verfahren umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, insitu-Hybridisierung oder umgekehrte Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (RTPCR-Verfahren).
  • Ein anderes Merkmal der Erfindung ist die Verwendung eines rauschverringernden Filters, das für die Farbverhältnisberechnung verwendet wird. Dieses Filter ist eine Schwelle, mit der die Zweifarbenkomponentendifferenz verglichen wird. Wenn die Zweifarbenkomponentendifferenz kleiner als die Schwelle ist, wird das Verhältnis für .das Pixel nicht berechnet. Vorzugsweise ist diese Schwelle eine kleine positive Zahl. Diese Rauschschwelle verringert die Wahrscheinlichkeit, dass ein Pixel, dessen zwei Zweifarbenkomponentendifferenz auf eine kleine positive Zahl durch elektronisches Rauschen erhöht wird, für ein Markerkennzeichnendes Präzipitat ausgewertet wird. Dieses Filter hilft ebenfalls, Pixel von einer roten Blutzelle auszuschließen, die sich über einen überlappenden Bereich mit einem interessierenden Kandidaten-Objekt erstrecken. Somit verringert das Filter die Notwendigkeit, den Umfang des Kandidaten-Objekts von Interesse genau festzulegen, und gleicht elektronisches Rauschen bei der Erzeugung der Bilddaten aus.
  • Diese und weitere Vergünstigungen und Vorteile des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems und Verfahrens können aus der ausführlichen Beschreibung der Erfindung ermittelt werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Die begleitenden Zeichnungen, die in die Beschreibung aufgenommen sind und einen Teil dieser bilden, veranschaulichen bevorzugte und alternative Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit einer oben gegebenen allgemeinen Beschreibung und der nachstehend gegebenen ausführlichen Beschreibung der Ausführungsformen dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erläutern.
  • 1 ist eine Perspektivansicht einer Vorrichtung zur automatisierten Zellenanalyse, die die vorliegende Erfindung verkörpert;
  • 2 ist ein Blockdiagramm der in 1 gezeigten Vorrichtung;
  • 3 ist ein Blockdiagramm des Mikroskopcontrollers von 2;
  • 4 ist ein Ablaufdiagramm für das bevorzugte Verfahren zum Einstufen von Objekten in einem Bild eines zellularen Spezimen, der durch die Vorrichtung von 1 erhalten wurde;
  • 5 ist eine Perspektivansicht eines regelmäßig geformten Bereichs in einem Bild eines zellularen Spezimen, das durch das in 3 dargestellte beispielhafte Verfahren verarbeitet wird; und
  • 6 ist ein Blockdiagramm eines zellularen Spezimeneinstufungssystems, das das Verfahren von 4 implementiert.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Mit Bezugnahme auf die Figuren wird eine Vorrichtung zur automatisierten Zellenanalyse von biologischen Spezimen im allgemeinen durch eine Bezugsziffer 10 angegeben, wie es in einer Perspektivansicht in 1 und in einem Blockdiagramm in 2 gezeigt wird. Die Vorrichtung 10 umfasst ein Mikroskopsubsystem 32, das in einem Gehäuse 12 untergebracht ist. Das Gehäuse 12 umfasst ein Trägerhaltereingabemagazin 16 und ein Trägerhalterausgabemagazin 18. Eine Tür 14 in dem Gehäuse 12 schützt das Mikroskopsubsystem von der externen Umgebung. Ein Computersubsystem umfasst einen Computer 22 mit einem Systemprozessor 23, einem Bildprozessor 25 und einem Kommunikationsmodem 29. Das Computersubsystem umfasst ferner einen Computermonitor 26 und einen Bildmonitor 27 und weitere externe Peripheriegeräte, einschließlich einer Speichervorrichtung 21, einer Trackballvorrichtung 30, einer Tastatur 28 und einem Farbdrucker 35. Eine externe Leistungsversorgung 24 zum Versorgen des Systems ist ebenfalls gezeigt. Betrachtungsokulare 20 des Mikroskopsubsystems ragen von dem Gehäuse 12 zur Bedienerbetrachtung heraus. Die Vorrichtung 10 umfasst ferner eine CCD-Kamera 42 zum Erfassen von Bildern durch das Mikroskopsubsystem 32. Vorzugsweise ist ein Schalter in dem System enthalten, der entweder die vergrößerte Ansicht von dem Objektivrevolver 44 an Okulare 20 oder die Kamera 42 liefert. Ein Mikroskopcontroller 31 unter der Steuerung des Systemprozessors 23 steuert eine Anzahl von Mikroskopsubsystemfunktionen, die weiter ausführlich beschrieben werden. Ein automatisierter Trägerzuführmechanismus 37 in Verbindung mit einem X-Y-Objekttisch 38 stellen eine automatisierte Trägerhandhabung in der Vorrichtung 10 bereit. Eine Beleuchtungslichtquelle 48 projiziert Licht auf dem X-Y-Objekttisch 38, das nachfolgend durch das Mikroskopsubsystem 32 abgebildet und durch die CCD-Kamera 42 zur Verarbeitung in dem Bildprozessor 25 erfasst wird. Eine Z-Stufe (Z-Abschnitt) oder Fokussierstufe 46 unter der Steuerung des Mikroskopcontrollers 31 stellt eine Verschiebung des Mikroskopsubsystems in der Z-Ebene zur Fokussierung bereit. Das Mikroskopsubsystem 32 umfasst ferner einen motorisierten Objektivrevolver 44 zur Auswahl von Objektiven.
  • Der Zweck der Vorrichtung 10 besteht in dem unbegleiteten automatischen Abtasten vorbereiteter Mikroskopträger für die Erfassung von interessierenden Kandidaten-Objekten, wie beispielsweise besonderen Zellen, die ein Marker-kennzeichnendes Präzipitat enthalten, und die Auswertung der Menge eines Marker-kennzeichnenden Präzipitats in den interessierenden Kandidaten-Objekten. Die Vorrichtung 10 lokalisiert interessierende Kandidaten-Objekte automatisch, die in einem biologischen Spezimen vorhanden sind, auf der Grundlage von Farbe, sowie Größe- und Formcharakteristiken. Einstufungen, die die Menge des Markerkennzeichnenden Präzipitats für die Kandidaten-Objekte von Interesse angeben, werden bestimmt und summiert, um einen Punktwert für den biologischen Spezimen zu erzeugen. Dieser Punktwert kann verwendet werden, um auszuwerten, ob der biologische Spezimen einen medizinischen Zustand angibt, der typischerweise dem Marker zugeordnet ist, der das Markerkennzeichnende Präzipitat erzeugte. Eine Anzahl von Färbungen und Kontrastfärbungen werden verwendet, um ein gefärbtes Marker-kennzeichnendes Präzipitat in verschiedenen Zellen und Zellenstrukturen des biologischen Spezimen zu erzeugen. Die Vorrichtung der Erfindung wird verwendet, um dieses Präzipitat zu erfassen, um Kandidaten-Objekte von Interesse zu kennzeichnen.
  • während des Betriebs der Vorrichtung 10 bringt ein Pathologe oder ein Labortechnologe vorbereitete Träger auf Trägerhaltern an. Ein Trägerhalter hält bis zu 4 Träger, und bis zu 25 Trägerhalter können in das Eingabemagazin 16 geladen werden. Der Bediener kann die Größe, Form und Position des abzutastenden Bereichs spezifizieren, oder das System kann alternativ Abtastbereiche automatisch lokalisieren. Der Bediener weist dann das System an, das automatische Abtasten der Träger durch eine graphische Benutzerschnittstelle zu beginnen. Das unbegleitete Abtasten beginnt mit dem automatischen Laden des ersten Halters auf dem motorisierten X-Y-Präzisions-Objekttisch 38. Ein Strichcodeetikett, das an dem Träger befestigt ist, wird von einem Strichcodeleser 33 während dieses Ladevorgangs gelesen. Jeder Träger wird dann mit einer benutzerausgewählten niedrigen Mikroskopvergrößerung, beispielsweise 20-fach, abgetastet, um Kandidaten-Objekte basierend auf ihrer Farbe sowie Größen- und Formcharakteristiken zu kennzeichnen. Die X-Y-Positionen von Kandidaten-Objekten werden gespeichert, bis die Abtastung abgeschlossen ist.
  • Nachdem das Abtasten mit niedriger Vergrößerung abgeschlossen ist, kehrt die Vorrichtung automatisch zu jedem Kandidaten-Objekt zurück, fokussiert mit einer höheren Vergrößerung, wie beispielsweise 60-fach, für NAP-Auswertung und erfasst ein digitales Bild zur weiteren Analyse, um den Objekt-Kandidaten zu bestätigen. Der Flächenschwerpunkt für jeden bestätigten Zellenkandidaten wird berechnet und zur Auswertung des Marker-kennzeichnenden Präzipitats gespeichert. Die Vorrichtung 10 kehrt dann zu dem Flächenschwerpunkt für das erste bestätigten interessierende Kandidaten-Objekt zurück und erfasst ein Farbbild eines um den Flächenschwerpunkt zentrierten Bereiches. Die Pixeldaten für diesen Bereich werden verarbeitet, um die Menge des Markerkennzeichnenden Präzipitats in dem Bereich zu bestimmen, und eine Stufe wird dem Objekt zugewiesen. Die Vorrichtung 10 setzt die Verarbeitung und die Einstufung von Bereichen durch, die um andere bestätigte interessierende Kandidaten-Objekte zentriert sind, bis eine vorbestimmte Anzahl von Objekten verarbeitet wurde. Eine Gesamtpunktzahl wird dann aus den Einstufungen für die vorbestimmte Anzahl von Objekten berechnet. Die Objekteinstufungen, Gesamtpunktzahl und Bilder können dann in einer Speichervorrichtung 21, wie beispielsweise einer auswechselbaren Festplatte oder einem DAT-Band gespeichert oder an eine entfernte Stelle zur Prüfung oder Speicherung gespeichert werden. Die für jeden Träger gespeicherten Bilder können in einem Mosaik von Bildern zur. weiteren Durchsicht betrachtet werden. Außerdem kann der Pathologe oder ein Techniker ebenfalls eine erfasste Zelle direkt durch das Mikroskop mittels Okulare 20 oder den Bildmonitor 27 betrachten.
  • Mit Bezug auf 3 wird der Mikroskopcontroller 31 ausführlicher gezeigt. Der Mikroskopcontroller 31 umfasst eine Anzahl von Subsystemen, die durch einen Systembus verbunden sind. Der Systemprozessor 112 steuert dieses Subsystem und wird von dem Vorrichtungssystemprozessor 23 durch einen RS-232-Controller 110 gesteuert. Der Systemprozessor 102 steuert einen Satz von Motorsteuersubsystemen 114 bis 124, die die Eingabe- und Ausgabezuführvorrichtung, den motorisierten Revolver 44, den X-Y-Objekttisch 38 und die Z-Stufe 46 steuern (2). Ein Histogrammprozessor 108 empfängt eine Eingabe von der CCD-Kamera 42 zum Berechnen von Varianzdaten während des hier außerdem beschriebenen Fokussiervorgangs.
  • Der Systemprozessor 102 steuert ferner den Beleuchtungscontroller 106 zum Steuern der Substufenbeleuchtung 48. Das von der Halogenlampe ausgegebene Licht, die die Beleuchtung für das System liefert, kann sich mit der Zeit aufgrund von Lampenalterung, Veränderungen in der optischen Ausrichtung und anderen Faktoren verändern. Außerdem können Träger, die "überfärbt" wurden, die Kamerabelichtung auf ein unannehmbares Niveau verringern. Um diese Effekte auszugleichen, ist ein Beleuchtungscontroller 106 enthalten. Dieser Controller wird in Verbindung mit Lichtsteuersoftware verwendet, um die Variationen im Lichtniveau auszugleichen. Die Lichtsteuersoftware tastet die Ausgabe von den Kameras an Intervallen ab (wie beispielsweise zwischen dem Laden der Trägerhalter) und weist den Controller an, das Lichtniveau auf das gewünschte Niveau einzustellen. Auf diese Art und Weise ist die Lichtsteuerung automatisch und für den Benutzer transparent, und fügt dem Systembetrieb keine zusätzliche Zeit hinzu.
  • Der Systemprozessor 23 ist vorzugsweise ein IBMkompatibler PC mit einem Intel-Pentium-90 MHz-Prozessor, 32 MB RAM und zwei 1-GB-Festplatten, wobei die Festplatte auswechselbar sein kann. Das Betriebssystem für den Systemprozessor 23 ist Windows for Workgroups 3.1, das von Microsoft Corporation, Redmond, Washington, verfügbar ist. Der Bildprozessor 25 ist vorzugsweise eine Matrox-Imaging-Serie 640-Platinensatz, der von Matrox Electronic Systems, Ltd., Dorval, Quebec, Kanada, verfügbar ist. Der bevorzugte Bildprozessor wird mit Unterstützungssoftware und dem Matrox Imaging Library (MIL) ausgestattet. Der Mikroskopcontrollersystemprozessor 102 ist eine AMD29K-Vorrichtung von Advanced Micro Devices.
  • Die Bildverarbeitung mit niedriger Vergrößerung kennzeichnet Zellen mit einem Kern, der mit einer bestimmten Farbe gefärbt ist, die der Färbung oder Kontrastfärbung entspricht, die verwendet wird, um den zellularen Spezimen aufzubereiten. Beispielsweise wird ein Blutabstrich, der verwendet wird, um die Anwesenheit alkaliner Phosphatase in Neutrophile auszuwerten, typischerweise mit einer Lösung aus Naphtol-AS-Biphosphatsalz und schnellem roten Violett-LB gefärbt. Die Anwesenheit alkaliner Phosphatase in einem Neutrophil (NAP) in dem zellularen Spezimen wird durch die rote Farbe des durch Hydrolyse gebildeten Präzipitats angegeben. Der Spezimen wird gewöhnlicherweise mit einer Kontrastfärbung, wie beispielsweise Hematoxylin, kontrast gefärbt, um ein blaues unlösliches Präzipitat in den Zellenkernen des weißen Blutes zu erzeugen. Der resultierende Spezimen von diesem Färbungs/Gegenfärbungs-Verfahren führt zu weißen Blutzellen, die durch Zellen gekennzeichnet werden können, die blaue Kerne aufweisen. Diese Zellen können verarbeitet werden, um Neutrophilzellen basierend auf der Form und Größe der Kerne zu kennzeichnen. Somit kennzeichnet die Verarbeitung mit niedriger Vergrößerung interessierende Kandidaten-Objekte, wie beispielsweise Neutrophile, aus der Farbe, Form und Größe der Objekte in dem Bild des zellularen Spezimen.
  • Die von dem System während der Bildverarbeitung mit hoher Vergrößerung durchgeführte Verarbeitung wertet ferner die Farbe, Form und Größe des Zellenkerns für jedes der interessierenden Kandidaten-Objekte aus, um Objekte, die das Marker-kennzeichnende Präzipitat wahrscheinlich nicht enthalten, zu eliminieren. Bei einer bevorzugten Implementierung der Erfindung für NAP beträgt die minimale Fläche zum Kennzeichnen von interessierenden Kandidaten-Objekten l4 μm2. Der bevorzugte Kompaktheitwert ist für Objekte mit einem Kern, der größer als der Wert 1,25 ist. Die Kompaktheit ist ein Begriff, der die Form des Umfangs des Kerns angibt, die auf dem Gebiet bekannt ist. Der Flächenschwerpunkt des gekennzeichneten Kandidaten-Objekts von Interesse wird dann berechnet, und der Flächenschwerpunkt wird für die Punktzahlverarbeitung gespeichert. Nachdem eine vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten bestätigt und ihre entsprechenden Flächenschwerpunkte gespeichert sind, wird eine Punktzahlverarbeitung durchgeführt.
  • Bei der bevorzugten Implementierung ist die Bildverarbeitung, die mit der niedrigen Vergrößerung und hohen Vergrößerungsniveaus durchgeführt wird, diejenige, die in unserer gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit dem Titel "METHOD AND APPARATUS FOR AUTOMATED IMAGE ANALYSIS OF BIOLOGICAL SPECIMENS", Seriennummer 08/758436, eingereicht am 27. November 1996, offenbart wird. Die Offenbarung dieser Anmeldung wird hiermit ausdrücklich durch Bezug aufgenommen. Die in diesem Dokument offenbarte Farbumwandlung, Tiefpassfilterung, Schwellenwertbildung und morphologische Verarbeitung wird vorzugsweise verwendet, um interessierende Kandidaten-Objekte zu kennzeichnen. Der Flächenschwerpunkt und die morphologischen Charakteristika für ein interessierendes Kandidaten-Objekt, wie beispielsweise seine Größe und Kompaktheit, wird aus Funktionen in dem MIL für den bevorzugten Bildprozessor erhalten. Obgleich dies das bevorzugte Verfahren zum Kennzeichnen und Bestätigen von interessierenden Kandidaten-Objekten in dem Bild eines zellularen Spezimen ist, können andere bekannte Verfahren verwendet werden, solange wie das Verfahren die Position und die allgemeine Form dieser Zellen kennzeichnet, die das Markerkennzeichnende Präzipitat enthalten.
  • Das Verfahren der Punktzahlverarbeitung ist in 4 gezeigt. Dieses Verfahren beginnt durch Wiedergewinnen des Flächenschwerpunkts für das erste bestätigte interessierende Objekt und erfasst die Farbpixelwerte für einer regelmäßig geformten Bereich, der um den Flächenschwerpunkt zentriert ist (Block 200). Der Bereich kann jeder regelmäßig geformte Bereich sein, der ohne weiteres durch eine bekannte Programmschleifensteuerung durchlaufen werden kann, wie beispielsweise zweidimensionaler Parallelogramme. Die bevorzugteste regelmäßige Form ist ein Quadrat, und die bevorzugteste Größe des Quadrats ist 70 Pixel mal 70 Pixel. Der regelmäßig geformte Bereich sollte ausreichend groß sein, um alle Pixel aufzunehmen, die Bilddaten für das Marker-kennzeichnende Präzipitat enthalten, das einem interessierenden Kandidaten- Objekt zugeordnet ist. Beispielsweise entspricht die bevorzugteste 70-Pixel-mal-70-Pixel-Form einem Bereich, der groß genug ist, um das Zytoplasma und den Kern der Zelle abzudecken, die einem bestätigten interessierenden Kandidaten-Objekt entsprechen. Die bevorzugteste Fläche ist in 5 gezeigt. Wie aus der Figur ersichtlich ist, erstreckt sich die regelmäßig geformte Fläche über den Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts, so dass die um den Flächenschwerpunkt des interessierenden Objekts zentrierte Fläche alle Pixel des interessierenden Kandidaten-Objekts aufnehmen kann. Der Leser erkennt, dass jeder Bereich, der verwendet werden kann, um die Auswertung der Menge des Marker-kennzeichnenden Präzipitats in einem interessierenden Kandidaten-Objekt zu vereinfachen, ohne dass der Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts festgelegt werden muss, um die Pixel des interessierenden Kandidaten-Objekts zu kennzeichnen, die in die Auswertung aufzunehmen sind, innerhalb der Prinzipien der Erfindung liegt.
  • Ein Farbverhältnis wird dann für jedes Pixel berechnet (Block 204). Bei der bevorzugten Implementierung ist das Farbverhältnis die Differenz von zwei Pixel-Farbkomponenten zu der Summe der gleichen zwei Pixel-Farbkomponenten. Bei der bevorzugtesten Implementierung werden die roten und grünen Pixel-Farbkomponenten verwendet, um NAP in einem zellularen Spezimen zu bewerten, der mit einer Lösung von Naphtol-AS-Biphosphatsalz und schnellem roten Violett-LB gefärbt und dann mit Hematoxylin kontrastgefärbt wird. Somit kann das Verhältnis als (R – G)/(R + G) ausgedrückt werden, obwohl andere Farbkomponentenkombinationen verwendet werden können. Die Farbkomponentenauswahl umfasst vorzugsweise die zwei Farbkomponenten, die der Marker-kennzeichnenden Präzipitatfarbe (typischerweise Färbungsfarbe) und die zellenkennzeichnende Farbe (typischerweise Kontrastfärbungsfarbe) am besten entsprechen. Das Verhältnis kennzeichnet diejenigen Pixel, die von der ersten Farbkomponente (Rot bei der bevorzugten Ausführungsform) dominiert werden), von denen die zweite Farbkomponente (Grün bei der bevorzugtesten Ausführungsform) subtrahiert wird. Das Verhältnis liegt in dem Bereich von –1 bis +1, wobei das Verhältnis für von der ersten Farbkomponente dominierte Pixel positiv, für von der zweiten Farbkomponente dominierte Pixel negativ und, wenn die beiden Komponenten gleich sind, Null ist,.
  • Die Verwendung des Farbverhältnisses ermöglicht dem System und Verfahren der Erfindung, die Pixel der regelmäßig geformten Fläche zu verarbeiten, und die Menge des Markerkennzeichnenden Präzipitats auszuwerten, ohne den Umfang zu durchlaufen, um alle Pixel in einem interessierenden Kandidaten-Objekt zu kennzeichnen. Statt dessen ermöglicht das Verhältnis der beiden Farbkomponenten, wobei mindestens eine von diesen der Farbe des Marker-kennzeichnenden Präzipitats entspricht, die Pixelwerte zu kennzeichnen, die dem Marker-kennzeichnenden Präzipitat entsprechen, ohne auf die Geometrie des interessierenden Kandidaten-Objekts Bezug zu nehmen. Dies ermöglicht dem Verfahren der Erfindung, jedes Kandidaten-Objekt schneller und genauer auszuwerten, als Verfahren, die sich auf die Geometrie stützen, um Pixel zu kennzeichnen, die dem Marker-kennzeichnenden Präzipitat entsprechen.
  • Am besten wird ein Farbverhältnis nur für. diejenigen Pixel berechnet, die eine Differenz der beiden Farbkomponenten aufweisen, die größer als eine vorbestimmte Rauschschwelle ist. Vorzugsweise ist die Rauschschwelle eine kleine positive Zahl, und am bevorzugtesten ist die Schwelle fünf (5). Die Wirkung der Rauschschwelle besteht darin, die Anzahl von Pixeln in einem weißen oder schwarzen Bereich zu verringern, für den es den Anschein haben kann, dass er eine Farbe aufweist, die das Marker-kennzeichnenden Präzipitat angibt. Weiße oder schwarze Pixel sollten einen Wert aufweisen, bei dem alle Farbkomponenten Null (0) bzw. Zweihundertfünfundfünfzig (255) sind. Als Ergebnis sollte eine Differenz der beiden Farbkomponenten für ein weißes oder schwarzes Pixel Null und das Pixel nicht in der unten erläuterten Farbverhältnisnormierung enthalten sein. Elektronisches Rauschen kann jedoch veranlassen, dass ein Pixel, das weiß sein sollte, eine Farbkomponente mit einem kleinen positiven Wert aufweist, oder ein Pixel, das schwarz sein sollte, eine Farbkomponente aufweist, die geringfügig kleiner als 255 ist. Wenn diese Farbkomponente mit dem rauschinduzierten Wert die rote Komponente für das weiße Pixel oder die grüne Komponente für das schwarze Pixel bei der bevorzugten Differenz der beiden Farbkomponenten für NAP-Einstufung ist, dann wird ein kleines positives Verhältnis sowohl für das weiße als auch das schwarze Pixel berechnet. Diese Farbverhältnisse würden dann in die Farbverhältnisnormierung aufgenommen und die Ergebnisse verschieben. Dieses verschobene Verhältnis kann dann die Einstufung für das interessierende Kandidaten-Objekt und möglicherweise die Punktzahl für den zellularen Spezimen beeinflussen. Die Rauschschwelle verhindert jedoch die Berechnung des Farbverhältnisses für die Pixel, solange wie die Zweifarbenkomponentendifferenz kleiner als die Rauschschwelle ist. Außerdem verringert die Rauschschwelle die Wahrscheinlichkeit, dass Pixel von einer überlappten Zelle in der Einstufung und Punktzahlbewertung des zellularen Spezimen enthalten sind. Beispielsweise sind Pixel für eine rote Blutzelle, die ein interessierendes Kandidaten-Objekt überlappt und die sich über den Umfang des Kandidaten-Objekts von Interesse erstreckt, typischerweise nicht intensiv rot. Als Folge würde die Rauschschwelle diejenigen Pixel der roten Blutzelle außerhalb des Kandidaten-Objekts von Interesse eliminieren, die von der Kandidaten-Objekteinstufung nominal rot gefärbt sind. Diese Filterung wird ohne Bezug auf den Umfang des Kandidaten-Objekts von Interesse durchgeführt.
  • Alternativ können Pixel, die fast weiß oder fast schwarz sind, als weiß oder schwarz betrachtet werden, so dass sie nicht für die Einstufung eines interessierenden Kandidaten-Objekts verwendet werden. Dieses Verfahren bestimmt, ob die Farbkomponente mit dem größten Wert kleiner als eine Weiß-Schwelle ist, oder ob die Farbkomponente mit dem kleinsten Wert größer als eine Schwarz-Schwelle ist. Wenn beispielsweise eine Weiß-Schwelle von 10 verwendet wird, würde ein fast weißes Pixel mit roten, grünen und blauen Werten von 9, 3 bzw. 8 als ein weißes Pixel mit einer Differenz der beiden Farbkomponenten von Null (0) betrachtet werden, obwohl die tatsächliche Rot-Grün-Differenz gleich sechs (6) ist. Somit würde eine Rauschschwelle von 5 in dem Farbverhältnis für das Pixel bei der Objekteinstufung aufgenommen werden müssen, wobei jedoch die Weiß-Schwelle von 10 es aus der Einstufung entfernen würde. Auf ähnliche Weise würde eine Schwarz-Schwelle von zweihundertfünfzig (250) Pixel mit einer kleinsten Farbkomponente von 250 oder höher als schwarze Pixel klassifizieren und kein Farbverhältnis für das Pixel berechnen.
  • Das Verfahren von 4 fährt dann durch Summieren aller Farbverhältnisse für die Pixel mit einem positiven Farbverhältnis ungleich Null und. teilen der Summe durch die Anzahl verwendeter Pixel fort, um die Summe zu berechnen (Block 208, 210, 212, 214). Dieses normierte Farbverhältnis für die Fläche wird dann mit mindestens einer Schwelle verglichen, um die Menge des Marker-kennzeichnenden Präzipitats zu bestimmen (Block 220). Bei der oben erläuterten bevorzugten Ausführungsform für NAP für die Färbung und Kontrastfärbung gibt es vier Schwellen für den Bereich von 0 bis +1. Diese vier Schwellen teilen den Bereich in fünf Subbereiche auf, die den fünf Einstufungen entsprechen, die typischerweise verwendet werden, um die Intensität des NAP-Präzipitats zu klassifizieren. Die Einstufung für die Fläche wird dann zu einem Objektpunktwert hinzugefügt (Block 224), und das Verfahren setzt sich fort, bis eine vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten verarbeitet wurden (Block 228). Bei der bevorzugtesten Ausführungsform beträgt die vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten, um die Menge von NAP in einem zellularen Spezimen auszuwerten, einhundert (100) Objekte. Die Objektpunktzahl wird dann in Verbindung mit dem Träger (Block 230) zur späteren Auswertung durch einen Pathologen gespeichert. Alternativ kann die Objektpunktzahl mit einer vorbestimmten Schwelle verglichen werden, die angibt, ob der zellulare Spezimen den dem Marken zugeordneten Zustand angibt.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren von 4 in einem C-Programm implementiert, das zu dem Bildprozessor 25 zur Ausführung heruntergeladen wird, obwohl andere Programmiersprachen verwendet werden können. Außerdem kann das Programm auf einem anderen Prozessor des Systems ausgeführt werden, solange die in dem Prozessor 25 gespeicherten Bilddaten für das Programm und/oder die Hardware, die das Verfahren von 4 implementieren, verfügbar sind.
  • Ein System, das verwendet werden kann, um das bevorzugte Verfahren der Erfindung zu implementieren, ist in 6 gezeigt. Das System 150 verarbeitet in dem Bildprozessor 25 gespeicherte Bilddaten, um eine Punktzahl für einen an einem Träger gebundenen zellularen Spezimen zu erzeugen. Ein Farbverhältnisgenerator 154 berechnet die Farbverhältnisse für Pixel innerhalb eines regelmäßig definierten Bereichs um einen Flächenschwerpunkt für ein interessierendes Kandidaten-Objekt in den Bilddaten. Vorzugsweise umfasst ein Farbverhältnisgenerator 150 eine Rauschschwelle, um zu bestimmen, für welche Pixel ein Farbverhältnis berechnet wird. Die berechneten Farbverhältnisse werden an einen Farbverhältniskomparator 58 geliefert, der das Farbverhältnis mit einer positiven Schwelle ungleich Null vergleicht, um zu bestimmen, ob das Farbverhältnis in dem normierten Farbverhältnis für den Spezimen enthalten ist. Diese von dem Komparator 158 weitergeleiteten Farbverhältnisse werden an einen Farbverhältnisnormierer 160 geliefert, der die an ihn geleiteten Farbverhältnisse summiert und sie durch die Anzahl von an ihn geleitete Farbverhältnisse teilt. Das normierte Farbverhältnis für ein interessierendes Kandidaten-Objekt wird an einen Einstufungsgenerator 164 geliefert, der das normierte Farbverhältnis mit einer oder mehreren Schwellen vergleicht und dem interessierenden Kandidaten-Objekt eine Einstufung zuweist. Die zugewiesene Einstufung wird an einen Punktzahlgenerator 168 geliefert. Der Punktzahlgenerator 168 summiert die Einstufungen für eine vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten, um eine Gesamtpunktzahl zu erzeugen, die mit Daten für den Träger gespeichert werden können. Die Punktzahl kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob der zellulare Spezimen einen bestimmten medizinischen Zustand angibt. Die Komponenten des Systems 150 können in Hardware oder Software oder einer Kombination derselben implementiert sein.
  • Beim Gebrauch bereiten Labortechnologen eine Mehrzahl von Trägern mit zellularen Spezimen auf, die behandelt werden, um einen Marker visuell erfassbar zu machen. Die Träger werden dann auf Trägerhalter geladen und in das Trägermagazin des automatisierten Mikroskopsystems platziert. Das System wird initialisiert, und Trägerhalter werden an den motorisierten Objekttisch unter dem Objektivrevolvers geführt. Die Verarbeitung mit niedriger Vergrößerung und höherer Vergrößerung wird durchgeführt, um interessierende Kandidaten-Objekte zu kennzeichnen und zu bestätigen. Abbildungen eines um den Flächenschwerpunkt zentrierten regelmäßig geformten Bereichs einer vorbestimmten Anzahl von bestätigten Kandidaten-Objekten werden dann mittels des Verfahrens der Erfindung eingestuft. Die Gesamtpunktzahl für den zellularen Spezimen auf dem Träger wird dann mit einer Kennung für den Träger gespeichert, und der nächste Träger auf dem Halter wird verarbeitet. Dieser Träger auf jedem Halter wird verarbeitet, bis alle Träger in den allen Haltern verarbeitet wurden. Am Ende des Verfahrens werden eine Montage der bestätigten interessierenden Kandidaten-Objekte für jeden Träger, eine Einstufung für jedes Objekt, eine Position für jedes Objekt und eine Gesamtpunktzahl für jeden Träger in dem Computersubsystem gespeichert. Diese Information kann von einem Pathologen verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein zellularer Spezimen einen spezifischen medizinischen Zustand angibt, oder um die Objekte auf dem Träger zu prüfen, die eingestuft wurden.
  • Obwohl die Erfindung durch die Beschreibung der bevorzugten und alternativen Ausführungsformen dargestellt wurde, und obwohl die Ausführungsformen in beträchtlichem Detail beschrieben wurden, ist es nicht die Absicht des Anmelders, den Schutzumfang der angefügten Ansprüche durch derartiges Detail zu beschränken oder irgendwie zu begrenzen. Zusätzliche Vorteile und Abwandlungensind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich. Die breiteren Aspekte der Erfindung sind daher nicht auf die gezeigten und beschriebenen spezifischen Einzelheiten, die repräsentative Vorrichtung und das Verfahren oder veranschaulichende Beispiele begrenzt.

Claims (28)

  1. Verfahren zum Auswerten des Betrags eines visuell erfassbaren Markers, der einen Niederschlag bei einem an einem Objektträger gebundenen zellularen Spezimen identifiziert, mit folgenden Schritten: Erhalten eines digitalen Farbbildes einer vergrößerten Ansicht eines an dem Objektträger gebundenen zellularen Spezimens; Verarbeiten des digitalen Farbbildes, um eine Mehrzahl. von Kandidaten-Objekten von Interesse in dem zellularen Spezimen zu identifizieren; Identifizieren eines Flächenschwerpunkts für identifizierte Kandidaten-Objekte von Interesse aus der Mehrzahl von Kandidaten-Objekten von Interesse; Berechnen eines Farbverhältnisses von mindestens zwei Farbkomponenten für jedes Pixel eines um jeden identifizierten Flächenschwerpunkts zentrierten Bereichs; Berechnen eines durchschnittlichen Farbverhältnisses für alle Pixel in dem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich, der ein berechnetes Farbverhältnis aufweist, das eine vorbestimmte Farbverhältnisschwelle überschreitet; und Vergleichen des berechneten durchschnittlichen Farbverhältnisses mit mindestens einer Intensitätsschwelle, um den Betrag des Markers auszuwerten, der einen Niederschlag bei jedem um jedem Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich identifiziert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Farbverhältnis-Berechnungsschritt ferner folgenden Schritt umfasst: Berechnen eines Farbverhältnisses einer roten Pixelkomponente zu einer grünen Pixelkomponente für jedes Pixel.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Farbverhältnis-Berechnungsschritt ferner folgenden Schritt umfasst: Berechnen eines Farbverhältnisses einer Differenz zwischen einer ersten Pixelfarbkomponente und einer zweiten Pixelfarbkomponente zu einer Summe der ersten Pixelfarbkomponente und der zweiten Pixelfarbkomponente für jedes Pixel in dem Bereich.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die erste Pixelfarbkomponente rot und die zweite Pixelfarbkomponente grün ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem der Vergleichsschritt das berechnete durchschnittliche Farbverhältnis mit einer Mehrzahl von geordneten Schwellen vergleicht, um eine Stufe für den Betrag des Markers zu ermitteln, die den Niederschlag bei jedem um den Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich identifiziert.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, ferner mit folgendem Schritt: Summieren der Stufen für eine Mehrzahl von Bereichen, um eine Auswertung für den zellularen Spezimen zu ermitteln.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem die zellulare Spezimen-Auswertung die Summe der Stufen für einhundert Bereiche ist, die um einhundert Flächenschwerpunkte zentriert sind, die bei dem zellularen Spezimen identifiziert sind.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 8, ferner mit folgendem Schritt: Vergleichen der Differenz der beiden Farbkomponenten mit einer Rauschschwelle; und Berechnen des Farbverhältnisses in Abhängigkeit davon, dass die Differenz der beiden Farbkomponenten größer als die Rauschschwelle ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 3, ferner mit folgenden Schritt: Vergleichen einer Farbkomponente für ein Pixel mit einem größten Wert mit einer weißen Schwelle und einer Farbkomponente für das Pixel mit einem kleinsten Wert mit einer schwarzen Schwelle, um zu ermitteln, ob ein Farbverhältnis für das Pixel berechnet ist.
  10. System zum Auswerten des Betrags eines visuell erfassbaren Markers, der einen Niederschlag bei einem an einem Objektträger gebundenen zellularen Spezimen identifiziert, mit: einem Bildprozessor zum Erhalten eines digitalen Farbbildes einer vergrößerten Ansicht eines an einem Objektträger gebundenen zellularen Spezimens; einem Mittel zum Identifizieren von Kandidaten-Objekten von Interesse in dem zellularen Spezimen; einem Mittel zum Identifizieren eines Flächenschwerpunkts für jedes Kandidaten-Objekt von Interesse; einem Mittel zum Berechnen eines Farbverhältnisses von mindestens zwei Farbkomponenten für jedes Pixel eines um jeden identifizierten Flächenschwerpunkt zentrierten Bereichs; einem Mittel zum Berechnen eines durchschnittlichen Farbverhältnisses für alle Pixel bei dem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich, der ein berechnetes Farbverhältnis aufweist, das eine vorbestimmte Verhältnisschwelle überschreitet; und einem Mittel zum Vergleichen des berechneten durchschnittlichen Verhältnisses mit mindestens einer Intensitätsschwelle, um den Betrag des Markers auszuwerten, der einen Niederschlag bei jedem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich identifiziert.
  11. System gemäß Anspruch 10, bei dem das Mittel zum Berechnen eines Farbverhältnisses ein Verhältnis von einer roten Pixelkomponente zu einer grünen Pixelkomponente berechnet.
  12. System gemäß Anspruch 10, bei dem das Mittel zum Berechnen eines Farbverhältnisses ein Verhältnis einer Differenz zwischen einer ersten Pixelfarbkomponente und einer zweiten Pixelfarbkomponente zu einer Summe der ersten Pixelfarbkomponente und der zweiten Pixelfarbkomponente berechnet.
  13. System gemäß Anspruch 10, bei dem die erste Pixelfarbkomponente rot und die zweite Pixelfarbkomponente grün ist.
  14. System gemäß Anspruch 10, bei dem das Mittel zum Vergleichen des berechneten durchschnittlichen Farbverhältnisses das berechnete durchschnittliche Farbverhältnis mit einer Mehrzahl von geordneten Schwellen vergleicht, um eine Stufe für den Betrag der Marke bei jedem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich zu ermitteln.
  15. System gemäß Anspruch 12, ferner mit: Mittel zum Summieren der Stufen einer Mehrzahl von Bereichen, um eine Auswertung für den zellularen Spezimen zu ermitteln.
  16. System gemäß Anspruch 13, bei dem das Mittel zum Summieren die Stufen von einhundert Bereichen summiert, die um einhundert in dem zellularen Spezimen identifizierte Flächenschwerpunkte zentriert sind.
  17. Verfahren zum Auswerten des Betrags eines visuell erfassbaren Markers, der einen Niederschlag bei einer Mehrzahl von Kandidaten-Objekten von Interesse identifiziert, die in einem digitalen Bild eines zellularen Spezimen positioniert sind, das an einen Objektträger gebunden ist, mit folgenden Schritten: Identifizieren eines Flächenschwerpunkts für jedes Kandidaten-Objekt von Interesse bei einer Mehrzahl von Kandidaten-Objekten von Interesse; Berechnen eines Farbverhältnisses von mindestens zwei Farbkomponenten für jedes Pixel eines um jeden identifizierten Flächenschwerpunkt zentrierten Bereichs; Berechnen eines durchschnittlichen Farbverhältnisses für alle Pixel bei dem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich, der ein berechnetes Farbverhältnis aufweist, das eine vorbestimmte Farbverhältnisschwelle überschreitet; und Vergleichen des berechneten durchschnittlichen Farbverhältnisses mit mindestens einer Intensitätsschwelle, um den Betrag des Markers auszuwerten, der einen Niederschlag bei jedem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich identifiziert.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der um einen Flächenschwerpunkt zentrierte Bereich ein regelmäßig geformter Bereich ist.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der regelmäßig geformte Bereich ein Parallelogramm ist.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Farbverhältnisberechnungsschritt ferner folgenden Schritt umfasst: Berechnen eines Farbverhältnisses einer Differenz zwischen einer ersten Pixelfarbkomponente und einer zweiten Pixelfarbkomponente zu einer Summe der ersten Pixelfarbkomponente und der zweiten Pixelfarbkomponente für jedes Pixel in dem Bereich.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die erste Pixelfarbkomponente rot und die zweite Pixelfarbkomponente grün ist.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem der Vergleichsschritt das berechnete durchschnittliche Farbverhältnis mit einer Mehrzahl von geordneten Schwellenwerten vergleicht, um eine Stufe für den Betrag des Markers zu ermitteln, der einen Niederschlag bei jedem um jeden Flächenschwerpunkt zentrierten Bereich identifiziert.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 5, ferner mit folgendem Schritt: Summieren der Stufen für eine Mehrzahl von Bereichen, um eine Auswertung für den zellularen Spezimen zu ermitteln.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 20, ferner mit folgenden Schritten: Vergleichen der Differenz der beiden Farbkomponenten mit einer Rauschschwelle; und Berechnen des Farbverhältnisses in Abhängigkeit davon, dass die Differenz der beiden Farbkomponenten größer als die Rauschschwelle ist.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 20, ferner mit folgendem Schritt: Vergleichen einer Farbkomponente für ein Pixel mit einem größten Wert mit einer weißen Schwelle und einer Farbkomponente für ein Pixel mit einem kleinsten Wert mit einer schwarzen Schwelle, um zu ermitteln, ob ein Farbverhältnis für das Pixel berechnet ist.
  26. System zum Auswerten des Betrags eines Markers, der einen Niederschlag bei einem an einem Objektträger gebundenen zellularen Spezimen identifiziert, mit: einem Farbverhältnisgenerator zum Berechnen von Farbverhältnissen für Pixel innerhalb eines um einen Flächenschwerpunkt zentrierten Bereichs für ein Kandidaten-Objekt von Interesse bei Bilddaten einer vergrößerten Ansicht des zellularen Spezimens; einem Farbverhältniskomparator zum Vergleichen der berechneten Farbverhältnisse mit einer vorbestimmten Schwelle, um zu ermitteln, welche Farbverhältnisse in einem normierten Farbverhältnis enthalten sind; einem Farbverhältnisnormierer zum Erzeugen eines normierten Farbverhältnisses; einem Stufenerzeuger zum Erzeugen einer Stufe für das Kandidaten-Objekt von Interesse aus dem normierten Farbverhältnis; und einem Auswertungsgenerator zum Erzeugen einer Auswertung, die einen Betrag eines Markers angibt, der einen Niederschlag identifiziert, in einem zellularen Spezimen durch Summieren von Stufen für eine vorbestimmte Anzahl von Kandidaten-Objekten von Interesse.
  27. System gemäß Anspruch 26, bei dem der Farbverhältnisgenerator ferner umfasst: eine Rauschschwelle, die von dem Farbverhältnisgenerator verwendet wird, um zu ermitteln, ob ein Farbverhältnis für ein Pixel berechnet wird.
  28. System gemäß Anspruch 26, bei dem der Farbverhältnisgenerator ferner umfasst: eine weiße Schwelle und eine schwarze Schwelle, die von dem Farbverhältnisgenerator verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein Farbverhältnis für ein Pixel berechnet wird.
DE69815085T 1997-03-28 1998-03-26 System und verfahren zur klassifizierrung von zellproben Expired - Lifetime DE69815085T2 (de)

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