CN108961208B - 一种聚集白细胞分割计数系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚集白细胞分割计数系统，所述系统包括：图像采集模块，用于对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解所述血样中的红细胞,获取白细胞图像；图像预处理模块，用于对所述白细胞图像进行图像背景去除和采用最大类间方差法得到最佳分割阈值，将白细胞区域粗分割；聚集细胞判断模块，用于根据白细胞区域粗分割后得到粗分割图像，设定细胞面积的判别函数，获取多细胞聚集区域；聚集细胞分割计数模块，用于采用形态学细化方法提取各个聚集区域内的细胞骨骼及所述细胞骨骼处的灰度曲线。本发明采用通过分析低倍显微镜下各类白细胞面积灰度特征，构建自适应阈值函数，在获取白细胞计数的同时，获取嗜酸细胞数量，对聚集区域细胞进行快速、准确的分割和计数，快速简单，易于实现。

Description

一种聚集白细胞分割计数系统及方法

技术领域

本发明涉及一种白细胞分割计数系统及方法，具体涉及一种聚集白细胞分割计数系统及方法。

背景技术

白细胞检测是临床检验的一项重要内容，其含量和质量是人体健康状况的重要指症。自动仪器分析法及人工镜检法是目前白细胞分类计数的主要方法，但还存在设备笨重、不易维护及操作专业度高等缺点，不适合基层医疗卫生机构、移动医疗及家庭使用。基于图像的便携式白细胞计数仪可以在最接近病患的地方，通过分析血液样本图像获得准确的诊断信息，具有大型仪器不具备的时间和空间优势。但受制于其计数方法影响，便携式白细胞计数设备精度还不够准确，其难点主要是对于聚集细胞分割、计数。

目前绝大多数的白细胞分割方案还存在以下问题：(1)都是基于100倍放大镜下的，而便携式设备中显微镜多数只有4-20倍。这种情况下，图像上无法分清细胞核区域，基于细胞机器模型也很难构建；(2)在4-20倍显微镜下，白细胞的边界模糊，数量多，基于形态学边界提取的方法还存在着精度低，无法识别聚集细胞的情况，B-snake模型迭代收敛太慢，耗时长；(3)聚集细胞边界模糊，边界凹凸点判别困难，判别误差大。尤其聚集程度较高、聚集数量多时，细胞边界几乎观察不到凸凹点，基于距离曲线的分割方法无法获取分割点。综上所述，应用上述各种方法无法获取精确的细胞分割，无法完整的分离聚集细胞，尤其是高聚集细胞，存在计数准确性低的问题。

因此，迫切需要寻找一种快速、准确、便捷的聚集细胞分割、计数方法，以提高便携式检验设备的计数精度。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种聚集白细胞分割计数系统及方法，可以解决无法获取精确的细胞分割，无法完整的分离聚集细胞，尤其是高聚集细胞，存在计数准确性低的问题。

ROI是指在图像处理领域，从图像中选择的一个图像区域，这个区域是你的图像分析所关注的重点。圈定该区域以便进行进一步处理。使用ROI圈定你想读的目标，可以减少处理时间，增加精度。

技术方案：一方面，本发明实施例提供一种聚集白细胞分割计数系统，该系统包括：

图像采集模块，用于对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解所述血样中的红细胞,获取白细胞图像；

图像预处理模块，用于对所述白细胞图像进行图像背景去除和采用最大类间方差法得到最佳分割阈值，将白细胞ROI区域粗分割，得到最佳分割阈值；

聚集细胞判断模块，用于根据所述最佳分割阈值，进行二值化处理，得到二值图像，并根据所述二值图像设定细胞面积的判别函数，获取细胞聚集ROI区域；

聚集细胞分割模块，用于根据所述二值处理图像采用形态学细化方法提取各个细胞聚集ROI区域内的细胞骨骼，将所述细胞骨骼映射到白细胞灰度图像中，得到所述细胞骨骼处的灰度曲线，所述灰度曲线波峰处为聚集细胞连接处，其灰度值即为细胞连接处灰度值；所述灰度曲线波谷处为细胞核灰度值，并根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割，得到单一细胞ROI区域的面积；

细胞计数模块，通过分析低倍显微镜下聚集ROI区域灰度骨骼曲线的波谷值和单一细胞ROI区域面积的比值，即获取ROI区域参数灰度比，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值，统计阈值区间ROI数目，实现白细胞及嗜酸细胞计数。

优选的，所述图像预处理模块，包括背景去除模块和ROI区域分割模块，所述背景去除模块将所述图像采集模块采集的所述白细胞图像复杂背景进行删除，所述ROI区域分割模块通过最大类间方差法实现细胞ROI区域粗分割，具体步骤包括：

在所述重构后的白细胞图像的灰度区间初始化分割阈值T；

使用所述分割阈值T分割所述图像，所述图像像素的灰度值大于等于T的像素区域记作g₁小于T的区域记作g₂；

计算所述g₁和g₂区域内的灰度方差，分别对应记为u₁和u₂；

更新所述分割阈值T，公式为：

T＝1/2×(u₁-u₂)²

计算类间方差σ，公式为：

σ＝ω₁×ω₂×(μ₁-μ₂)²

其中，ω₁+ω₂＝1，ω₁为所述区域g₁的面积占所述图像的面积比，ω₂为所述区域g₂的面积占所述降噪图像的面积比；

迭代上述步骤，直到所述分割阈值T使得σ最大，得到最佳分割阈值。

优选的，所述聚集细胞判断模块中获取细胞聚集ROI区域的具体步骤包括：

采用最大类间方差法得到所述最佳分割阈值，进行阈值二值化处理，记细胞ROI区域像素值为1，背景像素为0，从而得到面积连通区域；

获取每个所述面积连通区域的面积，做出面积分布直方图；

采用样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f-¹(x)，f(x)＝max f(x)，该面积即为这幅白细胞图像面积判断阈值。

优选的，所述聚集细胞分割模块包括骨骼提取模块和细胞分割模块；

所述骨骼提取模块采用形态学细化方法提取所述聚集ROI区域内的细胞骨骼，包括：

将白细胞图像的二值图像记为A，结构元素对序列记为{B}＝{B₁,B₂,...B_i,...B_n}，则所述生态学细化定义为：

重复计算，直到满足如下条件，则迭代停止：腐蚀结果是一条细线且只有一个像素宽度；腐蚀结果为所述白细胞图像的中心线；腐蚀结果是连通的；

所述细胞分割模块利用所述细胞骨骼处的灰度曲线，以所述灰度曲线的细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割，得到单一细胞ROI区域的面积。

优选的，所述根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割，具体包括：

所述骨骼灰度曲线的波峰处的灰度值为所述聚集细胞连接处灰度值，所述骨骼灰度曲线的波谷处为细胞核灰度值；

以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点，以波峰值为终止条件，设R为所述白细胞图像中的一聚集细胞ROI区域，第i个波谷灰度值为g_i，第i个波峰灰度值为p_i，I_k为所述区域R对应的灰度值，在所述种子点g_i处进行8邻域扩展，所述波谷值g_i的8邻域像素灰度值记为g_k，所述波峰值p_i8邻域值像素灰度值记为p_k；

以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点进行区域增长，若所述区域R对应的灰度值I_k符合g_i-g_k>|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域的最小值，则该灰度值I_k被包括进所述波谷值g_i种子像素所在的区域；当不再有像素I_k满足加入所述波谷值g_i种子像素所在的区域，分割结束；

重复上述过程，直至所述所有种子区域均被分割完成，得到满足一定条件的n个子区域R₁,R₂,......,R_n。

优选的，所述细胞计数模块中获取白细胞计数的同时，获取嗜酸细胞数量的实现方法为：

参数灰度比表示为：

g为聚集ROI区域灰度骨骼曲线波谷值，C为单一细胞ROI区域的面积；

嗜酸细胞数目和白细胞图像内白细胞数目表示为：

其中，Num_e为嗜酸细胞数目，Num_w为白细胞图像内所有白细胞数目，n为白细胞图像内ROI G_ratio小于阈值t₁的区域数目，N为白细胞图像内ROI G_ratio小于阈值t₂的区域数目。

进一步的，所述阈值t₁和t₂的获取是采用自适应阈值法，具体包括：

(1)计算白细胞图像范围内ROI区域灰度比参数；

(2)统计所有ROI区域灰度比参数分布直方图；

(3)样条插值拟合获取灰度比参数分布曲线；

(4)寻找所述参数分布曲线波谷，波谷点所对应灰度比值即为嗜酸细胞、白细胞与杂质的分割点，即波谷点所对应的灰度比值即为阈值t₁和t₂。

另一方面，本发明还涉及一种聚集白细胞分割系统的聚集白细胞分割计数方法，该方法包括：

(1)对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解血样中的红细胞，获取白细胞图像；

(2)采用形态学重构去除所述白细胞图像的复杂背景，得到重构后的白细胞图像；

(3)采用最大类间方差法得到最佳分割阈值，对所述重构后的白细胞图像实现细胞ROI区域粗分割；

(4)根据所述最佳分割阈值将白细胞图像进行二值化处理，得到二值图像，并根据所述二值图像设定细胞面积判别函数，获取所有细胞聚集ROI区域，并根据所述二值化图像，采用形态学细化方法提取各个细胞聚集ROI区域内的细胞骨骼，将所述细胞骨骼映射到白细胞图像中，得到所述细胞骨骼处的灰度曲线；

(5)以所述灰度曲线的细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割；

(6)通过分析低倍显微镜下聚集ROI区域灰度骨骼曲线的波谷值和单一细胞ROI

区域面积的比值，即获取ROI区域参数灰度比，统计图像内参数比值分布，计算区

间自适应分割阈值；统计阈值区间ROI数目，实现白细胞及嗜酸细胞计数。

优选的，所述实现所述聚集ROI区域的细胞分割，具体包括：

(51)所述骨骼灰度曲线的波峰处的灰度值为所述聚集细胞连接处灰度值，所述骨骼灰度曲线的波谷处为细胞核灰度值；

(52)以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点，以波峰值为终止条件，设R为所述白细胞图像中的一聚集细胞ROI区域，第i个波谷灰度值为g_i，第i个波峰灰度值为p_i，I_k为所述区域R对应的灰度值，在所述种子点g_i处进行8邻域扩展，所述波谷值g_i的8邻域像素灰度值记为g_k，所述波峰值p_i8邻域值像素灰度值记为p_k；

(53)以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点进行区域增长，若所述区域R对应的灰度值I_k符合g_i-g_k>|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域的最小值，则该灰度值I_k被包括进所述波谷值g_i种子像素所在的区域；当不再有像素I_k满足加入所述波谷值g_i种子像素所在的区域，分割结束；

(54)重复上述过程，直至所述所有种子区域均被分割完成，得到满足一定条件的n个子区域R₁,R₂,......,R_n。

优选的，所述获取ROI区域灰度比参数，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值具体包括：

参数灰度比表示为：

g为聚集ROI区域灰度骨骼曲线波谷值，C为单一细胞ROI区域的面积；

嗜酸细胞数目和白细胞图像内白细胞数目表示为：

其中，Num_e为嗜酸细胞数目，Num_w为白细胞图像内所有白细胞数目，n为白细胞图像内ROI G_ratio小于阈值t₁的区域数目，N为白细胞图像内ROI G_ratio小于阈值t₂的区域数目；

所述阈值t₁和t₂的获取具体方法为：

(1)计算白细胞图像范围内ROI区域灰度比参数；

(2)统计所有ROI区域灰度比参数分布直方图；

(3)样条插值拟合获取灰度比参数分布曲线；

(4)寻找所述参数分布曲线波谷，波谷点所对应灰度比值即为嗜酸细胞、白细胞与杂质的分割点，即波谷点所对应的灰度比值即为阈值t₁和t₂。

有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：1、本发明采集白细胞图像采用的是基于生物试剂的白细胞图像获取方法，去除红细胞干扰，快速获取更加精确的白细胞显微镜图像；2、基于灰度骨骼曲线的聚集细胞分割方法，可以快速识别出区域、链码、凹凸性及距离曲线特征不明显的聚集程度高、聚集数量多的细胞区域，聚集细胞分割更加准确、可靠；3、基于面积灰度比值特征的白细胞及嗜酸细胞识别计数方法，通过量化不同细胞特征，快速去除红细胞碎片杂质及灰尘等非细胞区域噪声影响，对计数结果更精确；在白细胞计数的同时，实现嗜酸细胞数量评估，极大地拓展了便携式白细胞仪检测范围，提高系统使用性能。

附图说明

图1为本发明的一个实施例所述的聚集白细胞分割计数系统结构示意图；

图2为本发明的一个实施例所述的聚集白细胞分割计数系统结构示意图；

图3为本发明的一个实施例所述的聚集白细胞分割计数系统中的聚集细胞分割模块结构示意图；

图4为本发明的一个实施例所述的聚集白细胞分割计数方法的流程图；

图5为本发明采集的白细胞图像；

图6为本发明所述基于重构的背景去除白细胞图像：

图7为本发明所述的采用最大类间方差法白细胞粗分割图像：

图8为本发明所述的粗分割图像标记识别结果图；

图9为本发明所述的细胞面积判断函数的面积及拟合曲线图；

图10为本发明所述聚集区域细胞骨骼峰值曲线图，其中图10a是聚集区域细胞图，图10b为聚集区域细胞边界及其骨骼示意图；

图11为本发明所述的聚集细胞区域处骨骼灰度曲线图；

图12为本发明所述的聚集区域细胞分割结果示意图；

图13为本发明所述的聚集区域细胞标记识别结果图；

图14为本发明一实施例所述的聚集区域细胞曲线图；

图15为4倍显微镜下的细胞图像，其中15a为普通白细胞图像，图15b为嗜酸细胞图像；

图16为本发明所述的4种白细胞ROI区域灰度比值分布示意图；

图17为本发明所述的一幅图像上4种白细胞ROI灰度比参数直方图；

图18为本发明所述的方法与血液分析仪白细胞计数相关性曲线对比结果图；

图19为本发明所述的方法与血液分析仪嗜酸细胞计数相关性曲线对比结果图。

具体实施方式

如图1所示，本发明提供一种聚集白细胞分割计数系统，系统包括：

图像采集模块1，用于对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解所述血样中的红细胞,获取白细胞图像。为了提高白细胞计数精度，先用台盼蓝对血样中白细胞染色，增强细胞对比度；然后再用红细胞裂解液裂解掉血样中的红细胞，降低不相干细胞杂质的干扰。白细胞染色、红细胞裂解方法也可用其它方法实现。图像采集溶血染色4倍显微镜下白细胞图像。

图像预处理模块2，用于对白细胞图像进行图像背景去除和白细胞ROI区域粗分割。

可选的，在本发明一实施例中，如图2，图像预处理模块2包括背景去除模块21和ROI区域分割模块22，背景去除模块21将图像采集模块1采集的白细胞图像复杂背景进行删除，采集过程中受处理器、灯光及溶液杂质等因素的影响，获取的图像往往背景不均匀，为后期细胞计数带来干扰。结合便携式设备图像特点，首先采用半径为20的圆形结构元素对图像进行开运算重构，再从原图中减去开运算重构结果，即可实现图像复杂背景删除。即：

I_new＝I₀-I_open

其中，I_new为背景删除图像，I₀为原图，I_open为经半径20圆形结构元素开运算重构后图像。

图像经预处理重构后，白细胞区域得到突显，噪声及杂质区域得到很好的抑制。此时虽然背景与目标区域差别比较明显，为避免不同机器间图像对比度差异，本发明通过最大类间方差法设置全局自适应阈值，实现细胞区域分割，最大类间方差法根据图像的灰度特性，将图像分为前景和背景两个部分。当构成图像的两个部分之间的差别越大时，则二者间方差差异越大；当目标被错分时，则二者间方差差异变小。通过对比前景和背景之间的类间方差，便可得到最佳全局阈值。ROI区域分割模块22通过最大类间方差法实现细胞区域粗分割，具体步骤包括：

在所述重构后的白细胞图像的灰度区间初始化分割阈值T；

使用分割阈值T分割图像，图像像素的灰度值大于等于T的像素区域记作g₁小于T的区域记作g₂；

计算所述g₁和g₂区域内的灰度方差，分别对应记为u₁和u₂；

更新分割阈值T，公式为：

T＝1/2×(u₁-u₂)²

计算类间方差σ，公式为：

σ＝ω₁×ω₂×(μ₁-μ₂)²

其中，ω₁+ω₂＝1，ω₁为所述区域g₁的面积占所述图像的面积比，ω₂为所述区域g₂的面积占所述降噪图像的面积比；

重复上述过程，直到连续迭代中T的使得σ最小为止，得到最佳分类阈值，从而实现ROI区域分割。白细胞分割也可以应用其它二分类算法。

聚集细胞判断模块3，用于根据白细胞ROI区域粗分割后得到的最佳分割阈值，进行二值化处理，得到二值图像，并根据所述二值图像设定细胞面积的判别函数，获取细胞聚集ROI区域。

细胞面积判别步骤：

首先，采用自适应阈值法得到最佳分割阈值，之后进行阈值二值化处理图像，此时细胞ROI区域像素值为1，背景像素为0，得到面积连通区域；

其次，获取每个连通区域面积，做面积分布直方图；

最后，样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f^-1(x)，f(x)＝max f(x)。此面积即为这幅图像面积判断阈值。

区域面积大于阈值A，判别为聚集ROI区域。这里所涉及的拟合为样条插值平滑拟合，拟合参数为经验值0.003。

聚集细胞分割模块4，用于根据二值处理图像采用形态学细化方法提取各个细胞聚集ROI区域内的细胞骨骼，将细胞骨骼映射到原白细胞灰度图像中，得到细胞骨骼处的灰度曲线，灰度曲线波峰处为聚集细胞连接处，其灰度值即为细胞连接处灰度值；所述灰度曲线波谷处为细胞核灰度值，并根据区域灰度均值相似性实现聚集ROI区域的细胞分割，得到单一细胞ROI区域的面积。

目前聚集细胞分割最常用的方法是基于边界链码的凹凸特征法、基于细胞边界的距离曲线法。但是对于低倍显微镜及聚集程度高、聚集数量多的细胞区域，细胞边界链码的凹凸性不够明显，分割误差大；尤其聚集程度较高、聚集数量多时，细胞边界几乎观察不到凸凹点，基于细胞距离曲线的方法无法获取分割点。4倍显微镜下，白细胞以点状分布，细胞核中心灰度值最小，细胞聚集处灰度值要高于核中心处，核骨骼曲线在细胞聚集处达到最高点，在核中心处到达波谷点。通过找寻聚集区域灰度骨骼曲线上峰峰、峰谷，便可实现聚集细胞分割。

如图3所示，聚集细胞分割模块4包括骨骼提取模块41、细胞分割模块42。

骨骼提取模块41采用形态学细化方法提取聚集ROI区域内的细胞骨骼，包括：

根据图像特征，白细胞骨架提取采用半径为1的圆形结构算子的形态学细化方法。其基本思想是给定系列具有一定形状的结构元素后，顺序循环地删除满足击中变换的像素，直到图像只剩单一骨架曲线。具体实现如下：

假设一结构元素对B＝(C,D)，利用B细化图像A，即：

其中

为在A中去掉A被B击中的结果。若结构元素对序列{B}＝{B₁,B₂,…,B_n}，其中B_i+1代表B_i旋转的效果，则细化也可以定义为：

这个细化过程可通俗理解为：对于二值图像A，先用B₁腐蚀一遍，然后用B₂对前面结果腐蚀一遍，如此继续，整个过程可再重复直到满足如下原则，迭代停止：

①输出结果是一条细线且只有一个像素宽度；

②输出结果为原目标图像的中心线；

③输出结果是连通的。

将白细胞图像的二值图像记为A，结构元素对序列记为{B}＝{B₁,B₂,...B_i,...B_n}，则所述生态学细化定义为：

重复计算，直到满足如下条件，则迭代停止：腐蚀结果是一条细线且只有一个像素宽度；腐蚀结果为所述白细胞图像的中心线；腐蚀结果是连通的。

形态学细化能够将大量复杂的图像处理转换成最基本的移位和逻辑运算的组合，便于并行处理及硬件实现，是一种理想的聚集细胞骨架提取方法。形态学细化算子也可以采用其它结构算子。

细胞分割模块42利用细胞骨骼处的灰度曲线，以灰度曲线的细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性实现聚集细胞ROI区域的细胞分割。

聚集细胞ROI区域骨骼提取出来后，映射到原图像中，获取骨骼处灰度曲线。骨骼灰度值为：

G_c＝I_b×I_roi

其中，I_b为骨骼二值化图像，I_roi为分割到的聚集细胞ROI区域，G_c为骨骼处灰度图像。依次提取G_c图像上灰度值构建骨骼灰度曲线，骨骼曲线是聚集区域切面上的起伏曲线。曲线波峰处即为聚集细胞链接处，其灰度值即为细胞连接处灰度值；曲线波谷处为细胞核灰度值。此时，以细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性，最终实现聚集细胞分割。具体包括：

假设R为一聚集细胞ROI区域，第i个波谷值为g_i，第i个波峰值为p_i，I_k为区域R上灰度值。在种子点g_i处进行8邻域扩展。其中g_k为g_i 8邻域像素灰度值，p_k为p_i 8邻域值像素灰度值。若g_i-g_k>|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域最小值，则将该像素被包括进g_i种子像素所在的区域；当不再有像素I_k满足加入这个区域，增长停止，分割结束。重复上述过程，直至区域内所有种子区域均被分割完成。被分割的n个子区域R₁,R₂,......，R_n满足以下条件：

①U(Ri)＝R；

②R_i是一个连通区域，i＝1,2,3,......n；

③R_i∩R_j＝空集，对于任何的i,j；都有i≠j。

细胞计数模块5，通过分析低倍显微镜下聚集ROI区域灰度骨骼曲线的波谷值和单一细胞ROI区域面积的比值，即获取ROI区域参数灰度比，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值，统计阈值区间ROI数目，实现白细胞及嗜酸细胞计数。

人体血液中白细胞又分为中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞及淋巴细胞。经过红细胞裂解及染色作用后，中性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞及淋巴细胞的细胞膜破裂，图像上只能观察到这4种细胞深蓝色的核；而嗜酸性细胞膜保存完好，图像上能观察到细胞膜及其深蓝色核，其在图像上显示出来的面积要大于其它种类白细胞；又由于膜的存在，导致嗜酸性细胞核颜色略浅于其它白细胞。因此，可以通过灰度面积比值，来估计图像中嗜酸细胞数量、去除杂质干扰，实现白细胞计数。

参数灰度比G_ratio定义如下：

g为ROI区域最小灰度值，即聚集区域灰度骨骼曲线波谷值；C为ROI区域面积。嗜酸细胞灰度比参数区间介于0.2-0.6之间，所有白细胞灰度比参数介于0.2-1之间。即：

其中，Num_e为嗜酸细胞数目，Num_w为图像内所有白细胞数目。n为图像内ROI G_ratio小于阈值t₁的区域数目，N为图像内ROI G_ratio小于阈值t₂的区域数目。为了避免机器间差异，细胞间G_ratio分割阈值t₁和t₂采用自适应阈值法获取：首先计算图像范围内ROI区域灰度比参数；统计所有ROI区域灰度比参数分布直方图；样条插值拟合获取灰度比参数分布曲线；最后寻找分布曲线波谷，波谷点所对应灰度比值即为嗜酸细胞、白细胞与杂质的分割点。

本发明实施例还提供基于聚集白细胞分割计数系统的一种聚集白细胞分割计数方法，为了验证本发明的可行性和有效性，我们做了一个初步的仿真、测量实验。实验血样样本品来源于某医院检验科样本。白细胞提取分析在软件Matlab2017a中完成，图像大小为1920×1080，白细胞放大倍数为4倍。

如图4所示，该方法包括：

S01对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解所述血样中的红细胞,获取白细胞图像。

为了提高白细胞计数精度，先用台盼蓝对血样中白细胞染色，增强细胞对比度；然后再用红细胞裂解液裂解掉血样中的红细胞，降低不相干细胞杂质的干扰，得到如图5所示白细胞图像。白细胞染色、红细胞裂解方法也可用其它方法实现。图像采集溶血染色4倍显微镜下白细胞图像

S02采用形态学重构去除所述白细胞图像的复杂背景，得到重构后的白细胞图像，如图6所示；

具体为：采集过程中受处理器、灯光及溶液杂质等影响，获取的图像往往背景不均匀，为后期细胞计数带来干扰。结合便携式设备图像特点，首先采用半径为20的圆形结构元素对图像进行开运算重构，再从原图中减去开运算重构结果，即可实现图像复杂背景删除。即：

I_new＝I₀-I_open

其中，I_new为背景删除图像，I₀为原图，I_open为经半径20圆形结构元素开运算重构后图像。

S03采用最大类间方差法得到最佳分割阈值，对所述重构后的白细胞图像实现细胞ROI区域粗分割；

细胞图像经预处理重构后，白细胞ROI区域得到突显，噪声及杂质区域得到很好的抑制。此时虽然背景与目标区域差别比较明显，为避免不同机器间图像对比度差异，本发明通过最大类间方差法设置全局自适应阈值，实现细胞ROI区域粗分割，如图7所示，标记结果如图8所示。

最大类间方差法根据图像的灰度特性，将图像分为前景和背景两个部分。当构成图像的两个部分之间的差别越大时，则二者间方差差异越大；当目标被错分时，则二者间方差差异变小。通过对比前景和背景之间的类间方差，便可得到最佳分割阈值。具体步骤包括：

(31)在所述重构后的白细胞图像的灰度区间初始化分割阈值T；

(32)使用分割阈值T分割图像，图像像素的灰度值大于等于T的像素区域记作g₁小于T的区域记作g₂；

(33)计算所述g₁和g₂区域内的灰度方差，分别对应记为u₁和u₂；

(34)更新分割阈值T，公式为：

T＝1/2×(u₁-u₂)²

计算类间方差σ，公式为：

σ＝ω₁×ω₂×(μ₁-μ₂)²

其中，ω₁+ω₂＝1，ω₁为所述区域g₁的面积占所述图像的面积比，ω₂为所述区域g₂的面积占降噪图像的面积比；

(35)迭代步骤(34)，直到分割阈值T使得σ最大，得到最佳分割阈值。

S04根据所述最佳分割阈值将白细胞图像进行二值化处理，得到二值图像，并根据所述二值图像设定细胞面积判别函数，获取所有细胞聚集ROI区域，并根据二值化图像，采用形态学细化方法提取各个细胞聚集ROI区域内的细胞骨骼，将细胞骨骼映射到白细胞图像中，得到细胞骨骼处的灰度曲线。

目前聚集细胞分割最常用的方法是基于边界链码的凹凸特征法、基于细胞边界的距离曲线法。但是对于低倍显微镜及聚集程度高、聚集数量多的细胞区域，细胞边界链码的凹凸性不够明显，分割误差大；尤其聚集程度较高、聚集数量多时，细胞边界几乎观察不到凸凹点，基于细胞距离曲线的方法无法获取分割点。4倍显微镜下，白细胞以点状分布，细胞核中心灰度值最小，细胞聚集处灰度值要高于核中心处，核骨骼曲线在细胞聚集处达到最高点，在核中心处到达波谷点。通过找寻聚集区域灰度骨骼曲线上峰峰、峰谷，便可实现聚集细胞分割。

正常情况下，细胞均匀的分布在图像上。随着细胞数量的增多，或前期化学药物没有混匀时，则图像会出现分布不均、聚集的现象。如图9所示，聚集细胞ROI区域判别步骤如下：

首先，采用自适应阈值法得到的得到最佳分割阈值，进行二值化处理图像，此时细胞区域像素值为1，背景像素为0，得到面积连通区域；

其次，获取每个连通区域面积，计算面积分布；

最后，样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f^-1(x)，f(x)＝max f(x)。此面积即为这幅图像面积判断阈值。

区域面积大于阈值A，判别为聚集区域，如图10a所示。这里所涉及的拟合为样条插值平滑拟合，拟合参数为经验值。

根据图像特征，白细胞骨架提取采用半径为1的圆形结构算子的形态学细化方法。其基本思想是给定系列具有一定形状的结构元素后，顺序循环地删除满足击中变换的像素，直到图像只剩单一骨架曲线。具体实现如下：

假设一结构元素对B＝(C,D)，利用B细化图像A，即：

其中

为在A中去掉A被B击中的结果。若结构元素对序列{B}＝{B₁,B₂,…,B_n}，其中B_i+1代表B_i旋转的效果，则细化也可以定义为：

这个细化过程可通俗理解为：对于二值图像A，先用B₁腐蚀一遍，然后用B₂对前面结果腐蚀一遍，如此继续，整个过程可再重复直到满足如下原则，迭代停止：

①输出结果是一条细线且只有一个像素宽度；

②输出结果为原目标图像的中心线；

③输出结果是连通的。

形态学细化能够将大量复杂的图像处理转换成最基本的移位和逻辑运算的组合，便于并行处理及硬件实现，是一种理想的聚集细胞骨架提取方法。形态学细化算子也可以采用其它结构算子。

将白细胞图像的二值图像记为A，结构元素对序列记为{B}＝{B₁,B₂,...B_i,...B_n}，则生态学细化定义为：

重复计算，直到满足如下条件，则迭代停止：腐蚀结果是一条细线且只有一个像素宽度；腐蚀结果为白细胞图像的中心线；腐蚀结果是连通的，如图10b所示。

聚集细胞ROI区域骨骼提取出来后，映射到原图像中，获取骨骼处灰度曲线，如图11所示。骨骼灰度值为：

G_c＝I_b×I_roi

其中，I_b为骨骼二值化图像，I_roi为分割到的聚集细胞ROI区域，G_c为骨骼处灰度图像。依次提取G_c图像上灰度值构建骨骼灰度曲线。曲线波峰处即为聚集细胞连接处，其灰度值即为细胞连接处灰度值；曲线波谷处为细胞核灰度值。

S05以所述灰度曲线的细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性实现聚集细胞ROI区域的细胞分割；

此时，以细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性，最终实现聚集细胞分割，如图12所示。

具体包括：

(51)骨骼灰度曲线的波峰处的灰度值为所述聚集细胞连接处灰度值，骨骼灰度曲线的波谷处为细胞核灰度值；

(52)以骨骼灰度曲线波谷为种子点，以波峰值为终止条件，设R为白细胞图像中的一聚集细胞ROI区域，第i个波谷灰度值为g_i，第i个波峰灰度值为p_i，I_k为区域R对应的灰度值，在种子点g_i处进行8邻域扩展，波谷值g_i的8邻域像素灰度值记为g_k，波峰值p_i8邻域值像素灰度值记为p_k；

(53)以骨骼灰度曲线波谷为种子点进行区域增长，若区域R对应的灰度值I_k符合g_i-g_k>|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域的最小值，则该灰度值I_k被包括进所述波谷值g_i种子像素所在的区域；当不再有像素I_k满足加入波谷值g_i种子像素所在的区域，分割结束；

(54)重复上述过程，直至所有种子区域均被分割完成，得到满足一定条件的n个子区域R₁,R₂,......,R_n。被分割的n个子区域R₁,R₂,......，R_n满足以下条件：

①U(Ri)＝R；

②R_i是一个连通区域，i＝1,2,3,......n；

③R_i∩R_j＝空集，对于任何的i,j；都有i≠j。

高聚集细胞标记结果如图13所示，为方便理解，现将上述步骤举例理解如下：

实际情况如图14所示，倒着的小山丘为聚集区域细胞，想象成3维小山丘。骨骼曲线只是山丘纵向切面上的起伏曲线。可以看到图中有个山丘看起来是一个起伏曲线。这个曲线可以看成骨骼曲线，其中曲线波谷为细胞区域顶点，波峰为聚集区域交界点。以波谷点为种子点进行区域增长，生长条件为g_i-g_k>|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域最小值。像素不满足上述条件时，将不被计入在细胞区域，当不再有像素满足这个条件时，增长停止，分割完成，上述的种子区域指聚集细胞ROI区域。如图14中有2个波谷，即2个种子区域。

S06通过分析低倍显微镜下聚集细胞ROI区域灰度骨骼曲线的波谷值和单一细胞ROI区域面积的比值，即获取ROI区域参数灰度比，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值；统计阈值区间ROI数目，实现白细胞及嗜酸细胞计数，如图15a和15b所示。

人体血液中白细胞又分为中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞及淋巴细胞。经过红细胞裂解及染色作用后，中性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞及淋巴细胞的细胞膜破裂，图像上只能观察到这4种细胞深蓝色的核；而嗜酸性细胞膜保存完好，图像上能观察到细胞膜及其深蓝色核，其在图像上显示出来的面积要大于其它种类白细胞；又由于膜的存在，导致嗜酸性细胞核颜色略浅于其它白细胞。因此，可以通过灰度面积比值，来估计图像中嗜酸细胞数量、去除杂质干扰，实现白细胞计数。

参数灰度比G_ratio定义如下：

g为ROI区域最小灰度值，即聚集区域灰度骨骼曲线波谷值；C为ROI区域面积，即单一细胞ROI区域面积。图16中给出4倍显微镜下细胞图像上嗜酸性细胞、杂质区域及其它4种白细胞的灰度比值分布情况。嗜酸细胞灰度比参数区间介于0.2-0.6之间，所有白细胞灰度比参数介于0.2-1之间。即：

其中，Num_e为嗜酸细胞数目，Num_w为图像内所有白细胞数目。n为图像内ROI G_ratio小于阈值t₁的区域数目，N为图像内ROI G_ratio小于阈值t₂的区域数目。为了避免机器间差异，细胞间G_ratio分割阈值t₁和t₂采用自适应阈值法获取：首先计算图像范围内ROI区域灰度比参数；统计所有ROI区域灰度比参数分布直方图；样条插值拟合获取灰度比参数分布曲线；最后寻找分布曲线波谷，波谷点所对应灰度比值即为嗜酸细胞、白细胞与杂质的分割点，如图17所示，可看到同一幅图像上，该直方图包括两条虚线，左边的虚线处波谷点的值为阈值t₁，右边虚线处波谷点代表的值为阈值t₂，经本方法获取白细胞计算结果与细胞分析仪测量结果相对比，如图18所示，二者相关系数R²＝0.992；如图19所示，嗜酸性细胞计数结果相关性为0.9855。从初步实验效果图来看，本方法性能良好，可以用于人体全血聚集白细胞分割、白细胞及嗜酸细胞计数。

Claims (10)

1.一种聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述系统包括：

图像采集模块，用于对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解所述血样中的红细胞,获取白细胞图像；

图像预处理模块，用于对所述白细胞图像进行图像背景去除和采用最大类间方差法得到最佳分割阈值，将白细胞ROI区域粗分割，得到最佳分割阈值；

聚集细胞判断模块，用于根据所述最佳分割阈值，进行二值化处理，得到二值图像，并根据所述二值图像设定细胞面积的判别函数，获取细胞聚集ROI区域；

聚集细胞分割模块，用于根据所述二值处理图像采用形态学细化方法提取各个细胞聚集ROI区域内的细胞骨骼，将所述细胞骨骼映射到白细胞灰度图像中，得到所述细胞骨骼处的灰度曲线，所述灰度曲线波峰处为聚集细胞连接处，其灰度值即为细胞连接处灰度值；所述灰度曲线波谷处为细胞核灰度值，并根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割，得到单一细胞ROI区域的面积；

细胞计数模块，通过分析低倍显微镜下聚集ROI区域灰度骨骼曲线的波谷值和单一细胞ROI区域面积的比值，即获取ROI区域参数灰度比，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值，统计阈值区间ROI数目，实现白细胞及嗜酸细胞计数。

2.根据权利要求1所述的聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述图像预处理模块，包括背景去除模块和ROI区域分割模块，所述背景去除模块将所述图像采集模块采集的所述白细胞图像复杂背景进行删除，得到重构后的白细胞图像，所述ROI区域分割模块通过最大类间方差法实现细胞ROI区域粗分割，具体步骤包括：

在重构后的白细胞图像的灰度区间初始化分割阈值T；

使用所述分割阈值T分割所述图像，所述图像像素的灰度值大于等于T的像素区域记作g₁小于T的区域记作g₂；

计算所述g₁和g₂区域内的灰度方差，分别对应记为u₁和u₂；

更新所述分割阈值T，公式为：

T＝1/2×(u₁-u₂)²

计算类间方差σ，公式为：

σ＝ω₁×ω₂×(μ₁-μ₂)²

其中，ω₁+ω₂＝1，ω₁为所述区域g₁的面积占所述图像的面积比，ω₂为所述区域g₂的面积占所述图像的面积比；

迭代上述步骤，直到所述分割阈值T使得σ最大，得到最佳分割阈值。

3.根据权利要求1所述的聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述聚集细胞判断模块中获取细胞聚集ROI区域的具体步骤包括：

采用最大类间方差法得到所述最佳分割阈值，进行阈值二值化处理，记细胞ROI区域像素值为1，背景像素为0，从而得到面积连通区域；

获取每个所述面积连通区域的面积，做出面积分布直方图；

采用样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f^-1(x)，f(x)＝max f(x)，该面积即为这幅白细胞图像面积判断阈值。

4.根据权利要求1所述的聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述聚集细胞分割模块包括骨骼提取模块和细胞分割模块；

所述骨骼提取模块采用形态学细化方法提取所述聚集ROI区域内的细胞骨骼，包括：

将白细胞图像的二值图像记为A，结构元素对序列记为{B}＝{B₁,B₂,...B_i,...B_n}，则所述生态学细化方法定义为：

重复计算，直到满足如下条件，则迭代停止：腐蚀结果是一条细线且只有一个像素宽度；腐蚀结果为所述白细胞图像的中心线；腐蚀结果是连通的；

所述细胞分割模块利用所述细胞骨骼处的灰度曲线，以所述灰度曲线的细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割，得到单一细胞ROI区域的面积。

5.根据权利要求4所述的聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割，具体包括：

所述骨骼灰度曲线的波峰处的灰度值为所述聚集细胞连接处灰度值，所述骨骼灰度曲线的波谷处为细胞核灰度值；

以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点，以波峰值为终止条件，设R为所述白细胞图像中的一聚集细胞ROI区域，第i个波谷灰度值为g_i，第i个波峰灰度值为p_i，I_k为所述区域R对应的灰度值，在所述种子点g_i处进行8邻域扩展，所述波谷值g_i的8邻域像素灰度值记为g_k，所述波峰值p_i8邻域值像素灰度值记为p_k；

以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点进行区域增长，若所述区域R对应的灰度值I_k符合g_i-g_k＞|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域的最小值，则该灰度值I_k被包括进所述波谷值g_i种子像素所在的区域；当不再有像素I_k满足加入所述波谷值g_i种子像素所在的区域，分割结束；

重复上述过程，直至所述所有种子区域均被分割完成，得到满足一定条件的n个子区域R₁,R₂,......,R_n。

6.根据权利要求1所述的聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述细胞计数模块中获取白细胞计数的同时，获取嗜酸细胞数量的实现方法为：

参数灰度比表示为：

g为聚集ROI区域灰度骨骼曲线波谷值，C为单一细胞ROI区域的面积；

嗜酸细胞数目和白细胞图像内白细胞数目表示为：

其中，Num_e为嗜酸细胞数目，Num_w为白细胞图像内所有白细胞数目，n为白细胞图像内ROI G_ratio小于t₁的区域数目，N为白细胞图像内ROI G_ratio小于t₂的区域数目。

7.根据权利要求6所述的聚集白细胞分割计数系统，其特征在于，所述t₁和t₂的获取是采用自适应阈值法，具体包括：

(1)计算白细胞图像范围内ROI区域灰度比参数；

(2)统计所有ROI区域灰度比参数分布直方图；

(3)样条插值拟合获取灰度比参数分布曲线；

(4)寻找所述参数分布曲线波谷，波谷点所对应灰度比值即为嗜酸细胞、白细胞与杂质的分割点，即波谷点所对应的灰度比值即为t₁和t₂。

8.一种基于权利要求1-7任一项所述的聚集白细胞分割计数系统实现的聚集白细胞分割计数方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)对血样中的白细胞染色，利用红细胞裂解液溶解所述血样中的红细胞,获取白细胞图像；

(2)采用形态学重构去除所述白细胞图像的复杂背景，得到重构后的白细胞图像；

(3)采用最大类间方差法得到最佳分割阈值，对所述重构后的白细胞图像实现细胞ROI区域粗分割；

(4)根据所述最佳分割阈值将白细胞图像进行二值化处理，得到二值图像，并根据所述二值图像设定细胞面积判别函数，获取所有细胞聚集ROI区域，并根据所述二值化图像，采用形态学细化方法提取各个细胞聚集ROI区域内的细胞骨骼，将所述细胞骨骼映射到白细胞图像中，得到所述细胞骨骼处的灰度曲线；

(5)以所述灰度曲线的细胞波谷为种子点，以波峰值为终止条件，根据区域灰度均值相似性实现所述聚集ROI区域的细胞分割；

(6)通过分析低倍显微镜下聚集ROI区域灰度骨骼曲线的波谷值和单一细胞ROI区域面积的比值，即获取ROI区域参数灰度比，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值；统计阈值区间ROI数目，实现白细胞及嗜酸细胞计数。

9.根据权利要求8所述的聚集白细胞分割计数方法，其特征在于，所述实现所述聚集ROI区域的细胞分割，具体包括：

(51)所述骨骼灰度曲线的波峰处的灰度值为所述聚集细胞连接处灰度值，所述骨骼灰度曲线的波谷处为细胞核灰度值；

(52)以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点，以波峰值为终止条件，设R为所述白细胞图像中的一聚集细胞ROI区域，第i个波谷灰度值为g_i，第i个波峰灰度值为p_i，I_k为所述区域R对应的灰度值，在所述种子点g_i处进行8邻域扩展，所述波谷值g_i的8邻域像素灰度值记为g_k，所述波峰值p_i8邻域值像素灰度值记为p_k；

(53)以所述骨骼灰度曲线波谷为种子点进行区域增长，若所述区域R对应的灰度值I_k符合g_i-g_k＞|p_i-p_k|或g_k不为其2邻域区域的最小值，则该灰度值I_k被包括进所述波谷值g_i种子像素所在的区域；当不再有像素I_k满足加入所述波谷值g_i种子像素所在的区域，分割结束；

(54)重复上述过程，直至所述所有种子区域均被分割完成，得到满足一定条件的n个子区域R₁,R₂,......,R_n。

10.根据权利要求8所述的聚集白细胞分割计数方法，其特征在于，所述获取ROI区域灰度比参数，统计图像内参数比值分布，计算区间自适应分割阈值具体包括：

参数灰度比表示为：

g为聚集ROI区域灰度骨骼曲线波谷值，C为单一细胞ROI区域的面积；

嗜酸细胞数目和白细胞图像内白细胞数目表示为：

其中，Num_e为嗜酸细胞数目，Num_w为白细胞图像内所有白细胞数目，n为白细胞图像内ROI G_ratio小于阈值t₁的区域数目，N为白细胞图像内ROI G_ratio小于阈值t₂的区域数目；

所述阈值t₁和t₂的获取具体方法为：

(1)计算白细胞图像范围内ROI区域灰度比参数；

(2)统计所有ROI区域灰度比参数分布直方图；

(3)样条插值拟合获取灰度比参数分布曲线；

(4)寻找所述参数分布曲线波谷，波谷点所对应灰度比值即为嗜酸细胞、白细胞与杂质的分割点，即波谷点所对应的灰度比值即为阈值t₁和t₂。

Images