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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung bezieht sich auf
die automatisierte Analyse von zellularen Spezimen auf Objektträgern (microscope
slides) und insbesondere auf die automatisierte Analyse von zellularen
Spezimen, die gefärbte
Marker enthalten.
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Hintergrund der Erfindung
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Auf dem Gebiet der medizinischen
Diagnose einschließlich
der Onkologie, ist die Erfassung, Kennzeichnung, Quantisierung und
Charakterisierung von interessierenden Zellen, wie beispielsweise Karzinomzellen,
durch das Testen von biologischen Proben oder Spezimen ein bedeutsamer
Aspekt der Diagnose. Typischerweise wird eine biologische Probe,
wie beispielsweise Knochenmark, Lymphknoten, peripheres Blut, Zerebrospinal-Fluid,
Urin, Effusionen, feine Nadelaspirate, periphere Blutabschabungen
oder andere Materialien durch Färbung
des Spezimen aufbereitet, um die interessierenden Zellen zu kennzeichnen.
Ein Verfahren der Zellenspezimenaufbereitung besteht darin, ein
Spezimen mit einem spezifischen Tester reagieren zu lassen, der
ein monoklonaler Antikörper,
ein polyklonales Antiserum oder eine Nukleinsäure sein kann und mit einem
Teil der interessierenden Zellen, wie beispielsweise Tumorzellen,
reagiert. Die Reaktion kann mittels einer enzymatischen Reaktion,
wie beispielsweise alkaliner Phosphatase oder Glukoseoxidase oder
Peroxidase, um ein lösliches
farbloses Substrat in ein gefärbtes unlösliches
Präzipitat
umzuwandeln, oder durch direktes Verbinden eines Farbstoffs mit
dem Tester erfasst werden.
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Beispielsweise können Substanzen, die gelegentlich
als Marker bezeichnet werden, in dem Blut einer Person als Ergebnis
eines medizinisch anormalen Zustands existieren. Diese Marker können für solche
Zustände,
wie präleukämische Karzinome,
Trisomie-21-Fötus
oder andere bekannte Zustände
existieren, die verursachen, dass Marker in dem Blut existieren.
Diese Marker sind normalerweise nicht visuell erfassbar. Eine Blutzellenprobe
kann jedoch festgelegt und mit einem Substrat eines Enzyms gebunden
werden, um ein gefärbtes
unlösliches
Präzipitat
zu erzeugen, um die Marker zu kennzeichnen. Die die aufbereiteten
zellularen Spezimen enthaltenden Träger werden dann geprüft, um die
Menge des in dem zellularen Spezimen enthaltenen Präzipitats auszuwerten,
um zu bestimmen, ob der zellulare Spezimen angibt, dass der Zustand
in der Person existiert, von der die Probe genommen wurde.
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Blutzellen werden beispielsweise
in zwei Arten klassifiziert – rote
und weiße
Zellen. Die roten Zellen befördern
Sauerstoff mittels Hämoglobin
zu dem Gewebe in einer Person. Die weißen Zellen beziehen sich im
allgemeinen auf das Immunsystem einer Person. Weiße Blutzellen
sind aus fünf
Arten zusammengesetzt, von denen eine, Neutrophile, einen plattenförmigen Kern
aufweist, der typischerweise verwendet wird, um diese Art von weißen Blutzellen
zu kennzeichnen. Als Antwort auf die Anwesenheit eines Fötus weisen
die neutrophilen Zellen in dem Blut einer schwangeren Frau ein erhöhtes Niveau
von alkaliner Phosphatase auf. Wenn der Fötus ein Trisomie-21-Fötus ist,
ist das Niveau der alkalinen Phosphatase in den Neutrophilen sogar
höher.
Somit kann die Menge von alkaliner Phosphatase in den Neutrophilen
des Bluts einer schwangeren Frau als einen Marker für einen
Trisomie-21-Fötus
verwendet werden. Durch Aufbereiten eines Blutspezimens von einer
schwangeren Frau mit einer Färbung zum
Kennzeichnen der alkalinen Phosphatase in Neutrophilen und einer
Kontrastfärbung,
um die Erfassung des plattenförmigen
Nukleus von Neutrophilen zu ermöglichen,
kann ein Pathologe visuell die Wahrscheinlichkeit bestimmen, dass
der Fötus
ein Trisomie-21-Fötus
ist.
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Die Prüfung von biologischen Spezimen
wurde in der Vergangenheit entweder von einem Labortechnologe oder
einem Pathologen manuell durchgeführt. Bei dem manuellen Verfahren
wird ein mit einem biologischen Spezimen aufbereiteter Träger mit einer
niedrigen Vergrößerung unter
einem Mikroskop betrachtet, um interessierenden Kandidatenzellen
visuell zu lokalisieren. Diejenigen Bereiche des Trägers, wo
die interessierenden Zellen lokalisiert sind, werden dann mit einer
höheren
Vergrößerung betrachtet,
um diejenigen Objekte als interessierenden Zellen zu bestätigen. Das
manuelle Verfahren ist zeitintensiv und kann für Fehler, einschließlich fehlende Bereiche
des Trägers,
empfänglich
sein. Bei dem oben gegebenen Beispiel wird eine Abtastung mit niedriger
Vergrößerung durchgeführt, um
die Neutrophile anhand der plattenförmigen Kerne mittels der Kontrastfärbungsfarbe
zu kennzeichnen.
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Automatisierte Zellenanalysesysteme
wurden entwickelt, um die Geschwindigkeit und die Genauigkeit des
Trägerauswertungsverfahrens
zu verbessern. Ein bekanntes interaktives System umfasst ein einziges
Mikroskopobjektiv mit hoher Leistung zum Abtasten eines Trägergestells,
wobei deren Abschnitte vorher zur Prüfung durch einen Bediener gekennzeichnet
wurden. Bei diesem System tastet der Bediener zuerst jeden Träger mit
einer niedrigen Vergrößerung ähnlich dem
manuellen Verfahren ab und vermerkt interessierende Punkte auf dem
Träger
für eine
spätere
Analyse. Der Bediener speichert dann die Adresse der vermerkten
Stelle und die zugeordnete Funktion in einer Datendatei. Sobald
die interessierenden Punkte lokalisiert und von dem Bediener gespeichert
wurden, wird der Träger
dann in einer automatisierten Analysevorrichtung positioniert, die
Bilder des Trägers
an den markierten Punkten erfasst und eine Bildanalyse durchführt.
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Es gibt ebenfalls bekannte automatisierte Spezimenanalysesysteme,
die Träger
automatisch betrachten, die in in einem Magazin geladenen Haltern
angeordnet sind. Die Träger
werden dann einzeln von dem Magazin zu einem motorisierten X-Y-Objekttisch des
Mikroskops bewegt. Der motorisierte Objekttisch wird betätigt, um
einen Träger
in dem Halter unter einem Objektivrevolver des Mikroskops zu platzieren,
und der Träger
wird mit einer niedrigen Vergrößerungsleistung
abgetastet. Die Ansicht des Trägers
durch die Okulare des Mikroskops wird von einer Kamera erfasst,
die entweder eine digitale Kamera oder eine analoge Kamera mit einem A/D-Wandler sein kann.
Das digitalisierte Bild wird an ein Computersubsystem geliefert,
das mit dem automatisierten Mikroskop gekoppelt ist, um interessierende
Kandidaten-Objekte
auf dem Träger
au erfassen. Information hinsichtlich des interessierenden Kandidaten-Objekts
wird dann gespeichert, und die Betrachtungsleistung für den Objektivrevolver
wird auf ein hohes Vergrößerungsniveau
erhöht.
Der Träger
wird mit hoher Vergrößerung abgetastet,
und ein Bild des Trägers
mit dem hohen Vergrößerungsniveau
wird von der Kamera erfasst, digitalisiert und von dem Computersubsystem
weiter verarbeitet, um Debris und andere Objekte zu beseitigen,
die Teil des zellularen Spezimen sein können und keine Analyse erfordern.
Die Abschnitte des Bildes mit hoher Vergrößerung, die interessierenden
Kandidaten-Objekten
entsprechen, die nicht durch die Verarbeitung mit dem Niveau mit
hoher Vergrößerung beseitigt
wurden, werden dann in einer Montage zum Betrachten durch einen
Pathologen gespeichert. Information, die den Träger kennzeichnet, von dem das
Bild erhalten wurde, und die Position des interessierenden Kandidaten-Objekts
auf dem Träger
wird ebenfalls mit der Montage aufgezeichnet. Wenn der Pathologe
das interessierende Kandidaten-Objekt auf dem Träger betrachten möchte, kann
der Pathologe den Träger
in einem Halter platzieren und in das automatisierte Analysesystem
laden. Das System bewegt dann den Träger zu einer Position unterhalb
des Objektivrevolvers, wo unter höherer Vergrößerung der Pathologe das interessierende
Kadidaten-Objekt
betrachten kann, um die Auswahl des interessierenden Kandidaten-Objekts
für die
Montage zu bestätigen.
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Ein Problem mit vorbekannten automatisierten
Systemen ist die Schwierigkeit beim Auswerten der Menge eines in
einem zellularen Spezimen vorhandenen Markers. Beispielsweise wird
neutrophile alkaline Phosphatase (NAP) typischerweise gefärbt, um
zu veranlassen, dass das unlösliche
Produkt, das den Marker kennzeichnet, eine rote Farbe annimmt. Der
zellulare Spezimen wird gewöhnlicherweise
kontrastgefärbt,
damit die Kerne der Zelle eine blaue Farbe annehmen. Ein einen derartigen
Träger
betrachtender Pathologe erfasst Neutrophile durch Lokalisieren derjenigen
Zellen, die einen Kern der Farbe, Form und Größe aufweisen, der für ein Neutrophil
erwartet wird. Der Pathologe wertet dann die Intensität der roten
Farbe für
jedes lokalisierte Neutrophil subjektiv aus und ordnet jedem eine
Punktzahl zu. Der Pathologe bestimmt dann subjektiv, ob die Anzahl von
hochgradig roten Neutrophilen und moderat roten Neutrophilen ausreichend
ist, um zu folgern, dass der zellulare Spezimen einen bestimmten
Zustand angibt. Für
NAP stuft der Pathologe gewöhnlicherweise
die Neutrophile mit der Bewertung von 0, 1, 2, 3 oder 4 in Übereinstimmung
mit einer Bewertungsskala ein, wie beispielsweise diejenige, die
mit dem Verfahren zum Verwenden des Reagenzkits bereitgestellt wird,
der von Sigma Diagnostics zum Demonstrieren von alkaliner Phosphataseaktivität in den
Leukozyten verkauft wird. Gemäß diesem
Verfahren summiert ein Pathologe die subjektiv zugewiesenen Einstufungen
für ein
Marker-kennzeichnendes Präzipitat
in den ersten 100 Neutrophilen, um zu einem Punktwert zu gelangen,
der .verwendet werden kann, um die relative rote Intensität der Neutrophile
in der zellularen Probe zu bestimmen. Diese Punktzahl kann dann
verwendet werden, um-zu bestimmen, ob der der Anwesenheit des Markers
zugeordnete Zustand angegeben wird.
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Vorbekannte automatisierte Spezimenanalysesysteme
waren nicht imstande, eine Einstufung bereitzustellen, die so zuverlässig ist,
wie diejenige, die durch einen geschulten Pathologen möglich ist. Beispielsweise
offenbart das U.S.-Patent
Nr. 5.352 613, erteilt an Tafas u. a., ein zytologisches Sortierverfahren,
das angibt, die Anwesenheit und die Menge derartiger Marker wie
NAP auszuwerten. Das System dieses Patents weist jedoch eine Anzahl
von Einschränkungen
auf. Zum einen muss der Umfang von Neutrophilen oder anderen interessierender
Kandidaten-Objekte genau in den Bildern lokalisiert sein, da das
Verfahren dieses Patents eine durchschnittliche optische Dichte
für jedes
Pixel innerhalb eines interessierenden Kandidaten-Objekts berechnet. Wenn
jedoch ein interessierendes Kandidaten-Objekt, wie beispielsweise
ein Neutrophil, von einer roten Blutzelle überlappt wird, kann das Verfahren
dieses Patents den Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts ungenau festlegen,
wenn es die rote Farbkomponente verwendet, um den Umfang für das interessierende
Kandidaten-Objekt
festzulegen. Wenn der Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts
nicht genau festgelegt wird, können
Pixel tatsächlich
in einem interessierenden Kandidaten-Objekt verfehlt werden, und
diejenigen, die nicht tatsächlich
in einem interessierenden Kandidaten-Objekt sind, können bei
der Berechnung des Dichtewerts enthalten sein. Tatsächlich gibt
dieses Patent nicht an, dass die Pixel für die Kerne der ausgewählten Zellen
von den optischen Dichtemessungen ausgenommen sind. In einigen Fällen kann
die Inklusion der Kernpixel oder die Exklusion der Pixel tatsächlich in
einer Zelle die Messungen verschieben. Außerdem arbeitet das Verfahren
dieses Patents an einer einzelnen Farbkomponente des Bildes des
zellularen Spezimen, und als Ergebnis kann, wenn sich Zellen überlappen
können,
der Pixelwert der einzelnen Farbkomponente, die analysiert wird, in
dem von den überlappten
Zellen weitergeleiteten Licht nicht geschwächt werden.
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Was benötigt wird, ist ein System,
das Neutrophile mit NAP genau so zuverlässig wie ein geschulter Pathologeeinstuft.
Was benötigt
wird, ist ein automatisiertes Spezimenanalysesystem, das sich nicht
auf die genaue Parameterdefinition eines interessierenden Kandidaten-Objekts
stützt,
um die Menge eines Markers zu messen, der ein Präzipitat innerhalb eines interessierenden
Kandidaten-Objekts kennzeichnet.
Was benötigt
wird, ist ein System, das die Menge eines Markers genau auswerten
kann, der ein Präzipitat
innerhalb eines zellularen Spezimen kennzeichnet, obwohl überlappende
Zellen in dem definierten interessierenden Objekt vorhanden sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Einschränkungen vorbekannter automatisierter
Analysesysteme und -verfahren können durch
ein System überwunden
werden, das das Verfahren der Erfindung implementiert. Das erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die Schritte eines Erhaltens eines digitalen Farbbildes
einer vergrößerten Ansicht
eines an dem Objektträger
gebundenen zellularen Spezimen, eines Verarbeitens des digitalen Farbbildes,
um eine Mehrzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten in den zellularen Spezimen
zu kennzeichnen; eines Kennzeichnens eines Flächenschwerpunkts für jedes
interessierende Kandidaten-Objekt, eines Berechnens eines Farbverhältnisses
von mindestens zwei Farbkomponenten für jedes Pixel eines um jeden
gekennzeichneten Flächenschwerpunkt
zentrierten Bereichs, Berechnen eines durchschnittlichen Farbverhältnisses
für alle
Pixel in dem um jeden Flächenschwerpunkt
zentrierten Bereich, der ein berechnetes Farbverhältnis aufweist, das
eine vorbestimmte Farbverhältnisschwelle überschreitet,
und Vergleichen des berechneten durchschnittlichen Farbverhältnisses
mit mindestens einer Intensitätsschwelle,
um die Menge des Markers auszuwerten, der ein Präzipitat bei jedem um jeden
Flächenschwerpunkt
zentrierten Bereich kennzeichnet.
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Dieses Verfahren kann durch ein automatisiertes
Analysesystem implementiert werden, das digitale Bilder erhält und die
digitalen Bilder verarbeitet, um interessierende Kandidaten-Objekte
in einem zellularen Spezimen auf einem Objektträger zu lokalisieren. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform
berechnet das System ein Verhältnis
von zwei Farbkomponenten für
die Pixel in einem regelmäßig geformten
Bereich um den gekennzeichneten Flächenschwerpunkt. Bei der bevorzugtesten
Implementierung ist der Bereich ein um den Flächenschwerpunkt zentrierten
70-Pixel-mal-70-Pixel-Bereich.
Durch Definieren eines regelmäßig geformten
Bereichs um den Flächenschwerpunkt
muss das Einstufungssystem nicht länger einen einem interessierenden
Kandidaten-Objekt zugeordneten unregelmäßigen Umfang durchlaufen, um
die für
die Analyse des Objekts erforderlichen Pixel zu kennzeichnen. Statt
dessen weist die Berechnung eines Farbverhältnisses mit mindestens zwei
Farbkomponenten bei der Auswertung nur diejenigen Pixel wirksam
auf, die Beweise des Marker-kennzeichnenden Präzipitats und seine relative
Intensität
enthalten. Da der um den Flächenschwerpunkt
zentrierte Bereich regelmäßig geformt ist,
ist die Verarbeitung der Pixel viel schneller als bei vorbekannten
Verfahren. Außerdem
liefert die Verwendung des Verhältnisses
von zwei Farbkomponenten mehr Information, so dass das Verfahren
genauer als diejenigen ist, die nur eine Farbkomponente verwenden,
um die Menge eines Marker-kennzeichnenden Präzipitats auszuwerten.
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Bei der bevorzugten Implementierung
der Erfindung wird zuerst ein 70-Pixel-mal-70-Pixel-Bereich um den
Flächenschwerpunkt
definiert. Ein Verhältnis
der roten Pixelintensität
zu der grünen
Pixelintensität
für jedes
Pixel in dem Bereich wird für
die Auswertung von NAP in diesem Bereich verwendet. Das bevorzugte
Verhältnis
ist ein Verhältnis
der Differenz zwischen den roten und grünen Pixelkomponenten zu der
Summe der roten und grünen
Pixelkomponenten. Da die bevorzugte Implementierung nicht den Betrag
der Differenz verwendet, ist das Verhältnis eine vorzeichenbehaftete
Größe innerhalb
des Bereichs von –1
bis +1. Wenn eine zellulare Probe chemisch mit einer Lösung von
Naphtal-AS-Biphosphatsalz und schnellem rotem Violett-LB geprüft wurde,
wird die Anwesenheit von alkaliner Phosphatase durch die rote Farbe
des durch Hydrolyse gebildeten Präzipitats angegeben. Als Ergebnis
sind die bevorzugten Farbverhältnisse,
die die Anwesenheit von NAP angeben, in dem Bereich von geringfügig größer Null
bis +1. Folglich können
alle die Pixel, die die Anwesenheit von NAP innerhalb des regelmäßig geformten
Bereichs angeben, durch Verhältnisse
mit einem positiven Wert ungleich Null gekennzeichnet werden.
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Die Farbverhältnisse für diejenigen Pixel mit einem
Farbverhältnis,
das sowohl nicht Null als auch positiv ist, werden summiert und
dann durch die Anzahl von Pixeln dividiert, die positive Werte ungleich Null
aufweisen. Dieser berechnete Wert ist ein normiertes Verhältnis in
dem Bereich von Null bis +1. Der Bereich von Null bis +1 kann dann
in fünf
Subregionen aufgeteilt werden, die den Punktzahlwerten 0, 1, 2,
3 und 4 entsprechen, die gewöhnlicherweise verwendet
werden, um die Menge von NAP in einem zellularen Spezimen einzustufen.
Die Punktzahl für 100
dieser Bereiche wird berechnet und dann summiert, um eine Gesamtpunktzahl
für den
zellularen Spezimen zu erhalten. Diese Gesamtpunktzahl wird dann
mit einer Schwelle verglichen, um auszuwerten, ob die Menge von
NAP in dem zellularen Spezimen angibt, ob die Person, von der der
Spezimen erhalten wurde, den Zustand aufweist, der normalerweise
von dem Marker angegeben wird.
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Das Verfahren und das System der
Erfindung stellt eine Anzahl von Verbesserungen und Vorteilen bereit.
Zum einen ist, da die regelmäßig geformten
Bereiche verwendet werden, um den Bereich um den Flächenschwerpunkt
eines Kandidaten-Objekts
von Interesse auszuwerten, die Verarbeitung der Pixel in dem Bereich
viel schneller als wenn ein unregelmäßig geformter Umfang lokalisiert
und dann verfolgt werden muss, um die Bilddaten für ein Kandidaten-Objekt
zu verarbeiten. Die Verwendung von zwei Farbkomponenten für das Farbverhältnis ermöglicht dem
System und dem Verfahren, einen regelmäßig geformten Bereich zu verwenden,
da das Verhältnis
nur diejenigen Pixel in dem Zytoplasma des Neutrophil wirksam kennzeichnet,
die alkaline Phosphatase enthalten, ohne einen Objektparameter zu
lokalisieren und zu durchlaufen. Außerdem ermöglicht die Verwendung von zwei
Farbkomponenten einem System, die Anwesenheit eines Markers zu erfassen,
obwohl Debris oder eine überlappende Zelle
die roten Pixelwerte in dem überlappten
Bereich dämpfen
können.
Der Leser erkennt, dass das System und das Verfahren der Erfindung
verwendet werden können,
um die Menge des Markers in jedem zellularen Spezimen auszuwerten,
der gefärbt
wurde, um den in dem zellularen Spezimen vorhandenen Marker zu kennzeichnen.
Diese Verfahren umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind,
monoklonale Antikörper,
polyklonale Antikörper,
insitu-Hybridisierung oder umgekehrte Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren
(RTPCR-Verfahren).
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Ein anderes Merkmal der Erfindung
ist die Verwendung eines rauschverringernden Filters, das für die Farbverhältnisberechnung
verwendet wird. Dieses Filter ist eine Schwelle, mit der die Zweifarbenkomponentendifferenz
verglichen wird. Wenn die Zweifarbenkomponentendifferenz kleiner
als die Schwelle ist, wird das Verhältnis für .das Pixel nicht berechnet.
Vorzugsweise ist diese Schwelle eine kleine positive Zahl. Diese
Rauschschwelle verringert die Wahrscheinlichkeit, dass ein Pixel,
dessen zwei Zweifarbenkomponentendifferenz auf eine kleine positive
Zahl durch elektronisches Rauschen erhöht wird, für ein Markerkennzeichnendes
Präzipitat ausgewertet
wird. Dieses Filter hilft ebenfalls, Pixel von einer roten Blutzelle
auszuschließen,
die sich über
einen überlappenden
Bereich mit einem interessierenden Kandidaten-Objekt erstrecken.
Somit verringert das Filter die Notwendigkeit, den Umfang des Kandidaten-Objekts
von Interesse genau festzulegen, und gleicht elektronisches Rauschen
bei der Erzeugung der Bilddaten aus.
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Diese und weitere Vergünstigungen
und Vorteile des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems und Verfahrens
können
aus der ausführlichen
Beschreibung der Erfindung ermittelt werden.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Die begleitenden Zeichnungen, die
in die Beschreibung aufgenommen sind und einen Teil dieser bilden,
veranschaulichen bevorzugte und alternative Ausführungsformen der Erfindung
und dienen zusammen mit einer oben gegebenen allgemeinen Beschreibung
und der nachstehend gegebenen ausführlichen Beschreibung der Ausführungsformen
dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erläutern.
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1 ist
eine Perspektivansicht einer Vorrichtung zur automatisierten Zellenanalyse,
die die vorliegende Erfindung verkörpert;
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2 ist
ein Blockdiagramm der in 1 gezeigten
Vorrichtung;
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3 ist
ein Blockdiagramm des Mikroskopcontrollers von 2;
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4 ist
ein Ablaufdiagramm für
das bevorzugte Verfahren zum Einstufen von Objekten in einem Bild
eines zellularen Spezimen, der durch die Vorrichtung von 1 erhalten wurde;
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5 ist
eine Perspektivansicht eines regelmäßig geformten Bereichs in einem
Bild eines zellularen Spezimen, das durch das in 3 dargestellte beispielhafte Verfahren
verarbeitet wird; und
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6 ist
ein Blockdiagramm eines zellularen Spezimeneinstufungssystems, das
das Verfahren von 4 implementiert.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Mit Bezugnahme auf die Figuren wird
eine Vorrichtung zur automatisierten Zellenanalyse von biologischen
Spezimen im allgemeinen durch eine Bezugsziffer 10 angegeben,
wie es in einer Perspektivansicht in 1 und
in einem Blockdiagramm in 2 gezeigt
wird. Die Vorrichtung 10 umfasst ein Mikroskopsubsystem 32,
das in einem Gehäuse 12 untergebracht
ist. Das Gehäuse 12 umfasst
ein Trägerhaltereingabemagazin 16 und
ein Trägerhalterausgabemagazin 18.
Eine Tür 14 in
dem Gehäuse 12 schützt das
Mikroskopsubsystem von der externen Umgebung. Ein Computersubsystem
umfasst einen Computer 22 mit einem Systemprozessor 23,
einem Bildprozessor 25 und einem Kommunikationsmodem 29.
Das Computersubsystem umfasst ferner einen Computermonitor 26 und
einen Bildmonitor 27 und weitere externe Peripheriegeräte, einschließlich einer
Speichervorrichtung 21, einer Trackballvorrichtung 30,
einer Tastatur 28 und einem Farbdrucker 35. Eine
externe Leistungsversorgung 24 zum Versorgen des Systems
ist ebenfalls gezeigt. Betrachtungsokulare 20 des Mikroskopsubsystems
ragen von dem Gehäuse 12 zur
Bedienerbetrachtung heraus. Die Vorrichtung 10 umfasst
ferner eine CCD-Kamera 42 zum Erfassen von Bildern durch
das Mikroskopsubsystem 32. Vorzugsweise ist ein Schalter
in dem System enthalten, der entweder die vergrößerte Ansicht von dem Objektivrevolver 44 an
Okulare 20 oder die Kamera 42 liefert. Ein Mikroskopcontroller 31 unter der
Steuerung des Systemprozessors 23 steuert eine Anzahl von
Mikroskopsubsystemfunktionen, die weiter ausführlich beschrieben werden.
Ein automatisierter Trägerzuführmechanismus 37 in
Verbindung mit einem X-Y-Objekttisch 38 stellen eine automatisierte
Trägerhandhabung
in der Vorrichtung 10 bereit. Eine Beleuchtungslichtquelle 48 projiziert
Licht auf dem X-Y-Objekttisch 38,
das nachfolgend durch das Mikroskopsubsystem 32 abgebildet
und durch die CCD-Kamera 42 zur Verarbeitung in dem Bildprozessor 25 erfasst
wird. Eine Z-Stufe (Z-Abschnitt) oder Fokussierstufe 46 unter
der Steuerung des Mikroskopcontrollers 31 stellt eine Verschiebung
des Mikroskopsubsystems in der Z-Ebene zur Fokussierung bereit.
Das Mikroskopsubsystem 32 umfasst ferner einen motorisierten
Objektivrevolver 44 zur Auswahl von Objektiven.
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Der Zweck der Vorrichtung 10 besteht
in dem unbegleiteten automatischen Abtasten vorbereiteter Mikroskopträger für die Erfassung
von interessierenden Kandidaten-Objekten,
wie beispielsweise besonderen Zellen, die ein Marker-kennzeichnendes
Präzipitat
enthalten, und die Auswertung der Menge eines Marker-kennzeichnenden
Präzipitats
in den interessierenden Kandidaten-Objekten. Die Vorrichtung 10 lokalisiert
interessierende Kandidaten-Objekte automatisch, die in einem biologischen
Spezimen vorhanden sind, auf der Grundlage von Farbe, sowie Größe- und
Formcharakteristiken. Einstufungen, die die Menge des Markerkennzeichnenden
Präzipitats
für die
Kandidaten-Objekte von Interesse angeben, werden bestimmt und summiert,
um einen Punktwert für den
biologischen Spezimen zu erzeugen. Dieser Punktwert kann verwendet
werden, um auszuwerten, ob der biologische Spezimen einen medizinischen Zustand
angibt, der typischerweise dem Marker zugeordnet ist, der das Markerkennzeichnende
Präzipitat
erzeugte. Eine Anzahl von Färbungen
und Kontrastfärbungen
werden verwendet, um ein gefärbtes Marker-kennzeichnendes
Präzipitat
in verschiedenen Zellen und Zellenstrukturen des biologischen Spezimen
zu erzeugen. Die Vorrichtung der Erfindung wird verwendet, um dieses
Präzipitat
zu erfassen, um Kandidaten-Objekte von Interesse zu kennzeichnen.
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während
des Betriebs der Vorrichtung 10 bringt ein Pathologe oder
ein Labortechnologe vorbereitete Träger auf Trägerhaltern an. Ein Trägerhalter hält bis zu
4 Träger,
und bis zu 25 Trägerhalter
können
in das Eingabemagazin 16 geladen werden. Der Bediener kann
die Größe, Form
und Position des abzutastenden Bereichs spezifizieren, oder das
System kann alternativ Abtastbereiche automatisch lokalisieren.
Der Bediener weist dann das System an, das automatische Abtasten
der Träger
durch eine graphische Benutzerschnittstelle zu beginnen. Das unbegleitete
Abtasten beginnt mit dem automatischen Laden des ersten Halters
auf dem motorisierten X-Y-Präzisions-Objekttisch 38.
Ein Strichcodeetikett, das an dem Träger befestigt ist, wird von
einem Strichcodeleser 33 während dieses Ladevorgangs gelesen.
Jeder Träger
wird dann mit einer benutzerausgewählten niedrigen Mikroskopvergrößerung, beispielsweise
20-fach, abgetastet, um Kandidaten-Objekte basierend auf ihrer Farbe
sowie Größen- und
Formcharakteristiken zu kennzeichnen. Die X-Y-Positionen von Kandidaten-Objekten
werden gespeichert, bis die Abtastung abgeschlossen ist.
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Nachdem das Abtasten mit niedriger
Vergrößerung abgeschlossen
ist, kehrt die Vorrichtung automatisch zu jedem Kandidaten-Objekt
zurück,
fokussiert mit einer höheren
Vergrößerung,
wie beispielsweise 60-fach, für
NAP-Auswertung und erfasst ein digitales Bild zur weiteren Analyse,
um den Objekt-Kandidaten zu bestätigen.
Der Flächenschwerpunkt
für jeden
bestätigten
Zellenkandidaten wird berechnet und zur Auswertung des Marker-kennzeichnenden
Präzipitats
gespeichert. Die Vorrichtung 10 kehrt dann zu dem Flächenschwerpunkt
für das
erste bestätigten
interessierende Kandidaten-Objekt
zurück
und erfasst ein Farbbild eines um den Flächenschwerpunkt zentrierten
Bereiches. Die Pixeldaten für
diesen Bereich werden verarbeitet, um die Menge des Markerkennzeichnenden
Präzipitats
in dem Bereich zu bestimmen, und eine Stufe wird dem Objekt zugewiesen.
Die Vorrichtung 10 setzt die Verarbeitung und die Einstufung
von Bereichen durch, die um andere bestätigte interessierende Kandidaten-Objekte zentriert
sind, bis eine vorbestimmte Anzahl von Objekten verarbeitet wurde.
Eine Gesamtpunktzahl wird dann aus den Einstufungen für die vorbestimmte
Anzahl von Objekten berechnet. Die Objekteinstufungen, Gesamtpunktzahl
und Bilder können
dann in einer Speichervorrichtung 21, wie beispielsweise
einer auswechselbaren Festplatte oder einem DAT-Band gespeichert
oder an eine entfernte Stelle zur Prüfung oder Speicherung gespeichert
werden. Die für
jeden Träger
gespeicherten Bilder können
in einem Mosaik von Bildern zur. weiteren Durchsicht betrachtet
werden. Außerdem
kann der Pathologe oder ein Techniker ebenfalls eine erfasste Zelle
direkt durch das Mikroskop mittels Okulare 20 oder den
Bildmonitor 27 betrachten.
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Mit Bezug auf 3 wird der Mikroskopcontroller 31 ausführlicher
gezeigt. Der Mikroskopcontroller 31 umfasst eine Anzahl
von Subsystemen, die durch einen Systembus verbunden sind. Der Systemprozessor 112 steuert
dieses Subsystem und wird von dem Vorrichtungssystemprozessor 23 durch einen
RS-232-Controller 110 gesteuert. Der Systemprozessor 102 steuert
einen Satz von Motorsteuersubsystemen 114 bis 124,
die die Eingabe- und Ausgabezuführvorrichtung,
den motorisierten Revolver 44, den X-Y-Objekttisch 38 und
die Z-Stufe 46 steuern (2).
Ein Histogrammprozessor 108 empfängt eine Eingabe von der CCD-Kamera 42 zum
Berechnen von Varianzdaten während
des hier außerdem beschriebenen
Fokussiervorgangs.
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Der Systemprozessor 102 steuert
ferner den Beleuchtungscontroller 106 zum Steuern der Substufenbeleuchtung 48.
Das von der Halogenlampe ausgegebene Licht, die die Beleuchtung
für das
System liefert, kann sich mit der Zeit aufgrund von Lampenalterung,
Veränderungen
in der optischen Ausrichtung und anderen Faktoren verändern. Außerdem können Träger, die "überfärbt" wurden, die Kamerabelichtung auf ein
unannehmbares Niveau verringern. Um diese Effekte auszugleichen,
ist ein Beleuchtungscontroller 106 enthalten. Dieser Controller
wird in Verbindung mit Lichtsteuersoftware verwendet, um die Variationen
im Lichtniveau auszugleichen. Die Lichtsteuersoftware tastet die
Ausgabe von den Kameras an Intervallen ab (wie beispielsweise zwischen
dem Laden der Trägerhalter)
und weist den Controller an, das Lichtniveau auf das gewünschte Niveau
einzustellen. Auf diese Art und Weise ist die Lichtsteuerung automatisch
und für
den Benutzer transparent, und fügt
dem Systembetrieb keine zusätzliche
Zeit hinzu.
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Der Systemprozessor 23 ist
vorzugsweise ein IBMkompatibler PC mit einem Intel-Pentium-90 MHz-Prozessor,
32 MB RAM und zwei 1-GB-Festplatten, wobei die Festplatte auswechselbar
sein kann. Das Betriebssystem für
den Systemprozessor 23 ist Windows for Workgroups 3.1,
das von Microsoft Corporation, Redmond, Washington, verfügbar ist.
Der Bildprozessor 25 ist vorzugsweise eine Matrox-Imaging-Serie 640-Platinensatz,
der von Matrox Electronic Systems, Ltd., Dorval, Quebec, Kanada, verfügbar ist.
Der bevorzugte Bildprozessor wird mit Unterstützungssoftware und dem Matrox
Imaging Library (MIL) ausgestattet. Der Mikroskopcontrollersystemprozessor 102 ist
eine AMD29K-Vorrichtung von Advanced Micro Devices.
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Die Bildverarbeitung mit niedriger
Vergrößerung kennzeichnet
Zellen mit einem Kern, der mit einer bestimmten Farbe gefärbt ist,
die der Färbung oder
Kontrastfärbung
entspricht, die verwendet wird, um den zellularen Spezimen aufzubereiten.
Beispielsweise wird ein Blutabstrich, der verwendet wird, um die
Anwesenheit alkaliner Phosphatase in Neutrophile auszuwerten, typischerweise
mit einer Lösung
aus Naphtol-AS-Biphosphatsalz und schnellem roten Violett-LB gefärbt. Die
Anwesenheit alkaliner Phosphatase in einem Neutrophil (NAP) in dem
zellularen Spezimen wird durch die rote Farbe des durch Hydrolyse
gebildeten Präzipitats
angegeben. Der Spezimen wird gewöhnlicherweise
mit einer Kontrastfärbung,
wie beispielsweise Hematoxylin, kontrast gefärbt, um ein blaues unlösliches
Präzipitat
in den Zellenkernen des weißen
Blutes zu erzeugen. Der resultierende Spezimen von diesem Färbungs/Gegenfärbungs-Verfahren
führt zu
weißen Blutzellen,
die durch Zellen gekennzeichnet werden können, die blaue Kerne aufweisen.
Diese Zellen können
verarbeitet werden, um Neutrophilzellen basierend auf der Form und
Größe der Kerne
zu kennzeichnen. Somit kennzeichnet die Verarbeitung mit niedriger
Vergrößerung interessierende
Kandidaten-Objekte, wie beispielsweise Neutrophile, aus der Farbe,
Form und Größe der Objekte
in dem Bild des zellularen Spezimen.
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Die von dem System während der
Bildverarbeitung mit hoher Vergrößerung durchgeführte Verarbeitung
wertet ferner die Farbe, Form und Größe des Zellenkerns für jedes
der interessierenden Kandidaten-Objekte aus, um Objekte, die das
Marker-kennzeichnende Präzipitat
wahrscheinlich nicht enthalten, zu eliminieren. Bei einer bevorzugten
Implementierung der Erfindung für
NAP beträgt
die minimale Fläche
zum Kennzeichnen von interessierenden Kandidaten-Objekten l4 μm2.
Der bevorzugte Kompaktheitwert ist für Objekte mit einem Kern, der
größer als
der Wert 1,25 ist. Die Kompaktheit ist ein Begriff, der die Form
des Umfangs des Kerns angibt, die auf dem Gebiet bekannt ist. Der
Flächenschwerpunkt
des gekennzeichneten Kandidaten-Objekts von Interesse wird dann
berechnet, und der Flächenschwerpunkt wird
für die
Punktzahlverarbeitung gespeichert. Nachdem eine vorbestimmte Anzahl
von interessierenden Kandidaten-Objekten bestätigt und ihre entsprechenden
Flächenschwerpunkte
gespeichert sind, wird eine Punktzahlverarbeitung durchgeführt.
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Bei der bevorzugten Implementierung
ist die Bildverarbeitung, die mit der niedrigen Vergrößerung und
hohen Vergrößerungsniveaus
durchgeführt
wird, diejenige, die in unserer gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit
dem Titel "METHOD
AND APPARATUS FOR AUTOMATED IMAGE ANALYSIS OF BIOLOGICAL SPECIMENS", Seriennummer 08/758436,
eingereicht am 27. November 1996, offenbart wird. Die Offenbarung
dieser Anmeldung wird hiermit ausdrücklich durch Bezug aufgenommen.
Die in diesem Dokument offenbarte Farbumwandlung, Tiefpassfilterung,
Schwellenwertbildung und morphologische Verarbeitung wird vorzugsweise
verwendet, um interessierende Kandidaten-Objekte zu kennzeichnen.
Der Flächenschwerpunkt
und die morphologischen Charakteristika für ein interessierendes Kandidaten-Objekt,
wie beispielsweise seine Größe und Kompaktheit,
wird aus Funktionen in dem MIL für
den bevorzugten Bildprozessor erhalten. Obgleich dies das bevorzugte
Verfahren zum Kennzeichnen und Bestätigen von interessierenden
Kandidaten-Objekten in dem Bild eines zellularen Spezimen ist, können andere
bekannte Verfahren verwendet werden, solange wie das Verfahren die
Position und die allgemeine Form dieser Zellen kennzeichnet, die
das Markerkennzeichnende Präzipitat
enthalten.
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Das Verfahren der Punktzahlverarbeitung
ist in 4 gezeigt. Dieses
Verfahren beginnt durch Wiedergewinnen des Flächenschwerpunkts für das erste
bestätigte
interessierende Objekt und erfasst die Farbpixelwerte für einer
regelmäßig geformten Bereich,
der um den Flächenschwerpunkt
zentriert ist (Block 200). Der Bereich kann jeder regelmäßig geformte
Bereich sein, der ohne weiteres durch eine bekannte Programmschleifensteuerung
durchlaufen werden kann, wie beispielsweise zweidimensionaler Parallelogramme.
Die bevorzugteste regelmäßige Form
ist ein Quadrat, und die bevorzugteste Größe des Quadrats ist 70 Pixel
mal 70 Pixel. Der regelmäßig geformte
Bereich sollte ausreichend groß sein, um
alle Pixel aufzunehmen, die Bilddaten für das Marker-kennzeichnende
Präzipitat
enthalten, das einem interessierenden Kandidaten- Objekt zugeordnet ist. Beispielsweise
entspricht die bevorzugteste 70-Pixel-mal-70-Pixel-Form einem Bereich,
der groß genug
ist, um das Zytoplasma und den Kern der Zelle abzudecken, die einem
bestätigten
interessierenden Kandidaten-Objekt entsprechen. Die bevorzugteste Fläche ist
in 5 gezeigt. Wie aus
der Figur ersichtlich ist, erstreckt sich die regelmäßig geformte
Fläche über den
Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts, so dass die um den
Flächenschwerpunkt
des interessierenden Objekts zentrierte Fläche alle Pixel des interessierenden
Kandidaten-Objekts aufnehmen kann. Der Leser erkennt, dass jeder
Bereich, der verwendet werden kann, um die Auswertung der Menge
des Marker-kennzeichnenden Präzipitats
in einem interessierenden Kandidaten-Objekt zu vereinfachen, ohne
dass der Umfang des interessierenden Kandidaten-Objekts festgelegt
werden muss, um die Pixel des interessierenden Kandidaten-Objekts
zu kennzeichnen, die in die Auswertung aufzunehmen sind, innerhalb
der Prinzipien der Erfindung liegt.
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Ein Farbverhältnis wird dann für jedes
Pixel berechnet (Block 204). Bei der bevorzugten Implementierung
ist das Farbverhältnis
die Differenz von zwei Pixel-Farbkomponenten zu der Summe der gleichen
zwei Pixel-Farbkomponenten. Bei der bevorzugtesten Implementierung
werden die roten und grünen
Pixel-Farbkomponenten verwendet, um NAP in einem zellularen Spezimen
zu bewerten, der mit einer Lösung
von Naphtol-AS-Biphosphatsalz
und schnellem roten Violett-LB gefärbt und dann mit Hematoxylin
kontrastgefärbt
wird. Somit kann das Verhältnis
als (R – G)/(R
+ G) ausgedrückt
werden, obwohl andere Farbkomponentenkombinationen verwendet werden
können.
Die Farbkomponentenauswahl umfasst vorzugsweise die zwei Farbkomponenten,
die der Marker-kennzeichnenden Präzipitatfarbe (typischerweise
Färbungsfarbe)
und die zellenkennzeichnende Farbe (typischerweise Kontrastfärbungsfarbe) am
besten entsprechen. Das Verhältnis
kennzeichnet diejenigen Pixel, die von der ersten Farbkomponente
(Rot bei der bevorzugten Ausführungsform)
dominiert werden), von denen die zweite Farbkomponente (Grün bei der
bevorzugtesten Ausführungsform)
subtrahiert wird. Das Verhältnis
liegt in dem Bereich von –1
bis +1, wobei das Verhältnis
für von
der ersten Farbkomponente dominierte Pixel positiv, für von der
zweiten Farbkomponente dominierte Pixel negativ und, wenn die beiden
Komponenten gleich sind, Null ist,.
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Die Verwendung des Farbverhältnisses
ermöglicht
dem System und Verfahren der Erfindung, die Pixel der regelmäßig geformten
Fläche
zu verarbeiten, und die Menge des Markerkennzeichnenden Präzipitats
auszuwerten, ohne den Umfang zu durchlaufen, um alle Pixel in einem
interessierenden Kandidaten-Objekt zu kennzeichnen. Statt dessen
ermöglicht
das Verhältnis
der beiden Farbkomponenten, wobei mindestens eine von diesen der
Farbe des Marker-kennzeichnenden Präzipitats entspricht, die Pixelwerte
zu kennzeichnen, die dem Marker-kennzeichnenden Präzipitat
entsprechen, ohne auf die Geometrie des interessierenden Kandidaten-Objekts Bezug
zu nehmen. Dies ermöglicht
dem Verfahren der Erfindung, jedes Kandidaten-Objekt schneller und
genauer auszuwerten, als Verfahren, die sich auf die Geometrie stützen, um
Pixel zu kennzeichnen, die dem Marker-kennzeichnenden Präzipitat
entsprechen.
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Am besten wird ein Farbverhältnis nur
für. diejenigen
Pixel berechnet, die eine Differenz der beiden Farbkomponenten aufweisen,
die größer als eine
vorbestimmte Rauschschwelle ist. Vorzugsweise ist die Rauschschwelle
eine kleine positive Zahl, und am bevorzugtesten ist die Schwelle
fünf (5).
Die Wirkung der Rauschschwelle besteht darin, die Anzahl von Pixeln
in einem weißen
oder schwarzen Bereich zu verringern, für den es den Anschein haben kann,
dass er eine Farbe aufweist, die das Marker-kennzeichnenden Präzipitat
angibt. Weiße
oder schwarze Pixel sollten einen Wert aufweisen, bei dem alle Farbkomponenten
Null (0) bzw. Zweihundertfünfundfünfzig (255)
sind. Als Ergebnis sollte eine Differenz der beiden Farbkomponenten
für ein weißes oder
schwarzes Pixel Null und das Pixel nicht in der unten erläuterten
Farbverhältnisnormierung enthalten
sein. Elektronisches Rauschen kann jedoch veranlassen, dass ein
Pixel, das weiß sein
sollte, eine Farbkomponente mit einem kleinen positiven Wert aufweist,
oder ein Pixel, das schwarz sein sollte, eine Farbkomponente aufweist,
die geringfügig
kleiner als 255 ist. Wenn diese Farbkomponente mit dem rauschinduzierten
Wert die rote Komponente für
das weiße
Pixel oder die grüne
Komponente für
das schwarze Pixel bei der bevorzugten Differenz der beiden Farbkomponenten
für NAP-Einstufung
ist, dann wird ein kleines positives Verhältnis sowohl für das weiße als auch
das schwarze Pixel berechnet. Diese Farbverhältnisse würden dann in die Farbverhältnisnormierung
aufgenommen und die Ergebnisse verschieben. Dieses verschobene Verhältnis kann
dann die Einstufung für
das interessierende Kandidaten-Objekt und möglicherweise die Punktzahl
für den zellularen
Spezimen beeinflussen. Die Rauschschwelle verhindert jedoch die
Berechnung des Farbverhältnisses
für die
Pixel, solange wie die Zweifarbenkomponentendifferenz kleiner als
die Rauschschwelle ist. Außerdem
verringert die Rauschschwelle die Wahrscheinlichkeit, dass Pixel
von einer überlappten
Zelle in der Einstufung und Punktzahlbewertung des zellularen Spezimen
enthalten sind. Beispielsweise sind Pixel für eine rote Blutzelle, die
ein interessierendes Kandidaten-Objekt überlappt und die sich über den
Umfang des Kandidaten-Objekts von Interesse erstreckt, typischerweise
nicht intensiv rot. Als Folge würde
die Rauschschwelle diejenigen Pixel der roten Blutzelle außerhalb
des Kandidaten-Objekts von Interesse eliminieren, die von der Kandidaten-Objekteinstufung
nominal rot gefärbt sind.
Diese Filterung wird ohne Bezug auf den Umfang des Kandidaten-Objekts
von Interesse durchgeführt.
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Alternativ können Pixel, die fast weiß oder fast
schwarz sind, als weiß oder
schwarz betrachtet werden, so dass sie nicht für die Einstufung eines interessierenden
Kandidaten-Objekts
verwendet werden. Dieses Verfahren bestimmt, ob die Farbkomponente
mit dem größten Wert
kleiner als eine Weiß-Schwelle ist, oder
ob die Farbkomponente mit dem kleinsten Wert größer als eine Schwarz-Schwelle
ist. Wenn beispielsweise eine Weiß-Schwelle von 10 verwendet
wird, würde
ein fast weißes
Pixel mit roten, grünen
und blauen Werten von 9, 3 bzw. 8 als ein weißes Pixel mit einer Differenz
der beiden Farbkomponenten von Null (0) betrachtet werden, obwohl die
tatsächliche
Rot-Grün-Differenz
gleich sechs (6) ist. Somit würde
eine Rauschschwelle von 5 in dem Farbverhältnis für das Pixel bei der Objekteinstufung aufgenommen
werden müssen,
wobei jedoch die Weiß-Schwelle
von 10 es aus der Einstufung entfernen würde. Auf ähnliche Weise würde eine Schwarz-Schwelle
von zweihundertfünfzig
(250) Pixel mit einer kleinsten Farbkomponente von 250 oder höher als
schwarze Pixel klassifizieren und kein Farbverhältnis für das Pixel berechnen.
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Das Verfahren von 4 fährt
dann durch Summieren aller Farbverhältnisse für die Pixel mit einem positiven
Farbverhältnis
ungleich Null und. teilen der Summe durch die Anzahl verwendeter
Pixel fort, um die Summe zu berechnen (Block 208, 210, 212, 214).
Dieses normierte Farbverhältnis
für die Fläche wird
dann mit mindestens einer Schwelle verglichen, um die Menge des
Marker-kennzeichnenden Präzipitats
zu bestimmen (Block 220). Bei der oben erläuterten
bevorzugten Ausführungsform
für NAP für die Färbung und
Kontrastfärbung
gibt es vier Schwellen für
den Bereich von 0 bis +1. Diese vier Schwellen teilen den Bereich
in fünf
Subbereiche auf, die den fünf
Einstufungen entsprechen, die typischerweise verwendet werden, um
die Intensität
des NAP-Präzipitats
zu klassifizieren. Die Einstufung für die Fläche wird dann zu einem Objektpunktwert
hinzugefügt
(Block 224), und das Verfahren setzt sich fort, bis eine
vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten verarbeitet
wurden (Block 228). Bei der bevorzugtesten Ausführungsform
beträgt
die vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten,
um die Menge von NAP in einem zellularen Spezimen auszuwerten, einhundert (100)
Objekte. Die Objektpunktzahl wird dann in Verbindung mit dem Träger (Block 230)
zur späteren Auswertung
durch einen Pathologen gespeichert. Alternativ kann die Objektpunktzahl
mit einer vorbestimmten Schwelle verglichen werden, die angibt,
ob der zellulare Spezimen den dem Marken zugeordneten Zustand angibt.
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Bei der bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Verfahren von 4 in
einem C-Programm implementiert, das zu dem Bildprozessor 25 zur
Ausführung
heruntergeladen wird, obwohl andere Programmiersprachen verwendet
werden können.
Außerdem
kann das Programm auf einem anderen Prozessor des Systems ausgeführt werden, solange
die in dem Prozessor 25 gespeicherten Bilddaten für das Programm
und/oder die Hardware, die das Verfahren von 4 implementieren, verfügbar sind.
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Ein System, das verwendet werden
kann, um das bevorzugte Verfahren der Erfindung zu implementieren,
ist in 6 gezeigt. Das
System 150 verarbeitet in dem Bildprozessor 25 gespeicherte
Bilddaten, um eine Punktzahl für
einen an einem Träger gebundenen
zellularen Spezimen zu erzeugen. Ein Farbverhältnisgenerator 154 berechnet
die Farbverhältnisse
für Pixel
innerhalb eines regelmäßig definierten
Bereichs um einen Flächenschwerpunkt
für ein
interessierendes Kandidaten-Objekt
in den Bilddaten. Vorzugsweise umfasst ein Farbverhältnisgenerator 150 eine
Rauschschwelle, um zu bestimmen, für welche Pixel ein Farbverhältnis berechnet
wird. Die berechneten Farbverhältnisse
werden an einen Farbverhältniskomparator 58 geliefert,
der das Farbverhältnis
mit einer positiven Schwelle ungleich Null vergleicht, um zu bestimmen,
ob das Farbverhältnis in
dem normierten Farbverhältnis
für den
Spezimen enthalten ist. Diese von dem Komparator 158 weitergeleiteten
Farbverhältnisse
werden an einen Farbverhältnisnormierer 160 geliefert,
der die an ihn geleiteten Farbverhältnisse summiert und sie durch
die Anzahl von an ihn geleitete Farbverhältnisse teilt. Das normierte
Farbverhältnis
für ein
interessierendes Kandidaten-Objekt wird an einen Einstufungsgenerator 164 geliefert,
der das normierte Farbverhältnis
mit einer oder mehreren Schwellen vergleicht und dem interessierenden
Kandidaten-Objekt eine Einstufung zuweist. Die zugewiesene Einstufung
wird an einen Punktzahlgenerator 168 geliefert. Der Punktzahlgenerator 168 summiert
die Einstufungen für
eine vorbestimmte Anzahl von interessierenden Kandidaten-Objekten,
um eine Gesamtpunktzahl zu erzeugen, die mit Daten für den Träger gespeichert
werden können.
Die Punktzahl kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob der zellulare
Spezimen einen bestimmten medizinischen Zustand angibt. Die Komponenten
des Systems 150 können
in Hardware oder Software oder einer Kombination derselben implementiert
sein.
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Beim Gebrauch bereiten Labortechnologen eine
Mehrzahl von Trägern
mit zellularen Spezimen auf, die behandelt werden, um einen Marker
visuell erfassbar zu machen. Die Träger werden dann auf Trägerhalter
geladen und in das Trägermagazin
des automatisierten Mikroskopsystems platziert. Das System wird
initialisiert, und Trägerhalter
werden an den motorisierten Objekttisch unter dem Objektivrevolvers
geführt.
Die Verarbeitung mit niedriger Vergrößerung und höherer Vergrößerung wird
durchgeführt,
um interessierende Kandidaten-Objekte zu kennzeichnen und zu bestätigen. Abbildungen
eines um den Flächenschwerpunkt
zentrierten regelmäßig geformten
Bereichs einer vorbestimmten Anzahl von bestätigten Kandidaten-Objekten
werden dann mittels des Verfahrens der Erfindung eingestuft. Die
Gesamtpunktzahl für
den zellularen Spezimen auf dem Träger wird dann mit einer Kennung
für den
Träger gespeichert,
und der nächste
Träger
auf dem Halter wird verarbeitet. Dieser Träger auf jedem Halter wird verarbeitet,
bis alle Träger
in den allen Haltern verarbeitet wurden. Am Ende des Verfahrens
werden eine Montage der bestätigten
interessierenden Kandidaten-Objekte für jeden Träger, eine Einstufung für jedes
Objekt, eine Position für
jedes Objekt und eine Gesamtpunktzahl für jeden Träger in dem Computersubsystem
gespeichert. Diese Information kann von einem Pathologen verwendet
werden, um zu bestimmen, ob ein zellularer Spezimen einen spezifischen medizinischen
Zustand angibt, oder um die Objekte auf dem Träger zu prüfen, die eingestuft wurden.
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Obwohl die Erfindung durch die Beschreibung
der bevorzugten und alternativen Ausführungsformen dargestellt wurde,
und obwohl die Ausführungsformen
in beträchtlichem
Detail beschrieben wurden, ist es nicht die Absicht des Anmelders,
den Schutzumfang der angefügten
Ansprüche
durch derartiges Detail zu beschränken oder irgendwie zu begrenzen.
Zusätzliche
Vorteile und Abwandlungensind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Die breiteren Aspekte der Erfindung sind daher nicht auf die gezeigten
und beschriebenen spezifischen Einzelheiten, die repräsentative
Vorrichtung und das Verfahren oder veranschaulichende Beispiele
begrenzt.