JP2510771B2 - 培養生体の活性診断方法及びシステム - Google Patents

培養生体の活性診断方法及びシステム

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は時間と共に状態が変化する対象物を異なつた
倍率で撮像し、得られた対象物の画像を画像処理し、そ
れによつて２種以上の情報を得て、これを対象物の状態
診断や制御因子の制御に利用する画像診断システム，画
像診断制御システム，画像診断方法，画像診断制御方法
等に関する。本発明の典型的な応用例として、動・植物
細胞，微生物等の生体培養システムがあり、特に、上記
生体の活性を、生理的条件下で診断する活性診断方法，
活性診断装置及び該活性診断装置を組み込み、かつ、こ
の診断結果を基に、培養環境条件を制御する手段を具備
した生体培養システムがある。
〔従来の技術〕
以下の説明では、主として生体培養診断，制御システ
ムを例にとつて説明するが、本発明がこれに限られるも
のではないことは明らかである。
生体培養システムは、医薬・診断薬分野，食品分野
では、動・植物細胞，微生物，酵母を培養した、有用物
質の生産システムとして、医療分野では、免疫療法等
細胞の活性化システムとして、排水処理分野では、微
生物による有害物質除去システムとして、水産分野で
は、魚介類等の養殖システムとして、広く利用され、ま
た、実用化のための研究が進められており、，では
生産性の向上、では活性化効率の向上、では運転の
安定性向上等、いずれも、高効率化の要望が強い。
では、細胞の産生する有用物質の量は、数ng〜数μ
g/106cells・日と極めて微量であり、工業的にこれらの
物質を得るためには、培養液中の細胞濃度の向上と、培
養槽の大容量化及び細胞の活性化（細胞１個当りの産生
能力の向上）が必要である。細胞濃度を向上させると
は、すなわち栽培の増殖を促進し、死滅を抑えることで
あるが、このためには細胞の濃度と細胞総数のうちの生
細胞数の比率（生存率）、さらには、生細胞数のうちの
分裂可能な細胞数の比率（分裂細胞比率）や細胞の活性
化には分泌活性の高い細胞数の比率（分泌細胞比率）等
の情報をきめ細かに得、培養条件の制御に速やかに反映
させる必要がある。従来、この作業は、特開平２−2797
7号公報に記載されているように、死細胞を染色剤で染
色して生細胞との区別を明らかにしたのちに顕微鏡で拡
大した像を観察して行つていた。
現在、細胞の数を指標とする活性診断は、人が目で見
て行うのが主流であるが、画像処理を用いて培養細胞を
計数する技術の公知例もいくつか存在する。特開昭62−
201332号公報、及び特開昭64−029765号公報には、線形
空間フイルターを用い、染色されない生細胞と染色され
た死細胞とを認識する方法が示されている。また、前述
の特開平２−27977号公報では、染色剤を培養液に注入
せず、生細胞と死細胞とをその大きさにより判別するこ
とを線形空間フイルターを用いて行う方法が示されてい
るが、いずれも、生存率の情報のみを得るものである。
上記、有用物質の生産システムでは、分泌細胞比率が特
に重要な情報であり、また、では生きの良い細胞の割
合の指標となる分裂細胞比率が重要な情報となるが、細
胞の生理的条件下でこれらの情報を得る方法は提案され
ていない。の活性汚泥処理システムでは、システムの
安定した運転のために、活性汚泥が沈降しなくなるバル
キング現象を防止する必要があり、これには、活性汚泥
群に出現する微生物相が重要な情報で、現在、凝集性微
生物と糸状性微生物の割合で、活性汚泥の沈降性を評価
しているが、より高精度な評価に基づく制御が望まれて
いる。
また、特開昭61−21786号公報には、汚水中の微生物
を観察するにあたり、異なつた倍率で撮像することが述
べられている。ここでは画像処理することは述べられて
いない。
特開昭61−32182号公報には、顕微鏡で細胞標本を異
なつた倍率で撮像し、それぞれの画像情報から細胞を識
別する方法が開示されている。ここでは血球など増殖能
力のない細胞を扱つており、観察期間中には本質的に変
化しない対象を扱つている。また、撮像された画像を画
像処理することも述べられている。
特開昭64−53157号公報には、顕微鏡で皮膚細胞サイ
プルをある倍率で観察し、その位置を記憶したあと高倍
率で顕微鏡観察し、画像処理して細胞の特性を測定する
方法が開示されている。
〔発明が解決しようとする課題〕
生体細胞の場合を例に述べると、死細胞を染色剤で染
色して生細胞との区別を明らかにしたのちに顕微鏡で拡
大した像を観察することによる培養動物細胞の活性診断
方法には、以下の欠点がある。
（１）一般に、生体培養は純粋培養であるため培養系は
系外とは遮断され、対象とする生体以外の生体の混入を
防止する必要がある。培養液の試料を採取し染色剤を注
入する際に、一時的に培養システムの無菌的な閉鎖系を
開き、系外と接触させざるを得ない。そのため、雑菌侵
入のおそれがあり、以後の培養の継続に支障をきたしか
ねない。
（２）染色剤を注入した培養液は培養槽に戻せないた
め、試料採取の都度培養液が失われていくことになる。
このため、細胞の活性診断の頻度を増やすことには限界
がある。
（３）透明なカルチヤーフラスコ中での増養の場合、液
をフラスコにいれたまま顕微鏡に載せて細胞の像を観察
できるにもかかわらず、染色剤注入のためにサンプリン
グの手順を経ざるを得なくなつている。
（４）死ぬ過程にあり、染色されつつある細胞は、人が
判別する場合も、画像処理で認識する場合も、生細胞と
するか死細胞とするかの判断は難しい。
さらに、システムの高効率化のための （５）分裂細胞比率の情報が得られない。
（６）分泌細胞比率の情報が得られない。
（７）従つて、システムの高効率化が困難である。
これらの課題は、生体が微生物（組換え微生物を含
む）、酵母（組換え酵母を含む）等であつても同様であ
り、また、活性診断を目視で行なうか、画像処理による
かには依存しない。特開平２−27977号公報で示され
た、画像処理により培養細胞の大きさの分布から生死判
別する方法では、上記（１）〜（４）欠点を解決できる
が、（５）〜（７）の欠点は解決できない。
そこで、発明者らは培養過程における生体の数及び形
態の変化を詳細に検討し、各種活性（生存率，分裂細胞
比率，分泌細胞比率）と形態との関連を明らかにし本発
明に至つた。
そのほか、活性汚泥の状態を監視する方法などにおい
ても豊富な画像情報を利用すればより信頼性の高い監
視，制御ができるわけである。
本発明の目的は、時間の経過と共に状態が変化する対
象物の監視，状態監視の精度をより高めることである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、微小球体を放出する性質を有する生体の培
養システムにおいて、該生体が懸濁した培養液の画像を
任意の時間間隔で夫々複数回異なる倍率で拡大して撮像
する撮像装置、該撮像装置で取り込んだある倍率の画像
により生体を確認し、他の異なる倍率で取り込んだ画像
により該生体から放出された微小球体或いは／及び微小
球体を放出過程にある生体を認識する画像認識装置、該
画像認識装置で認識した画像を解析して生体の濃度、該
生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球
体を放出過程にある生体の濃度を各時間毎に求める画像
処理装置、該画像処理装置で得られた生体の濃度と該生
体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球体
を放出過程にある生体の濃度との割合を指標として、培
養液中の生体の活性状態の変化を診断する生体活性診断
装置、及び該生体活性診断装置の診断結果に基づいて培
養液の状態に影響を与える因子を制御する培養条件制御
装置を具備した生体培養システムを提供するものであ
る。
本発明において、該生体が懸濁した培養液の画像を撮
像する撮像装置、該撮像装置で取り込んだ画像を処理し
て生体、該生体から放出された微小球体或いは／及び微
小球体を放出過程にある生体を認識する画像認識装置、
該画像認識装置で認識した画像を解析して生体の濃度、
該生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小
球体を放出過程にある生体の濃度を求める統計処理装
置、該統計処理装置で得られた生体の濃度と、該生体か
ら放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球体を放
出過程にある生体の濃度との割合を指標として培養液中
の生体の活性状態を診断する生体活性診断装置、及び該
生体活性診断装置の診断結果に基づいて培養液の状態に
影響を与える因子を制御する培養条件制御装置を具備し
た生体培養システムが提供される。
本発明は更に、生体と生体以外の微小粒子とを含む培
養液中の生体培養システムにおいて、該生体が懸濁した
培養液中の生体を観察するために該培養液の画像をｍ倍
に拡大する画像拡大手段と生体以外の微小粒子を観察す
るために該培養液の画像をｎ倍に拡大する拡大手段を備
えた培養液撮像装置、該撮像装置で取り込んだｍ倍画像
を処理して生体を認識し、ｎ倍画像を処理して生体以外
の微小粒子を認識する画像認識装置、該画像認識装置で
認識された生体及び生体以外の微小粒子を統計処理して
夫々の濃度を求める統計処理装置、該統計処理で得られ
た生体の濃度と生体以外の微小粒子の濃度の割合を指標
として生体の活性状態を診断する生体活性診断装置、及
び該生体活性診断装置の診断結果に基づいて培養液の状
態に影響を与える因子を制御する培養条件制御手段を具
備した生体培養システムを提供する。
本発明によれば、微小球体を放出する性質を有する生
体の活性診断システムにおいて、該生体が懸濁した培養
液の画像を撮影する撮像装置、該生体が懸濁した培養液
の画像を処理して生体、該生体から放出された微小球体
或いは／及び微小球体を放出過程にある生体を認識する
画像認識装置、該画像認識装置で認識した画像を解析し
て生体の濃度、該生体から放出された微小球体の濃度或
いは／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度を求め
る統計処理装置、該統計処理装置で得られた生体の濃度
と、該生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び
微小球体を放出過程にある生体の濃度との割合を指標と
して培養液中の生体の活性状態を診断する生体活性診断
装置を具備した生体活性診断システムが提供される。
この活性予測システムにおいて、該生体が懸濁した培
養液の画像を任意の時間間隔で夫々複数回異なる倍率で
拡大して撮影する撮像装置、該撮像装置で取り込んだあ
る倍率の画像による生体を認識し、上記他の異なる倍率
で取り込んだ画像により該生体から放出された微小球体
或いは／及び微小球体を放出過程にある生体を認識する
画像認識装置、該画像認識装置で認識した画像を解析し
て生体の濃度、該生体から放出された微小球体の濃度或
いは／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度を各時
間毎に夫々求める画像処理装置、該画像処理装置で得ら
れた生体の濃度と該生体から放出された微小球体の濃度
との割合を指標とし、該指標の時間経過に伴う変化から
培養液中の生体の活性状態の今後の推移を予測する生体
活性診断装置を具備した生体活性診断予測システムでも
よい。
更に、微小球体を放出する性質を有する生体が懸濁し
た培養液中の生体の活性状態を診断する方法において、
該生体が懸濁した培養液の画像を撮像する撮像段階、該
撮像段階で取り込んだ画像を画素ごとの輝度差に基づい
て処理し、生体、該生体から放出された微小球体或いは
／及び微小球体を放出過程にある生体を夫々認識する画
像認識段階、該画像認識段階で認識した結果に基づいて
生体の濃度、該生体から放出された微小球体の濃度或い
は／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度を夫々求
める濃度計測段階、該濃度計測段階で得られた生体の濃
度と、該生体から放出された微小球体の濃度或いは／及
び微小球体を放出過程にある生体の濃度との割合を指標
として培養液中の生体の活性状態を診断する活性診断段
階を含む生体活性診断方法に係わる。
本発明を動植物細胞，酵母，微生物等生体を例にとつ
て説明する。これらの生体は分裂あるいは出芽により増
殖する。培養過程は、一般に、指数関数適に増加する対
数増殖期，増殖期，見かけ上濃度が一定となる定常期及
び濃度が減少する死滅期と移行する。培養システムで
は、短時間に濃度を増加させ、高密度状態とし、その後
の定常期を長期間継続することが必要である。
上記、培養過程と生体の形態を対応させると、動植物
細胞では、対数増殖期及び増殖期において、ほとんど完
全な球体であるが、定常期に入ると球体がゆがみ、定常
期も中半を過ぎると表面にポリープ状の突起を形成した
もの、突起が細胞から脱離した小球体が観察できる。こ
れらの形態と活性との関係を第１表に示した。
一般に、動物細胞の大きさは＋数μｍ〜数＋μｍであ
り、上記小球体の大きさは数μｍ程度である。
第２図は細胞総数に対する小球体数の比率（小球体比
率）と生存率の関係を示す実験データを示すが、両者は
直線関係にあり、小球体比率を求めることにより、生存
率を得ることができる。また、形態の違いを認識し、そ
れぞれを計数することにより、分泌細胞比率を得ること
ができる。形態の違いの認識は下記で行ない得る。
第３図（ａ）に示すように、形状が完全な円の場合、
外周の長さは、 半径×２×π で表される。ところが、第３図（ｂ）のように凹凸があ
ると、面積が等しい物体でも外周の長さは次第に長くな
つてくる。円の面積から求めた半径の長さ から計算した外周の長さＬを、実際の外周の長さＬ′で
割つた値（形状係数） によつて、物体の形状がどこまで完全な円に近いかの指
標とすることができる（凹凸がおおいほど０、円に近い
ほど１に近づく）。
細胞を認識した２値画像では、活きの良い細胞のもの
ほどすなわち、分裂活性の高いものほど完全な円に近く
なる。従つて、上記、形状係数を用いて、上記形態の違
いを認識し、活性診断ができる。
上記、活性診断するためには、基本的に、 （ａ）細胞総数の計測 （ｂ）小球体数の計測 （ｃ）形状係数の算出 が必要である。ところが、微小な小球体は、細胞を認識
しやすい倍率で撮像した画像を処理したのでは認識でき
ないおそれが多い。細部懸濁液の画像は背景に汚れが入
つている場合が多く雑音処理は欠かせないが、微小球体
がこれにひつかかつてノイズとして除去されてしまうお
それが多い。
一方、微小球体を認識しやすい倍率では、細胞が画像
をまたいで認識される頻度が多くなり、細胞の個数を計
測するうえでの誤差が大きくなる。
また、形状係数で細胞の活性を診断しようとする場
合、外周の凹凸をも正確に認識する必要があり、解像度
（１画面あたりの画素数）を変更し得ない画像処理装置
を用いるときには、光学顕微鏡での倍率を高めにしなけ
ればならない。
すなわち、上記（ａ）と（ｂ）あるいは（ｃ）は倍率
を変えて行なうことで必要で、これが本発明のポイント
でもある。
生体が酵母の場合には、出芽によつて増殖するため、
形態と活性との関係は第２表のようになる。
突起を有する細胞が多い場合には増殖活性が高く、球
体あるいは楕円体の細胞が多いときには分泌活性が高
く、上記動植物細胞の場合とは反対になる。しかし、形
状係数により、形状の違いを認識し、分裂細胞比率，分
泌細胞比率を得ることができる。同様に、上記（ａ）と
（ｃ）を倍率を変えて行なうことが本発明のポイントで
ある。
活性汚泥では、一般に凝集性細菌が多いときは沈降性
がよいが、系状性微生物が多いと沈降性が悪い。しか
し、系状性微生物の種類，凝集性細菌と系状性微生物が
形成するフロツクの形態によつても、沈降性が変化する
ため、上記形態情報を的確に得る必要がある。このため
には、凝集性細菌と系状性微生物の割合は低倍率で、系
状性微生物の種類及びフロツク形態は高倍率で観察する
必要がある。
生体の総数を、低倍率で得られた画像を処理して求
め、特定生体（小球体，分裂活性の高い細胞，分泌活性
の高い細胞等）の数や種類（系状性微生物）を、高倍率
で得られた画像を処理して求め、これを基に、生存率，
分裂細胞比率，分泌細胞比率の情報を得、培養環境の適
否を診断する。診断結果に基づき、所定の培養環境に制
御することでシステムの高効率化をはかる。
培養環境の制御因子には温度,pH,浸透圧，溶存酵素濃
度，液の滞留時間，生体濃度等がある。この内、温度,p
H,浸透圧，溶存酵素濃度は高い生存率を維持するため、
それぞれ、適正な範囲に制御される。分裂細胞比率及び
分泌細胞比率を制御するには、（生体濃度）×（液の滞
留時間）の値を操作する。（生体濃度）×（液の滞留時
間）の値を大きくすれば、分泌細胞比率を増大でき、
（生体濃度）×（液の滞留時間）の値を小さくすれば、
分裂細胞比率を増大できる。有用物質の生産システムで
は、培養初期において（生体濃度）×（液の滞留時間）
の値を小さく設定し、短時間で高密度化し、しかる後、
（生体濃度）×（液の滞留時間）の値を大きく設定し、
生体の分泌活性を高め、生産性を向上する。免疫療法等
の細胞活性化システムでは、（生体濃度）×（液の滞留
時間）の値をできるだけ小さく設定し、活きの良い生体
の濃度をできるだけ高くする。活性汚泥処理では、（生
体濃度）×（液の滞留時間）の値を大きく設定し、分裂
細胞比率を減少させ、生体濃度の余分な増加を押え、余
剰汚泥を減らす。同時に、系状微生物の増殖を押え、糸
状微生物の割合を減少させ、沈降性を向上できる。
〔実施例〕 本発明の実施例を図面を用いて説明する。
第４図は、本発明の一実施例による画像認識制御シス
テムの構成の例を示す。反応・増殖等が制御されるべき
生体が懸濁した液の容器10から、液の一部を採取し、撮
像装置20に導く。この撮像装置20において、液の像を光
学的に２種の異なる倍率で光学的に拡大し、それぞれを
テレビカメラ等の撮像手段により、電気的な画像信号と
して撮影する。これらの画像信号を画像処理装置30に入
力し、第１の倍率で得られた画像を処理して液中の生体
の濃度を、また第２の倍率で得られた画像を処理して特
性生体の濃度を、それぞれ求める。画像処理装置30で計
測されたそれらの生体の濃度データを制御装置40に入力
し、容器10内の液の状態を制御する。
第１図は、撮像装置20を実現するために構成例を示
す。透明容器21は、ガラス，プラスチツク等の透明な材
質でできており、中に観察対象とする液を液容器10から
導く。この場合、観察対象である微生物等の生理的状態
を保つたまま扱えるように、例えば特開平２−27977号
公報に記載された技術を採用するのが良い。光学顕微鏡
22は、透明容器21中の液の像を拡大する。テレビカメラ
24は、拡大された像を電気的な画像信号（アナログ）に
変換する。A/D変換器25で、テレビカメラからのアナロ
グ画像信号を、画像処理装置30で処理することのできる
デイジタル信号の形式に変換して、画像処理装置30に入
力する。対物レンズ自動切り替え機構23は、画像処理装
置からの駆動信号を受けて、光学顕微鏡22の対物レンズ
を切り替え、液の像の拡大倍率を変更する。
第５図は、本発明の他の実施例を示す。タイマー33か
ら駆動信号が発せられると細胞が懸濁した培養液が採取
され、撮像装置20に導かれる。この場合、撮像装置20は
液の供給のために、ポンプ等の機構を内蔵している必要
がある。撮像装置20では、複数回異なる倍率で液の像を
拡大し撮像する。タイマーからの駆動信号は、同時に画
像認識装置31にも送信され、撮像された液の画像を遅滞
なく処理し、物体を認識する。この画像認識装置31で
は、撮像装置20で取り込まれた複数の画像のうち、ある
倍率のものを処理して細胞、他の異なる倍率のものを処
理して、細胞から放出された微小球体と、微小球体を放
出する過程にある細胞とのうちのどちらか、またはそれ
らの両方が「１」の値となつた２値画像を生成する（認
識する）。
画像処理装置32では、画像認識装置31から送られた２
値画像を解析して、生体（細胞，微小球体，微小球体を
放出過程の細胞のいずれか）の画面内に存在する個数を
計測し、液中の濃度を計算する。細胞活性診断装置50で
は、画像処理装置32で得られた生体の濃度を用い、細胞
の濃度と、微小球体の濃度との２変量、細胞の濃度と微
小球体を放出中の細胞の濃度との２変量、あるいは細胞
の濃度、微小球体の濃度、微小球体を放出過程の細胞の
濃度の３変量で比率を計算して、培養液中の細胞の活性
を診断する。培養条件制御装置41では、細胞活性診断装
置50の診断結果に基づいて、細胞培養槽11内の液の状態
に影響を与える因子を制御する。
タイマーからの駆動信号は、以上の例では撮像装置20
と画像認識装置31とだけに送信されるようになつている
が、これは、画像処理装置32以降の装置は画像信号を待
機する状態にしておくことで、処理の同期がうまく取れ
るためである。もちろん、すべての装置をタイマーで駆
動する仕組みにしておくことも可能である。
第６図は、更に他の実施例を示す。この例では、撮像
装置30で撮影される培養液の画像は単一であり、画像認
識装置31でも細胞と微小球体とを一緒に認識する。そし
て、統計処理装置34で、生体の認識面積によつて細胞が
微小球体かを判別，計数して、液中の濃度を計算する。
細胞活性診断装置50及び培養条件制御装置41の機能は、
第５図に示した実施例の場合と同様である。
以上の実施例として、液を採取したのち撮像する例を
示したが、その他に撮像装置を培養槽に直かに設置し、
槽内にある状態で液の像を撮像するシステムでもよい。
第７図は、更に他の実施例を示す。細胞培養槽11から
採取した培養液を２つの撮像装置26、27とに導く。この
うち、26は拡大倍率がｍ倍に設定されており、細胞が観
察するための画像を撮像する。また、撮像装置27は拡大
倍率がｎ倍に設定されており、細胞以外の粒子を観察す
るための画像を撮像する。２つの撮像装置で撮像された
画像を、時間をずらして１台の画像認識装置31に入力
し、撮像装置26の画像から細胞を、また撮像装置27の画
像から粒子をそれぞれ認識する。統計処理装置34では、
画像認識装置31で認識された細胞及び細胞以外の粒子を
統計処理して、それぞれの濃度を求める。この図におけ
る、細胞活性診断装置50及び培養条件制御装置41もま
た、機能は第５図のそれらと同様である。
第８図は、２つの撮像装置を実現するための装置構成
の例を示す。細胞培養槽11から採取した培養液を撮像装
置に供給するためのチユーブを分岐して、左右２つの透
明容器21に導く。対物レンズの設定をｍ倍とｎ倍にした
２台の光学顕微鏡22でそれぞれ像を拡大し、テレビカメ
ラ24で撮影する。A/D変換器25を２基用いてそれぞれの
画像信号をデジタルに変換し、画像認識装置31に入力す
る。すなわち、ハードウエア的には、全き同一の装置一
式を２組用意すればよいことになる。
培養液中に放出される微小粒子の量と、細胞の生存率
との間には、第２図に示すような線形の関係があり、こ
れを利用して活性状態を判定するシステムを構築でき
る。、判定のためのパラメータを何らかの方法で決定す
る必要があるが、過去のデータを元にして判定手段を作
成しておくことができる。また、この過去のデータから
作成された判定手段と現在の培養液の撮像画像から求め
た指標とを比較して活性状態を判定する手段も合わせ持
つことができる。
他の発明の実施態様においては、経時的に細胞と微小
球体との濃度を計測するシステムにおいて、それらの濃
度の変化速度を将来の時間に補外計算することで、細胞
の活性状態の今度の推移を予測する機能を持つた細胞活
性診断装置を備えたシステムが構成される。この計算
は、微分方程式によつて達成可能である。
第９図は、細胞活性診断方法に準拠する処理の実施例
の骨子を示す。工程110では細胞と微小球体が混在して
懸濁する培養液の像を拡大し、撮像する。工程120で
は、工程110撮像された画像内にある細胞及び、微小球
体と微小球体を放出過程にある細胞のどちらか一方また
は両方を、画像内での当該生体周辺の輝度パターンを利
用して認識する。工程130では、工程120で認識された細
胞，微小球体の濃度を、生体の種類毎に計測する。工程
140では、細胞の濃度及び、微小球体または微小球体を
放出過程にある細胞のどちらか一方、またはそれらの両
方の濃度から計算される割合を指標として、培養液中の
細胞の活性状態を診断する。
第10図（ａ），（ｂ）は、ある種の細胞の周辺が画像
内でどのような輝度パターンを示すかを図示する。輪郭
の部分が低い輝度，細胞の部分は高い輝度になつてい
る。また輪郭と細胞との間には大きな輝度差が存在す
る。このような特徴は、微小球体にも共通なもので、そ
のため細胞と微小球体は同様な手順で認識することがで
きる。
第11図は、上記の輝度パターンを利用して、細胞や微
小球体を認識し、第９図の工程120を実現する方法の一
例を示す。
この認識法は、生体の一部分を認識する段階及び、認
識部分を拡張して細胞の全体像を把握する段階に分けら
れる。
細胞の一部分を認識する工程では、原画像に極小値フ
イルターをかけ、その結果から原画像を減算する（工程
210〜220）。これらの処理は、互いに隣接し、かつ輝度
差の大きい２画素に対して、高輝度側の画素にその輝度
値を、低輝度側の画素に０を、それぞれ新たな輝度の値
として与える効果を持つ。動物細胞の培養液が撮像され
た画像にこれらの処理を適用する場合、細胞や小面積粒
子の輪郭に当る画素は低輝度になつているので、その直
ぐ内側が高輝度になつた濃淡画像が得られる。この画像
を固定２値化し、輝度の高い個所を選択することによ
り、細胞の内側に相当する画素群のうち、輪郭の接する
何画素かを認識した２値画像が得られる（工程230）。
細胞の輪郭との外周の背景に当る画素との間には、細
胞と輪郭との輝度差に準じた大きな輝度差が存在するこ
とがあり、工程210〜230の処理ではこれらを誤つて生体
と認識してしまう恐れが大きい。このような個所の輝度
は一般的な細胞内部の輝度の水準よりは低いことが多
く、原画像を直接２値化した２値画像との論理積によつ
てかなりの割合で除去可能である（工程240〜250）。
以上の生体の一部分を認識する工程が終了した時点で
は各生体の認識面積は小さく、生体の認識個数も１個の
生体を何個にも分割して認識するため、大変不正確であ
る。そこで、認識部分の拡張を行う。この工程は、各々
の細胞の内部がほぼ一定の輝度水準になつていることを
利用するものである。
まず、前工程までで認識された生体の部分を原画像に
マスキングする（工程260）。マスキングとは、２値画
像で１となつている画像と座標が同一な濃淡画像画素の
輝度値を残し、それ以外の全ての画素の輝度値を０とし
た濃淡画像を得る処理である。この処理によつて拡張の
起点となる個所を前工程で認識された部分に限定する。
次に、この濃淡画像に極大値フイルターをかける（工
程270）。この処理によつて、前工程までで認識された
部分及びその部分に隣接する画素の輝度が正、それ以外
の背景画素の輝度値が０となつた濃淡画像が得られる。
この濃淡画像から原画像を減算すると、背景は負，輪郭
は高輝度、物体内部は０前後の輝度になつた濃淡画像が
得られる（工程280）。２つのしきい値、例えばマイナ
ス５とプラス15というような値の間の輝度を持つた部分
を１とする条件でこの濃淡画像を２値化すると、生体内
部に当る個所だけが抽出される（工程290）。このとき
の認識部分には、拡張前の生体部分に隣接し、その部分
との輝度差の小さい画素も含まれている。すなわち、１
画素分の拡張ができたことになる。
ここでも、原画像との論理積演算を行う（工程30
0）。ここでの論理積演算の目的は、生体を認識した部
分から輪郭を越え、背景に向かつて拡張が起こることの
防止である。
以上の認識部分拡張工程を、拡張がそれ以上進まなく
なるまで反復する。反復回数は５〜10回が目安である
が、多すぎても生体の認識への悪影響はない。
第12図は、第９図の工程120で一緒に認識された細胞
と微小球体とを、それら生体の認識面積に基づいて判別
する処理の例を示す。この処理は、第９図においては工
程130の一部となる。
この判別方法は、認識生体１個ごとの面積を計測し、
その値が一定値以上であるか否かによつて進められる。
まず、生体が認識された２値画像中の生体の各々に番号
をつける（ラベリング、工程310）。ラベリングが終了
すると、最後の番号がすなわちその画面内の生体数であ
る。生体数を代入するために用意した変数にこの値を入
れておく（工程320）。次に、番号順に１個ずつ、細胞
が小面積球体かを判別する。すなわち、その番号の生体
の面積を計測し（工程340）、その値が一定値以上なら
ば細胞、一定値に満たないならば小面積球体と判別する
（工程350）という作業を生体数と同じ回数反復する
（工程330）。
第13図は、一緒に認識した正常な細胞と微小球体放出
過程の細胞との判別を形状係数とよばれる係数によつて
行う処理法を示す。形状係数は、生体の形状がどの程
度、真円に近いかを示す係数であり、生体が円であると
仮定したときの生体の面積を周囲長から求め、実際の面
積と比較する。数式で表すと、 となる。また、生体が真円と仮定したときの周囲長を生
体の面積から求め、実際の周囲長と比較する もまた、用いることができる。どちらの値とも、凹凸が
多いほど０、円に近いほど１に近づく。
細胞の観察に用いる場合には、微小球体が細胞から分
かれて外に出ようとしているときに、形状係数が小さく
なる。
第14図に従つて処理は、以下のような工程からなる。
まず、生体が認識された２値画像中の生体の各々に番号
をつける（ラベリング、工程310）。ラベリングが終了
すると、最後の番号がすなわちその画面内の生体数であ
る。生体数を代入するために用意した変数にこの値を入
れておく（工程320）。次に、番号順に１個ずつ、正常
な細胞か微小球体放出過程の細胞かを判別する。すなわ
ち、その番号の生体の面積（工程340）及び周囲長（工
程360）を計測し、上記の形状係数計算式のいずれか一
方によつて、形状係数を計算する（工程370）。そし
て、形状係数が一定値よりも大きくて１に近ければ正常
細胞、小さくて０に近ければ微小生体を放出過程の細胞
と判別する（工程380）。これらの判別ルーチンを生体
の番号順に１番から最後の番号のものまで反復する（工
程330）。
第14図は、細胞が懸濁した培養液の像を、初めから複
数の異なる倍率で拡大して撮像する場合の処理の流れの
例を示す。
工程111では、低めの拡大倍率で細胞が懸濁する培養
液の像を拡大し、撮像する。その画像内に存在する細胞
を工程121で認識する。また、工程112では、工程111と
同時に採取した培養液の像を当該工程よりも高めの拡大
倍率で拡大し、撮像する。工程112から得られた画像か
らは、微小球体と微小球体を放出過程にある細胞のうち
のどちらか一方、或いはそれらの両方を認識する。工程
130で細胞や微小球体の濃度を、生体の種類ごとに計測
し、工程140でそれらの濃度から培養液の活性を診断す
る。
本発明によれば、細胞活性診断装置内に、過去に培養
液を採取したときの細胞の活性のデータを蓄積しておく
手段を設け、その手段から読み出されたデータと今回の
活性とを微分方程式等の計算式に入れ、今後細胞の活性
状態がどのように変化していくか予測する段階を含む細
胞活性予測診断方法が提供できる。第15図において、工
程110乃至140は第９図と同一である。そのあとに、過去
の活性データを格納する手段160とのデータ変換をしな
がら今後の活性状態の変化を予測する工程150が、何加
されている。
以上の実施例では、細胞の活性を診断するところまで
で処理を打ち切ることになつていたが、得られた活性の
データを利用して、培養液の状態に影響を与える因子を
制御する段階を後に付加することもできる。第16図と第
17図においては、それぞれ第９図と第14図と同一の工程
のあとに、工程140で診断した結果得られた細胞の活性
のデータを利用して、培養液の状態に影響を与える因子
を制御する工程170が付加されている。また、第18図に
おいては、第15図と同一の工程の後に、工程140からの
活性診断結果と、工程150の予測結果との両方を利用し
て培養液の状態に影響を与える因子を制御する工程170
が付加されている。
以上の実施例では、細胞の種類は特に限定していなか
つたが、本発明の好適な応用例は培養動物細胞培養であ
る。動物細胞の中には、死細胞に至る前に細胞とは認め
られない微小球体を放出する性質を持つものがあり、こ
れまでに述べた細胞の活性診断方法、培養方法を適用で
きる。
〔発明の効果〕
本発明によれば、時々刻々状態が変化する対象物を正
確に画像認識でき、かつ対象物の制御因子を制御するこ
とができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明において用いられる撮像装置の詳細な構
成例を示す概略図、第２図は生存率と細胞に対する小球
体数の比率との間に存在する関係を示すグラフ、第３図
（ａ），（ｂ）は細胞の形態例を示す概略図、第４図は
本発明の実施例による画像認識装置システムの構成例を
示す線図、第５図は他の実施例の細胞培養システムの構
成例を示す線図、第６図は他の実施例の細胞培養システ
ムの構成例を示す線図、第７図は他の実施例の細胞培養
システムの構成例を示す線図、第８図は第７図中にある
２つの撮像装置を実現するための装置構成の例を示す概
略図、第９図は他の実施例の細胞活性診断方法による処
理法の例を示すフロー図、第10図（ａ）は原画像におけ
る細胞近辺の輝度の状況を示す図、第10図（ｂ）は輝度
の状況に対応する画素位置と輝度の関係を示すグラフ、
第11図は輝度差利用認識法による生体認識の手順を示す
フロー図、第12図は第９図内の工程120で一緒に認識さ
れた細胞と微小球体とを生体の面積に基づいて判別する
処理の例を示すフロー図、第13図は第９図内の工程120
で一緒に認識された細胞と微小球体放出過程にある細胞
との判定を形状係数に基づいて行なう処理の例を示すフ
ロー図、第14図は細胞が懸濁した培養液の像を初めから
複数の異なる倍率で拡大して撮像する場合の処理の例、
第15図は第９図の後に、過去の活性データを格納する手
段とのデータ交換をしながら今後の活性状態の変化を予
測する工程が付加された場合の処理の例を示すフロー
図、第16図〜第18図は、それぞれ第９図，第４図，第15
図の後に、得られた活性のデータを基に、培養液の状態
に影響を与える因子を制御する工程が付加された場合の
処理の流れの例を示すフロー図である。 10…反応・増殖等が制御されるべき生体が懸濁した液の
容器、11…細胞培養槽、20…撮像装置、21…透明容器、
22…光学顕微鏡、23…対物レンズ自動切替機構、24…テ
レビカメラ、25…A/D変換器、26…細胞液の像をｍ倍に
拡大する手段を備えた撮像装置、27…撮像液の像をｎ倍
に拡大する手段を備えた撮像装置、30…画像処理装置、
31…画像認識装置、32…画像処理装置、33…タイマー、
34…統計処理装置、40…制御装置、41…培養条件制御装
置、50…細胞活性診断装置、110,111,112,120,121,122,
130,140,150,160,170,210,220,230,240,250,260,270,28
0,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380…活性診
断，培養液制御の単位工程。
フロントページの続き (72)発明者 松崎 晴美 茨城県日立市久慈町4026番地 株式会社 日立製作所日立研究所内 (72)発明者 中野 隆盛 山口県下松市東豊井794番地 株式会社 日立製作所笠戸工場内

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】微小球体を放出する性質を有する生体の培
    養システムにおいて、該生体が懸濁した培養液の画像を
    任意の時間間隔で夫々複数回異なる倍率で拡大して撮像
    する撮像装置、該撮像装置で取り込んだある倍率の画像
    により生体を認識し、他の異なる倍率で取り込んだ画像
    により該生体から放出された微小球体或いは／及び微小
    球体を放出過程にある生体を認識する画像認識装置、該
    画像認識装置で認識した画像を解析して生体の濃度、該
    生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球
    体を放出過程にある生体の濃度を各時間毎に求める画像
    処理装置、該画像処理装置で得られた生体の濃度と該生
    体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球体
    を放出過程にある生体の濃度との割合を指標として、培
    養液中の生体の活性状態の変化を診断する生体活性診断
    装置、及び該生体活性診断装置の診断結果に基づいて培
    養液の状態に影響を与える因子を制御する培養条件制御
    装置を具備したことを特徴とする生体培養システム。
  2. 【請求項２】微小球体を放出する性質を有する生体の培
    養システムにおいて、該生体が懸濁した培養液の画像を
    撮像する撮像装置、該撮像装置で取り込んだ画像を処理
    して生体、該生体から放出された微小球或いは／及び微
    小球体を放出過程にある生体を認識する画像認識装置、
    該画像認識装置で認識した画像を解析して生体の濃度、
    該生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小
    球体を放出過程にある生体の濃度を求める統計処理装
    置、該統計処理装置で得られた生体の濃度と、該生体か
    ら放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球体を放
    出過程にある生体の濃度との割合を指標として培養液中
    の生体の活性状態を診断する生体活性診断装置、及び該
    生体活性診断装置の診断結果に基づいて培養液の状態に
    影響を与える因子を制御する培養条件制御手段を具備し
    たことを特徴とする生体培養システム。
  3. 【請求項３】生体と生体以外の微小粒子とを含む培養液
    中の生体培養システムにおいて、該生体が懸濁した培養
    液中の生体を観察するために該培養液の画像をｍ倍に拡
    大する画像拡大手段と生体以外の微小粒子を観察するた
    めに該培養液の画像をｎ倍に拡大する拡大手段を備えた
    培養液撮像装置、該撮像装置で取り込んだｍ倍画像を処
    理して生体を認識し、ｎ倍画像を処理して生体以外の微
    小粒子を認識する画像認識装置、該画像認識装置で認識
    された生体及び生体以外の微小粒子を統計処理して夫々
    の濃度を求める統計処理装置、該統計処理で得られた生
    体の濃度と生体以外の微小粒子の濃度の割合を指標とし
    て生体の活性状態を診断する生体活性診断装置、及び該
    生体活性診断装置の診断結果に基づいて培養液の状態に
    影響を与える因子を制御する培養条件制御手段を具備し
    たことを特徴とする生体培養システム。
  4. 【請求項４】請求項１ないし２において、該生体活性診
    断装置内に過去のデータを元にして予め生体の濃度と、
    該生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小
    球体を放出過程にある生体の濃度との割合を指標として
    培養液中の生体の活性状態を求める活性状態判定手段を
    備えたことを特徴とする生体培養システム。
  5. 【請求項５】請求項４において、該生体活性診断装置内
    に培養液の現在の撮像画像から求めた指標を過去のデー
    タを元にして予め作成された前記活性状態判定手段と比
    較して活性状態を判定する比較手段を備えたことを特徴
    とする生体培養システム。
  6. 【請求項６】請求項２において、該画像処理装置で得ら
    れた生体の濃度と該生体から放出された微小球体の濃度
    或いは／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度との
    割合を指標とし、該指標の時間経過に伴う変化率から培
    養液中の生体の活性状態の今後の推移を予測する生体活
    性診断装置を備えたことを特徴とする生体培養システ
    ム。
  7. 【請求項７】微小球体を放出する性質を有する生体の活
    性診断システムにおいて、該生体が懸濁した培養液の画
    像を撮影する撮像装置、該生体が懸濁した培養液の画像
    を処理して生体、該生体から放出された微小球体或いは
    ／及び微小球体を放出過程にある生体を認識する画像認
    識装置、該画像認識装置で認識した画像を解析して生体
    の濃度、該生体から放出された微小球体の濃度或いは／
    及び微小球体を放出過程にある生体の濃度を求める統計
    処理装置、該統計処理装置で得られた生体の濃度と、該
    生体から放出された微小球体の濃度或いは／及び微小球
    体を放出過程にある生体の濃度との割合を指標として培
    養液中の生体の活性状態を診断する生体活性診断装置を
    具備したことを特徴とする生体活性診断システム。
  8. 【請求項８】請求項７において、該統計処理装置で得ら
    れた生体の濃度と、該生体から放出された微小球体の濃
    度或いは／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度と
    の割合を指標とし、過去のデータを元に予め該指標と生
    体の活性状態との関係を求めた生体活性判定手段とを比
    較して培養液中の生体の活性状態を診断する生体活性診
    断装置を備えたことを特徴とする生体活性診断システ
    ム。
  9. 【請求項９】微小球体を放出する性質を有する生体の活
    性予測診断システムにおいて、該生体が懸濁した培養液
    の画像を任意の時間間隔で夫々複数回異なる倍率で拡大
    して撮影する撮像装置、該撮像装置で取り込んだある倍
    率の画像により生体を認識し、上記他の異なる倍率で取
    り込んだ画像により該生体から放出された微小球体或い
    は／及び微小球体を放出過程にある生体を認識する画像
    認識装置、該画像認識装置で認識した画像を解析して生
    体の濃度、該生体から放出された微小球体の濃度或いは
    ／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度を各時間毎
    に夫々求める画像処理装置、該画像処理装置で得られた
    生体の濃度と該生体から放出された微小球体の濃度との
    割合を指標とし、該指標の時間経過に伴う変化から培養
    液中の生体の活性状態の今後の推移を予測する生体活性
    診断装置を具備したことを特徴とする生体活性予測診断
    システム。
  10. 【請求項１０】微小球体を放出する性質を有する生体が
    懸濁した培養液中の生体の活性状態を診断する方法にお
    いて、該生体が懸濁した培養液の画像を撮像する撮像段
    階、該撮像段階で取り込んだ画像を該画像内の輝度差に
    基づいて処理し、生体、該生体から放出された微小球体
    或いは／及び微小球体を放出過程にある生体を夫々認識
    する画像認識段階、該画像認識段階で認識した結果に基
    づいて生体の濃度、該生体から放出された微小球体の濃
    度或いは／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度を
    夫々求める濃度計測段階、該濃度計測段階で得られた生
    体の濃度と、該生体から放出された微小球体の濃度或い
    は／及び微小球体を放出過程にある生体の濃度との割合
    を指標として培養液中の生体の活性状態を診断する活性
    診断段階を含むことを特徴とする生体活性診断方法。
  11. 【請求項１１】請求項10において、該生体が懸濁した培
    養液の画像を複数の異なる倍率で拡大して撮像する前記
    撮像段階と、該撮像段階で取り込んだある倍率の画像に
    より生体を認識し、他の異なる倍率の画像により該生体
    から放出された微小球体或いは／及び微小球体を放出過
    程にある生体を認識する前記画像認識段階とを含むこと
    を特徴とする生体活性診断方法。
  12. 【請求項１２】請求項10において、更に該生体が懸濁し
    た培養液の画像を任意の時間間隔で撮像する前記撮像段
    階と、該濃度計測段階で得られた前記指標の時間経過に
    伴う変化から培養液中の生体の活性状態の推移を予測す
    る前記活性診断段階とを含むことを特徴とする生体活性
    予測診断方法。
  13. 【請求項１３】請求項10〜12において、更に前記活性診
    断段階での診断結果に基づいて培養液の状態に影響を与
    える因子を制御する制御段階を含むことを特徴とする生
    体培養方法。
  14. 【請求項１４】培養液の画像を複数の異なる倍率で撮影
    し、小さい倍率で撮像した画像の画像処理による生体の
    濃度及び／又は生体数を認識し、大きい倍率で撮像した
    画像の画像処理により生体以外の微小粒子或いは／及び
    微小粒子を放出過程にある生体の数及び／又は濃度を認
    識し、生体数及び／又は濃度と微小粒子或いは／及び微
    小粒子を放出過程にある生体の数及び／又は濃度の相対
    関係を求め、培養生体の活性を診断するようにしたこと
    を特徴とする培養生体の活性診断方法。
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